Post on 26-Jun-2015
description
1
Unidad 2. Estructura y función de los microorganismos
Objetivos
• Conocer
-La relación entre la estructura y función de los microorganismos
• Asimilar
-La estructura de los procariotas los hace enormemente interesantes en microbiología aplicada
• Capacidad
– Manejar las técnicas más frecuentes en un laboratorio de Microbiología y aprenda a plantear experimentos sencillos y a interpretar y discutir científicamente los resultados
– Manejar, ajustar y mantener los microscopios
– Teñir y observar microorganismos
2
Unidad 2. Estructura y función de los microorganismos
Capítulo 2: El estudio de la estructura microbiana: Microscopía y preparación del
especimen
3
Las lentes y el desvío de la luz
• La luz es refractada (desviada) cuando pasa de un medio a otro
• El índice de refracción– Es una medida del grado en el que una
sustancia reduce la velocidad de la luz• La dirección y la magnitud de la
desviación se determina por los índices de refracción de los dos medios que forman la interfase
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
4
Lentes• Una lente convexa enfocará
los rayos luminosos en un punto concreto denominado punto focal (F)
• La distancia entre el centro de la lente y el punto focal es la distancia focal (f)
• Los aumentos que proporciona una lente están relacionados con la distancia focal– A menores distancias
focales más aumentos
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
5
El microscopio óptico
• Tipos– Microscopio de campo claro– Microscopio de campo oscuro– Microscopio de contraste de fase– Microscopio de fluorescencia
• Son microscopios compuestos– La imagen se forma por la acción
de 2 lentes
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
6
El microscopio de campo claro• Produce una imagen oscura sobre un fondo luminoso• En general de 3 a 5 objetivos con lentes diferentes (si la imagen
permanece enfocada a medida que se cambian los objetivos el microscopio se denomina parfocal)
• Aumento total (producto del aumento de las lentes del ocular y el objetivo)
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
7
Resolución de un microscopio (d)• Capacidad de una lente de separar o distinguir entre objetos pequeños que están
próximos• La longitud de onda de la luz empleada es un factor fundamental en la resolución (filtro
azul en los microscopios del laboratorio)A menor longitud de onda mayor resolución
•Distancia de trabajo— distancia entre la superficie frontal
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Tabla 2.2 Propiedades de los objetivos de un microscopio óptico
(n sen θ)
θ =Apertura angular
d= 0.5 λ/n sen θ n = índice de refracción
•Aceite de inmersión— aumenta el índice de refracción
Nagua= 1.33Naceite: 1.45
8
Microscopio de campo oscuro
Treponema
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Diafragma de campo oscuro
Condensador Abbé = produce un cono hueco de luz
• Produce una imagen iluminada del objeto sobre un fondo oscuro
• Se emplea para observar organismos vivos en preparaciones sin teñir
9
Microscopio de contraste de fases• Aumenta el contraste entre las estructuras intracelulares que tienen
ligeras diferencias en el índice de refracción• Excelente para observar células vivas sin teñir
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
10
Microscopia de contraste de interferancia diferencial o técnica Nomarski• Similar a la de contraste de fases
– Crea imágenes sobre la base de una detección de diferencias en el índice de refracción y el espesor de la muestra
– Excelente para observar células vivas
• Emplea luz polarizada– Esto mejora el contraste y da como resultado una imagen
tridimensional
Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
11
Brightfield microscopy image of cultured epithelial cells using a 20X objective
Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective.
Differential Interference Contrast (DIC or Nomarski) image of cultured epithelial cells using a 20X objective.
12
Microscopía de fluorescenciaFundamentos y tipos de microscopios ópticos
Protozoo flagelado Crithidia luciliae teñido con anticuerpos fluorescentes
Live/Dead stainig: Mezcla de Micrococcus luteus y Bacillus cereus (verdes vivas, rojas muertas)
• Expone un especimen a luz ultravioleta, violeta o azul
• En general, el especimen se tiñe con fluorocromos
• Se observa, en un fondo oscuro, una imagen brillante del objeto como resultado de la fluorescencia emitida por la muestra
13
Preparación y tinción de la muestra
• Aumenta la resolución
• Acentúa las características morfológicas
• Conserva la muestra
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
14
Preparación (Fijación)• Proceso mediante el cual se procesan y fijan en su posición las
estructuras internas y externas de la célua• Además se mata al microorganismo y se fija firmemente al porta
objetos (microscope slide)– Fijación por calor
• Preserva la morfología general pero no las estructuras internas– Fijación química
• Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Ej.: • aldehídicos (al formaldehído, el paraformaldehído, el glutaraldehído, la acroleína), • el ácido ósmico• el tetróxido de osmio• los compuestos mercúricos y crómicos, • los alcoholes, la acetona, el dietil-pirocarbonato.
