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8/13/2019 1981, Varela. El problema de la determinación de clorofila-a en el fitomicrobentos...discusión sobre la metodología.
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Oecologia aquatica, 5: 7-1 9. 1981
E probema de a eteminación e corofia a ene fitomirobens: discusión sobrea meodología *MANU VALAInstitut Español de Oceanografía. Muelle de nimas s/n. Aptdo 3 La Coruña
INTRODUCCiN
Esá demosado qe os podcos
de degadación de a cooia epesen-
an en e benos na acción impoane
de oa de pigmenos vedes pesenes
Esas omas degadadas o inacivas ab-
soben z en a pae oja de especo
y esa absoión no es di s ingi b e de
a de as omas acivas Las éc nic as
empeadas paa a deeminación de pig-
menos deben po ano ee en cena
esa cicnsancia poqe de o cona
io os esados obenidos sean poco
iabes
E esqema de a degadación de
a cooi aa es e s igiene ( YENTSCH
967) :
-Mg - Fitol
Feof ia-� Crofia-�
Coofiia-a-ito -Mg
La pédida de núceo magnésico
y de a cadena io degada a cooi
* ate tr o ha sid
zd dsdel program cooperativo hispo-americno " B nº de royeco 020
aa a eoóbidoa a avés de a
eoi inaa o de a cooi i daa según
e esqema señaado
La cooiida y ss omas oida-
das pesenan n especo de absoción
idénico a de a cooiaa y po
ano en os anáis is especooomé
icos esas cooas egadadas se
vaoaán como cooia aciva Po
oa pae eoi ina y eoób ido ( eo
pigmenos pesenan n especo igea-
mene dieene a de a cooia aci-
va La absoción en a pae oja de
especo se despaza de 665 a 667 nm
y decece apoimadamene en n 50 %
( ig . Sin embago es a dieencia
es an escasa qe no pemie na caa
di sinc ión ene os pigmenos y poano os eopigmenos peden ineei
seiamene as deeminac iones especo
ooméicas de cooiaa ya qe es-
os podcos se incián como si casi
a miad de a coespondiene canidad
de c ooia esviese p esene
La cooaa pede se anso
mada en eoiinaa y a cooiida
en eoóbido ac idi icando os eac-
os de pigmenos con ácidos mineaes
di idos Paiendo de esa base se
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8
sd pcdis spc
éics c s fcs d c-
ccó dcds p pii disci
i cfi iclyd c
id y fs xidds) y fpi
s s d fi y ffóbid)
LORNZN, 1967; TT 975).
L cidd d pis pd s b
s dic d l lció
s bsbcis s y dspés
d cidiicció Es l ció pd
i dsd i d , cs
d xisci xclsi d pi
s s l áxi s éss s
c ss
ELECCN DEL SOLVENTE
Ls cis c
p cció d s l sá
bsds cp ci dd xc , p
Fig. spectros de absorió de u extrato
de aceona al 100 procedete de aga verde
cenedesmus dimorphus, tratado co diferetes
ANE VAA
Taa - Eficncia d man aoo de a acetona a 9 a etracción de clo�
rofia-a, en diatomeas cianofíceas (de HOL
-HANSEN & RIEMAN 978)
GRUPO TI E MP O (h) p g CL O R O FA -a/ MU ES T RA
TAXONMCO EXTACCN ACETNA 9 METANO
Diatomeas 342!O,4 37,0 06
6 5,1!,8
2 362!0,7
20 368!O6
Cianoíceas 286!02 34, 0,4
6 29,4!0,4
2 298!0,8
2 30OO,
d , y sbil dd d l s p
s él d ls pcss d x
cció y cidifccó , p
CAPACIDAD DE EXTRACCIN
s sls ás pl i
lids s , cf c
i , l l bsl y
c 0 %. xc , l
l s ch ás ápid y fic
q l c , c pd s l
b Al cb d h , l xc
có f cp l l , p i
cp l l cs d l c Ds
pés d 20 h ls ss d ds
s pxi l 00 % d xcció ,
is q cifcs s sól
88 % cpds c ls ss d
l S b , s l s ss
s ds y xds d s
concen tacons d ClH (MOE & H E RE pcs hs , ls slds s cp
1978
. Abso:tio specra f
on ex-r
h geen lg Senede smus morphu, eed
w sussvy nesn mo o C1H
(MOE HALEGRAEF
bIs bs sl s P ,
cd s p l c, s i s ds xcció cpl , l s ss
db s bi xs d
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DTERMNACIÓN DE CLOROFLA EN EL FITOMICROBNTOS 9
te a menos 24 anqe en es te caso
a etacción no sea competa en agnos
gpos e spec iamente c oofíceas y cia-
nof ceas . Como se compobaá pos tei o-
mente a ace tona pesent a dante os
pocesos de acidificación nmeosas ven-
tajas compaada con e metano ac iendo
qe s so sea pefeib e a de éste .
