Antequera, 12 abril 2019

TOXOFREE

CAPRITEC

PATÓGENOS ZOONÓSICOS EN LA CADENA ALIMENTARIA DEL CERDO IBÉRICO: TOXOFREE

R.J.Astorga

‘CódigodeHammurabi’sigloXVIIIaC

‘El cerdo es también impuro porque,aunque tiene la pezuña hendida, no rumia.No podrás comer su carne ni tocar sucadáver’

QuintolibrodeMoisés‘Deuteronomio’,14:8

Descripcióndeenfermedadesanimales‘Transmisiónalhombre’

CulturaEgipcia

‘PapirodeKahun’sigloXXaC

Trichinella Spiralis(Inspección microscópica carne)

Trichinella Spiralis(Inspección microscópica carne)

ÍNDICE

q INTRODUCCIÓN. ACTUALIZACIÓN

q MODELO TRANSFERENCIA GRUPO AGR-256 (UCO)

q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN

q PROYECTO TOXOFREE

Commission Regulation (EU) 2017/1495

Origen alimentario en brotes causados por Salmonella en 2017 (EFSA, 2018)

Pescados curados y ahumadosCarne de cerdo (no salchichas)Quesos blandos (leche cruda)

< 5 ºC

Toxinas bacterianas Norovirus Salmonella

ÍNDICE

q INTRODUCCIÓN

q MODELO INVESTIGACIÓN GRUPO AGR-256 (UCO)

q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN

q PROYECTO TOXOFREE

Grupo investigación AGR-256

ÍNDICE

q INTRODUCCIÓN

q MODELO TRANSFERENCIA GRUPO AGR-256 (UCO)

q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN

q PROYECTO TOXOFREE

ESTUDIO DE EVALUACIÓN Y MEJORA DE LA SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA EN EL CERDO IBÉRICO

IDI-20090414

SANIBERICO 08/222

SANIBÉRICO

0

5

10

15

20

25

ENERO

FEBRERO

MARZO

ABRIL

MAYO

JUNIO JU

LIO

AGOSTO

SEPTIEMBRE

OCTUBRE

NOVIEMBRE

DICIEM

BRE

NUM

ERO

DE A

NIM

ALES

(*10

00)

SACRIFICIOS MENSUALES EN MATADERO IBERICO

Campaña montanera: diciembre-marzo

Determinar la prevalencia de Salmonella spp. ˂ Cadena de sacrificio del cerdo Ibérico ˃

SANIBÉRICO

SANIBÉRICO

• Cultivo microbiológico

(ISO 6579:2002/Amd 1:2007, Annex D)

§ Serotipificación (Biorad)

§ Fagotipia (Colindale, UK)

§ Ensayos in vitro

(CLSI) documents M100-S15/2005 y M31-A3/2008

§ Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE)

§ Las mayores tasas de prevalencia se observan en los meses de mayor intensificación de

sacrificios (enero, febrero, marzo).

§ Los puntos de mayor contaminación de Salmonella spp. en el matadero son: camiones

(23,21%), corrales (14,06%) y ciego (21,25%), tonsilas (17,50%), nódulos linfáticos

ileocólicos (16,25%).

§ El escaldado es un factor de protección frente a la contaminación por Salmonella spp.

(36,25% vs 8,75%) (Odds Ratio/IC95, y estimación χ2, Winepi).

§ La detección de genotipos idénticos de Salmonella spp. a través de la cadena, demuestra

contaminación cruzada, lo que supone un riesgo de contaminación de la carne en los

ambientes pre- y post-sacrificio.

SANIBÉRICO

Rissen (TCM2)

PFP4 (16 strains); PFP5 (1); PFP6 (1); PFP7 (1)

ZOONOSIS ALIMENTARIAS EN EL CERDO IBÉRICO: PREVALENCIA Y CONTROL PARA OBTENCIÓN DE ALIMENTOS SEGUROS

SAFEPORK

SAFEPORK

§ (2013) Prevalencias inferiores

§ Intensificación protocolos (ej. Hidroalcohólicos)

Materiales faenado y despiece; superficies trabajo

Serotipos Salmonella(97 cepas)

mST (21)

Anatum (20)

Typhimurium (17)

Hessarek (15)

Derby (8)

Newport (7)

Kentucky (3)

Bredeney (1)

Infantis (1)

Rissen (1)

Veneziana (1)

