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01 Introduccion a la Biotecnologia p2.pptx
02 Cultivo de Tej Veg - fundamento.pptx
03 Reguladores de Crecimiento.pptx
03 respuestas no deseadas.pptx
04 Aclimatacion new.pptx
04 Micropropagacion b.pptx
05 Cultivo de Meristemas.pptx
06 Aclimatación nuevo.ppt
06 Cultivo de anteras (2).pptx
06 germoplasma - crioconservacion (2).pptx
07 Protoplastos.pptx
08 suspension & metab 2nd.pptx
09 Marcadores moleculares 1.2a.pptx
09 Marcadores moleculares.pptx
10 Tecnologia del ADN recombinante 1.2.pptx
10 transgenicos.pptx
11 Biopharming.ppt
01 Introduccion a la Biotecnologia p1.pptx
La Biotecnología Vegetal
Seguridad alimentaria
Tiene tres aspectos fundamentales:
1. La disponibilidad de alimentos.
2. El acceso de las personas a ellos.
3. El aprovechamiento biológico de los mismos.
Productividad de los cultivos
Suelo Clima
Variedad
Manejo poscosecha
FACTORES1. Genotipo.2. Control de plagas y
enfermedades.3. Técnicas de manejo
agronómico4. Mejoramiento del
suelo.5. Manejo de las
condiciones climáticas.
Características deseadas por los fitomejoradores
• Resistencia a enfermedades y plagas.
• Disminuir el costo de producción.
• Incrementar el rendimiento/ha
• Aumentar la calidad organoléptica.
• Mejora del contenido nutricional.
• Tolerancia a stress abióticos (cambio climático, heladas, etc.)
• Precocidad.
• Incrementar la productividad (rendimiento/ingreso)
• Asegurar la inocuidad del alimento.
Diferentes rutas del fitomejoramiento moderno
Recursos Genéticos y Genómicos para la pre-mejora y mejora de los cultivos
Estrategias para obtener variedades mejoradas usando la biotecnologia
MejoramientoDiversidad del
patógenoDiversidad del germoplasma
Desarrollo de marcadores moleculares Nueva
variedad
Genes importantes
EnfermedadesProducciónCalidad
Selección Asistida o transformación genética
Biólogos molecularesFitomejoradores
Fitopatólogos
Tomado de: Uilson Lopes Coord. Biomol SEGEN/CEPEC/CEPLAC
• Cultivo de Tejidos Vegetales.
• Marcadores Moleculares.
• Ingeniería Genética.
Técnicas de la Biotecnología que contribuyen a la mejora vegetal
Tomate silvestre
Tomate cultivado
Domesticación del tomate
Consecuencias de la domesticación
• Las plantas domesticadas se caracterizan por:
- Rasgos que confieren adaptación al ambientehumano.
- Pérdida de capacidad reproductiva, dedispersión de la semilla e inactividad de lasemilla.
- Pérdida de capacidad adaptativa.
Tomado de: ISNAR, 2001; REDBIO/FAO, 2002.
Técnicas más utilizadas en I+D+I (Investigacion, Desarrollo e Innovacion:
Recursos genéticos 21 %
Mejora de productividad 23 %
Protección de plantas 25 %
Otros 19 %
Grandes temas en I+D+i:
Distribución de actividades de la I+D en Biotecnologia en América Latina y el Caribe
Cultivo de tejidos 29%
Marcadores moleculares 27%
Diagnóstico 20%
Ingeniería genética 14%
Cadenas de comercialización de productos agrícolas:
¿Cómo participa la biotecnología vegetal??
BIOFERTILIZANTES
Microorganismos que incrementan el suministro y disponibilidad de nutrientes.
Ejemplo:
Efficient Microorganisms®
BIOPESTICIDAS Bacillus thuringiensis
Es compatible la Agricultura Orgánica con la Biotecnología?
Microalgas: producción masiva
APLICACIONES:
1. Alimento humano y animal.
2. Polisacáridos: alginatos.
3. Propiedades medicinales.
4. Biomasa para biocombustibles.
5. Biofertilizantes.
Género
NicotianaCatharanthus
CinchonaDuboisiaDatura
BetaLippia
ArtemisiaCoreopsis, Bidens
Tagetes
DigitalisCassiaPanax
ChaenactisPodophyllum
LinumLithospermum
Solanum
Metabolito
AlcaloideAlcaloides piridínicosIndoles
Tropano
OtrosBetalainaSesquiterpenos
PoliacetilenosTiofenos
Glicósidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos
NaftoquinonasEsteroides
Algunos metabolitos secundarios producidospor raíces transformadas
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Tipos de plantas más utilizadas
Freatófitas
- Plantas de raíces profundas
(álamo, sauce, algodonero).
Pasturas
- Por su tipo de raíz retienen el suelo.
Legumbres
- Permiten enriquecer el suelo en N2.
Acuáticas
- Permiten la degradación de contaminantes
en ciénagas artificiales.
Fitorremediación
Marcadores Moleculares
• ¿Que es un Marcador?
• Un marcador es considerado como un carácter cuyo patrón de herencia puede determinarse en un nivel morfológico (fenotípico), bioquímico y/o molecular.
Tumbes LimaTrujillo Chimbote¿?
¿Son el mismo genotipo? ¿tiene parentesco alguno?¿Si son diferentes Cuanta diferencia hay entre ellos?
Método:1. Extracción de ADN2. Amplificación de fragmentos de ADN3. Corrida electroforética4. Teñido y visualización de bandas5. Análisis de la información
Individuo A Individuo B
Identificación de individuos
ICS-6ICS-1
Fuente: Ing. Luis Garcia Carrion UNAS
2
3
4
5
6
7
8
9
101112
0.44 0.52 0.60 0.68 0.76 0.84 0.92 1.00
C42 HTM1 C65 PA150 U1U9 U12 U15 CAT4 U26U54 SCA6 CCN51 C53 U68 U43 U48 SilvHu SeñoA H12 Pand U60 C69 C81 H61C85 P7 ChuC U70UF29 H60 H37 Seño
1
EET400 EET228 EET233 M18.16 EET62 ICS6 ICS78 ICS95 ICS1 ICS39 M1.7 I16.20 UF667 I12.12 IMC67 I14.20 ChuS
0.79
13
Análisis de agrupamiento o “cluster” para medir el grado de diversidad genetica entre los cacao en estudio.
-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20-0.37
-0.23
-0.08
0.06
0.20
0.34
EET400
EET228EET233
EET62ICS6 ICS78
ICS1ICS95
ICS39
M18.16
M1.7
UF667
U1
CAT4
U9
U12
U15
U26
U43
U48
U54
U60
U68
U70
SCA6C42
C53
C65HTM1
CCN51
IMC67
I12.12
I14.20
I16.20
C69
C81
C85
SilvHu
H12H61
Pand
PA150
P7ChuC
ChuS
SeñoA
Dimensión 1
Dim
en
sió
n 2
PCoA50 OTUs
Análisis de ordenamiento (coordenadas principales) para distinguir grupos entre los cacao en estudio.
Micro-arrays can carry 20,000 genes on a 2 cm2
plate. When arrays are probed with RNAs from, say, stressed and unstressed plants computer enhanced imaging identifies genes that are under-expressed (in red) and over-expressed (in green).
Estudio de la expresion genética con microarreglos o “microchips de ADN”
Ingeniería Genética de Plantas
¿ Cómo combinamos ADN de diferentes organismos?
• Cortando y uniendo trozos de ADN de diferentes organismos para producir una molécula de ADN híbrida.
• Las plantas transgénicas se han construido sobre la base de introducir al sistema genético de la planta receptora información genética adicional proveniente de otro organismo donante.
Ingenieria Genética de Plantas
Transformando plantas
Resistencia a enfermedades
Potenciando al tomate(Lycopersicon esculentum)
Licopeno, carotenoide, antioxidante (relacionado a vitamina A)
Maduración retardada (etileno)
Variedades tolerantes al alto contenido de sales en suelo y agua de riego (acumulación de sales en follaje)
Deficiencia de vitamina A: efecto sobre la capacidad visual, susceptibilidad a diarreas y fallas cardiovasculares
Consumo masivo en Asia
Carece de precursores de vitamina A
Inserción de genes asociados a la síntesis de ß-caroteno, precursor de la vitamina A
El “arroz dorado” y la deficienciade vitamina A
http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/components/7055fig7.html
http://www.filmnebraska.org/gallery/crop.htm
http://www.hockinghills.com/gallery/pg_82.htm
http://www.ba.ars.usda.gov/history/photos/1970_2.html
Soya, maíz y trigo
La soya se usa en el 40-60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, cerveza. Tolerancia a herbicidas (Roundup Ready, liberado en 1996, glifosato).
El maíz es un producto de consumo muy difundido. Genes bt.
En el trigo se estudia la introducción de genes implicados en la síntesis de la glutenina del trigo, relacionados en la elasticidad del gluten, útil para la panificación.
http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/DC7055.html
Vacunas comestibles de origenvegetal
• Protección contra la hepatitis B (antígeno de superficie HBsAg), el cólera, la diarrea (E. coli, toxina LT-B, CT-B), HIV (gp120), herpes
• Plantas: papa, plátano, tomate, tabaco, otras frutas
• Evaluaciones en laboratorio en estado avanzado. En papa, hasta 0.3% de ab solubles de LT-B en papas hervidas (Tacket et al, 1998)
• Actualmente, fase de prueba en voluntarios• Cornell Univ., Univ. of Loma Linda (California), Maryland, Pennsylvania,
Mississippi
http://home.cwru.edu/~eay3/ESR/vaccine2big.htm
http://www.sciam.com/2000/0900issue/0900langridge.html
Retos de la Biotecnología en el Mejoramiento Genético de Plantas
• Solucionar problemas de contaminación ambiental.
• De erosión de suelos.
• Brecha Político Social Económica.
• Salinidad de los suelos.
• Disminuir la erosión genética.
• Altos costos de producción.
• Pérdida de competitividad.
• Enfrentarse al incremento de plagas y enfermedades.
Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos
vegetales
Cultivo in vitro de plantas consiste en lograr que un “explante” en
un medio nutritivo estéril regenere en una o más plantas
completas. También permite la producción de metabolitos
secundarios.
Introducción
Etapas
Laboratorio
Invernadero
Establecimiento in vitro
Plántulas enraizadas
Aclimatación
Campo
morfogénesis in vitro
Plántulas no enraizadas
Enraizamiento ex vitro
Regeneración
explantes
Cada una de las células de unindividuo vegetal, proporcionandolos estímulos adecuados, posee lacapacidad necesaria como parapermitir el crecimiento y desarrollode un nuevo individuo, sin quemedie ningún tipo de fusión decélulas sexuales o gametos.
Haberlandt (1902)
Totipotencia
Morfogénesis
Embriogénesis cigótica
1. Organogénesis.
2. Embriogénesis.
Tipos de Morfogénesis in vitro
Morfogénesis directa e indirecta (Hicks, 1980)
Una dediferenciación celular
acompañada de crecimiento
celular desorganizado y la
formación de meristemoides
puede generar indirectamente
órganos o embriones.
Respuesta morfogenética
por la cual o se forman
directamente órganos o
embriones.
Organogénesis
Embriogénesis somática
Embriogénesis somática
Embriogénesis somática
Embriogénesis somática
De Klerk et al. 1997:
a. Adquisición de la competencia.
Las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren
esa competencia durante una fase de desdiferenciación.
b. Inducción.
Las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación
directa entre el tipo, concentración y combinación de reguladores del
crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar.
c. Realización.
La célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano
determinado.
Fases de la Morfogénesis
http://www.ejpau.media.pl/series/volume5/issue1/biotechnology/art-02.html
Son cuatro los principales:
a. Explante.
b. Genotipo.
c. Condiciones químicas.
d. Condiciones físicas.
