Post on 12-May-2020
Clase 3: Balance de Flujos Metabólicos
Prof: Guillermo R. Castro
Lab de Nanobiomateriales – CINDEFI
UNLP – CONICET, La Plata
Materia de Articulación CEBI - E4b
Ingeniería Metabólica
CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL . FCEyN-INTI
Como caracterizar un flujo metabolico?
Sink fluxes
Source fluxes
Metabolite Pool
Page 2 Guillermo R. Castro
Flujo metabólico (def.)
El flujo metabólico se define como la velocidad a
la que un sustrato se convierte en un producto
mediante reacciones y rutas metabólicas.
Sustrato –> Metabolito Intermedio –> Producto
4
Vias en E. coli
(A) This version of the overview shows all interconnections between occurren-ces of the same metabolite to communicate the complexity of the interconnections in the metabolic network.
Ouzonis, Karp, Genome Res. 10, 568 (2000)
5
Ouzonis, Karp, Genome Res. 10, 568 (2000)
(B) In this version many of the meta-bolite interconnec-tions have been removed to simplify the diagram; those reaction steps for which an enzyme that catalyzes the reaction is known to have a physiologi-cally relevant acti-vator or inhibitor are highlighted.
Vias en E. coli
8
Metabolic Networks
Network Reconstruction
Genome Annotation
Biochemistry Cell
Physiology Inferred Reactions
Metabolic Network Analytical Methods
9
Probs. de composición de biomasa Varia de acuerdo a diferentes organismos
Depende del medio de crecimiento y el medio ambiente
Depende de la velocidad de crecimiento
La biomasa optima no cambia demasiado con cambios en la
composición de macromoléculas
relacionadas
La biomasa optima cambia con
cambios relativos en la
composición de las
macromoléculas mas
relevantes
10
El numero de reacciones (744) y el numero de
enzimas (607) es diferente ...OOOOOpssss!!
WHY??
I. No existe un mapeo de uno a uno entre enzimas y
reacciones!!
II. Algunas enzimas catalizan reacciones multiples y
otras reacciones son catalizadas por multiples
enzimas.
III. En algunos casos las enzimas NO han sido
identificadas Ouzonis, Karp, Genome Res. 10, 568 (2000)
Caso: E. coli
Para un desarrollo exitoso de la ingeniería
metabólica es importante el uso de:
los balances,
la aplicación de técnicas de Ing. genética,
la genética clásica,
la biología celular y
la fisiología del cultivo
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Metodologia de análisis de Flujos metabólicos
El Método para determinar los flujos metabólicos utiliza modelos estequiométricos de las vías y balances de masa para metabólicos intracelulares.
Se miden los flujos de metabólicos extracelulares
Se obtiene un mapa de flujos metabólicos que permite comparar distintas condiciones y encontrar posibles problemas en la vía
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Análisis de Flujos metabólicos
El análisis de flujos metabólicos se puede definir como el cálculo y la distribución de flujos de una vía metabólica
de un sistema en estudio
(Este diagrama puede ser representado en una matriz estequiométrica S de m metabolitos (filas) y n reacciones (columnas).
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Estequiometria y balances
• En Biología de sistemas:
Input -> processing -> output.
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Que se necesita para realizar un análisis de flujos metabólicos?
Definir el sistema (vías metabólicas)
Considerar comportamiento estacionario o
pseudo-estacionario del sistema
Aplicar restricciones termodinámicas
Definir condiciones nutricionales
Definir un objetivo: biomasa
Predecir la velocidad de crecimiento para las
cepas salvajes y mutantes en dif. condiciones exp.
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Analisis estructural del sistema
• m – numero de especies qcas.
• q - numero de reacciones
• N = q*m, es la matrix estequiometrica
Reacciones
• Rev - reversibles
• Irrev - irreversibles
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Ley de acción de masas (Guldberg & Waage, 1864)
La velocidad de una reacción química es proporcional a la
probabilidad de colisión EFECTIVA de los reactantes. Se asume la probabilidad como proporcional a la concentración
Reaccion: 2 sust y 1 producto =>
La vel de reaccion Total es (v):
Guillermo R. Castro
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De manera genérica:
En donde mi y mj son las molecularidades de los Si y los Sj respect.