Rubislaw (1)

Heidelberg (1)

AB

AB

A

B

AB

AB

FagotiposmST (21)U302 (7)193 (6) 104l (2) 138 (2) 104b (1) 120 (1) U311 (1)

Typhimurium (17)193 (11)104b (2)104l (2)U302 (1)U311 (1)

SAFEPORK

SAFEPORK

AB

AB

AB

AB

Campylobacter spp.(104 cepas)

C. coli (71)

C. jejuni (2)

Campylobacter spp. (31)

SAFEPORK

AB

AB

AB

AB

AB

Listeria monocytogenes

(68 cepas)

4b (40)

1/2a* (28)

SAFEPORK

SAFEPORK

SAFEPORK

§ Determinación de la viabilidad de patógenos zoonósicos alimentarios frente a lascondiciones de curación empleadas en los productos del cerdo Ibérico.

SAFEPORK

§ Valores de pH y aw descendieron.

§ S. Typhimurium (p 0,03) and C. coli (p 0,03) reducción significativa (3,28 y 2,14 log).

§ L. innocua reducción escasa (0,84 log unit).

§ Concentración inicial de bacteria, progresiva reducción de pH y actividad agua.

Es preciso un análisis periódico en los diferentes puntos o fases del proceso decuración de lomos para asegurar la eliminación de patógenos alimentarios en lacadena.

SISTEMA DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE Clostridium difficileCON IMPLICACIONES EN SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD

ALIMENTARIA

ESTUDIO DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE EN EL CERDO IBÉRICO

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

OBJETIVO

Seguimiento de C. difficile y C. perfringens en la

cadena alimentaria del cerdo Ibérico

ESTRATEGIAS DE DIAGNÓSTICOCultivo microbiológico

(Blanco et al., 2013)

PCR - Ribotipificación // PCR multiplex

(Dr. Kuijper, Universidad de Leiden, Holanda)

(PHLS Anaerobic Reference Unit) (Dr. Wilcox, University of Leeds, UK)

AFLP (genotipado CD y CP)

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

DISEÑO MUESTREO:• Marzo, 2016• Muestreos aleatorios (2)• 10 animales /muestreo• Transportes; Corrales; Matadero (TCM)

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

RESULTADOS:

Prevalencias globales: CD (14,4%) y CP (12,6%)

Distribución de muestras positivas:CD: camiones (80%) y corrales (37,5%)

CP: ciego (85%) y recto (45%)

En muestras ambientales de la línea de sacrifico sólo se

detectó CD (7,1%) PCR-RT

078 (34)

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

AFLP

95 GENOT.

El aislamiento de idénticos genotipos de CD/CP a partir

de muestras de origen animal y/o ambientales supone

un gran riesgo de contaminación en la cadena de

sacrificio del cerdo Ibérico.

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

Actividad investigadora

CAPRITEC (Ref IDI: 12013126)Optimización de la sanidad, producción y productos de la leche de

cabra en Andalucía

27/03/2013 a 27/12/2014

ÍNDICE

q INTRODUCCIÓN

q MODELO TRANSFERENCIA GRUPO AGR-256 (UCO)

q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN

q PROYECTO TOXOFREE

TOXOPLASMOSIS: CLASIFICACIÓN, HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS Y VIABILIDAD DEL PARÁSITO TRAS EL PROCESADO

IDI-20090414

TOXOFREE

TOX-SUFRI

TOXOFREE

TOXOFREE

https://amazingbooks.es/guia-zoonosis-animales-compañia

(12-18 meses)

TOXOFREE

(15%)

(7%)

1. Cantidad de animales testados

2. Uso de diferentes técnicas directas e indirectas, no validadas

3. Factor edad desconocido

4. No información sobre el tipo de reproducción

5. No relación entre presencia de Ac e Infección (caballos, bovinos)

6. Métodos serológicos para detección de infección en granjas y no en animales

(aves, cerdos y pequeños rumiantes)

SISTEMA DE VIGILANCIA DE TOXOPLASMA- LIMITACIONES -

SEROPREVALENCIA (UAB + CRESA):

Domésticas (gatos, perros, cerdos, caballos, rumiantes)

Silvestres (cérvidos, felinos salvajes, jabalíes, aves silvestres)

+ DELFINES MEDITERRÁNEOS

SEROPREVALENCIA EN GATOS (DOMÉSTICOS/SILVESTRES)