Factores que afectan los procesos morfogénicos
Explante
a. Estado fisiológico de la planta madre.
b. Sector del cual se toma el explante.
c. Estado sanitario.
d. Tamaño.
e. Esporofito o gametofito.
f. Época del año.
protoplasto
Radice, Silvia. Morfogénesis in vitro. En: ECHENIQUE, V.; RUBINSTEIN, C. Y MROGINSKI, L.A. (eds.) 2004.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Ediciones Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Consejo
Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología. Buenos Aires, Argentina.
a. Factor determinante.
b. No es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo.
c. Variación intravarietal de respuestas regenerativas.
Genotipo
a. Composición salina del medio de cultivo.
b. Composición orgánica + fuente de carbono.
c. Reguladores de crecimiento.
d. Antibióticos.
e. Fenolización.
f. Agar, Gelrite® , Phytagel®
g. Atmósfera gaseosa.
h. pH: 5,4 – 5,8
Condiciones Químicas
Requerimientos nutricionales
a. Temperatura.
b. Humedad relativa.
c. Luz (Fotoperiodo).
Condiciones Físicas
• Micropropagación vegetal (embriogénesis y organogénesis).
• Cultivo de meristemas.• Cultivo de suspensiones de células .• Cultivo de protoplastos.• Cultivo de anteras, óvulos y embriones.• Microinjertos.• Microtuberización.• Producción de metabolitos secundarios.• Etc.
Técnicasdel cultivo de células y tejidos vegetales
Infraestructura
Área de Preparación
Área de Siembra o Transferencia
Cabinas de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril.
Área de Incubación
•Asepsia.•Temperatura: 25-27°C.•HR: 99%.•Fotoperiodo controlable.• Intensidad luminica
controlable.
Invernadero
Reguladores de crecimientovegetales
o fitohormonas
Reguladores de Crecimiento
• Son sustancias que promueven e influencian el crecimiento, desarrollo y la diferenciación de células y tejidos.
• Determinan la formación de flores, brotes, hojas, senescencia, el desarrollo y maduración de los frutos.
• Actúan a bajas concentraciones (0,1 – 1,5 ppm).
• Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas de las diferentes fitohormonas).
• Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.
• Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida, pero su concentración fluctúa.
• Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.
Tipos
Papel de diversas fitohormonas como reguladores del crecimiento
Factores que influyen en Auxinas
Factores que influyen en Giberelinas
N
OH
O
Acido indol acético (AIA)(auxina endógena)
Auxinas
Las Auxinas , descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptilo de las gramíneas.
Se usan como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis.
• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión.
• La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
• Su transporte es polar
Posibles etapas en la acción de la auxina
Funciones
• Alargamiento y división celular
• Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos
• Formación de raíces adventícias
• Dominancia apical
• Acción herbicida
• Estimulación de la producción de etileno.
(2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acidAcido 2,4,5 tricloro fenoxi acetico (2,4,5 T)
(2,4-dichlorophenoxy) acetic acidAcido 2,4 diclorofenoxi acetico (2,4D)
Acido indol acetico (AIA)β-indoleacetic acid
4-(1H-indol-3-yl)butyric acidAcido indol butirico (AIB)
Acido naftalen acetico (ANA)1-naphthylacetic acid
Descubiertas en 1955 al estudiar las sustancias promotoras de la división celular in vitro.
Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:
•Promoción de la Division celular, reguladorde la fase G1.
•Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas).
•Retardo de la senescencia.•Síntesis de clorofila y desarrollo de
cloroplastos.
Citoquininas
En combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas
Precursores de las citoquininas
1. Se pueden obtener como subproductos del ADN sometido a altas Tº
2. Conjugados de ribosidos, riboctidos, glucosidos, conjugados de aminoácidos.
3. Ej: ribosido de zeatina, riboctido de zeatina, adenina, adenosina.
Se producen en el embrión y en el ápice de las raíces.
Su transporte es no polar:
1. A través del xilema, con transportador especifico.
2. Por liberación como ribósido o base nitrogenada.
• Citoquininas endógenas:
• Zeatina (Zea)• Isopenteniladenina (2iP)
• Citoquininas sintéticas:
• Kinetina (Kin)• Benziladenina o Bencil amino purina (BAP)
• La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg.
Citoquininas - Estructura química
NH CH2 CH C
CH3
CH2OH
Zeatina
NH CH2 CH C
CH3
CH3
Isopenteniladenina(IP)
6-bencilaminopurina
N NH C
H
H
N
N N
N
N
• Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, en plantas de arroz infectadas.
• Éstas presentaban marcada clorosis y entrenudos largos.
• El ácido giberélico (AG3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.
O
HCH3
H COOHH
HO OH
CH3
C O
Acido giberélico (AG3)
Las Giberelinas
Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
– Favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes nuevos.
– Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos.
– Crecimiento de yemas latentes.– Germinación de semillas en dormición.– Floración.– Movilización de reservas en la semilla.
• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.
• Los tejidos etiolados tienen alta conc. de giberelinas.
• En menor proporción en ápices y en raices.• Ruta de síntesis de la giberelina: ciclo de calvin.• Se estudió su actividad biológica en mutantes
para las enzimas de la síntesis de AG.• Su transporte no es polar.
Ácido absicico (ABA)
• Aislado de frutos jóvenes de algodón, que se secaban y caian(abscisión o caída).
• Se estudio la latencia inducida por fotoperiodo.
• Sesquiterpenoide, acido débil: pH 4,75• ABA natural y sintético.• Regulación de la biosíntesis del ABA por desdoblamiento de las
xantófilas.
• Tiene efectos diferentes en tallo o raíz.
• Déficit hídrico moderado, ABA incrementa el elongamiento de la raíz.
• Déficit hídrico severo, ABA inhibe el desarrollo de la raíz.
Reglas generales para la acción hormonal:
• Auxina : Citokinina = ~1 Callo
• Auxina : Citokinina < 1 Tallo
• Auxina : Citokinina > 1 Raíces
Respuestas no deseadas en cultivo in vitro
Contaminación en el cultivo in vitro de plantas
Principales fuentes de contaminación
• Contaminación de las plantas madres.
– El explante
• Contaminantes microbianos introducidos en el laboratorio.
– El operario(a).
– El ambiente
– Los equipos y el instrumental.
– Los insectos.
Influencia de los microorganismos en el cultivo in vitro
• Los principales microorganismos asociados con lasuperficie de las plantas son: hongos, levaduras,bacterias, spiroplasmas y micoplasmas.
• Las áreas donde se concentran mayor cantidad denutrientes en la superficie de las plantas son:néctar, ceras, tejidos senescentes, etc.
• Las poblaciones de hongos y bacterias puedendesarrollarse en residuos de insectos, además, lashendiduras, pelos densos y superficiesmucilaginosas pueden albergar microorganismos.
Métodos de identificación de contaminantes
• Se emplean los métodos tradicionales auxiliadosde los manuales de clasificacióncorrespondientes, aunque existen modernastécnicas como el análisis de ácidos grasos, PCR,RFLP y AFLP que se incorporan paramicroorganismos específicos de un cultivo.
• Es importante estudiar y determinar la microbiotaespecífica de un laboratorio, biofábrica o paíspara poder diseñar los métodos de detección ycontrol en función de esto.
Contaminación
GRADO DE CONTAMINACIÓN DE EXPLANTES DE CAFÉ
INICIO CONTAMINACIÓN
MEDIA CONTAMINACIÓN
ALTACONTAMINACIÓNN
Fenolización
FENOLIZACIÓN EN EXPLANTES DE CAFÉ
INICIO FENOLIZACIÓN
MEDIA FENOLIZACIÓN
ALTAFENOLIZACIÓN
Cultivo de varas de Phalaenopsis
Vitrificación
• Es el estado de hiperhidricidad (antesconocido como vitrificación)
• Es una malformacion fisiológica que resulta deuna excesiva hidratación, baja lignificación,disfunción estomática y una reducida fuerzamecánica en los tejidos de las vitroplantas.
• La consecuencia es la pobre regeneración detales plantas.
Síntomas y cambios anatómicos
• Apariencia translúcida, debido a unadisminución de la clorofila y un alto contenidode agua.
• Una delgada capa cuticular o su ausencia.
• Reducido número de células en palisada.
• Estomas irregulares.
• Una pared celular poco desarrollada.
• Grandes espacios intracelulares en la capa decélulas del mesófilo.
Causas
• Alta concentración de sales.
• Alta humedad relativa.
• Baja intensidad lumínica.
• Acumulación de gas en el interior del recipiente.
• Duración del tiempo de intervalo entre subcultivos.
• Número de subcultivos.
• Concentración y tipo de agente gelificante.
• Tipo de explantes utilizados.
• La concentraciones de microelementos.
• Inbalances hormonales.
Causas
• La hiperhidricidad es comun en plantascreciendo en cultivo liquido o cuando hay una baja concentracion de agentegelificante.
• La alta concentración de amonio tambiéncontribuye.
Callos hiperhídricos de Nicotiana tabacum
Variación somaclonal
Variación somaclonal
Mecanismos por los que ocurre la variación somaclonal
1. Alteraciones en el cariotipo.
2. Mutaciones puntuales.
3. Recombinación somática.
4. Elementos genéticos transponibles.
5. Metilaciones ADN.
6. Cambios ADN de orgánulos.
7. Prevalencia de tejidos quiméricos.
Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal
1. Genotipo.
2. Nivel de ploidía.
3. Explanto.
4. Vía de regeneración.
5. Condiciones de cultivo.
6. Reguladores del crecimiento.
7. Deficiencia de oxígeno.
8. Edad del cultivo.
9. Deficiencia o exceso de minerales.
Detección de la variación somaclonal
• Morfológicos
• Cariotípicos
• Bioquímicos
• Fisiológicos
• Moleculares
Variación en las hojas de yuca regeneradas in vitro
Estrategias para la
selección de variantes
útiles
Somaclones comerciales
1. Caña de azúcar – Resistentes a stress biótico y abiótico.
2. Patata – Resistencia a hongos y virus.
3. Ornamentales – color: gerbera, clavel y crisantemo, arquitectura floral: geranio.
4. Camote – calidad de raíces.
5. Maíz – contenido en triptófano.
6. Tomate – contenido en materia seca.
7. Apio – Rendimiento.
8. Arroz – resistencia a distintos tipos de stress. Caracteres agronómicos.
9. Mostaza – rendimiento.
10. Cebada – Tolerancia a glifosato.
11. Banana - resistente a Fusarium oxyporum.
12. Tabaco – tolerante a Al y resistente a herbicidas.
13. Trigo – resistente a Helminthosporium.
14. Alfalfa – resistente a Fusarium oxyporum.
Fase 4 de la micropropagación
La AclimataciónEndurecimiento (hardening), Rustificación,
etc.
Aclimatación
• Plantas in vitro deben adaptarse y crecer en condiciones in vivo (ex-vitro) más estresantes.
• La transición requiere Alta Humedad.
• Requiere una intensidad apropiada de luz.
• Requiere 20-25º C (muy variable).
• Requiere un suplemento adecuado de nutrientes.
• Requiere una correcta humedad del suelo.
• Crecimiento Nuevo = ÉXITO.
Aclimatación
• Adaptación de las plántulas de cultivos de tejidos al ambiente externo.
• Medios ambientes extremadamentediferentes – fuera y dentro.
• Puede requerir técnicas especiales para la adaptación o fortalecimiento.
• La mayoría de plantas no pueden sertransferidas directamente de cultivo al invernadero o campo.
• Muchas de las caracteristicas de plantasdesarrolladas in vitro son muy diferentes de las plantas que crecen in situ.