15
Colorantes y tinción simple
• Colorantes (dyes) – Hacen más visibles las estructuras internas y
externas aumentando el contraste con el fondo– Tienen dos características fundamentales
• Grupos cromóforos– Grupos químicos con dobles enlaces
conjugados– Dan al colorante su color
• Afinidad por los componentes celulares– se unen mediante enlaces iónicos (los
más comunes) , covalentes o hidrófobos
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
16
Tipos de tinción• Tinción simple
– Se emplea un solo colorante. Se dividen en dos clases generales
– Colorantes básicos se emplean frecuentemente
• Tienen cargas positivas• Ej.: Cristal violeta, fucsina básica,
safranina, verde malaquita
– Colorantes ácidos se emplean menos frecuentemente
• Tienen cargas negativas• Ej.: Eosina, Fucsina ácida
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Safranina
17
Tipos de tinción• Tinción diferencial
– Se emplean dos o más colorantes– Divide a las bacterias en grupos diferentes según
sus propiedades de tinción:• Ej.: Tinción de Gram• Ej.: Tinción ácido alcohol resistente
• Tinción de Gram– Es la tinción diferencial más empleada– Divide a las bacterias en grupos diferentes
según diferencias en la pared celular
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
18
Gram positiva
Gram negativa
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
19
Tipos de tinción• Tinción Ácido-alcohol resistente (Acid-fast
staining) – Se tiñen calentando una mezcla de fucsina básica y
fenol (Método de Ziehl-Neelsen)
– Tras la tinción no se decoloran fácilmente debido al elevado contenido en lípidos de las paredes de estas células
• En particular ácidos micólicos (lípidos hidroxílicos de cadena ramificada)
Mycobacterium lepraeColorante de contraste: azul de metileno
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
– Particularmente útil en la tinción de miembros del género Mycobacterium
Ej., Mycobacterium tuberculosis – causente de la tuberculosis
Ej., Mycobacterium leprae – causante de la lepra
20
Tinción de estructuras específicas
• Tinción negativa– Se emplea frecuentemente
para visualizar las capsulas difusas que rodean a algunas bacterias
– Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden sobre un porta
– Las capsulas se observan sin color sobre un fondo oscuro
Cryptococcus neoformans – tinción negativa con tinta china
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
21
• Tinción de esporas (Método de Schaeffer-Fulton)
– Técnica de doble tinción
– Las esporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita
– Después de desteñir se contratiñe con safranina quedando las células vegetativas y las endosporas con colores diferentes
– Son difíciles de teñir por eso se observan también en tinciones simples
• Tinción de flagelos
– Los flagelos deben ser recubiertos con suficiente colorante como para ser observados
– Se aplica mordiente (como ácido tánico y alumbre de potasio) para aumentar el grosor de los flagelos y se tiñen con pararosanilina (Método de Leifson) o fucsina básica (Método de Gray)
Bacillus cereus
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tinción de estructuras específicas
Vibrio cholerae O1
22
• Métodos directos – el primer anticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo
de marcador fluorocromo (pierde fluorescencia con el tiempo)– Se pueden emplear varios anticuerpos diferentes Ej.: 3
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Sistemas de marcaje inmunocitoquímico Tinción de estructuras específicas
• Métodos indirectos – El anticuerpo primario aplicado sobre las células es reconocido por un
segundo anticuerpo, secundario, unido a un marcador– El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso.– Es más sensibles que los directos pues al anticuerpo primario se
pueden unir más de un anticuerpo secundario, incrementando la señal.
– basta con disponer de unos pocos secundarios marcados para poder reconocer un gran número de anticuerpos primarios diferentes
23
• Métodos del anticuerpo no marcado o de puente – Un problema importante en el uso de anticuerpos (primarios o secundarios) marcados
• las técnicas químicas de formación de enlace covalente entre el anticuerpo y el marcador pueden destruir parcialmente la reactividad del anticuerpo.
– En el método de puente sencillos la primera capa está formada por el anticuerpo primario (por ej. obtenido en conejo). La segunda capa por un anti-anticuerpo, secundario (por ejemplo oveja anti conejo), la tercera por un anticuerpo anti-peroxidasa (por ejemplo conejo anti peroxidasa) producido en la misma especie que el primario y la cuarta por peroxidasa.
