1

Actualidades en Enfermedades Tumorales y su efecto en la Producción de Huevo ComercialTaylor BarbosaDVM, MS, PhD, Dipl. ACPV Sr. Manager, Tech Services Bio-Devices Latin America

2

Enfermedades Tumorales en Avicultura

• Formación genética

– Edad

• Origen infeccioso

– Enfermedad de Marek

– Leucosis Aviar

– Reticuloendoteliosis

3

• Enfermedad altamente infecciosa– Inmunodepresión– Signos nervosos: Parálisis– Lesiones cutáneas– Problemas locomotores – Tumores en vísceras

• Impacto económico: – La enfermedad avícola más

importante en el mundo– Pérdidas económicas anuales

estimadas en 1.5 M Millones de Euros (1% de la producción)

Enfermedad de Marek

4

El virus

• Herpesviridae• Alphaherpesvirus

• Cadena doble de DNA• 140Kb• 90 genes

• Asociado a células • Latencia en linfocitos• Gene oncogénico: meq

• Capacidad neoplásica

• Ubicuo• Infecta primariamente a las gallinas

5

Virus libre

Folículo da pluma

Citólisis

Inmunosupresión

BT ViremiaLatencia

Bursa de Fabrícios

ViremiaMacrófagos del

Pulmón

Patogenia de la Enfermedad de Marek

6

Curso de la infección

1. Infección Citolítica (Síndrome Linfodegenerativa)• Destrucción de células B• Intensidad dependiente de la genética del ave/ virulencia de la cepa• Parálisis temporaria (vasculitis y edema cerebral)• Inmunodepresión transitoria2. Latencia • Ocurre simultáneamente a la segunda ola de infección citolítica• Inmunodepresión permanente3. Fase de Transformación • MDV transforma principalmente células T CD4+• Linfomas pueden ocurrir en cualquier tejido, observados

macroscópicamente a partir de 3 semanas• Signos clínicos variables o inespecíficos (correspondiendo a

los órganos y sistemas afectados

7

Objetivos de la vacunación

• Brindar una respuesta inmune activasólida a partir de los primeros días deedad

• Disminuir la intensidad de la fase citolitica(3-6 días después de la infección por víarespiratoria) y por consecuencia losefectos de la inmunodepresión

• Limitar la viremia del vMDV asociado a loslinfocitos CD4+

• Prevenir la formación de tumores

8

Tipos de Vacunas

• Serotipo 1 CVI-988 Rispens (bajo pasage)• Serotipo 1 CVI-988 Rispens (alto pasaje)• Bivalente (Serotipos 2+3)• Vacunas con cepas de campo atenuadas (productos

experimentales/ no disponibles comercialmente) – Ejemplo: Md11/75C/R2

• Serotipo 1 Clonado con pasaje reversa en aves– Clone C/R6: 6 “back passages”

• Serotipo 3 monovalente (HVT) • Serotipo 2 monovalente (SB1 o 301 B/1)• Serotipo 1 Clone C (no disponible)

Eficacia

9R.L.Witter

?

1940 1960 1980 2000 2020

M

V

VV

VV+HVT

Bivalente

Rispens

Virulencia Relativa

Vacunas x Virus de Campo

10

Eficacia de las vacunas:% Protection contra 5 cepas vvMDV

0

102030405060708090

100

% P

rote

ctio

n

CVI-988 HVT/301B/1 HVT Clone C

R.L. Witter et al. 1992

Reto: 5 días de edad

11

Cambios en la vacuna asociados con el aumento del nivel de pasaje del virus semilla (MSV)

Requerimientos para

Dosis Minima

Tamaño del PFU

Titulo de la vacuna

(facilidad del conteo)

Proporción de Virus

libre de celula

Que es lo que AUMENTA?

12

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

SB-1 (11) SB-1 (23) SB-1 (64) SB-1 (98) Control (HVT)

(mm

2)

(PASAJE)Witter, Avian Diseases 31: 752-765

Eficacia de las vacunas:Número de Pasajes MSV x Tamaño del PFU

13

Cambios en la vacuna asociados con el aumento del nivel de pasaje del virus semilla

Transmisión lateral

Inmunogenicidad

Capacidad de Replicación “in vivo”

Tiempo para

formación de placas

Que es lo que DISMINUYE?