Aclimatación
Ceraepicuticular
• ClavelA. Invernadero
B. Invernadero
C. Cultivo in vitro
D. Cultivo in vitro
Ceraepicuticular
Plantas de clavel in vitro
A. Cultivo in vitro
B. Camara de incubacion
C. Camara de incubacion
D. Anormal
E. Invernadero
F. Anormal
Epicuticular wax on plants
Medios ambientes
• Cultivo de tejidos
– Poca luz
– Alta HR ~98%
– [CO2] - 300 ppm
– Sacarosa presente
– Esterilidad
• Invernadero/Campo
– Alta luz
– HR ~ 30-80%
– [CO2] - bajo
– No sacarosa
– Patógenos presentes
Cambios en las vitroplantas
• Cera epicuticular
• Funcionamiento estomatal
• Anatomia de las hojas
• Funcionamiento de las raices
Vitroplantas “Normales”
• ¿Pueden ser las vitroplantas “normales”?
• Muchos sintomas de hiperhidricidad son poco severos
– Cuticula desarrollada pobremente.
– Pueden tener cera epicuticular
– Espacios intracelulares grandes
– Desarrollo minimo de la palisada.
Anatomia foliar
• Cuticula muy delgada
• Grandes espacios de aire intracelular
• Capa de la células en empalizada pobrementedesarrolladas.
Fresa – crecimiento en invernadero
Capas en empalizada
Mesófiloesponjoso
Espacios de aire
Fresa – cultivo in vitro
Grandesespacios de aire
Una capa de células en empalizada
Conductancia estomática en plantas cultivadas in vitro
Pérdida de agua
Deben ocurrir cambios
• Se debe formar la cera epicuticular.
• Los estomas deben responder mas rapidamente.
• La actividad fotosintetica – incrementada.
• Obs: la cantidad de los cambios no es la misma para todas las plantas.
Funcionamiento estomatal
Técnicas para Aclimatación
• Remoción de la sacarosa de las raices• Aumentar HR
– nebulización– Aspersión intermitente
• Luz reducida– Gasa– Malla Saran
Gradualmente reducir la HR e incrementar la luz
El tipo de enraizamiento preferido es el que se realiza fuera del cultivo in vitro
(ex vitro).
Esta bandeja de brotes ha sido sacado del ambiente estéril, y son cortados y
sumergidos en una solución con hormona enraizante, (auxinas)
… luego estos brotes (aun sin raiz) son plantados en un sustrato estéril,
estableciendo algo asi como un almácigo
Son trasladados a un ambiente con nebulización y poca iluminación,
asemejando las condiciones de cultivo in vitro
En los próximos 10 a 14 dias, la nebulización es reducida y las
coberturas retiradas, hasta que las plantas no necesiten extra
protección (por eje. las plantas de la derecha)
Los brotes ya enraizados son trasladados a recipientes mas grandes, e
incrementarán su tamaño en solo algunas semanas.
Para terminar el proceso de aclimatación, se trasladan a un tinglado al
menos una semana antes de su plantacion. Y después de todo este
trabajo, las plantas están listas para el campo definitivo.
Vitroplantas en invernadero
Sistemas de nebulización paravitroplantas
Micropropagación vegetal
México, Noviembre de 1998
• Indicios de que la industria del agave para tequila (Agave tequilana Weber var. Azul) tenía una gran demanda
• Por ende, se estaban realizando año con año plantaciones cada vez mayores.
• Las estadísticas de siembra indicaban necesidades de hasta 30 millones de plantas al año.
1999
• Se había declarado una fuerte necesidad de material vegetal de siembra sano para esta industria, dado que las enfermedades propias del cultivo estaban acabando con gran parte de las plantaciones.
(a) Selección de las plantas donadoras por su alta productividad
(b) Inducción de la planta madre para selección de tejidos libres de enfermedades
(c) Multiplicación de plantas in vitro por gemación axilar
(d) Plantas enraizadas al salir del laboratorio listas para su aclimatación en invernadero
(e) Plantas adaptadas al salir del invernadero
(f) Plantas micropropagadas de cuatro meses en el campo.
(g) Plantas micropropagadas de ocho meses en el campo.
AGROMOD, una subsidiaria de Savia en México
• El primer año de funcionamiento, se produjeron 400 mil plantas.
• En el año 2002 se lograron dos millones.
• Para el 2003 se proyectó superar los 4,5 millones, tomando en cuenta tres especies: Cordyline, banano y agave.
• Desde el punto de vista económico, no sólo se resolvió el desabastecimiento de material limpio, homogéneo y de calidad, sino que se logra un impacto altamente significativo en los costos de producción de materia prima para tequila.
COMPARACIÓN ENTRE LAPROPAGACION TRADICIONAL Y CULTIVO DE
TEJIDOS DE PLÁTANO
Propagación clonal de Carica papaya var. Maradol y Tainung.
• Propagación vegetativa rápida y a gran escala• Uniformidad seleccionada del material clonado.• Multiplicación de plantas recalcitrantesa las técnicas convencionales• Reducción en el tiempo de multiplicacióny en el espacio requerido para tal fin.• Mayor control sobre la sanidad del material propagado y posibilidad de Certificación.• Introducción rápida de nuevos cultivares• Conservación de germoplasma• Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal
Ventajas de la Micropropagación vegetal
• Instalaciones muy especializadas• Trabajadores especializados.• Contaminación.• Diferente protocolo de micropropagación dependiendo de la especie o cultivar.• Tamaño de la plántula, al inicio son muy pequeña.• Estabilidad genética.• Costos.
Desventajas de la micropropagación vegetal
Biofábricas
• Ornamentales:
•Bromeliaceas
•Helechos
•Orquídeas
•Anthurium
• Especies leñosas:
•Araucaria
•Coffea
•Eucalyptus
•Malus
•Rosa
•Vitis
• Otras plantas (hortícolas)
•Allium
•Apium
•Arachis
•Asparagus
•Beta
•Brassica
•Glycine
Ejemplos plantas
micropropagadas
in vitro
http://www.ejpau.media.pl/series/volume5/issue1/biotechnology/art-02.html
Organogénesis
Definición amplia:
Produccion de órganos a partir de explantes, sea indirectamente a traves del estadío de “callo” o directamente del tejido.
Sistemas de propagación vegetativain vitro
Propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta
Material de partida
1. Meristemos caulinares y segmentos de tallos con yemas axilares.
2. Tejidos que formen: tallos adventicios y/o embriones adventicios, directamente o indirectamente.
Micropropagación vegetal:Otros Explantes
•Parte esporofiticade estructuras reproductivas: estaminodios, estambres, pétalos.
•Hojas jóvenes.
- Multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes.
- Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas.
- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo.
- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.
Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes
Cortes Nodales
Las secciones nodales se cortan y se individualizan, usandose como explantes para producir nuevos talluelos.
El seccionamiento de los nodos elimina la dominancia apical .
http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/Chap3898/sld006.htm&h
Corte de secciones nodales
La tasa de multiplicación (t.m.) puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.
Ejercicio:
Cuantas vitroplantas se pueden obtener después de un año, con una tasa de multiplicación de 5 brotes por mes, a partir de una única yema inicial.
Mes 0: 1 broteMes 1: 5 brotesMes 2: 5 x 5 brotesMes 3: 25 x 5 brotes
Mes 12: ………………..
Multiplicación de brotes Vacciniummeridionale.
Tasa de multiplicación 15-25 brotes/explante
Callogénesis en la naturaleza
Organogénesis en Callos
+ Callos
++Callos
Embriones iniciados a partir de células que no son el productode la fusión de gametos.
Embrión somático, asexual o adventicio
Son estructuras bipolares con un eje radical-apical y no poseen conexión vascular con el tejido materno, las estructuras bipolares deben ser también capaces de crecer y formar plantas normales.
• La Embriogénesis Somática es laproducción de embriones a partir decélulas somáticas o “no-germinales”.
• Pueden ser producidas por cultivos desuspensión celular.
• Puede involucrar un estadio intermediariode callo (E. indirecta), lo cual resultaría enmayor probabilidad de variaciónsomaclonal entre las plántulas generadas.
Embriogénesis Somática
• Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas:– Masas proembriogénicas– Estadío globular– Torpedo– Embrión.
Embriogénesis Somática
• Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática:
1. Iniciación: callos embriogénicos2. Proliferación: callos embriogénicos, masas
proembriogénicas (PEM)3. Desarrollo y maduración de embriones :
embriones4. Germinación de embriones (Regeneración)
Embriogénesis Somática
Carrot: Cell suspension-derived Grapevine: Callus-derived
Semilla artificial - antecedentes
• Muchas especies son estériles y no producen semillas.
• Otras especies, en particular algunas tropicales, producen semillas recalcitrantes que no pueden ser secadas.
• Poca efectividad en la conservación del germoplasma y con grandes gastos (actualmente son con plantas vivas en el campo).
• Altos costes para la obtención de pequeñas cantidades de semillas híbridas.
Semillas artificiales
• Llamadas también semillas sintéticas• Producción en masa de semillas genéticamente
mejoradas.• Es la encapsulación de embriones somáticos, con
la finalidad de protección y nutrición, con un material permeable al agua y biodegradable.
Explante
(disco de hoja)Explanto
(células vegetales)
REGENERACIÓN
Suspensión celular
Embriones somáticos
ENCAPSULACIÓN
GERMINACIÓN
GERMINACIÓN Semilla
artificial
Callo
Esquema general de producción de semilla artificial
Procedimiento:1. Encapsular en
cápsulas de gel, recubrir con una cubierta adecuada, almacenar.
2. Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc.
Semillas artificiales
Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por
encapsulación en alginato
Producción sincronizada y en gran escala de los embriones somáticos
• Es fundamental contar con embriones:
– Simples
– Que no se fusionen entre sí
– Que no se generen embriones secundarios
• Se han desarrollado diferentes procedimientos basados en filtros y equipos clasificadores automáticos
• Son biorreactores que permiten el control simultáneo de pH, la concentración de oxígeno, temperatura y mezclado entre otras cosas.
Se han obtenido embriones somáticos en especies como:
• Alfalfa (Medicago sativa).
• Soja (Glycine max).
• Apio (Apium graveolens).
• Pasto ovillo (Dactylis glomerata) .
Etapas de la Micropropagación vegetal
A) Iniciación O Establecimiento
- Elección y acondicionamiento de la planta madre.
- Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo.
- Desinfección superficial de los explantes.
- Establecimiento per se del cultivo in vitro.
B) Multiplicación
- Multiplicación del material stock
Etapas de la Micropropagación vegetal
C) Enraizamiento
Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro
D) Aclimatación, Rusticación o Endurecimiento (Hardening)
Pasaje de las plantas crecidas in vitroa las condiciones de maceta o a campo
Etapas de la Micropropagación vegetal
Planta Madura
Hoja Joven
Antioxidante, retarda
el oscurecimiento
Del tejido
Desinfección con
Hipoclorito de
sodio Sumergido en etanol
Cortar en segmento (descartar
porciones externas)
Placa petri estéril
Insertar segmentos
dentro de medio de
multiplicación
4 a 6 semanas
Primordios
Plantas pequeñas
Crecimiento
Continuo
Dividir en subcultivos
y colocar en medio de
multiplicación fresco
Separar las plántulas
individualmente
Medio de Pre trasplante
Planta joven
en su maceta
Las 4 etapas del cultivo de tejidos de plantas
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Formación de la raíz
Métodos de enraizamiento
Enraizamiento in vitro
Enraizamiento ex vitro
Cultivo de Meristemas
Principales métodos de Micropropagación
MeristemasLos meristemas son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta.
Los meristemas determinan el crecimiento de
la planta y dan origen a sus diferentes órganos
Aplicaciones
• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. Sin embargo, toma más tiempo la producción de brotes.
• Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.
• Son ampliamente utilizados como explantespara la criopreservación y conservación de germoplasma.
Domo Meristemático + primer juego de hojasMeristema apical
Primordios foliares
El cultivo de meristemas no incluye los
meristemas laterales. Solo el meristema apical.
Yemas laterales
Tejido para el cultivo de
meristemas
- El domo meristemático no está vascularizado(muchos patógenos se translocan por los tejidosde conducción).
- El número de partículas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.