45% (n=220) - Barcelona

32% (n=585) - Madrid y la Rioja

SEROPREVALENCIA EN MUJERES EMBARAZADAS

18,8% (n=2.929) - Salamanca

28,6 (n=16.362) - Barcelona

E. Creus. Producción Animal. Nº 272. Mayo-Junio 2012.

TOXOFREE

ESTUDIO DE SEROPREVALENCIA:

100 granjas (2970 animales)

1400 cerdas / 1570 engorde o cebo

Técnica MAT (> 1:25 POSITIVO)

RESULTADOS:

Prevalencia global = 85%

Prevalencia individual = 16,6%

Prevalencia Intragranja = 17,6%

FACTORES DE RIESGO:

1. Edad

2. Cerdas vs cebo (24,2% vs 9,7%)

3. Ausencia programas control roedores

4. Presencia de gatos

5. GESTIÓN DE CADÁVERES

(Hill et al. 2010. Zoonoses and Public Health. 57: 53-59)

García-Bocanegra I, Simon-Grifé M, Dubey JP, Casal J, Martín GE, Cabezón O, Perea A, Almería S.

(CReSA, IRTA-UAB)

TOXOFREE

ESTUDIO DE SEROPREVALENCIA:

Técnica MAT (cut off > 1:25)

DOMÉSTICOS:

Ovejas (41,2%, n=194)

Bovinos (18,6%, n=199)

Cabras (5,6%, n=89)

(FR) Gatos, Alimentación

SILVESTRES:

Ciervo (10,5%, n=1063)

Muflón (5,6%, n=216)

Cabra hispánica (5,6%, n=90)

JABALÍES (18,6%, n=666)

(FR) Especie, edad, estación de caza

Amplia diseminación y exposición a Toxoplasma gondii entre ungulados domésticos ysilvestres en el sur de España, con diferencias significativas entre especies quecomparten el mismo ecosistema.

Almería S, Cabezón O, Paniagua J, Cano-Terriza D, Jiménez-Ruiz S, Arenas-Montes A, Dubey JP, García-Bocanegra I.

OBJETIVO 1

§ Establecer un sistema de clasificación de

las explotaciones de porcino en función

de la seroprevalencia mostrada frente a

Toxoplasma gondii.

ESTRATEGIA DE DIAGNÓSTICOELISA

Priocheck® Toxoplasma AB Porcine (Prionics)

TOXOFREE

TOXOFREE

2013 2013

OBJETIVO 1

§ Establecer un sistema de clasificación de

las explotaciones de porcino en función

de la seroprevalencia mostrada frente a

Toxoplasma gondii.

ESTRATEGIA DE DIAGNÓSTICOELISA

Priocheck® Toxoplasma AB Porcine (Prionics)

TOXOFREE

OBJETIVO 2

§ Determinar la influencia de distintas dosisinfectantes de T. gondii mediante unmodelo de ensayo experimental.

ENSAYO EXPERIMENTAL ‘MODELO PORCINO’

ELISA (IDVet Toxoplasma)

qPCR; Histopatología; Inmunohistoquímica

Bioensayos felinos/murinos

TOXOFREE

6 Dosis alta(1x107 TQZ)

4 Dosis baja(1x103 TQZ)

2 Grupo control

TOXOFREE

PROTOCOLO NECROPSIAS§ Total animales = 12

6 dosis altas / 4 dosis bajas / 2 controles§ Día 30º: sedación, extracción sanguínea (3ª), necropsia reglada

§ Material (tipo de muestras): Específicas (E) / Opcionales (O) / Pool Carne (C)

• Toxoplasma gondii presenta diferente

tropismo tisular según dosis

infectante.

• En muestras de corazón, lengua y

masetero los resultados son similares

con independencia de la dosis

infectiva.

• La detección de T. gondii (DNA) fue

más frecuente en muestras de pool de

carne (jamón, paleta, lomo), a partir

de animales infectados con dosis altas.

Toxoplasma gondii continues being one of themain food safety hazards for pregnant womenand immunocompromised patients.

In this sense, the distribution of thisprotozoan within the organism and the roleof the infective dose in tissue distribution areof highly interest to understand the riskassociated to the parasite and to decipher thepathobiology of this infection.

