Post on 09-Jun-2018
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Actualización en Inmunohematología
Fundación Hemocentro Buenos Aires
Noviembre 2011
El estudio de los antígenos y anticuerpos presentes en la sangre, tanto en condiciones normales como patológicas
Es el estudio de los marcadores antigénicos propios de los glóbulos rojos, plaquetas y leucocitos, como así también de las respuestas inmunológicas que estos provocan
Sólo los antígenos de los sistemas RH, KELL MNS y LW, son específicos de la línea eritroide
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
La aglutinación es la agregación, mediada por anticuerpos, de las partículas que expresan antígenos de superficie.
Tiene dos etapas
1. Sensibilización
2. Formación de puentes entre las células sensibilizadas.
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
La hemólisis es la destrucción de los glóbulos rojos, con liberación de la hemoglobina intracelular
La hemólisis no ocurre si los antígenos interactúan con los anticuerpos en sueros sin complemento o plasma con anticoagulante
La hemólisis constituye un resultado positivo
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Algunos antígenos de grupo sanguíneo están presentes en formas solubles en saliva, orina y plasma
Estas sustancias pueden utilizarse para inhibir la reactividad de los anticuerpos correspondientes
La inhibición también permite neutralizar anticuerpos que enmascaran la presencia de otros no neutralizables
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
El grado de ionización de las moléculas
Depende fundamentalmente del pH del medio
Constante de equilibrio (afinidad de los anticuerpos)
Deriva de las tasas relativas de asociación y disociación
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
La inhibición de la aglutinación por exceso de
anticuerpos es sumamente infrecuente
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
La centrifugación promueve el acercamiento físico de las células
La prueba antiglobulínica indirecta emplea suero antiglobulínico
Otros métodos actúan: reduciendo la carga negativa de las moléculas
superficiales
disminuyendo la capa de hidratación que rodea a las células
introduciendo macro moléculas con carga positiva que las agregan
Albúmina Humana
LISS (Low ionic saline solution)
PEG (Polietilenglicol)
POLYBRENE (BHDM)
Técnicas con enzimas proteolíticas
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Disminuye el potencial Z, favoreciendo la 2º fase de la aglutinación.
En concentraciones de 30% o >favorece la aparición de rouleaux
En la PCI no aumenta la sensibilidad de la prueba
Por falta de ventajas objetivas está en desuso
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ante estos polímeros los GR normales exhiben agregación espontánea, que puede dispersarse con sales neutras como el citrato de sodio
El BHDM es un polícatión de amonio cuaternario que neutraliza las cargas negativas de los GR.
Favorecen la aglutinación por Ig G
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
El Polybrene se añade a los GR incubados con anticuerpos a baja potencia iónica y bajo pH
Si se adiciona citrato de sodio, se restablece la carga del GR
Si el aglutinado se disocia prueba negativa
Si el aglutinado persiste prueba positiva (aglutinación irreversible a los GR
sensibilizados con Acs)
Tiene sensibilidad disminuida en la detección de anticuerpos del sistema Kell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
El PEG es un polímero lineal hidrosoluble que se usa como aditivo para incrementar la captación de anticuerpos
Su acción principal es eliminar el agua intercelular favoreciendo el acercamiento de los GR
No debe centrifugarse el PEG con el suero y GR
Se lavan las células con solución salina y luego se efectúa la prueba antiglobulínica
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
El reactivo AGH de elección en las pruebas con PEG suele ser el anti-IgG
evita las reacciones falsas positivas con algunos agentes poliespecíficos
Precipitados podrían interpretarse como reacciones positivas
Potenciador de elección para la absorción de Ac calientes
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Potencia mucho la captación eritrocitaria de anticuerpos en la fase I de la aglutinación
La cantidad de iones +/- del LISS (0,03 M) es menor al de la SF (0.17M)
En la actualidad la mayoría de los profesionales usa diluyentes o aditivos LISS
Contiene macromoléculas además de sales iónicas y amortiguadores
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Puede aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ags y Acs
El aumento del volumen de suero acrecienta la potencia iónica del sistema LISS – aditivo
Se deben respetar estrictamente las instrucciones del fabricante
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas:
Aumenta la sensibilidad de la PCI para detectar Acs clínicamente significativos
Detecta Acs en baja concentración y los de baja afinidad que pueden perderse con los lavados
Reduce el tiempo de incubación
Desventajas:
Debe ser sometido a estricto control de osmolaridad para evitar la fijación inespecífica de C
Los GR suspendidos el LISS deben ser procesados dentro de las 24 hs
Menor sensibilidad para anti-K. (1º fase de aglutinación)
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Bromelina, ficina, papaína y tripsina (Las más usadas)
Desnaturalizan ciertos antígenos eritrocitarios, en especial M, N, S, Fya y Fyb, XG
Disminuyen la carga superficial de los GR por clivaje de las moléculas de ácido siálico de las cadenas polisacáridas
El tratamiento enzimático lleva a la formación de espículas en los GR y aumenta así el número potencial de puntos de contacto
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Adherencia eritrocitaria en fase sólida (Microplacas)
Aglutinación en columna, pruebas en gel y separación por afinidad
Qimioluminiscencia
Pruebas Inmunoabsorbentes ligadas a las enzimas (ELISA)
Inmunofluorescencia
Inmovilización de Antígenos Eritrocitarios con Anticuerpos Monoclonales Específicos (IAEAM)
Radioinmunoensayo
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Las reacciones se producen en microcolumnas que contienen mezclas de cuentas de vidrio o gel, amortiguadores y a veces reactivos
Se establecen barreras de densidad permiten separar el suero problema de los eritrocitos
Una de sus ventajas es que se evita el lavado con solución salina
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
F
e
n
o
t
i
p
i
f
i
c
a
c
i
ó
n
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Existen métodos manuales, semiautomatizados y automatizados
Utilizan antígenos o anticuerpos inmovilizados
En la prueba indirecta si las células indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reacción es positiva
Si sedimentan no se produjo reacción Ag-Ac
Ditiotreitol (DTT)
2-Mercaptoetanol (2-ME)
2-Aminoetilisotiouronio (AET)
Mecanismo de acción Clivan los puentes disulfuro que unen las
subunidades monoméricas de los pentámeros de IgM (19S en 7S)
Los puentes intercatenarios de las IgG monoméricas son bastante resistentes al clivaje
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Determinación de la clase de inmunoglobulina de los Acs
Identificación de las especificidades en mezclas de Acs, IgM e IgG (desenmascarar)
Determinación del monto relativo de IgG e IgM en una especificidad dada
Disociación de aglutinatos eritrocitarios por IgM (crioglobulinas)
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Destrucción de antígenos eritrocitarios seleccionados para investigación de Acs (Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)
Combinación con enzimas proteolíticas, para disociar los Acs IgG de GR (ZZAP) DTT + Papaína activada con cisteína
La cisteína forma puentes disulfuro que contribuyen al plegamiento de las proteínas
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Principios
El tratamiento de los Acs IgM, anula las actividades aglutinante y fijadora de complemento
La visualización de la actividad de los Acs antes y después del tratamiento con sulfhidrilos es útil para determinar la clase de inmunoglobulina
El tratamiento con sulfhidrilos también se emplea para abolir la actividad de los anticuerpos IgM y permitir la detección de IgG coexistentes
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Preparación Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3
Conservación 2 a 6 ºC
Los reactivos sulfhidrilos en baja concentración debilitarían los Ag del sistema Kell
Pudiera observarse gelificación de la muestra Causas Preparación incorrecta del DTT o concentración superior a
0,01 M. Incubación de suero y DTT prolongada
Las muestras gelificadas no pueden estudiarse
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Para los procedimientos de adsorción no existe un procedimiento único ideal
Para incrementar la captación de anticuerpos puede aumentarse la proporción de antígenos utilizando un volumen celular mayor
La temperatura de incubación debe ser la de reactividad óptima de los anticuerpos
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Las pruebas de adsorción requieren un volumen importante de GR
Los eritrocitos testigos de los paneles comerciales resultan insuficientes
las fuentes mas convenientes pueden ser unidades donadas o muestras de sangre del personal de los fenotipos deseados
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Las técnicas de elución liberan las moléculas de Acs de los GR sensibilizados
Los Acs fijados pueden liberarse:
por modificación de la termodinámica de las reacciones Ag-Ac
neutralización o reversión de las fuerzas de atracción que mantienen unidos a los complejos
alteración de la concordancia estructural entre los Ag y los puntos de fijación en las moléculas de Acs
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Las técnicas de elución pueden servir para:
Investigar una PAD positiva
Concentrar y purificar Acs, detectar Ag de expresión débil e identificar especificidades múltiples (junto a adsorción)
Preparar GR sin Acs para fenotipificación o estudios de adsorción autólogos.