14

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

JM/102W MD5

%P

rote

ctio

n

Virus de Desafío

SB-1 (23)

SB-1 (64)

SB-1 (98)

Witter, Avian Diseases 31: 752-765

Eficacia de las vacunas:Número de Pasajes MSV x %Protección

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Diagnostico y monitoria de la enfermedad

• Procedimientos de vacunación

• PCR de pluma

• Necropsias de rutina

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Feather PCR

Prueba Cuantitativa

– Real Time PCR amplifica una secuencia blanco en el genoma viral:

• Meq gene: especifico de los MDV-1

• sORF1: especifico del HVT

– Reacción PCR duplex: concentración del DNA del ave x DNA viral

Prueba Cualitativa

– Diferencia entre cepas vacúnales (Rispens) vs cepas de campo

MDV-1 Virus de campo: 1 o 2 “repeats”, 1 banda

MDV-1 vacuna RISPENS: •3 a 8 repeats, “Ladder” patrón

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• Bazo: sitio predominante de replicación del MDV

• La carga de genoma viral en las plumas presenta correlación directa con la del bazo*

• Método de muestreo conveniente y no invasivo

– Aves con 2 a 4 semanas

– 10 plumas de tracto axilar

– Seleccionar plumas en crecimiento que llevan pulpa

– Colocar las muestras en tubos individuales

– 20- 50 aves por lote

Feather PCR: Procedimiento de toma de muestras

* Baigent SJ, Smith LP, Currie RJ, Nair VK : “Replication kinetics of Marek's disease vaccine virus in feathers and lymphoid tissues using PCR and virus isolation.” J Gen Virol. 86(11):2989-2998

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• Estudios Inmunológicos:– Intensidad de la respuesta inmune

– Efecto de una misma vacuna en distintas líneas genéticas

– Efecto de distintas vacunas en una misma línea genética

– Eficacia de distintos planes vacúnales

• Estudios epidemiológicos

• Estudios comparativos:– Incrementos en la dosis

– Revacunación

– Doble vacunación

Feather PCR:Ejemplos de aplicación práctica

19

Fort Dodge vaccine

0500 000

1 000 0001 500 0002 000 000

2 500 0003 000 000

3 500 0004 000 000

0 10 20 30 40 50

Mea

n M

DV

cop

y no

/mill

ion

cells

Broiler breed 1 Broiler breed 2

Layer breed 1 Layer breed 2

4 GENETICAS x 1 VACUNA

Feather PCR:Ejemplos de aplicación práctica

20

1 GENETICA PONEDORAS x 3 VACUNAs

Feather PCR:Ejemplos de aplicación práctica

0500.000

1.000.0001.500.0002.000.0002.500.0003.000.0003.500.0004.000.000

0 10 20 30 40 50Mea

n M

DV

cop

y no

/milli

on c

ells

Vacc 1 Vacc 2 Vacc 3

21

Diagnostico

• Diferenciar enfermedad vs Infección

• MDV causa varías síndromes

- No neoplásica (Síndrome linfodegenerativa - Inmunosupresión)

- Neoplásica

• Edad del ave

- clásico hasta las 18 sem, pero hay caso en ponedoras viejas

(>80sem)

• Histórico del lote y de la raza

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Enfermedad de Marek: Comentarios finales

• La incidencia de la enfermedad en pollos de engorde en general hadisminuido en muchos países (hay excepciones !)

• Brotes en ponedoras comerciales siguen siendo frecuentes

• La casuística de la forma clásica con formación tumoral ha sidorelativamente bien controlada por los planes de vacunación actuales:

– Movimientos de regreso al uso de dosis completa

– Tendencia de reducción en la dilución de las vacunas

– Equipos de vacunación SC más calibrados (SOP’s)

– Avanzo en la adopción de la tecnología IN-OVO

– Elección de cepas con bajo pasaje

• La presión por la selección de nuevos patotipos del MDV en campo esun riesgo siempre presente en la avicultura moderna

23

Retrovírus

� Leucosis Aviar

� Reticuloendoteliosis

24

Retroviroses

• Grande familia de virus cubiertos

• Dos copias de ssRNA

– 7 kb a 12kb

– Linear, no-segmentado

• 80 – 120 nm de diámetro

• Transcriptasa reversa

– De ssRNA para dsDNA

• Integración del dsDNA en el genoma celular “pro-vírus”