El cultivo de meristemas facilita la eliminación de patógenos
Existen varias alternativas complementarias al cultivo de meristemas, para obtener plantas libres de virus:
Limpieza de virus
Termoterapia Quimioterapia
Talluelos in vitro son colocados en una camara de crecimientopor 3-6 semanas a una temperatura de 34-38 oC.Después de la termoterapia, los meristemas se extraen parael cultivo.
Termoterapia
Esta práctica no es efectiva para todos los virus por igual,
depende del virus y del hospedante.
Se ha observado que un mismo virus en distintas especies
se inactiva en forma diferente. Generalmente, esta práctica
ha resultado más efectiva en virus de partículas alargadas, y
menos eficiente para virus poliédricos.
En algunos casos las bajas temperaturas (5°C) seguidas del
cultivo de meristemas fueron utilizadas con éxito para la
eliminación de virus.
Esta práctica fue aplicada principalmente en el caso de
viroides, los cuales se desarrollan bien con altas
temperaturas.
Termoterapia
El uso de antivirales sería la solución definitiva para las
enfermedades virales; sin embargo, hasta ahora no se ha
encontrado un producto que por sí solo cumpla esta
función.
Algunas sustancias químicas ocasionan una disminución
en la concentración de virus existentes en la planta y
atenúan, o suprimen, los síntomas típicos de los virus,
pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la
concentración original.
Han sido evaluadas diferentes sustancias pero la más
utilizada es el Ribavirin o Virazole.
Quimioterapia
Un problema importante con el Virasole es su fitotoxicidad,
que a su vez depende de la dosis empleada y de la
especie de planta utilizada.
El éxito del proceso en muchos casos requiere de varios
meses de tratamiento y la fitotoxicidad del antiviral
constituye una dificultad.
También se han obtenido plantas libres de virus a partir de
callos a los que previamente se les aplicó Virasole, aunque
esta práctica no ha sido eficiente en todos los casos.
Quimioterapia
Un modo adecuado de emplear los antivirales es
combinándolos con el cultivo de meristemas.
También han sido aplicados directamente a los
meristemas in vitro.
En este caso, el antiviral es colocado en medio del
cultivo en concentraciones variables, que van desde 10
a 50 mg/l, y en algunos casos hasta 100 mg/l. Las
plantas son mantenidas bajo la acción del antiviral por
largos períodos que incluyen varios subcultivos.
Quimioterapia
Piña
Tamaño del meristemo: 2 mm
Intensidad luminosa: 3000 lux
Fotoperiodo: 12 horas de luz
Temperatura: 28 +/-4°C
Medio de iniciación y establecimiento: (MS)
• BAP : 2.0 mg/l + ANA: 1 mg/l
Medio de enraizamiento: (MS)
• ANA : 2 mg/l
Resultado: Plantas asépticas de piña
Plátano
Tamaño del meristemo: 0.5-0.7 mm
Intensidad luminosa: 2000 lux
Fotoperiodo: 16 horas de luz
Temperatura: 26-28°C
Medio de iniciación: Murashige & Skoog (MS)• BAP :1.0 mg/l
Medio de multiplicación: (MS)• BAP :3.0 mg/l
Medio de enraizamiento: (MS), sin hormonas
Resultado: Plantas de plátano asépticas.
Manzano
Tratamiento con calor: 37°C x 2 semanas
Tamaño del meristemo: 0.8-1.0 mm
Intensidad luminosa: 3000 lux
Fotoperiodo: 16 horas de luz
Temperatura: 26°C
Ribavirin: 25 ug. x 2 subcultivos (40 días)
Medio de iniciación: Murashige & Skoog• BAP :1.0 mg/l
Resultado: Plantas de manzano libres de virus.
Casos: limpieza de virus
Cuadro 4. Eficacia de Virazole para
eliminación de virus en papa.
• Entre las enfermedades que afectan a este cultivo, los virus son los responsables de las mayores pérdidas (entre un 20 y 80% de disminución en el peso de los bulbos).
• Las infecciones son causadas por un complejo viral que incluye:– Potyvirus (Onion yellow dwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe
virus, LYSV);
– Carlavirus (Garlic common latent virus, GCLV y Shallot lantentvirus, SLV),
– Allexivirus (Garlic virus-A, -B, -C, -D, -E, -X, GarV -A -B -C- D- E -X; Garlic mite-borne filamentous virus, GarMbFV).
Producción de plantas de ajo (Allium sativum L.)
libre de virus
Para ello dientes de ajo fueron sembrados en terrinas con una mezcla de tierra/mantillo/arena (1/1/1) y mantenidos en una cámara a 36ºC.
Cuando plantas de ajo Blanco fueron sometidas 60 días a 36°C y luego se hizo el cultivo de meristema, se regeneraron pocas plantas, pero las que se obtuvieron resultaron «libres de virus».
Producción de plantas de ajo (Allium sativum L.)
libre de virus
A: planta en medio de iniciación.
B: micropropagación.
C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos).
D: planta transferida a tierra y mantenida en cámara húmeda.
E: planta adaptada a las condiciones ex vitro.
F: plantas en suelo bajo jaula antiáfidos.
G: multiplicación a gran escala bajo jaula antiáfidos.
H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo).
Esquema de producción
Plantas de ajo libres de virus
IFFIVE-INTA,Argentina.
Métodos para detección de fitopatógenos
Métodos SerológicosELISA: Enzyme-linked Inmunosorbent Assay
Ensayo de inmuno absorción ligada a enzima (tipo sandwich)
Ralstonia solanacearum Bv2A (Raza 3)
• Bacilo gram negativo
• 0.5 x 1.5 um
•Presenta flagelo polar ( atípico)
• Aerobia estricta
• Temperatura óptima: 28-30ºC
Marchitez Bacteriana o pudrición parda de la papa
• Segundo factor más importante que limita la producción de papa
• Gran variabilidad del patógeno
• Amplio rango de hospedantes
Amplia distribución geográfica
Peru: Marchitez bacteriana, Seca seca,
bacteriosis, borrachera
Nombres:
Mucilago típico en el tubérculo
Advanced rotting involving secondary infections
Probredumbre parda
Pudrición parda, moco, mokera, papa llorona
RssBact / ml
108
107
106
105
(+E)
Control
(-E)
Muestranegativa
Muestrapositiva
+E = Extracto de suelo sano con enriquecimiento- E = Extracto de suelo sano sin enriquecimiento
Métodos moleculares
Fase 4 de la micropropagación
La Aclimatación
Endurecimiento (hardening), Rustificación,
etc.
Aclimatación
• Adaptación de las plántulas de cultivos de
tejidos al ambiente externo.
• Medios ambientes extremadamente
diferentes – fuera y dentro.
• Puede requerir técnicas especiales para la
adaptación o fortalecimiento.
Aclimatación
• La mayoria de plantas no pueden ser
transferidas directamente de cultivo al
invernadero o campo.
• Muchas de las caracteristicas de plantas
desarrolladas in vitro son muy diferentes de
las plantas que crecen in situ.
Medios ambientes
• Cultivo de tejidos
– Poca luz
– Alta HR ~98%
– [CO2] - 300 ppm
– Sacarosa presente
– Esterilidad
• Invernadero/Campo
– Alta luz
– HR ~ 30-80%
– [CO2] - bajo
– No sacarosa
– Patogenos presentes
Cambios en las vitroplantas
• Cera epicuticular
• Funcionamiento estomatal
• Anatomia de las hojas
• Funcionamiento de las raices
Plantas Hiperhídricas
• Los más extremos – una maladaptación al medio
ambiente externo.
• Vidriosas, apariencia estar llenas de agua.
• Capa de la palisada pobremente desarrollada.
• Reducida lignificación.
• Paredes celulares delgadas.
• Espacios intracelulares grandes.
• Falta de la cera epicuticular.
Causas de la Hiperhidricidad
• Estado fisico del medio
– Liquido
– Agar
– Gelrite
• Citokininas
Vitroplantas “Normales”
• ¿Pueden ser las vitroplantas “normales”?
• Muchos sintomas de hiperhidricidad son
poco severos
– Cuticula desarrollada pobremente.
– Pueden tener cera epicuticular
– Espacios intracelulares grandes
– Desarrollo minimo de la palisada.
Pérdida de agua
Deben ocurrir cambios
• Se debe formar la cera epicuticular.
• Los estomas deben responder mas
rapidamente.
• La actividad fotosíntetica – incrementada.
• Obs: la cantidad de los cambios no es la
misma para todas las plantas.
Funcionamiento estomatal
Epicuticular
Wax
• Carnation tc plants
A. Tissue culture
B. Growth chamber
C. Growth chamber
D. Abnormal
E. Greenhouse
F. Abnormal
Epicuticular
Wax
• Carnation
A. Greenhouse
B. Greenhouse
C. Tissue culture
D. Tissue culture
Epicuticular wax on plants
Anatomia foliar
• Cuticula delgada.
• Grandes espacios intracelulares con aire.
• Capa de celulas en empalisada pobremente
desarrollada.
Strawberry - Greenhouse grown
palisade
layers
spongy
mesophyll
air spaces
Strawberry - Tissue culture
large
air
spaces
one layer
of
palisade
cells
Conductancia de vitroplantas
Técnicas para Aclimatación
• Remoción de la sacarosa de las raíces
• Aumentar HR
– nebulización
– Aspersión intermitente
• Luz reducida
– Gasa
– Malla Saran
• Gradualmente reducir la HR e incrementar la luz
At C&W, as with many commercial labs, rooting in culture (in vitro) is skipped in favor of rooting out of
culture (ex vitro). This tray of unrooted microshoots has now been taken out of the sterile environment.
The microcuttings, as they are called, are trimmed up and soaked in a rooting hormone (auxin) solution...
...then planted in flats much like young bedding plants. At this point they still have
no roots.
Mist Systems for TC Plants
Flats of unrooted microcuttings are transferred to a fog chamber within a
greenhouse. Directly out of culture, the plantlets need high humidity levels and
reduced light (similar to the in vitro environment).
Over the next 10-14 days, fogging is diminished and the tent opened up, until the
plants do not need extra protection (ie. the plantlets on the right). This process is
known as acclimatization or hardening off.
The microcuttings have rooted, transplanted into larger cells, and increased
greatly in size in only a few weeks.
After all that work, the plants are ready for the field. They are moved to a shade
house at least one week before planting to finish the hardening-off process
Cultivo de los gametos de la planta: microsporas u óvulos (células germinales).
Estas son haploides (1 juego de cromosomas).
Las plantas regeneradas son haploides.
Las plantas regeneradas esteriles.
No pueden llevar a cabo la meiosis.
El número de cromosomas necesitan ser duplicado y obtener plantas dihaploides (lasplantas recuperadas son diploides y 100% homocigotas, AABBCCDDEE, AABBCCDDee, aabbccddee, AAbbCCddEE).
Se usan inhibidores de la mitosis: colchicina, fluoralina.
“Fija” los rasgos, disminuyendo el tiempo de mejoramiento.
La mayoría de variedades de Canola son dobles haploides.
P: AABBCCDDEE x AABBCCDDee
F1: AABBCCDDEe x AABBCCDDEe
F2: ¼ AABBCCDDEE, ½ AABBCCDDEe, ¼ AABBCCDDee
F3:
HAPLOIDES: ABCDE, ABCDe
DIHAPLOIDES: AABBCCDDEE, AABBCCDDee
Técnica de micropropagación in vitro, que cultiva
anteras de cultivares elite para regenerar plantas
haploides y diploides (líneas homocigotas), sin
pasar por la endogamia artificial.
Desarrollada por Guha y Maheshwari (1964), en
petunia, hoy se ha extendido a más de 150
especies: arroz, trigo, cebada, maiz, oleginosas,
tabaco, etc.
Las células gametofiticas (microsporas o megasporas) originan
esporofitos haploides por androgenesis y ginogenesis,
respectivamente.
Las anteras inmaduras, son cultivadas en un medio donde se
dividen para formar callo y posteriormente regenerar plantas
haploides.
Los haploides duplicados producen progenie homogénea y
estable .