Además dado qe as diatomeas cons tit-
yen en genea e gpo más abndante
de fitomicobentos e empeo de aceto
na no condce a gandes sbestimaciones
de a canti dad de c oofia I ncsoen e caso de a pesencia de oganismos
en os qe a etacción sea incompeta
con acetona pede incementase a efi-
cacia de ésta asta e n ive de a de
metano ti izando na mezca de dime-
ti s fóido ( DMO ) y acetona a pates
igaes ( V/v ) ( taba 1) Po ota pa-
te e DMSO o modific a e especto de
absoción de . coofiaa
SABLDAD D OS PGMNOSN DSNOS SOVNS
Como ya se a señaado e cambio
en a absobancia de na oción de
pigmentos despés de a ac idi ficación
es a base de os métodos espec tofoo
méticos paa a estimación de coofia
en pesencia de feofi tin Los métodosestán basados en a sposición de qe
e coeficiente de absoción de a feofi
tina póimo a 665 nm no vaa con
a acidi icación. Esta spos ición es
sin embago incoecta y e coeficiente
de absoc ión pede vaia amp iamente
dependiendo de tipo de sovente s
contenido en aga y a moaidad de
ácido en e etacto y po tanto de
pH.
La figa mesta caamente a
infencia en e especto de distintas
concentacio nes de ácido . Si a mo ai
dad fina de ácido se mantiene po de-
bajo de ci etos vaoes a degadación
de a c oofi aa a feofiti naa povoca
e despazamiento de máimo de abso
ci ón en a pate oja de especto
de 665 a 667 nm . n incemento en a
concentación de ácido oigina n coi-
miento de máimo a 657 nm . Po a ob
sevac ión de a figa eslta evidente
qe a apicación de bajas concentacio
nes de ácido j nto con cotos tiempos
de eacción es insfic iente paa aseg-
a a convesión de toda a coofia
Taba Comparaión de a efia ia etat
a de aetona a 90 % dimeti sfóxido DMS
+ aetona 90 %, v/v) ( de SHA & UM 1976 ) .
mg/
GUP TAXNMC EXTACT CLA-a
Diatomeas
Nitzsha sp . D 1 ,32
Aetona 1 31
Cclotel sp DMS 0,86
Aetona 0,86
Coofíeas
Choea renoidos DMS 2 ,66
Aetona 0,64
Seenasum c Ericornutum DMS 1 , 18
Aetona 002
Ankistodesmus baun DMS 1 05
Aetona 0,21
Ciofíeas
An cl st i s niduans DMS 0 ,40
Aetona 0,40
Anabaena flos-aquae DMS 245
Aetona 2,45Fremell diplosihon DMS 3 ,28
Aetona 3 ,16
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esene en eoiina , en es caso
se obendían aoes de eoiina muy
eeados y aoes de a eación ene
as absobacias anes y después de a
cdcació (R) muy bajos De oo
ado , ua uee acid cación hace que
p c o de absoc ón se de sace de 667
a 6 m so se debe ( USACHEVA , 971
a l esecia d un equ bo , depe
d e de e re a oma eu a
d eo s mooaó su d
ca a apac ó de p co de abso-
có a
6: sea idcaa de a
acó de dcaioes de eoina
a aue os casos en que es as as
a oes o aa s o dee cadas
e eaa a 1& obecó de oes
de eogmeo mu os , cuso nega
os y aoes de � na concen-
acó de ácido eeada puede incuso
UZO(
,
' � o
40
00 0LNGIT DE DA
MANUEl VARLA
llega a incemena de oa considea
be a absoción de ondo uiizada
aa coegi a ubidez de a sou
ci ón nodci endo de e sa oma nueos
eoes en e cácu o de gmenos . Ese
cemeno de a absoción a 7 nm se
debe a a escisió de a ucoxanna
en oducos de i o uano ( g E emo de meano como soene
pesea pobemas semejanes a de a
aeona , con desazam enos de os m
imos de absoción hacia ongiudes de
nda menoes de a eseada ( g 3 )
sa eacción es mucho ms pida
en meao acuoso que en aceona acuosa
La ansomación de monoca " oes de
eoiina en sus esecos dicaiones
ene uga a un pH < en meano acuo
so y sóo a H < en ace ona acuosa
Ese desazamieno de esco es com
ucxnn
00 0 0
F g 2 Espes de absn de a fuxan na anes () y después de se adfad
e exa 100 % de aena hasa una aidd fna de lH d e 4 , 4 2
M ME & HEE,
98 Abo spectra of ux nd t () iiio w Finl mol"ity
o ci. 4 4XIO2
M MOED L['CRA
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üzmO
1
DERMINACI6N DE CLOOFILA EN EL FITOMICOBENTOS
/
psente fomación de daiones . HOM-
HANSEN & RIEMANN ( 1978 aconsejan e
e mp l e o d e 2 5 m g d e C 03
Mg por ml de ex
tracto , pa ra una conc entrac ión final
de ácido 3x103M, con un tiempo de reac-
ci ón de 10 minutos y agitac ión suave
MEDIDAS DE pH ANTES Y DESP�SDE A ACIDIFICACIÚN
MOED & HALEGA ( 1978 n l l e
LG
vado a cabo un completo estud acerca
de la influenc ia del pH del extracto
en la absorbanci a de los pi gmentos , que
F. 3 . Epctros ' de absorció n de pgmntos
extraídos n mto de u n cult ivo de Dunaie-
ll tertiolecta ( HOLM-HANSEN & RI E NN , 1978 ) .