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Sistemas de marcaje inmunocitoquímico Tinción de estructuras específicas
24
Microscopio electrónico
• Se emplean haces de electrones para producir un imagen
• La longitud de onda de los haces de electrones es mucho menor que la de la luz, dando lugar a un gran aumento de la resolución
Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos
Límites de resolución de un microscopio
0,2 µm
25
Microscopio electrónico de transmisión
• Los electrones se dispersan cuando atraviesan una sección fina de la muestra
• Los electrones transmitidos (aquellos que no se dispersan) se emplean para producir una imagen
• Las regiones más densas de la muestra dispersan más electrones y aparecen más oscuras
Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos
26
Microscopio electrónico de barrido
Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos
• Crea la imagen a partir de los electrones reflejados en la superficie de la muestra
• Produce imágenes en 3D de las características superficiales de la muestra
27
Preparación de la muestraPreparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
• También pueden fracturarse en frio (criofractura) con una cuchilla quedando expuesta la membrana interna
• Los procedimientos son similares a los empleados en microscopía óptica
• Para la microscopía electrónica de transmisión las muestras deben ser cortadas muy finas (de 1-2 µm a 60 nm) con un ultramicrotomo
28
Preparación de la muestra
• La muestra se fija químicamente (Ej.: Glutaraldehido) y se tiñe con materiales electrodensos (Uranilo, platino y plomo)
• También puede emplearse inmunodetección si se marcan los anticuerpos con oro coloidal (esferas de 2-3 nm adsorbidas a los anticuerpos)
Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
29Ochoa de Alda et al. 2004 Immunolocalization of NblA, a protein involved in phycobilisome turnover, during heterocyst differentiation in cyanobacteria.Microbiology150:1377-84.
0,5 µm0,5 µm
Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
30
Otros métodos de preparación• Sombreado
– Recubrimiento de la muestra con una capa fina de un metal pesado
– La muestra se recubre desde un lado de forma que unas áreas se cubren más que otras
– La zona cubierta, más electrodensa se ve clara y la zona menos cubierta más oscura
Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
31
Nuevas técnicas de microscoíaNuevas técnicas de microscopía
Microscopía confocal de barrido por láser (MCBL)
• Se emplean haces de luz láser para iluminar la muestra
• Un ordenador recoge y agrupa las imágenes de cada punto para generar una imagen tridimensional
• Permite controlar la profundidad del campo que se observa eliminando o reduciendo la información fuera del plano
• Permite recolectar secciones ópticas seriadas de especímenes gruesos
32
Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía confocal de barrido por láser (MCBL)
Cultured epithelial cells triple stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired with a 20X objective (left) and a 100X objective (right).
33
• Microscopio de efecto tunel (Scanning tunneling microscope, STM)– Permite ver átomos (sustancias
conductoras) en la superficie de un sólido– Un punta muy fina (terminada en un solo
átomo) se aproxima a la muestra – Una corriente constante (tunneling
current) se aplica entre la sonda y la muestra
– Para mantener la corriente constante a medida que se desplaza la sonda, ésta debe moverse alejándose y acercándose a la muestra
– Las variaciones de corriente son detectados y empleadas para crear una imagen
– Tiene una enorme resolución – Permite observar incluso átomos
Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía con sonda de Barrido
Los electrones que rodean los átomos de la superficie se proyectan desde el borde de la superficie a una corta distancia
34
• Microscopio de fuerza atómica (Atomic force microscope, AFM)– Similar a la microscopia de efecto túnel
pero para materiales no conductores ya que no aplica un voltaje
– Un punta muy fina se mueve sobre la superficie de la muestra a una distancia constante
– A medida que la sonda se mueve a lo largo de la superficie de la muestra los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrónicas de los átomos de la misma. La altura de la sonda se ajusta de modo automático para mantener constante la fuerza recibida.
– Los movimientos ascendentes y descendentes de la sonda son detectados y empleados para crear una imagen
– Se emplea para muestras poco conductoras
Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía con sonda de Barrido
35
Imagen AFM del virus del mosaico de nabo amarillo en el que se observa la estrutura de la cápsula Características
superficiales de una espora de Bacillus atrophaeus (a) Espora hidratada (b), Detalle de ésta mostrando estructuras de cilindros ordenados que se pliegan tras hidratarse (c). Imagenes AFM
a–e) Imagenes AFM de la compactación progresiva del ADN de levadura por el efecto de la proteína AbF2.
Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía con sonda de Barrido
2 nm
Imagen STM del ADN