Lineas completamente homocigotas son producidas en la mitad
del tiempo requerido por el proceso convencional (v.g. arroz)
Recombinant Inbred Lines (RILs)
Fácil de evaluar en cualquier etapa del proceso
Lento desarrollo del mejoramiento genético por
los bajos porcentajes de regeneración.
Limitaciones técnicas:
- Renuencia a la regeneración de plántulas.
- Bajos porcentajes de plantas haploides.
A. Genotipo de las plantas donantes
Variabilidad en la respuesta al cultivo de anteras,entre especies y dentro de ellas; y suheredabilidad.
Muy evidente en cultivares de ARROZ
La capacidad genotípica de la cebada y trigo, sonrasgos heredados respecto a la formacion decallos y regeneracion de plantulas
B. Ecofisiologia de las plantas donantes
El fotoperiodo
Intensidad luminosa
Temperatura
Nutrición mineral
En tabaco, trigo, cebada y arroz, los granos de polen son morfológica y funcionalmente diferenciados.
.
C. Desarrollo del polen
• Mejor respuesta se tiene cuando se cultiva el polen entre la fase de microspora tardía y de polen temprano
D. Pretratamiento de las anteras
• Temperaturas bajas o altas, con choque osmótico o con otros estimulos – AUMENTA LA PRODUCCION DE PLANTAS A PARTIR DE POLEN
• Anteras o paniculas de arroz a 35oC/10 - 15 min. seguido de 8 dias a
10oC - AUMENTA LA RESPUESTA AL CULTIVO DE ANTERAS
• El tratamiento de frío se relaciona con una disminución del albinismo
de cereales y la estimulación de la mitosis ecuacional de las
microsporas androgenéticas
E. Medio de Cultivo
• Medio liquido: aumenta enormemente el porcentaje de plantasandrogenéticas
• Hay correlación entre el medio de inducción de callos y la tasa deregeneración de plántulas de ARROZ
• Mayor porcentaje de regeneración/numero de anteras plaquedas,hubo en callos inducidos en medio liquido y menos en mediosemisólido
• La adición de extracto de papa al medio de inducción, aumenta la producción de plantas.
• Niveles altos de sacarosa para inducción de callos y bajos niveles para la regeneración.
• Mayor concentración de auxinas para la inducción de embriones y callos.
Protocolo
• Separación y siembra de anteras en medio de cultivo (ejm. mediolíquido N6 de Chu, 1978)
• Formación de callo y posteriormente embrioides (25°C en luz uoscuridad)
• Plántulas haploides regeneradas se someten a luz continua (3000 lux)
• Vitroplántulas de 0.3 cm, se extraen y transfieren a un medio deenraizamiento (12 h. de luz y 6000 lux)
RESUMEN
Se estudió el efecto de la exposición a 4 °C (durante 7, 14 y 21 días) y diferentes concentraciones de fitohormonas sobre la regeneración de plantas a partir de anteras de arroz (Oryza sativa L.), cv. Japónica H2005
Los resultados mostraron que el tratamiento a 4 °C por 7días estimuló la inducción de callos. Las fitohormonas fueron esenciales para esta inducción, lográndose el mayor efecto con una combinación de 2,4-D (1.5 mg L-1) y KIN (1 mg L-1). Se obtuvo también mayor formación de brotes y raíces con la misma auxina y BAP (0.5 mg L-1)
La transferencia a un medio de cultivo sin 2,4-D, permitió obtener 37.5% de conversión a plantas haploides
Figura 2. Regeneración in vitro de plantas de arroz cv H2005 por cultivo de anteras.
A: Anteras
Figura 2. Regeneración in vitro de plantas a partir de anteras de arroz cv Japónica H2005
B: Inducción de callos
Figura 2. Regeneración in vitro de plantas a partir de anteras de arroz cv Japónica H2005
C: Formación de brotes
Figura 2. Regeneración in vitro de plantas a partir de anteras de arroz cv Japónica H2005
D: Formación de raíces
Figura 2. Regeneración in vitro de plantas a partir de anteras de arroz cv Japónica H2005
E: Regeneración de vitroplántulas
Figura 2. Regeneración in vitro de plantas a partir de anteras de arroz cv Japónica H2005
E: Plántula haploide de arroz
Util para aquellas especies de ciclo de crecimiento largo
o para aquellos cultivos de ciclo corto, que se
desarrollan a una tasa de un ciclo por año.
Ejm. La homocigosis del arroz se consigue en 1.5 a 2
años, lo que normalmente se hace en 3 o 6 años
El cultivo de anteras en tabaco es el sistema mas
avanzado para obtener haploides diploidizados
Progreso considerable con algunos cereales: trigo,
cebada y arroz.
El potencial de las anteras depende de la genotipo de las
células madre del polen
Permite seleccionar eficazmente los recombinantes
deseables; asi como, obtener lineas homocigotas
Las lineas homocigotas regeneradas fijan su genotipo y no
sufren segregación adicional
En los haploides duplicados no hay codominancia; i.e.,el
fenotipo = genotipo y aumenta la eficiencia de la selección
AaBbCcDDEeFF -> AABBCCDDEEFF y aabbccddeeff
El tiempo, el espacio y los costos son muy reducidos.
Seguirá siendo el método potencialmente mas eficaz para
obtener plantas haploides
Debe de tenerse en cuenta dos serias limitaciones:
Fuerte dependencia genotipica
Escaso número de plantas regeneradas
Técnicas moleculares dan valiosa información sobre la genética
de caracteres relacionados con el cultivo de anteras
Deberá ser accesible a otras especies cultivadas como: yuca y
maiz
A partir de Microsporas
Re-programación del desarrollo de la microspora para lograr la formacion directa de un embrion.
Embriogenesis de Microsporas
Finalidad
Genera un gran numero de plantulas esporofiticasdihaploides que son equivalentes a las lineashomocigoticas derivadas de retrocruza.
Acorta el ciclo de mejoramiento por 20-40% (un doble haploida F6 de retrocruza)
Expone los rasgos recesivos. Permite un facil tamizado de grandes poblaciones.c
¿Como?
Seleccionar yemas florales con anteras conteniendo predominantemente microsporas en un estadio temprano de desarrollo.
Colapsar las anteras e aislar asepticamente las microsporas.
Realizar un Cultivo en suspension de microsporas a una alta densidad poblacional bajo condiciones determinadas, y usualmente con un tratamiento de ‘shock termico´.
Caso: Canola (Brassica napus). Se regeneraron Plantas Dihaploides con un alto contenido acidos oleico y linoleico reducido y acidos α-linolenico en el aceite de la semilla. Se probaron en el campo por la estabilidad del perfil de acidos grasos y rasgos de rendimiento.
Microsporas uninucleadas en suspension(Brassica napus)
Embriones en estadio temprano}(7-10 dias)
Embriones estadio Medio (10-14 dias)
Embriones estadio tardio(21 days)
Embriones cotiledonarios en estadio tardio
“Germinacion”
Embriones Cotiledonarios transferidos a condiciones de crecimiento con luz y AG3.
Crecimiento de plantulas haploides en cultivode medio semi-solido
Plantula bien-desarrollada haploide lista para transferencia a suelo, o para duplicacion
cromosomica
Plantas Maduras Dihaploides
Conservación de
Germoplasma
1. Recolección de germoplasma (accesos o accesiones).2. Evaluación y caracterización.3. Conservación.4. Programa de mejoramiento:
a. Cruzasb. Selecciónc. Estabilizaciónd. Evaluación regional (ambientes)e. Validación
5. Registro comercial.6. Programa de reproducción de semilla.7. Mercadeo.
Proceso de investigación y desarrollo de una nueva variedad
Qué son los recursos genéticos
• Según la Convención de Diversidad Biológica (1992), los Recursos genéticos son material genético de valor real o potencial, o también son consideradas las variaciones acumuladas por un cultivo durante su proceso evolutivo.
• Pueden definirse como materiales biológicos con valor actual o potencial, que contengan unidades funcionales de herencia o “un acervo de información evolutivamente relevante” .
Valor de los recursos genéticos
• En la naturaleza podemos encontrar que ya se tienen las soluciones a muchos de los problemas que queremos resolver.
• El ser humano las ha aprovechado por mucho tiempo, imitando, seleccionando y mezclando los atributos de los organismos, modificando organismos directamente:– “idea”… por ejemplo: El velcro.– “selección”… variedades de maíz– “técnicas biotecnológicas”… organismos
genéticamente modificados
Velcro
Valor de los recursos genéticos
• Los procesos evolutivos han seleccionado una gran diversidad de organismos.
• La sobrevivencia de estos organismos esta basada en un paquete de estrategias de defensa, ataque, alimentación, etc.
• Estas características están codificadas en su información genética.
• Han contribuido y contribuye a la estabilidad presente y futura de:– Agricultura y ganadería– Medicina (etnobotánica)– Procesos industriales
• Aprovechamos los recursos genéticos físicamente:– como material biológico (ej. Barbasco).– como material para mejora genética con
mercados más o menos operantes.
Valor de los recursos genéticos
• El avance tecnológico multiplica el valor de los recursos genéticos– Bioensayos farmacéuticos.– Ingeniería genética.
lo cual también hace uso de los recursos genéticos como INFORMACIÓN.
• Estamos en una era basada, no en lo que podemos extraer de la naturaleza, sino en lo que podemos aprender de ella.
Valor de los recursos genéticos
Contribución de los RRGG a la economía del pais: desafios y amenazas
Convención de la Diversidad Biológica
1. La conservación de la biodiversidad.
2. El uso sostenible de sus componentes.
3. El disfrute justo y equitativo de los
beneficios obtenidos de la utilización de
los recursos genéticos.
• Importancia: • Seguridad alimentaria.
• Salud.
• Valor espiritual y religioso.
• Agua fresca, combustibles, materiales de
construcción, ropa.
Pérdida de la biodiversidad (influencia antropogenica)
• Urbanización (agua, vivienda, salud, educación, etc.)
• Mayor presión sobre los recursos (erosión suelos, deforestación, sobrepastoreo, salinidad, > uso de energía no renovable, etc.
• Cambio climático (climas extremos, aparición de nuevas plagas y enfermedades), etc.
• Domesticación y selección.
Consecuencias de la domesticación
Las plantas domesticadas se caracterizan por:
- Rasgos que confieren adaptación al ambientehumano.
- Pérdida de capacidad reproductiva, dedispersión de la semilla e inactividad de lasemilla.
- Pérdida de capacidad adaptativa.
Del teosinte al maíz moderno
Erosión genética
1. Disminución de lafrecuencia de un aleloen una población, hastasu extinción
2. Disminución de ladiversidad de la razadentro de la región
3. Extinción odesaparición de la razaen la región
Principales amenazas de la
biodiversidad
• Especies foráneas invasivas.
• Cambio climático.
• Incremento de nutrientes y contaminación.
• Cambio de habitat.
• Sobreexplotación.
Los conductores indirectos que interactuan en formas complejas para
causar cambios en la biodiversidad inducidos por la humanidad. Son
los factores demografico, economico, socio-politico, cultural, religioso,
cientificp y tecnologico
Desafíos
• Población 27 000 000 (doblará en 30-40 años), 40% rural.
• 4,2 millones de Has (3,3 % del territorio peruano).
• 0,16 Has per cápita (uno de los más bajos de los países en desarrollo).
• Cerca de 25 000 sp. de plantas:
– 180 sp. domesticadas
– 1044 sp. de uso medicinal
Tipos de conservación
Conservación «in situ»
Conservación in situ
• Se lleva a cabo en los “laboratorios de la evolución”(campo de agricultores, parques nacionales, reservas naturales).
• Puede tener un componente participativo de las comunidades o agricultores.
• Tiene en cuenta el potencial evolutivo del material ya que los recursos genéticos tiene que hacer frente a factores bióticos y abióticos, así como al flujo de genes.
• Cultivos están sujetos a presión de selección, control del flujo de genes con parientes silvestres, y entre cultivares.