Fi. 3 . Absortion specta _f pigm t extacted
in mthol ro a cutur of Du aia tertioecta
(HOLM- HASEN & RIEA, 1978).
pletamente rersible mediante neutrali
zación con C
3
Mg , l o c ual i nd i c a l a
xistencia de un cambio fsico más que
de uno químico de transomación en feo-
fórbi do .
Estos cambios espectrales de la
feofi tina en rel ación c on e l p H , han
si do señalados para metanol al 80 , 90 ,
95 100 % ( LIVINGSTONE et al , 19�3;
MARKER , 1972 100 % de acetona ( MOED
& HALLEGRAEFF , 1978 ,
no fueron de
tectados en acetona al 80 , 90 9 5 %
Esto e s deido a que e n acetona acuosa
es necesario alcanzar un pH tan bjo
como 0 , 5 para que comiece la formación
de di catione s de feofi tina , mientras
que en metanol acuoso esta transforma-
ci ón tiene lugar a a un pH de 2. Por
tanto , cuando se empl ee el metanol como
b l ven te spu
s la aci di ficac ión
es necesario neutralizar el extacto
hasta un niel de pH en el cual no se
permite explicar de forma clara numero
sos problema que plantea la acidifica-
c ión , en un i ntento de cara cterizar l as
condiciones óptimas de la misma en rela
ción con la molaridad final del ácido .
En este sentido , la determinación del
pH en los extractos parece ser un crite-
rio más adecuado que el cálculo de la
molaridad del ácido puesto que aquél
no depende únicamente de la cantidad
de ácido añadido sino también del con
teni do en agua del sol ente . De todas
formas las medid de pH en solentes
acuosos orgánicos deberían ser interpre-
tadas con grndes precauciones , a que
el concepto de pH ha sido definido úni-
camente en relación con el agua como
solente .
La adición de inluso pequeñas can-
ti dads de CH di lui do a sol ntes orgá-
nicos con un bajo contenido en agua
( " 5 % hace descender el pH , en sólo
un mi nuto , a alores comprendi dos entre
0 , 5 2 , 0 ; mentras que la misma canti-
dad de ácido en solentes con un mayor
contenido en agua ( 1020 % da 1ugar
a alores de pH que osc i lan entre 2 , Y 3 , dependi endo de la naturalza de
solente ( fig. 4 . El consumo de ácdo
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e pue mayor cuanto mar ea la can-
tidad de agua , y e uperior en metanol
ue en ac etona para ·a mma cantidad
de agua En olucione acuoa de meta
nol y acetona la completa degradación
de c l orofila en feofi tina tene lugar
a un pH comprendido entre 2 6 y 2 8
a rotura d e la fucoantina e n furano
y e incremento ubiguiente de la ab
orión a 750 nm e dependiente del
iempo y cmenza a un p ,5, veri-
n ts
Metl •
g. Vic de H e eci co
cidd de ácido CH 04 ñdido 2 m
de difeetes xtctos de ceto meto
co ist its coctc ioes de gu ED
& HALLEGAE 1978) .