En el equilibrio: v= 0 =>
P=Peq y S=Seq. => Reordenando:
=-v
Para la reacción:
Guillermo R. Castro
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Análisis estequiométrico:
(las vel son -1, -1 y 2)
y
Y para n moléculas y r reacciones
con
Con nij los coeficientes estequiométricos de la molécula i de la reacción j
Guillermo R. Castro
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Los coeficientes estequiométricos nij de la moléculas Si y a
las reacciones Vj se combinan para dar una matrix
denominada ESTEQUIOMETRICA
Con i= 1,…,m y j= 1,…,r
En donde cada:
1 columna = 1 reacción 1 fila = 1 molécula
Guillermo R. Castro
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Ejemplo 1:
Reacciones: 4 => 4 columnas
Moleculas : 3 => 3 hileras
(V1 v2 v3 v4)
S1
S2
S3
( - ) ( + )
Guillermo R. Castro
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Análisis de V2
Columna 1: 1 molécula de S1 desaparece => (-1)
Col. 2: 2 moléculas de S2 son producidas (+2)
Col. 3: S3 se mantiene constante (0).
0
1
S1
S2
S3
Reacción:
Guillermo R. Castro
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Descripción matemática de un modelo metabólico
En que consiste:
Un vector de concentraciones: S = (S1, S2, …, Sn)T
Un vector de velocidades de reacción: V = (V1, V2,…, Vn)T
Un vector paramétrico: p= (p1, p2,…, pn)T
Y la matriz esquiometrica N
V
Guillermo R. Castro
Sustrato (S)
1
Metabolito Intracelular 1 (A)
2 3
Metabolito Intracelular 2 (B) Producto 1 (P1)
4
Metabolito Intracelular 3 (C)
5 6
Producto 2 (P2) Producto 3 (P3)
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Sea la siguiente vía metabólica:
• La resolución de este simple sistema se podría hacer mediante cálculos manuales, pero esto no es posible en todos los casos y no es recomendable
Se definen 3 conceptos
• Matriz estequiométrica (T)
•Vector de flujos en estado estacionario (v)
•Vector de flujos medibles (r)
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• En vez de esto, se utiliza una aproximación matricial, en el cual las reacciones son tratadas utilizando álgebra lineal:
Matrices (repaso):
Guillermo R. Castro Page 32
Sea:
La inversa (T) de la matriz es:
= 1
Cuando una matriz NO es invertible el det (A) es CERO (ad-bc= 0).
Ecuación de Balance Metabólico
6 incógnitas, 3 metabolitos en estado estacionario 3 grados de libertad, hay que medir 3 metabolitos: rs = -1 rp1 = 0.3 rp2 = 0.5
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Ecuación de Balance Metabólico
-1 -1 0 0 0 0 0 1
0.3 0 0 1 0 0 0 2
0.5 0 0 0 0 1 0 3
0 = 1 -1 0 0 0 0 4
0 0 1 -1 -1 0 0 5
0 0 0 0 1 -1 -1 6
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Ecuación de Balance Metabólico
-1 0 0 0 0 0 -1 1
-1 0 0 -1 0 0 0.3 2
0 1 0 0 0 0 0.5 3
-1 -1 0 -1 -1 0 0 = 4
0 0 1 0 0 0 0 5
-1 -1 -1 -1 -1 -1 0 6
35 Guillermo R. Castro
Ojo que aquí la matriz es la TRANSPUESTA!!!
Reacciones bioqcas en un esquema metabolico
Ident: Intercambios Intracellulares Objetivos
Biomass: R8
B
A
F
2D
E
C
R3
R2
Waste: R9
Uptake: R5
Uptake: R1
R4
R7
R6 D
2B
Ejemplo de una matriz estequimetrica: Representacion de una via metabolica
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R8
A +1 -1 -1
B +1 -1 -2
C +1 +1 -1
D 2 +1 -1
E -1 +1
F +1 -1
R4: B + E → 2D
R5: → E
R6: 2B → C + F
R7: C → D
R8: D →
R9: F →
R1: → A
R2: A → B
R3: A → C
Como balancear un flujo metabolico?
dt
Bd
dt
Adv
][][2
Para la reaccion estequiometrica
R2: A → B
La vel de reaccion (flujo) es igual:
Para la reaccion estequiometrica
R4: B+E → 2D
El flujo es :
dt
Dd
dt
Ed
dt
Bdv
][
2
1][][4
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Asi por ej en condiciones de EE un modelo dinamico no-linear se simplifican en flujos lineales.
0321
][
]3][[
][
]2][[
][
]1][[
3,
3
2,
2
1,
1
vvvdt
dA
KC
PCk
KB
PBk
KA
PAk
dt
dA
mmmext
ext
Aext A P1
P2
P3
B
C
Aext A
v1
B
v2
v3
C
k1
k2
k3
Page 40 Guillermo R. Castro
En estado estacionario se
ASUME que la suma de los
flujos que produce un
metabolito es igual a la
suma de los que los
consume.