• Material de bancos pueden ser introducidos (repatriados), probados, incrementados y llegar a adaptarse.
• En el tiempo y espacio: selección, migración, deriva y recombinación.
Casos de conservación in-situ
• IPGRI (ahora Bioversity): Fortalecimiento de las bases científicas de la conservación in-situ
• IIAP/INIA/ONGs: Conservación in-situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres
• CONDESAN: Raíces y tuberosas andinas
• EE Andenes, INIA: Rescate de variedades
• Conservación de especies amazónicas
• Selección participativa y producción descentralizada de semilla
Casos de conservación in-situ
Conservación «ex situ»
Conservación «ex situ»
• Bancos de semillas (Cámaras de conservación de semillas)
• Colecciones en campo: plantas perennes, agámicas con semillas recalcitrantes.
• In vitro.
• Jardines botánicos.
• Crio-conservación.
• Conservación de polen.
• Conservación directa de ADN.
Accesión
• También llamada: entrada o acceso
• Unidad de conservación ex situ.
• La semilla se accesa a un banco de germoplasma cuando se conoce su origen, su representatividad y cuando tiene información sobre su origen e identificación.
• Banco de germoplasma: son campos, invernaderos, laboratorios, cámaras frías donde se conservan recursos genéticos.
• Bancos germoplasma en el Mundo: 1460
• N° aproximado de muestras conservadas: 5 400 000
• Limitante: escasos recursos financieros para
– Mantener cámaras frías y conservar viabilidad semillas.
– Regenerar semillas para asegurar su viabilidad
– Caracterización y evaluación
– Documentación para dinamizar su utilización
Bancos de Germoplasma
Germoplasma en los centros del CGIAR (Consultative Group I Agriculture Research)
Centro Especie Número de accesiones
CIAT Frijol común 36,000
Frijol (especies relacionadas) 5,100
Yuca cultivada 4,600
Yuca silvestre 30
Leguminosas forrajeras 18,000
Gramíneas forrajeras 2,500
CIMMYT Maíz 10,500
Trigo 60,000
Germoplasma en los centros del CGIAR
Centro Especie Número de accesiones
CIP Papa cultivada 5,000
Papa silvestre 1,500
Camote 5,200
ICARDA Gramíneas (Cebada, trigo) 50,000
Leguminosas (Lenteja, haba, garbanzo) 17,000
Especies forrajeras 20,000
ICRISAT Sorgo 22,500
Mijo 16,000
Garbanzo 24,000
Maní 14,300
Cajanus 11,000
Germoplasma en los centros del CGIARCentro Especie Número de accesiones
IITA Camote 1,000
Plátano 450
Yuca 2,000
Dioscorea 1,000
Caupí 15,000
Arroz 12,000
Bambara 2,000
Soya 1,500
Vigna 800
ILCA Gramíneas 1,500
Leguminosas 6,500
Forrajeras arbustivas 1,400
IRRI Arroz (Oriza sativa) 80,000
Arroz (especies relacionadas) 4,521
Conservación de semillas
Conservación in vitro
Bajas temperaturas y/o alta concentración osmótica en el medio de cultivo
Infraestructura para incubación de los
cultivos in vitro
• Cultivo in vitro de bajo nivel de
crecimiento:
– Almacenamiento frio: 0 – 15° C. considerar un
deshumidificador.
– Almacenamiento templado: 15 – 35°C.
• Cultivo in vitro sin crecimiento
– Almacenamiento criogénico
Número de réplicas en una accesión
• En bancos de germoplasma en todo el
mundo, el número de replicas en campo
varía, por ejemplo:
– 22 a 100 para pastos y forrajes.
– 5 a 10 para Cassava.
– 10 a 12 para el camote.
– 2 a 3 para ajo, arboles o arbustos
– 6 a 10 para plantas herbaceas
– 3 a 20 para plátano/banano
Número de réplicas en una accesión
• El mantenimiento de tales replicas
requieren espacio y mano de obra, los
cuales son factores limitantes.
• Si se realiza una caracterización botánica
o morfológica, se requerirán pocas
plantas, sin embargo, la caracterización
agronómica si requiere una considerable
cantidad.
Número de réplicas en una accesión
• Para las colecciones in vitro, el numero de
replicas varia de 3 a 20, dependiendo del
cultivo o especie en particular.
Mantenimiento de la estabilidad genética
Variación genética debe ser reducida al mínimo
1. Plantas propagadas por semilla
Colección base:-18°C, asume regeneración después de 50 años.
-196 °C, podría ser bueno para semillas recalcitrantes.
Apropiado para pequeñas poblaciones.
Colección activa/trabajo: 4° C, regeneración c/20 años aprox.
Estabilidad
2. Plantas propagadas clonalmente/semillas recalcitrantes
• Campo
• In vitro: colección base (6 – 8 °C), col activa (16°C). Reacción diferente de genotipos a los protocolos
• Criopreservación (-196 °C): en investigación. Exitoso para embriones.
Ejemplo de Crioconservación:
Banano
Justificación
• El “International Network for the Improvement of Banana and Plantain” (INIBAP), es responsable por la colección mundial del germoplasma de Musa.
• La colección cuenta con más de 1100 accesiones, tanto de especies silvestres, como de variedades cultivadas.
Justificación
• Actualmente, la colección se mantiene in vitro, en condiciones de crecimiento lento (baja intensidad de luz y temperatura baja) con el fin de reducir las tasas de crecimiento de los cultivos.
• A pesar de estas condiciones, aún es necesario hacer nuevos cultivos de todas las accesiones una vez al año con riesgos de contaminación por bacterias endófitas.
• Asimismo, las accesiones que se mantienen in vitro, aún bajo condiciones de crecimiento lento, están expuestas a la variación somaclonal.
Técnica que asegura un almacenamiento a largo plazo y a costo reducido de los recursos genéticos de especies que tienen semillas recalcitrantes o se propagan vegetativamente.
Aplicable a cualquier tipo de tejido vegetal con potencial de regeneración y se realiza a temperatura ultra baja, como la del nitrógeno líquido (-196 °C).
Qué es la Crioconservación o Criopreservación?
Antes, los protocolos de crioconservación para tejidos vegetales involucraban un congelamiento lento en presencia de mezclas crioprotectoras que contenían DMSO (sulfóxido de dimetilo), azúcares, glicerol y/o prolina.
Implicancia: deshidratación inducida por la congelación que dejaba menos agua en las células para que formen cristales de hielo durante la exposición a las ultra bajas temperaturas.
• Podemos mencionar dos protocolos:
A) Congelamiento rápido de los cultivos de meristemas altamente proliferantes precultivados durante dos semanas en 0,4 M de sacarosa.
B) La Vitrificación de los cultivos de meristemas altamente proliferantes precultivados en sacarosa (el más exitoso).
Crioconservación en Banano
Crioconservación en Banano
• La “Vitrificación” es usada en la actualidad.
• Involucra un tratamiento con soluciones crioprotectoras seguido por la deshidratación con soluciones de vitrificación de alta concentración.
• Las tasas de regeneración después de la descongelación, dependen del cultivar y del método utilizado.
AISLAMIENTO,
PURIFICACIÓN Y CULTIVO
DE PROTOPLASTOS
Desinfeccion Inmersion en
agua
Preplasmolisis
Eliminar la
epidermis
Enzimas Pared Celular
Protoplasto
Tratamiento Enzimatico
Protoplastos
Aislados
Proceso de lavado para eliminar desechos
Cultivo en
medio
semisolido
AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PROTOPLASTOS
Usos
• Estudio del comportamiento de la membrana plasmática, incluyendo el ingreso de macromoléculas y virus.
• También se usan ampliamente en la transformación genética de bacterias y de células vegetales.
• Al estar desprovistos depared, es más fácilintroducir ADN exógeno enlos protoplastos, que en lasbacterias o célulasvegetales íntegras.
• Son ampliamente usados enIngeniería Genética deBacterias y en el estudio dela expresión temporal degenes en plantas.
• Se puede regenerar unaplanta completa usandomicropropagación, unatécnica moderna usada encultivo de tejidos vegetales.
Usos
• Se usan protoplastos en el mejoramientogenético vegetal. Para ello se usa una técnicaconocida como fusión de protoplastos, en la queprotoplastos de diferentes plantas se fuerzan afusionarse para generar tejidos híbridos. De estaforma se puede generar:– Plantas poliploides, fusionando dos plantas de la misma especie,
lo que lleva a una duplicación del número de cromosomas queposeen respecto a las plantas originales.
– Plantas que posean cromosomas de distintas especies ovariedades en una misma planta, a partir de la fusión de dosplantas diferentes.
Protoplastos aislados
a. El tejido debe ser joven y contener alta proporcion de celulas
meristematicas.
b. El tejido consiste en celulas sin un excesivo engrosamiento secundario
de las paredes celulares.
c. Tejido inicial en dicotiledoneas es proporcionado por hojas jovenes en
expansion los cuales deben ser desinfectadas sin daño a los tejidos.
d. Un “semillero” continuo de tejido fuente ya desinfectado o aseptico
puede ser dado por el subcultivo de meristemas de dicotiledoneas.
e. Es dificil regenerar plantas de tejido foliar de monocotiledoneas.
f. Los embriones inmaduros escindidos de flores fertilizadas produce
callos embriogenicos, que suministra tejido inicial para el aislamiento
de protoplastos.
Fuente de tejido del explante
Medio de cultivo para cultivo de protoplastos
a. El medio usado para el mantenimiento de cultivo de
tejidos de las especies o genotipos que están siendo
estudiados sirve de base para formular la composición de
un medio de cultivo de protoplastos.
b. Los iones amonio son a menudo tóxicos para los
protoplastos los cuales deben ser reducidos u omitidos.
c. La presión osmótica de la solución externa debe ser
ajustada por la adición de azucares no metabolizables y
azucares alcoholes, tales como manitol o sorbitol
Composición de un medio inorgánico usado
para el aislamiento de protoplastos
Concentracion (mg l-1)
27.2
101.0
1480.0
246.0
0.16
0.025
5.8
Constituyentes
KH2PO4
KNO3
CaCl2 2H2O
MgSO4 7H2O
KI
CuSO4 7H2O
pH
Sales CPW
Preplasmolisis y disolución de la pared celular de los
explantes
a. Tejidos como hojas, tallos, o raices deben cortarse en tiritas y
mantenidas 1 hora en una solucion osmotica que contiene una
mezcla de sales inorganicas tales como las sales CPW y 13% w/v
de manitol como un osmoprotector para prevenir que la celula
pierda o gane agua despues de la remocion de la pared celular.
b. Si el tejido inicial proviene de in vitro, se puede hacer un
desagregado de las celulas y luego mantenerlos en el medio
osmotico a 25°C.
c. Los tejidos son luego expuestos a una mezcla de enzimas liticas en
la solucion osmotica. La digestion con diferentes enzimas puede
hacerse de manera secuencial o simultaneamente.
d. El periodo de exposicion depende de la fuente del tejido y de la fuerza
de las enzimas, por ejemplo las hojas cortadas de la mayoria de
especies pueden ser incubadas en 1% celulisina, 0.1% macerozyme
R10 y medio CPW13M at pH 5.6 de un dia para otro en oscuridad.
e. Para los cereales, donde se le ha eliminado la epidermis a las hojas, la
mezcla consiste en 2% celulisina, 0.2% macerozyme R10, 0.5%
hemicelulasa, 1% sulfato de dextran potasio, 11% manitol a pH 5.8
usando un buffer Tris-malato e incubado en la oscuridad por 1-2 h y
para la mayoria de cultivos de tejidos la mezcla de incubacion consiste
en 2% rhozyme HP150, 2% meicelase, 0.03% macerozyme R10 y
medio CPW13M a pH 5.8 e incubado de un dia a otro en oscuridad.