h dd n
mn d C1H) 0: he pH
( ) mhl w
w nn' MOE AGAEF, 978)
ANUE VAREA
ficndoe de forma muy lenta y iendo
mucho má rápida a un p comprendido
entre y ,5Dado que el pH final del etracto
no e únicamente función de la molaridad
de ácido ino del contenido en agua
del mimo lo cáculo de l p de l e
tracto a partir de la concentración
del ácido e'el mimo no correponden
al va lor real Por eta raón aun cuan
do teóricamente una con centracón de
ácido en e etracto entre 2 y 303
daría el rango de p eñalado como idó
neo ( 2 6 2 8 ) en la práctica eto no
e cierto a figura 4 re pre e nta la
diminución de l pH e n re lación con la
cantidad de ácido añadido a ditinto
olvente con diferente concentracione
de agua A partir de la mima e pue de
deducir el volumen de ácido a añadir
a dtinto vol úmene de etracto Mu-
cho autore acidifican directamente
en la cubeta del epectrofotómetro aun
que ería preferible utilizar etracto
de mayor volumen con obeto de poder
añadir cantidade eacta de ácido Ade
má dado que numeroo invetigadore
uan acetona metanol e incluo etanol
con variada concentracione de agua
ería conveniente que en cada cao
e etableciee el volumen de ácido re-querido para alcanzar el p eñalado:
2628
CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓ
DE PG MENTOS
Una vez obtenido lo etracto
en acetona del 90 % la lectura e
realian n el epec�rofotómetro a 665nm ante y de pué de la acidificación
con CIH corregida por la l ec tura a
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DERMINACÓN DE COOFA a EN EL FTOMICOBENOS 13
750 nm y con l as precauciones anterior-
mente señal adas en re laci ón con la can
tidad de ácido añadido
cálculo de la concentración de
clorofilaa se otiene a partir de las
si guientes ecuaciones L�NEN , 197):
Clorofila'a (mg/m 2
) AxKx(6650-665axvxLxS
Feoftina a (mg/m 2
)= AxKxRx665a6650xvxx
A , coeficiente de sorción d l a clo
rofila a=
; K , ctor para igualarla reducción en la asorancia a la con-
centración inicial de clorofila = 2 , 4 3 ;
665 , asorancia antes de la aci difica-
ción , corregida; 665a, a soranci a des-
pués de la acidi ficación , corregida;
v , volumen de extracto acetónico en m;
10 , factor de conversi ón a m2
; L , longi-
tud de paso d' la cueta en cm; S , su-
perficie de l muestra, en m2
; R , má xi -ma relación de 665/665a en ausencia
de feopigmentos 1,7).
LMTACONES DE LOS M�TODOS
NORMALMENTE UTLZADOS
Los métodos espectrofotométricos
empleados para la de terminación de pig-
mentos , tal como e l descrito anterior-
mente LORENZEN , 197) u otros similares
( HOL M HANS EN & R IEMANN , 1978; T ETT e t
a l ., 1975), así como los de fl uo rescen-
cia ( Y ENTSCH & M ENZ EL , 1 963; HOLM-
HANSEN et al . , 196 5 ) , proporc ionan e s-
timac iones po co vál i das ya que la medida
de c or ofi l aa c orresponde a l a s uma
d c orofi l a-a y c l orofi lidaa y la de fe ofi tinaa a la suma de feo fi t inaa
y feofórbidoa . Esto supone un serio
inconveniente , espec ialmente en muestras
entón icas , en donde e sto s pr od uc to s
de degradación pueden representar un
elevado porcentaje de la cantidad total
de pi gmentos Por otra parte , si la clo-
rofil a es tá presente , se oti ene un
val or de feofi ti naa muy al to , ya que
el espectro de asorción de la feofitina
a y de la feofi tina en los extractos
acidificados s muy se me j ante f i g 5 )
J EFFR EY 1974) comenta estas limitacio
nes y señala que cualquier método que
no implique la separación fsica de los
pigmentos porporciona resultados poco
precisos y está comprometido por la pre
sencia de productos de degradación nue
vos , resultantes de la acidificación
de las muestras . Este autor propone la
utilización de técnicas de cromatografa
en c apa fina, las cuales permiten la
separación de las formas principales
de clorofila a , y c ) y carotenoides ,as como feofit inas , feofóridos y clo-
rofil idas Sin emargo , en la estimación
de la iomasa de la microflora entóni-
ca , en la que el prolema de la patchi-
ness exige la toma de numerosas mues