0][
i
iivcdt
Ad
Aext A
v1
B
v2
v3
C
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En la matriz estequiometrica: mas incognitas que ecuaciones…..?????????????
0763][
046*22][
0321][
vvvdt
Cd
vvvdt
Bd
vvvdt
Ad
R1 R2 R4 R4 R5 R6 R7 R8 R9
A +1 -1 -1
B +1 -1 -2
C +1 +1 -1
D 2 +1 -1
E -1 +1
F +1 -1
v1
v2
v3
v4
v5
v6
v7
v8
v9 096][
054][
vvdt
Fd
vvdt
Ed
d[D]
dt 2*v4 v7 v8 0
Reacciones bioqcas en un esquema metabolico
Nota: Intercambios Intracellulares Objetivos
Biomass: R8
B
A
F
2D
E
C
R3
R2
Waste: R9
Uptake: R5
Uptake: R1
R4
R7
R6 D
2B
B
A
F
2D
E
C
v3
v2
R9
v5
v1
v4
v7
v6 v8 D
2B
B
A
F
2D
E
C
v3
v2
v9
v5
v1
v4
v7
v6 v8 D
2B
B
A
F
2D
E
C
v3
v2
v9
v5
v1
v4
v7
v6 v8 D
2B
E
Discriminando vias en EE
V1 v2 v3 v4 v5 v6 v7 v8 v9
A +1 -1 -1
B +1 -1 -2
C +1 +1 -1
D 2 +1 -1
E -1 +1
F +1 -1
Se elige una de las vias alternativas para optimizar
B
A
F
2D
E
C
v3
v2
v9
v5
v1
v4
v7
v6 v8
D
2B
10
10
10
10
20
Optimal Growth Flux
Consideraciones: conservar relaciones
• Detectar estados conservados en la vía
• Cuales pueden ser computados con
algoritmos determinados
• Que reacciones pueden ser removidas sin
que haya un impacto gral. en la vía
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Rutas metabólicas
Obtengo una serie de balances que indican la velocidad con que se
consumen sustratos, se producen productos y
se consumen/producen intermediarios
Esto genera una serie de ecuaciones con n incógnitas (flujos). Para resolver el sistema debe haber tantas ecuaciones (o sea componentes relevantes) como flujos
Resolución por cuadrados mínimos.
Matriz estequiométrica X
Matriz V
= Matriz
Q
Sale de las rutas
metabólicas
Sale de datos experimentales previamente reconciliados
Despejo Matriz V
A x V = Q
V= Q . AT =(A.AT)-1.AT.Q A AT
Relaciones conservadas:
• Una combinacion de una
columna con valores
linealmente dependiente.
• La matriz transpuesta (NT)
puede ser representada
por NTy=0
N
1
1
1
1
NT y [1 1 1 1)y 0
y
1 1 0
1 0 1
0 1 0
0 0 1
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Se asume Quasi EE
• 0=Nr
• Se considera que en el EE las concentraciones y las velocidades de reaccion son CONSTANTES
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Analisis de flujos Metabolicos como se procede…?
• Determinar las velocidades de reaccion en experimentos en EE
• Desarrollar un modelo de flujos en EE
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Analisis del balance de flujos
• Identificar patrones que:
– Mantengan la via balanceada
– Maximizar linealmente la funcion blanco
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Page 54
Ejemplo:
1. 1 - 2 - 3 = 0
2. 3 - 4 - 5 = 0
3. 2 - 25 = 0
Se asume estado pseudo-estacionario para los intermediarios B, D y NADH, luego son 3 restricciones en el sistema
Especie B:
D:
NADH:
Guillermo R. Castro
Resolviendo para v2, v3 y v4 en términos de v1 y v5
1. 2 = 25
2. 3 = 1 - 25
3. 4 = 1 - 35
Page 55 Guillermo R. Castro
Ejercicio B A
C
D E
F G
H
1
ATP
CO2
2 NAD+
NADH
3 ATP
4
CO2
5
ATP
CO2 6 NAD+
NADH
7
NAD+
NADH
ATP
ADP
ADP
ADP
ADP
Page 57 Guillermo R. Castro
Reacciones 1
1. A + ATP C + CO2 2
2. B + NAD+ C 3
3. C D + ATP 4
4. C E + CO2 5
5. D + ATP F + CO2 6
6. D G + NAD+
7
7. F + ATP H + NAD+
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Balance Estado Estacionario para Metabolitos Intracelulares
C: 1 + 2 - 3 - 4 = 0 1 + 2 = 3 + 4
D: 3 - 5 - 6 = 0 3 = 5 + 6
F: 5 - 7 = 0 5 = 7
ATP: - 1 + 3 - 5 - 7 = 0 3 = 1 + 5 + 7
NAD+: - 2 + 6 + 7 = 0 2 = 6 + 7
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Matriz de Coeficientes estequiométricos
A B E G H CO2 C D F ATP NAD+
-1 0 0 0 0 1 1 0 0 -1 0