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Si el eluato reacciona con todas las células
Alta probabilidad de que se deba a autoanticuerpos
Si el paciente no fue transfundido en fecha reciente y no existen Acs séricos inesperados no se requieren estudios serológicos adicionales
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Calor (56ºC) Calor suave (45ºC) Congelación-descongelación Frío-ácido Digitonina-ácido Diclorometano (DCM) Glicina-HCl / EDTA CLOROFORMO XILENO ETER
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO
Rápido y fácil
Desventajas
Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO
Rápido y fácil
Requiere un volumen celular reducido
Desventajas
Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Rápido y fácil
Sensibilidad comparable a digitonina-ácido
Desventajas
Menos sensible para auto y aloanticuerpos reactivos en caliente
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Adecuado para anti-K
No inflamable
Desventajas
Tóxico
Recuperación escasa de anti-Fyb
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Método de acción rápida
Líquido no inflamable
Recuperación de la mayoría de los anticuerpos significativos
Desventajas
Sustancia reconocida como carcinogénica
Altamente tóxico
Efecto narcótico inhalatorio
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Buena recuperación de la mayoría de los Acs significativos
Desventajas
Carcinogénico
Tóxico
Narcótico
Provoca hemólisis
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Excelente recuperación de la mayoría de los Acs de grupo sanguíneos
Desventajas
Narcótico
Tóxico
Explosivo
Muy inflamable
Poca recuperación de anti-S-s
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
No peligroso
Recuperación adecuada de la mayoría de los Acs significativos
Kit comercial
Desventajas
El lavado del estroma es lento
Baja sensibilidad sistema Kidd
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Ventajas
Apropiado para preparar eluatos y obtener células PAD negativas
No destruye las células tratadas
Sensibilidad comparable a digitonina-ácido
Desventajas
Desnaturaliza los Ag del sistema Kell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Los GR con PAD positiva no pueden tipificarse con reactivos que requieran una técnica de AGH
En condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de la membrana de los GR sin afectar su integridad.
Esto permite la fenotipificación completa de los GR recubiertos con autoanticuerpos reactivos en caliente
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Solución de difosfato de cloroquina preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF
Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N
Conservación 2 a 6º C
Se necesitan GR de control portadores de una dosis simple de los antígenos a fenotipificar
Se utiliza reactivo anti-IgG monoespecífico
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
No disocia el complemento de la membrana celular
Incubación no > de 2 hs. causa hemólisis y/o pérdida de reactividad antigénica
Los Ag del sistema Rh podrían experimentar cierta desnaturalización.