INTRODUCTION

Cañete-Buenestado M.1,AstorgaR.J.2,Cardoso-Toset F.1,2,Rodríguez-GómezI.M.3,Martínez-MorenoÁ.2,CarrascoL.3,Gómez-LagunaJ.1,3

1 CICAP,FoodResearch,Pozoblanco,Córdoba;2AnimalHealthDepartmentand³AnatomyandComparativePathologyDepartment,UniversityofCórdoba.InternationalExcellenceAgrifood Campus‘CeiA3’

UniversityCampusofRabanales,14071Córdoba,Spain

DistributionofToxoplasmagondii inpigswithahighandalowdoseofinfection

7th - 10th June 2016 Dublin, Ireland

CONCLUSIONSOur results highlight that despite the fact that T. gondii might present different tissue tropism according to theinfective dose, target skeletal muscles are similarly affected independently of the infective dose.

Interestingly, T. gondii DNA was more frequently detected from meat pool (shoulder, loin and ham) samples of HDinfected animals, which highlights a higher risk of contamination of these pieces at higher doses of infection.Therefore, different organs should be analysed to clarify the pathogenesis of this infection.

ACKNOWLEDGEMENTSThis study was financially supported by Centre for the Development of Industrial Technology (CDTi) of Spain, project reference IDI-20120176. FCT is funded by theInternational Campus of Excellence Programme, from the Ministry of Education, Culture and Sport and by Santander Universities Global Division.

MATERIAL&METHODS

11

HighDose(HD)IMinoculatedwith1x107 tachyzoitesStrainBCRReferenceTgH 00001(PRU)

5

4

2

LowDose(LD)IMinoculatedwith1x103 tachyzoitesStrainBCRReferenceTgH 00001(PRU)

ControlgroupNoninoculated

qPCR (TOX4/TOX5) (target: 529-bp repeat element)

Fw: 5’-CACAGAAGGGACAGAAGT-3’Rv: 5’-TCGCCTTCATCTACAGTC-3’

(Gutiérrezetal.,2010)

Euthanasia and post-mortem examination at 30dpi.Samples:brain, heart, tongue, lung, liver, spleen, kidney, mesentericlymph node, masseter muscle and a pool of shoulder, loinand ham (meat pool)

Bloodsamples-7,0,15,30dpi(IDScreenToxoplasmosis,IDVet)

Table 1 HighDose Low Dose ControlBrain 4/5(80%) 1/4(25%) 0/0(0%)Heart 5/5(100%) 3/4(75%) 0/0(0%)Tongue 2/5(40%) 2/4(50%) 0/0(0%)Masseter muscle 4/5(80%) 4/4(100%) 0/0(0%)Lung 2/5(40%) 3/4(75%) 0/0(0%)Liver 2/5(40%) 3/3(100%) 0/0(0%)Spleen 2/5(40%) 3/4(75%) 0/0(0%)Mesenteric LN 5/5(100%) 3/4(75%) 0/0(0%)Meat pool 4/5(80%) 0/4(0%) 0/0(0%)Kidney 5/5(100%) 3/4(75%) 0/0(0%)

RESULTSNo changes were detected in sera from control and LD animalsthroughout the study, but HD animals presented between 3.8 and16.1 fold increase in the OD (ID Screen ToxopIasmosis, IDvet).No gross lesions were detected in control or infected animals alongthe study. T. gondii DNA was not detected in control animals. T.gondii DNA detection in HD and LD animals is showed in Table 1.

§ Muestras (necropsia): pool carne (jamón-paleta-lomo), cerebro,

corazón, lengua, masetero, pulmón, hígado, riñón, bazo y nódulo

linfático mesentérico.

§ Técnicas diagnósticas: rtPCR, histopatología e inmunohistoquímica

(Ac. Policlonal, SerotecR).

§ Bioensayo en felinos: pool de carne.

§ Bioensayo murino: pool órganos diana (cerebro, lengua, corazón).

o La qPCR mostró diferencias significativas entre diferentes

dosis (ej. cerebro y carne); mayor sensibilidad en muestras

de corazón, masetero, nódulo linfático mesentérico y

riñón.

o El examen histopatológico no detectó presencia parasitaria;

la inmunohistoquímica resultó positiva de forma variable

en algunas muestras de animales (dosis altas).

o Los bioensayos felinos y murinos sólo detectaron presencia

parasitaria en el grupo 1 (dosis altas).