0 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 -1
T = 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 1 0
0 0 1 0 0 1 -1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 0 -1 1 -1 0
0 0 0 1 0 0 0 -1 0 0 1
0 0 0 0 1 0 0 0 -1 -1 1
60 Guillermo R. Castro
Ecuación de Balance Metabólico
r
= T T V
0
V : vector de flujos
r : vector de flujos medibles
T: matriz de coeficientes estequiométricos
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7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos: rA = -2 rB = -3
Ecuación de Balance Metabólico
RA -1 0 0 0 0 0 0
RB 0 -1 0 0 0 0 0
RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1
RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2
RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3
RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4
0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5
0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6
0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7
0 -1 0 1 0 -1 0 -1
0 0 -1 0 0 0 1 1
62 Guillermo R. Castro
Ecuación de Balance Metabólico
-2 -1 0 0 0 0 0 0 ν1
-3 0 -1 0 0 0 0 0 ν2
0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν3
0 = 0 0 1 0 -1 -1 0 ν4
0 0 0 0 0 1 0 -1 ν5
0 -1 0 1 0 -1 0 -1 ν6
0 0 -1 0 0 0 1 1 ν7
63 Guillermo R. Castro
Ecuación de Balance Metabólico
-1 0 0 0 0 0 0 -2 ν1
0 -1 0 0 0 0 0 -3 ν2
0 -1 0 1 1 0 1 0 ν3
-1 0 -1 -1 -1 0 -1 0 = ν4
0,5 -0,5 0 0,5 1 -0,5 0,5 0 ν5
-0,5 -0,5 0 -0,5 0 0,5 0,5 0 ν6
0,5 -0,5 0 0,5 0 -0,5 0,5 0 ν7
64 Guillermo R. Castro
Resultado
2 3
3
2
0.5
2.5
0.5
B A
C
D E
F G
H
ATP
CO2
NAD+
NADH
ATP
CO2
ATP
CO2 NAD+
NADH
NAD+
NADH
ATP
ADP
ADP
ADP
ADP
2 ν1
3 ν2
3 ν3
2 = ν4
0,5 ν5
2,5 ν6
0,5 ν7
65 Guillermo R. Castro
Sistema exactamente determinado
Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistema puede encontrarse de 3 formas:
Determinado, sobredeterminado o subdeterminado
Análisis de Flujos metabólicos
vT)(T r )(T T-1T-1T
vT r T
r -1T )(T v
Page 66 Guillermo R. Castro
Ecuación de Balance Metabólico
-1 -1 0 0 0 0 0 1
0.3 0 0 1 0 0 0 2
0.5 0 0 0 0 1 0 3
0 = 1 -1 0 0 0 0 4
0 0 1 -1 -1 0 0 5
0 0 0 0 1 -1 -1 6
Page 67 Guillermo R. Castro
Ecuación de Balance Metabólico
-1 0 0 0 0 0 -1 1
-1 0 0 -1 0 0 0.3 2
0 1 0 0 0 0 0.5 3
-1 -1 0 -1 -1 0 0 = 4
0 0 1 0 0 0 0 5
-1 -1 -1 -1 -1 -1 0 6
68 Guillermo R. Castro
Sistema exactamente determinado (matriz no invertible)
Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistema puede encontrarse de 3 formas:
Determinado, sobredeterminado o subdeterminado
Análisis de Flujos metabólicos
vS r
rS v-1T TSS
r -1(S) v
Page 69 Guillermo R. Castro
Sistema exactamente determinado
Sistema sobredeterminado: Es necesario agregar información al sistema, medición de metabolitos extracelulares (vector b).
Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistema puede encontrarse de 3 formas:
Determinado, sobredeterminado o subdeterminado
Análisis de Flujos metabólicos
rS v -1
vS r
rS v-1T TSS
Page 70 Guillermo R. Castro
7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos: rA = -2 rB = -3
Ecuación de Balance Metabólico
RA -1 0 0 0 0 0 0
RB 0 -1 0 0 0 0 0
RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1
RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2
RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3
RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4
0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5
0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6
0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7
0 -1 0 1 0 -1 0 -1
0 0 -1 0 0 0 1 1
71 Guillermo R. Castro