Aislamiento de ADN

Paula BautistaBacterióloga

Métodos de aislamiento de ADN

El aislamiento o extracción de ADN es el punto crucial en Biología Molecular.

Es el primer paso para realizar cualquier técnica de biología molecular.

Extracción y Purificación Extracción: sacar los componentes

desde un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los

restos celulares (debris).

Purificación: Separación de AN: De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos

El problema

Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de AN es necesario disponer de éstos en estado puro.

Por qué purificar?• Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los

ácidos nucléicos.• Interferentes que inhiben los procedimientos posteriores.

•El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN•Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

Muestra

Lisis celular

Separación y purificación

Precipitación

Calidad Cualitativo:electroforesis

Cuantitativo:

espectrofotometría UV

Etapas básicas para Extracción y Purificación de AN

Lugar de trabajo y

material estéril,

Además de guantes

1. Métodos de lisis celular

El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).

• Métodos Físicos (Baño María, Congelación- Descongelación Sonicación…)• Métodos Químicos (Detergentes)• Métodos Enzimáticos (Proteinasa K)

2. Separación y Purificación

Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez mas limpio.

• Desproteinización con fenol, que al denaturar proteínas causa su precipitación.

• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)

• Cromatografía De adsorción a sílica De filtración

*** Lavados***

3. Precipitación

Permite la obtención del ácido nucleíco listo para ser almacenado o diluido a la concentración deseada para su utilización.

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados

Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido

Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado)

Contaminantes e interferentes en el material biológico

En el pasado, el proceso de extracción y purificación de ácidos nucleícos solía ser complicado, laborioso y limitado en términos de rendimiento.

Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser usados para extraer biomoléculas puras.

QIAGEN

Es un técnica rápida y fácil para obtener ADN. El ADN puede ser obtenido a partir de sangre,

plasma, suero, capa de blancos, tejido, células bucales, otros fluidos biológicos, cultivos celulares.

QIAGEN

El buffer de lisis es ajustado para permitir fijar el ADN a la membrana. El ADN es absorbido por la membrana de sílica gel durante la centrifugación.

Las condiciones de pH en el lisado aseguran que las proteínas y otros contaminantes que puedan inhibir la PCR y otras reacciones enzimáticas, no sean retenidas en la membrana.

Adsorción de DNA a sílica

Las muestras pueden estar en citrato, heparina o EDTA. No es necesaria una previa separación de leucocitos.

El procedimiento de purificación se realiza usando las columnas y esto disminuye el grado de contaminación.

Permite obtener un ADN libre de proteínas, nucleasas y otros contaminantes o inhibidores.

Se obtiene buena concentración de ADN Las muestras pueden ser frescas o

congeladas.

VENTAJAS

Procedimiento

Verificación Calidad ADN

Electroforesis en Gel de Agarosa

Gracias