25

Classificacion de los Retrovírus

Retroviridae

Alpharetrovirus Leucosis Aviar

Exogenous

Endogenous

BetaretrovirusVirus Tumor Mamario

del ratón

GammaretrovirusReticuloendoteliosis

virus

Deltaretrovirus Virus Leucemia Bovinos

EpsilonretrovirusSarcoma de los peces

Walleye

Lentivirus HIV

SpumavirusVirus esponjoso del

Chimpance (foamy virus)

26

Leucosis Aviar

27

Clasificación

� Exógenos◦ Mayoría es competente para replicación ◦ Subgrupos

� Basado en la proteína del cubiertos y en la capacidad de reconocimiento del receptor celular

� A� B� C� D� J

� Endógenos◦ Secuencias virales integradas en el cromosoma de la mayoría de las

aves (gallinas)◦ Antes de la domesticación de la especie

� Subgrupo E

28

Clasificación

Sub-grupo Tipo Espécie Obs

A Exogenos Pollos Mas comunes en Leghorns

B Exogenos Pollos Segundo mas comun

C Exogenos Pollos Raro

D Exogenos Pollos Raro

E Endogenos Pollos Herencia Mendeliana

F Endogenos Faisões

G Endogenos Faisões

H Endogenos Perdiz

I Endogenos Codonices

J Exogenos Pollos Lineas pesadas

29

Impacto económico

• Mortalidad asociada con presencia de tumores

• Mortalidad en Machos con o sin tumores

• Aves adultas

– Diminución del tamaño de producción de huevos

• Pollitos

– Desuniformidad

– Mortalidad

– Inmunosupresión

30

Transmisión

• Vertical

– Genética

• Endógenos

• Cromosoma

– Congénita

• Exógenos

• Albumina

• Horizontal

– Contacto con animales infectados o secreciones

31

Patogénesis

• Tipo de virus

• Dosis

• Rota de infección

• Edad de exposición

• Forma de transmisión

• Infección doble

• Estado inmune de la ave

• Sexo de la ave

32

Patogénesis

� Leucosis linfoide (Células B)

� Eritroblastosis (eritrocitos inmaturos)

� Mieloblastosis (macrófagos inmaturos)

� Mielocitomatosis (macrófagos inmaturos)

� Nefroma (células renales inmaduras)� Tumores de tejido conjuntivo

� Fibrosarcomas y Mixosarcomas

� Tumores epiteliales

� Osteopetrosis

� Endoteliomas

33

Lesiones ALV - Linfóide

® G. Zavala

Hígado

Bursa

34

Lesiones – ALV-J

® G. Zavala

Riñon

Hígado

35

Diagnóstico

• Lesiones macroscópicas

• Histopatología

• Aislamiento viral– Plasma, suero, meconio, hisopos, tumores

• Fibroblastos de linajes susceptibles

• 7-9 días de incubación

• ELISA de captura

• Neutralización viral

• Detección de RNA/DNA

• Serología

36

Control

� Definición de los objetivos◦ Controlar, Reducir o Erradicar

� Valor económico◦ Elevado número de muestras, diversas etapas da crianza◦ Disminución del estoque genético

� Principal punto es romper el ciclo de transmisión congénita◦ Muestras siempre individuales◦ Eliminación de aves positivas◦ Mantener aves en grupos pequeños

� Evitar transmisión horizontal

37

Reticuloendoteliosis

38

REV - Clasificación

� Gamaretrovírus◦ Retrovirus simples

� Origen desconocida, mas probablemente adaptación de retrovirus endógenos de mamíferos

� Ausencia de formas endógenas

� Único serogrupo◦ Pequeña variación entre aislados

� Antígeno específico◦ p30

39

REV – Importancia económica

• Alta mortalidad – Tumores

• Retraso en crecimiento– Enanismo

• Problemas de emplume– Síndrome Nakanuke

• Barreras internacionales– Todas aves destinadas a exportación deben ser libres de

REV• Pruebas para producción de vacunas y lotes SPF

– Contaminación relacionada en algunas ocasiones

40

M

M

M

= Brote natural M = MDV+REV

20022006

1994

20022004

2006

2004

2006

M

J = ALV-J+REV

J

= Contaminación vacuna

M

REV - Epidemiologia

® Dr. Zavala

1980´s

41

Síndromes

1. Neoplasia reticular aguda

2. Enanismo

3. Síndrome neoplásico (tumores)

– Linfocitos B e T

42

1. Neoplasia reticular aguda

• Cepa T

– Aislada de pavos

• Histórico de linfomas

– Defectuosa

• Necesita de un virus auxiliar para replicar

– Induce alta mortalidad (>6 días)