Preplasmolisis y disolución de la pared celular de los
explantes
f. Las celulas son luego separadas de tal mezcla enzimatica por
filtracion a traves de un filtro de tamiz muy fino (tamaño poro 64 mM)
y centrifugando a baja velocidad (100g por 10 min).
g. Los protoplastos son resuspendidos en 5 ml del medio osmotico sin
enzimas y luego se realiza otra centrifugacion.
h. El precipitado es separado de los desechos transfiriendolo con
pipeta a una solucion densa (19-20% sacarosa o 30% Percoll) luego
se repite la centrifugacion pero esta vez los desechos van al fondo y
los protoplastos van a la superficie.
i. La banda flotante formada de protoplastos es posteriomente
transferida cuidadosamente con pipeta y luego cultivada en un
medio MS, 2.0 mgl-1ANA, 0.5 mgl-1 BAP, 3% sacarosa y 9% manitol)
Preplasmolisis y disolución de la pared celular de los
explantes
Influencia de la densidad de cultivo de protoplastos en la frequencia de division de
protoplastos y la eficiencia de plaqueo. Los datos son la media de 5 repeticiones
Influencia de la composicion de mezclas enzimaticas en el rendimiento de protoplastos. Los dados
son la media de 6 repeticiones.
Ma et al., 2003, Plant Cell Rep, 22, 320–327
Protoplastos de Sorgo derivados de suspension celular (Secale cereale L.)
Durante la prueba del efecto del la concentracion del 2,4-D la BAP fue mantenida a 1.8uM.
Cuando se probo la respuesta al BAP, la concentracion de 2,4-D fue mantenida a 6.3 uM. El
medio de cultivo fue tambien sumplementado con 1% de sacarosa, 0.5% glucosa y 0.5 M
sorbitol. Los datos se presentan como el numero de celulas que sufren division,
expresados como porcentaje.
El efecto de diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D en la
eficiencia de la eficiencia de plaqueo de los protoplastos de
hoja de C. melo `Green Delica'
Sutiojonos et al., 1998, Annals of Botany, 81, 775-777
Protoplastos purificados
Las hojas son cortadas en finas tiritas y
digeridas en una solucion de enzima y manitol
Purificación de protoplastos de los
desechos en un gradiente de sacarosa.
Cultivo de protoplastos aislados
a. Un medio tipico seria el MS suplementado con 2.0 mgl-1 ANA, 0.5
mgl-1 BAP, 3% sacarosa y 9% manitol.
b. La prueba experimental para establecer los niveles correctos de
auxina y citokinina requeridos para estimular el crecimiento de
protoplastos se basa en un arreglo de Cuadrado Latino.
c. Un metodo para estimular la division celular y la regeneracion (facil
tecnicamente) es el transferir el protoplasto directamente a un medio
liquido o semi-liquido en el cual los niveles de auxina y citokinina se
varien.
d. El agar normal es toxico para los protoplastos, y deben reemplazarse
por agentes gelificantes como agarosa, que solidifican a menor
temperatura.
e. Una suspension de protoplastos en la solución osmótica se mezcla
en un volumen similar de agar al 1.2% a 40oC luego de solidificar
es transferido como capas de 5 mm de diametro a placas petri.
f. Despues de dos semanas los bloques de agarosa que contienen
las colonias tanto en su superficie o incrustados al medio son
transferidos a medio fresco con una concentration de manitol
reducida al 6%.
g. Las colonias son sucesivamente transferidad a medio fresco cada
dos semanas con una reduccion progresiva del 3% de la
concentracion de manitol.
Cultivo de protoplastos aislados
Regeneración de protoplastos
Etapas
Desarrollo de Microcolonias
(a) 1ra division, 10 dias despues del aislamiento de protoplastos
(b,c) microcolonias.
(d,e) microcallos
(f) microcallos justo antes de ser transferidos en medio B5h
c
d
b
e f
a
ihg
Recuperacion de plántulas a traves de Embriogénesis somática
g: Transferir microcallos en medio B5H e inducir embriogenesis somatica.
h: Transferir los embriones globulares medio Boi2y para la maduracion de embriones somaticos.
i: Transferir embriones de fase cotiledonar en medio MS para su paso hacia plantulas.
Dovzhenko et al., 2003 , Protoplasma, 222, 107–111
Regeneración de brotes fértiles de protoplastos de cotiledones de A. thaliana
(a) Divisiones de protoplastos despues de 4 dias de cultivo (b) Formacion de microcolonias (flechas) despues de 3 dias mas (c) dentro del area identica: las colonias despues de dos semanas de cultivo (d) Formacion de brotes Shoot de una colonia 19 dias despues del aislamiento (e) Regeneracion de los brotes (flechas) despues de 5 semanas (f).
Los Regenerantes formaron raices despues de 7 semanas (g) y semillas despues de 9semans (h)
Cultivo de Protoplastos y regeneracion de plantas verdes y fertiles de sorgo.
FUSION DE PROTOPLASTOS
Fuente de Tejido (hojas jovenes, callos embriogenicos)
Protoplasto A Protoplasto B
Hibridizacion estandar –Mejoramiento de plantas
Fusion AB
Formacion Callo
Regeneracion
Brotes, Raices, Embriones
Plantas
Fusion
Seleccion
Disolucion de la Pared Celular
Seleccion
Seleccion
Seleccion
FUSION DE PROTOPLASTOS 1
Obtención de protoplastos
Cocultivo Inducción /Fusión
somática
Separación del Heterocarión
Regeneración de plantas
FUSION DE PROTOPLASTOS 2
1
2 3
45
Protoplastos de dos especies de tabaco son fusionados para producir una célula que adquiera algunas de las características de ambas parentales, y pueda ser regenerado en
una planta con esas características heredadas.
A
B
Protoplastos fusionados
[Miwa et al 1992]
FUSION DE PROTOPLASTOS 3
Productos de la Fusion
• Protoplastos parentales: +
Cibrido
NN
Hibrido
Fusion de protoplastos
(Polyethyleneglycol (PEG) 6000 )
a. La funcion de la PEG es el alterar las caaracteristicas de la membrana por
los que los protoplastos que se entran en contacto unos a otros se
adhirieren y los contenidos se mezclan.
b. Unos 4 ml de suspension de los protoplastos aislados de cada parental,
con una densidad celular de aproximadamente 2 x 105 medio CPW con
13% manitol son mezclados y centrifugados a 100g por 10 min y luego
resuspender los protoplastos in aproximadamente 0.5 ml de medio.
c. Las membranas exteriores son desestabilizadas añadiendo 2 ml de una
solucion PEG esteril (30% PEG 6000, 4% sacarosa, 0.01M CaCl2.6H2O) para
que actue por 10 min.
e. Los protoplastos se fusionan diluyendo el PEG cada 5 min añadiendo un
medio de cultivo de protoplastos (medio MS, 2.0 mgl-1 ANA, 0.5 mgl-1 BAP,
3% sacarosa y 9% manitol) con volumenes en incremento (0.5, 1.0, 2.0, 3.0,
4.0 ml por tubo)
f. Los protoplastos se resuspenden despues de cada dilucion por agitacion
suave y la mezcla se centrifuga a 100g (gravedades) por 10 min y luego los
protoplastos son lavados con medio de cultivo sin PEG, centrifugados y
resuspendidos en el mismo medio.
g. La suspension de protoplastos es luego “incrustada” o mezclada en medio
de agarosa, lo cual permite la estimulacion de formacion de pared celular,
division celular y separacion de microcolonias de cloroplastos.
Fusion de protoplastos
(Polyethyleneglycol (PEG) 6000 )
Híbridos somáticos obtenidos por fusión de protoplastos entre Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum y la especie silvestre Solanum circaeifolium Bitter .
Rosa Espejo, Giselle Cipriani, Genoveva Rosel, Alí Golmirzaie and William Roca
El numero cromosomico de S. tuberosum es 2n=4X=48 y el de S. circaeifolium es de: 2X=2X=24.
Cual sera el numero de cromosomas del Hibrido somatico = ¿?
a. La suspension de protoplastos que se van a fusionar se colocan
entre dos electrodos
b. Se pasa una corriente continua (AC) debil de A (400,000 Hz, 1.5V) a
traves de los electrodos lo cual causa que los protoplastos adquieran
carga positiva en un polo y carga negativa en el lado opuesto.
c. Como resultado de esta carga, los protoplastos se alinean en grupos
a lo largo de la linea de la corriente, tocandose uno con otro y
formando una cadena de perlas.
d. Las unidades que forman cada cadena pueden estar modificados
segun la densidad celular de protoplastos, la frecuencia del campo
AC y del voltaje pico-a- pico.
Electrofusion
e. Después de un periodo de aproximadamente 90s, el campo
AC es reemplazado por una descarga de 1000 V cm-1 unica
de pulso en un solo instante.
f. Donde los protoplastos estan en contacto, las membranas
plasmaticas se rompen y se fusionan formando una
membrana continua alrededor de la cadena de perlas.
g. Este evento es luego seguida de la fusion citoplasmatica.
Electrofusion
Esquema de la electrofusion
• Se realiza usando una corriente electrica.
• Se causa un menor daño que los metodos quimicos.
1. Camara de fusion
Generador sinusoidal
Generador de pulso DC
Electrodos
2. Corriente AC de bajo voltaje
altamente oscilante3. Pulso DC de alto voltaje
4. Rotura de membranas y fusion
1) Alineamiento:
Las celulas son
alineadas en
cercano contacto
por medio de
dielectroforesis.
2) Pulso fusion :
Un pulso de solo 15
microsegundos se
aplica con el fin de
permeabilizar las
membranas. Luego
estas se fusionan.
3) Fase de
Heterocarionte :
Las membranas
celulares se fusionan
completamente y los
citoplasmas se ha
unido. Solo los
nucleos quedan
separados.
4) Producto de
Fusion completa:
Cuando los
nucleos se
fusionan, los
cromosomas se
van perdiendo y
se reduce su
numero.
Etapas de la electrofusion
Fases de Fusion de protoplasts de Avena sativa
Seleccion de heterocariontes
a. La técnica mas simple es permitir que los protoplastos regeneren y
luego identificar el heterocarionte en el estadio de plántula joven o
inmadura por diferencias morfológicas (la eficiencia es buena).
b. Una técnica directa pero laboriosa es cuando los heterocariontes
son identificados visualmente luego removidos manualmente
usando un microscopio o un micromanipulador (la eficiencia no es
buena si no se visualiza la fusión de protoplastos parentales con
marcadores fácilmente visibles)
c. El método mas popular pero mas costoso es el uso de un citómetro
de flujo automatizado.
d. Utilizando una característica diferencial de uno de los parentales,
por ejemplo, la nula regeneración de los protoplastos individuales.
Citómetro de FlujoLas células son transportadas a través de un flujo del delgadísimo ancho de una célula.
Esta columna de fluido es interceptada por un rayo laser que enfoca su haz a unas pocas células después de la salida de la columna de células.
Cada célula que atraviesa el rayo laser emite una luz dispersa en todas direcciones.
La luz dispersa, medida a 90º de incidencia corresponde a la cantidad y la calidad de luz difractiva de estructuras granulares al interior de la célula.
http://flowcytometry.uchc.edu/CYTOMETERSWORK/cytometerswork.html
Analisis de un Citometro de Flujo del contenido de ADN en el nucleo. (Secale cereale L. cv. Auvinen)
a. Control externo de celulas rojas sanguineas de pollo (CRBC, 2C=2.33 pg DNA)
b. Planta (2C=6.47 pg DNA)
c. Diploide normal (2C=6.51 pg DNA)
d. Cromosomas del regenerante (2n=14)
Fusion de células de Citrus sp.