tras son quizá preferiles a aquéllos
más exactos pero lentos
UNA APROXMACIÓN AL PROBLEMA
El emp l eo de técni ca s de sp arac ió n
de fase es sugeri do por J EFFREY 1974)
como una opción para mejorar la metodo-
loga normalmente ut il izada WHITN
& DARLE 1979) desarrollan en este sen
tido un procedimiento para la determina-
ción precisa de clorofilaa en muestras
que contienen grandes cantidades de pro
ductos de degradación La partición con
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1 4
ean de un etrat aetón da lugar
a un s stema de s ases a perase
ntene ls artens , lrlas a
b Y e t nas a b , debd a que
ests mpnentes retenen la adena
n plar ( tl ) a pase nt ene
la l rl a parte de artens y
ls p rduts de degrada ón de l a l
rl a que areen de grup tl l -
rldas a y b Y eórbds a b
De es ta rma , l a part ón n ean
separa las rmas degradads de la l
rl a atva a lrl a a puede en
tnes ser alulada en la apa de e
an , en presena de e tnaa pr
una gra mdaón de as eua
A
Feofitin
(655)
600 650
Clorofl (665)
700
c(zcc
MANUEL VARELA
es de ORNZN 196 ) Dad que es te
predment supne una mprtante me
ra en l a metdlga , es más s mple
rápd que ls ténas rmatgrá-
as en us , n requere equp espe-
al será desrt en detalle
a partón n ean es m
s gue : 10 ml de un etrat aetón
90 % de atna) se añaden a 3 , 5 ml
de CNa al 0 , 05% Y 1 3 , 5 ml d e e an
( de grad espe tsóp rang de ebu
ll ón : 68 ,068, 8) en un embud de de-
anta ón de 60 ml l embud es agtad
uertemente durante 5 mnuts en una
agtadra reípra a 60 vbranes
pr m nut , para al anzar una má ma
B
600 650
oofil b(655)
_Feofitin b(653)
700LONGITUD DE ONDA
Fi 5 Espectro de absorción de las corofilas a y b feofitinas a y b en metano. Acidifica
ción hasta una moardad de 3X10- 2
M HOLM- HANSEN&
RIEMANN, 1978).
Fig 5. Absortion speca fr hloophyls a and b and phaeoph a d n mehanol. Mola 0' hcd n he exrac 3X0-2M (HOLMANSEN & RIEMA 1978).
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16 NUE VEl
Ta II oparn e s andes de orofa-a feofa- oendas por os
odo d aeon xan, en aros pos d sras Conenraones en g de pgnto
por ro de ex'aco aeno d WIUTN & AR 179
Aena
R
66: 66a a
Cooª ra ,80 ,896
Clindrothec srms ,768 37,89
Fpaon 1569 5,400
Fano ,544 9,58
es 1,054 0,525eona ua 1 08
e de ht e 2 % (tb cuo
e e ogítmc e cuto e
Crothec fuform e orcetj e
e ducto degro e corof
- ede czr el O % tb
Ü!
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9 70
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-3
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HX "
r ofVCO l _ DE aSO.NCI M"X4
i S Vació e val e eacó de
la a!aca a 66 ate é e
aca a t e a aa a
ca-a a e acet a Y hxan
WITY & DAR Y 97).
Hexano
R
feoftna 66 663a Ca ofn
0,00 ,227 3898 0009
1,18 2,105 3,083 7,139
,15 1,798 3,59 1,926
4548 7,648 55
7,70 ,57 0,00 4,085
465 ,050 0 16 358
aba IV - maraión e s valres e clr
fla-a feigentos btenis or s métd
de aetna hexano. e cas e la clrf
a ls porcentajes rrespnden a la reaión
etre os valores e hexano y aetona consie-
rado que ls rieros reresent a frma
ativa del igeno os segundos el ttal
(activa + degraada = clorofla clorofília)
En e caso de los feopentos ls prcentajes
exresan a relación entre ls aores obteni
dos por uno otr métdo Las uestras señala
as cn un * reresent catidades de feopig
mentos más eleas en aena ue en ex.
Muestras proedentes e a ra de Arosa (VAR
& PENAS en reparaión) N , núero de mues
tra
% l-a ativa
rfiaa OPIGMENTOS
m/m2
mg /m2
N acetna hexan % aetna hexan %
3 7 3 198 3 2851 3 4 8 5 22
2 2573 1331 51 1 38 32
3 3778 2 1 7 7 58 2 8 3 2 4537 60
Fig Dpndec af bare-ta cidn ' 133 5 2 3 39 658 6285 71
raic wavlngth f' pur hlaIapyl1-
: ' ac'an nó xn (WHITNEY DARL,
7)
5 23
6 52
1 8 5 8 229 2, *
123 226 204 *110
8/13/2019 1981, Varela. El problema de la determinación de clorofila-a en el fitomicrobentos...discusión sobre la metodología.
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DRMNACIÓN DE CLOOFLA . EN EL FITOC OBENTOS 1 9
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