• Probablemente o mas patogénicos de todos los retrovirus

– Aumento en hígado y riñón

LTR LTR

DNA Pro-viral de cepa defectiva (REV-T)

gag pol/env envv-rel

43

2. Enanismo

• Inducido por varias cepas de REV

• Cepas no defectuosas

• Disminución del crecimiento

• Problemas de emplume

• Puede causar linfomas en las aves sobrevivientes

• Inmunosupresión

• Proventriculitis

® Dr. Zavala® T.Barbosa

44

3. Síndrome neoplásico

• Inducido por varias cepas de REV

• Cepas no defectuosas

• Linfomas de células B – Bursa involucrada

– Linfomas en vísceras

• Linfomas de células T– Descrito en experimentos

– Normalmente por activación c-myc

• Virus de Marek serotipo 2 puede potencializar la formación de linfomas

Bazo- pollo

® Dr. Zavala

45

Lesiones Macroscopicas – Experimental

® T.Barbosa

Infectado

Normal

Codornices 17 semanas

46

Lesiones microscópicas

Bursa- Pavo

Rinon-APC

Pâncreas-

Codornices

® Dr. Zavala

47

Inmunosupresión

� REV causa:

◦ Disminución de blastogénesis linfocitaria

◦ Interferencia con el sistema inmune

� Desregulación de citokinas

◦ Disminución de la respuesta humoral

48

Genoma REV APC-566

Barbosa, et al. 2007

49

Secuencia del peptídeo de inmunosupresión

10 20

L Q N R R G L D L L T A E Q G G I C L A L Q E K C C F 1 apc-566.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-745-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-793.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-782-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-853-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-854-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-947-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-951-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-976.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-1006.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-1011.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 GPC-G99-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 PMX-16-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 PMX-19-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 REV 397 A.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 REV-A.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 SNV.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 AF246698 REV in Pox.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 REV China.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 MPMV.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 AKV-murine endogenous.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 MMCF.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 AMCF.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 FriendLV.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 Gross LV.pro. . . . . . . . . . F L Q E . . L . A . . K . E . . . 1 FeLV.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 MoLV.proA . . . . . . . . . F W . . . . L . K . I . . Q . . . 1 HTLV-II.proA . . . . . . . . . F W . . . . L . K . . . . Q . R . 1 HTLV-I.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L 1 CKS-17.pro

LTR gag pol env LTR

Barbosa, et al., 2007.

APC/GPC

Pollo /broiler

PAVOS

Pollos/Viruela

RetrovírusMamíferos

50

REV APC-566 Inmunosupresión

Vacunacion y desafio PM Respuesta vacuna inactivada

0

20

40

60

80

100

120

Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5

PM

REV+PM

REV+Vacina+PM

Vacina+PM

Anticuerpos (GMT)

ELISA NDV

HIIBD NDV REV

Sin Vac 5c 1b 1b 5c

REV 5c 1b 6034a 5c

REV+Vac 175b 112b 3949ª 54b

Vac 683a 867a 1b 149a

51

Diagnostico

• Similar a Leucosis• Lesiones macroscópicas

– Involucra a la bursa o no– Involucra dos nervios o no– Linfomas de células B o T

• Aislamiento viral e identificación– Fibroblastos– Cultivar mínimo por 7 días– IF, PCR, IHC

• RT-PCR o PCR de los tumores

® T.Barbosa

52

Control

• Muestrear los animales varias veces

• Infecciones en los primeros días

– Puede causar tolerancia

– Desarrollo de tumores

• Infecciones tardías

– Producción de anticuerpos

– Sin transmisión del virus

• Vacunar para Viruela

• Controlar insectos

53

Como saber cual enfermedad?

54

Diagnóstico diferencial

REV Leucosis

Enfermedad de Marek

55

Diagnóstico diferencial

REVLeucose Enfermedad de Marek

56

Diagnóstico diferencial

REV ALV-A ALV-C ALV-J

REV

ALV-A ALV-C

ALV-J

ALV-B ALV-C ALV-D

57

Diagnóstico diferencial

� Histórico

� Lesiones macroscópicas

�Ojos y niervos

� Histopatología

�Población heteróloga (MD, REV no bursal)

�Pobación homogénea (LL, REV bursal)

� Imunohistoquímica

� Técnicas Moleculares

�Mas seguras y definitivas

58

Muchas gracias !!!

taylor.barbosa@pfizer.com