TEJIDO ESTUDIADO Y DOSIS INFECTIVA DIAGNÓSTICO TOXOPLASMOSIS TEMPRANA EN PORCINOS IBÉRICOS

TOXOFREE

TOXOFREE Toxoplasmosis: clasificación, herramientas diagnósticas y viabilidad del parásito tras el procesado

TOXOFREE: INFORME FINAL

OBJETIVO 3

§ Determinar la supervivencia y capacidad

infectiva de T. gondii en piezas cárnicas

de origen porcino y en las distintas fases de

su proceso de curación.

ESTRATEGIA DE DIAGNÓSTICO

DIEFRENTES PCRs

§ CARNE FRESCA (+) // CONGELACIÓN (96 h.) (-)

Jamones / Paletas / Lomos

§ EMBUTIDOS (+) (60 días)

§ PALETAS Y JAMONES

Fase intermedia (3-4 meses) / Fase final (18-19 meses)

Loncheado (tras congelación 48 h)

Fases intermedias (3-4 m) / (18-19 meses)

Fase final (24 meses)

Loncheado (tras congelación 48 h)

Pool carne distintas zonas

• BIOENSAYO EN RATONES (cerebro) / PCR

TOXOFREE: INFORME FINAL

TOXOFREE: INFORME FINAL

Bayarri et al. (2010) FAVE Zaragoza. Ensayo infección natural - Cerdos infectados (+IFA)

Muestras de tejido y carne con bradizoitosBioensayo en ratones (IFA, histopatología y PCR)

No se detectaron formas viables en el producto curado (7-14 meses)

TOXOFREE: INFORME FINAL

Genchi et al. (2017) Italia – Prosciuto di ParmaEnsayo de viabilidad de quistes tidulares de Toxoplasma gondii

Seroconversión 21 días PIPCR + (sacrificio / piezas cárnicas curadas 12, 14 y 16 meses)Bioensayos en ratones inoculados negativos (+ paletas frescas)

TOXOFREE: INFORME FINAL

Protocolo de digestión

TOXOFREE: INFORME FINAL

BIOENSAYO EN RATONES (cerebro) // PCR

qPCR, TOXOGONDII-VK(VACUNEK)

qPCR IN-HOUSETOX4-TOX5

3. Determinación supervivencia y capacidad infec5va de T. gondii en piezas cárnicas origen porcino y dis5ntas fases proceso curación

Tabla 1. Procesado de piezas cárnicas objeto de estudio para PCR.(PI, punto intermedio; PF, punto final; AD, alta dosis; BD, baja dosis; C, controles)

TOXOFREE: INFORME FINAL

TOXOFREE: INFORME FINAL

3. Determinación supervivencia y capacidad infectiva de T. gondii en piezas cárnicas origen porcino y distintas fases proceso curación

§ qPCR (Toxogondii VK, Vacunek®) à TODOS resultados negativos

§ PCR in-house (TOX4/TOX5) à Resultados positivos evidentes (71,4%)

TOXOFREE Toxoplasmosis: clasificación, herramientas diagnósticas y viabilidad del parásito tras el procesado

TOXOFREE

¿?

TOXOFREE: INFORME FINAL

q El consumo de jamón como alimento cardiosaludable no debe desecharse

durante el embarazo cuando no existen estudios concluyentes que establezcan

que su ingesta aumenta las posibilidades de contagiarse por toxoplasmosis.

q A partir de los 18 meses de curación, y cuando se superan los

controles de calidad que así lo certifiquen, sí se puede comer

jamón durante el embarazo, por tanto, el jamón con

denominación de origen con 24 meses de curación (fase de

finalización), asegura la no supervivencia del parásito.

q Por todo ello, es muy recomendable que se refleje en el

etiquetado del producto el tiempo de curación.

TOXOFREE: INFORME FINAL

3. Determinación supervivencia y capacidad infectiva de T. gondii en piezas cárnicas origen porcino y distintas fases proceso curación

Nuevos ensayos añadiendo sondas “Taqman” a la técnica PCR

Aumentar ESPECIFICIDADTOXOFREE Toxoplasmosis: clasificación, herramientas diagnósticas y

viabilidad del parásito tras el procesado

TOXOFREE

DIFUSIÓN DE RESULTADOS Y TRANSFERENCIA A EMPRESAS

R.J.Astorga

GRACIAS POR SU ATENCIÓN