Pudieran no eliminarse por completo los Acs de los GR sensibilizados
sólo atenuar la intensidad de la PAD
La cloroquina atenúa la expresión de Ag HLA de Clase I eritrocitarios
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Principios
Es un método semicuantitativo que se emplea para determinar la concentración de Acs en muestras de suero o comparar la intensidad de la expresión antigénica en distintas muestras de GR
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Aplicaciones Estimar actividad de Acs en embarazadas
alosensibilizadas Definir la especificidad relativa de los
autoanticuerpos Caracterizar Acs de título alto baja avidez (TABA)
Ejemplo Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH
Observar el efecto de los reactivos sulfhidrilo sobre el comportamiento de los Acs (IgG o IgM)
Monitoreo de IgG en embarazadas
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Interpretación
Observar la mayor dilución que produce aglutinación 1+
El título es la inversa de la dilución
Si se advierte aglutinación en el tubo que contiene el suero mas diluido no se alcanzó el punto final
En los estudios comparativos la diferencia significativa en los títulos es de 3 diluciones
Los títulos solos sin la evaluación adicional de la intensidad de la aglutinación pueden ser engañosos
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Por ser un método semicuantitavo la variabilidad técnica puede desviar los resultados
Score de Mars
Asignar un valor numérico a la intensidad de la aglutinación
4 + = 12
3 + = 10
2 + = 8
1 + = 5
La suma correspondiente a todos los tubos representa el score
El umbral significativo arbitrario para comparar los puntajes es de 10 ó más
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Claves Técnicas Calidad de las pipetas y su utilización
Respetar tiempo y temperatura de incubación
Duración y potencia de centrifugación
La antigüedad, el fenotipo y la concentración de las células influyen en los resultados
Es casi imposible lograr resultados reproducibles en su totalidad Las comparaciones son válidas con análisis
simultáneos
Se disminuye la variabilidad con la utilización de mayores volúmenes
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Nomenclatura
SISTEMA GENES ANTIGENOS FENOTIPOS
MNS M N S s M N S s M+ N+ S-s+
Duffy FYa FYb Fy a y Fy b Fy (a+b-)Fy (a+b+)Fy (a-b+)Fy (a-b-)
Kell K k Kpa Jsa K k Kpa Jsa K+k+ Kp(a+b-) Js (a+b-)
Kidd Jka Jkb Jka Jkb Jk (a+b+)
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Referentes históricos:
Issit, Daniels, Garratty, Pineda
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Hibridomas
La fusión de células plasmáticas normales, productoras de anticuerpos, con células plasmáticas neoplásicas permite obtener líneas celulares con capacidad reproductiva infinita.
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Una célula B estimulada da origen a una progenie clonal que produce Acs específicos para un epítopo
El sobrenadante del cultivo de un clon de células B contiene Acs de especificidad única
Los eventos posteriores a la activación pueden inducir diferencias en el isotipo de las cadenas pesadas
la especificidad idiotípica codificada en las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas no se modifica
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Siempre comenzar por verificar la existencia de antecedentes transfusionales recientes
Puede tratarse de:
Autoanticuerpos reactivos en frío
Autoanticuerpos reactivos en caliente
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Macroscópica
BI
Haptoglobina
LDH
Hemoglobina libre en plasma y orina
Si no hay clínica ni laboratorio de hemólisis no se justifican estudios adicionales
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
La reactividad de la mayoría de los autoanticuerpos reactivos en caliente aumenta con el uso de PEG y enzimas
Es conveniente realizar la DAI sin los medios potenciadores habituales
Si los resultados son negativos puede emplearse el mismo procedimiento para la prueba de compatibilidad sin necesidad de adsorciones
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Si el autocontrol es positivo en la fase AGH, podría haber células recubiertas con Acs que determinan una PAD positiva con campo mixto
La elución podría ser útil en especial cuando las pruebas séricas no son concluyentes
En el paciente con PAD positiva transfundido en fecha reciente o no, podría ser difícil obtener el fenotipo exacto de los GR Muchos reactivos monoclonales pueden proporcionar
resultados válidos a pesar de la PAD positiva
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
En nuestro país, además de los laboratorios de investigación y los que realizan pruebas de compatibilidad para transplantes de médula ósea y órganos sólidos, los bancos de sangre están realizando en forma rutinaria pruebas de biología molecular con amplificación de ácidos nucleicos
01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
46
57 21 34 6
21
7
7
9
9
15 9
4
12p12.3
6p21.3
A, B, AB, A1
6
3
Sistemas antigénicos eritrocitarios
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell
Thermophilus aquaticus, es una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente Vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 °C, debido a que su cóctel enzimático resiste tales condiciones Normalmente, a esas temperaturas, las proteínas constitutivas de la mayoría de los seres vivos se desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales
En la PCR se separan las cadenas de la doble hélice del ADN mediante desnaturalización térmica
Taq DNA Polimerasa
Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de
la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra
Un fluorocromo, es un componente de una molécula que hace que ésta sea fluorescente Un grupo funcional de la molécula absorberá energía
de una longitud de onda específica y la volverá a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda
La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias
Se requieren oligonucleótidos alelo esoecíficos complementarios a la secuencia a analizar
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
Gracias por vuestra amable atención
01/11/2011 Dr. Silvio Rosell
medicinatransfusional@hotmail.com