Células en suspension de Citrus x sinensis var. Hamlin
Protoplastos blancos
Naranjo espinoso Poncirus trifoliata
protoplastos verdes
Los protoplastos de Citrus Hamlin no regeneran y actuan como una capa de propagacion
Los protoplastos del naranjo espinoso no forman pared celular ni se dividen
Solo los productos de la fusion se regeneraran
Contribución de la fusión de protoplastos
al mejoramiento de Cultivos
a. Originalmente la hibridizacion celular fue considerada
como un medio para la unión de dos diferentes
genotipos que eran incapaces de hibridizar por medio
sexual normal.
b. La producción de la semilla hibrida tiene el potencial
de la induccion de la esterilidad citoplasmatica
masculina.
c. Transformación.
Fig. 2A–M Flower morphology of parental plants
used for somatic hybridization and their somatic
hybrids. A Oriental hybrid lily (Lilium L.) cv.
Acapulco. B Lilium·formolongi cv. Hakucho. C
Oriental hybrid lily cv. Shirotae. D, E Flowering
regenerants derived from somatic hybrids in the
fusion combinations of Acapulco+Hakucho (D)
and Shirotae+Hakucho (E). F–L Morphological
features of flower organs of the intact parents
and regenerants. Regenerants from
Acapulco+Hakucho (G) and Shirotae+Hakucho (I)
showed anther colours different from those of
their parents, Acapulco (F), Hakucho (H) and
Shirotae (J). The regenerant from
Shirotae+Hakucho (E) also showed a shorter
prominence at the top of petals (K) compared to
that of its parent, Shirotae (L). M Propagated
plants obtained by in vitro culture derived from
a somatic hybrid plant of Acapulco+Hakucho
Production of fertile somatic hybrid plants between Oriental hybrid lily
and Lilium formolongiMitsugu Horita Æ Hitomi Morohashi Æ Fuminori Komai .Planta (2003) 217: 597–601
Visualisacion de la expresion transitoria en protoplastos transformados con GFP
(Green Fluorescent Protein
Expresion estable de GFP en hojas de plantas transgenicas obtenidas despues de
una transformacion de protoplastos y regeneracion de la planta completa.
Metabolitos secundarios
- Insecticidas
- Saborizantes
- Colorantes
Las plantascomo fuentede metabolitossecundarios de interés comercial
Potencial
75 % de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas.
Sólo se tiene buen conocimiento de 5 000 de las 250 000 a 300 000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.
25 % de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal.
75 % de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.
- Medicinas
- Herbicidas
- Proteasas
- Fragancias
- Antimicrobianos
- Enzimas
Producciónde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode células y órganos vegetales: ¿por qué?
- Independizarse de factores externos tales como: cambios de temperatura, sequías, plagas, variabilidad de la producción, factores políticos y sociales, etc.
- Evitar la extinción de especies vegetales.- Disponer de condiciones controladas en el
proceso de producción y extracción.- Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos
mas cortos.- Hacer viable la producción de compuestos
complejos con uno o más C quirales en forma más económica respecto de la síntesis química.
- Posibilitar la obtención de nuevos compuestos no presentes en la planta madre.
- Establecer procesos de biotransformación sólo realizables por enzimas provenientes de plantas.
Resveratrol
Estructura del Limoneno (A) y el Mentol.
Son los monoterpenosmas conocidos que sirven como defensa ante insectos y otros organismos que se alimentan de estas plantas
Fuentes Naturales
Fuentes Naturales
Vincristina y Vinblastina, alcaloides antitumorales extraidos de las hojas de Catharanthus roseus “Isabelita”
COOCH3
CH3
H
OH
N
N
N
OCOCH3
R
H3CO
H COOCH3
CH3
OHN
Taxol, extracto anti tumoral, de la Corteza de Taxus brevifolia
O
C
H
CH3 - C - O
O - C -CH3
O
O
OO
OH
OH
OH
O O
O
CH33HC
C - NH - CH - CH - C - O
Fuentes Naturales
Los metabolitos secundarios
• Los metabolitos secundarios están siempre
presentes en las plantas y pueden tener un relación
estructural y evolutiva con los metabolitos
primarios.
• Usualmente ocurren en diferentes rutas
bioquímicas y procesos al mismo tiempo.
• El costo para producir un metabolito secundario es
alto y consume energía que podría utilizarse para el
crecimiento y la reproducción.
HIPOTESIS: los metabolitos secundarios evolucionaron de una derivación de una ruta biosintetica básica
MoleculaPrecursora
TriptofanoAmino acido,
Un compuesto primario
Enzima A
B
C
E
F
D
DIMBOApesticida,
metabolito secundario
2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one
NH
MoleculaPrecursora
TSA
TSBNH
CO2H
NH2NH
Triptofano
BX1
BX2
BX3
BX4
BX5
NH
O
NH
OH
OH
O
NH
OH
O
O OH
ONOH
O OH
ONOH
CH3O
DIMBOA
Comparación entre la síntesis de triptófano y DIMBOA
• Los metabolitos secundarios en los vegetales son economicamente importantes, en los diferentescampos, en aplicaciones como los farmacos, fragancias, pigmentos, aditivos alimenticios y pesticidas.
• Una alternativa para su extraccion de las plantas, es su sintesis a partir de cultivos in vitro.
Cultivos en suspensióncélulas, tejidos u órganos
Material de partida
• Cultivos en suspensión:derivan de célulasindiferenciadas o callos,en medio líquido decomposición adecuada,crecimiento más rápido yhomogéneo.
• Hair root culture (cultivode raices pilosas): sontejidos infectados porAgrobacteriumrhizogenes.
Callos
• Tejidos no diferenciados en división activa.
• Se pueden desarrollar a partir de heridas.
Microscopio Invertido
Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación.
Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.
Aplicaciones de las suspensiones Celulares
• Estudios sobre el ciclo celular.
• Estudios fisiológicos y bioquímicos.
• Producción de metabolitos secundarios.
• Aislamiento de Mutantes.
• Embriogénesis Somática.
Embriogénesis somática y micropropagación
Introducción a suspensión
+
Plaqueo
Filtrar las células1 2
Elección de los mas altos productores
Alta densidad inicial
Subcultivo y filtrado
Procesos industriales
Tipo de compuesto
Farmacéuticos
Pigmentos
Fragancias
Saborizantes
Depigmentadores
Producto
Shikonina
Berberina
Sanguinarina
Gingsenósidos
Taxol
Cartamina
Geraniol
Citronerol
Vanillina
Arbutina
Compañía
Mitsui Petrochemical Ind.
Mitsui Petrochemical Ind.
Vigont Researol Lab.
Nitto Denko Co.
Phyton USA
Kibun Kyoto University
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Mitsui Petrochemical Ind.
Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso terapéutico
Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$
Hiosciamina, escopolamina
Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos
Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata
Antineoplásico
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local
Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico
Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota
Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa
Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico
Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco
Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico
Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico
Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico
Vinblastina, vincristina
Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico
Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae
Afrodisíaco
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$
Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico
Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales
Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$
Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico
Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$
Ipecac Mezcla de alcaloides de ipecacuana
Cephaelis ipecacuanha
Emético
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico
Cultivo de órganos: raíces transformadas
Propiedad
Forma de crecimiento
Patrón de crecimiento
Tiempo de duplicación
Biomasa final
(peso seco/L)
Background genético
Formación inicial de producto
Medio de crecimiento
Localización del producto
Tipo de proceso
Suspensiones
Células simples-agregados
Desorganizado; cada célula
puede dividirse y expandirse
15 h-días
30-60 g
Heterogéneo
Usualmente bajo
Complejo; hormonas
y vitaminas
Intracelular- extracelular
Batch; continuo, deben
ser inmovilizadas
Raíces transformadas
Red de ramificaciones
División celular localizada;
crecimiento linear con
ramificaciones laterales
36 h-días
30-60 g
Euploide
Similares a la planta madre
Simple, sales y azúcar
Intracelular- extracelular
Batch o continuo, no hay
necesidad de inmovilizar
Agrobacterium
rhizogenes
Tumor de raíces producido por Agrobacterium
rhizogenes en discos de remolacha
Gentileza del Dr. Mark Tepfer
Género
Nicotiana
Catharanthus
Cinchona
Duboisia
Datura
Beta
Lippia
Artemisia
Coreopsis, Bidens
Tagetes
Digitalis
Cassia
Panax
Chaenactis
Podophyllum
Linum
Lithospermum
Solanum
Metabolito
Alcaloide
Alcaloides piridínicos
Indoles
Tropano
Otros
Betalaina
Sesquiterpenos
Poliacetilenos
Tiofenos
Glicósidos cardioactivos
Antraquinonas
Saponinas
Polyines
Lignanos
Naftoquinonas
Esteroides
Algunos
metabolitos
secundarios
producidos
por raíces
transformadas
Agrobiotecnología
Cultivos
celulares
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Compuesto
PiretrinasCardenólidosArtemisinina
Aceites esencialesAceites esenciales
Planta
Chrysanthemum spp. Digitalis spp.
Artemisia annuaMentha spp.
Pelargoium spp.
Cultivode tallos
• Ventajas
- Cultivos genética y bioquímicamente estables
- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos
presentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales
- Niveles similares a los de la planta (no siempre se
cumple).
• Desventajas
- Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas
- Vitrificación
Procesos Biotecnológicos
Taxol®
• Planta entera
- La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años. - La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.
- Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.
• Semisíntesis
- El material vegetal empleado presenta variación en la concentración de precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente.
- Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.
Schoepke Plant Image Gallery
Producción de taxol por Taxus spp.
• Condiciones económicas:
- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)
- Alto rendimiento y productividad del cultivo
comparado con la planta entera
- Buen crecimiento en biorreactores
- Crecimiento lento de la planta entera
como fuente alternativa
• Parámetros principales:
- Productividad: g de producto/L/día
- Concentración máxima de producto:
g de producto/L
- Rendimiento: g producto/g sustrato
Viabilidad de
un proceso
para su
escalado a
nivel industrial
Estrategias para incrementar
la producción de metabolitos secundarios
• Problemas a considerar:
- Tasa de crecimiento
- Volumen del inóculo
- Tamaño y agregación de las células
- Oxigenación
- Agitación
Cultivos en
suspensión
Diferencias entre suspensiones de células vegetales
y de células microbianas
Tomado de: Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.
Consecuencias para
cultivos a gran escala
Sedimentación rápida;
sensibilidad a fuerzas de corte;
formación de gradientes;
dificultad para tomar muestras
Largos tiempos de proceso;
baja productividad
Necesidad de grandes
cantidades de inóculo;
escalado más largo
Bajas velocidades
de agitación
Baja demanda de oxígeno:
fermentadores con baja
transferencia de oxígeno
Permeabilización;
remoción in situ
Células
vegetales
Agregados de
10-200 mm y
de hasta 2 mm
de diámetro
Lenta; td ~ 2-5 días
5-20%
Sensible /
Tolerante
Baja
Intracelular /
a veces extracelular
Células
microbianas
Células
Individuales
2-10 mm
Rápida;
td ~ 1-2 h
Pequeña
Insensible
Alta
Extracelular
Caracterización
Tamaño
y morfología
Velocidad
de crecimiento
Densidad de
inoculación
Sensibilidad a
fuerzas de corte
Aireación
Acumulación
del producto
• Selección de especies vegetales apropiadas
• Selección de líneas celulares mejoradas
• Optimización de las condiciones de cultivo
• Agregado de precursores
• Tipo de cultivo: suspensiones, órganoso células inmovilizadas
• Uso de elicitores microbianosy estrés abiótico
• Permeabilización y remoción in situ
Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios
• Screening y selección de líneas sobreproductoras
- Se facilita cuando el metabolito de interés es un
pigmento, ya que puede hacerse una selección
visual.
- Es importante contar con un método rápido y sencillo
para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo,
ELISA).
• Optimización del medio de cultivo (variables másensayadas)
- Fuente de carbono
- Limitación en nitrógeno
- Limitación en fosfato
- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)
- Relación C/N
• Agregado de precursores
- Bajo costo
- Baja toxicidad
- No muy alejado del producto final en la ruta metabólica
Metodologías
utilizadas para
optimizar
la producción
de metabolitos
secundarios
Patrón de flujo de dos diseños de propulsor
Agitador de paletas inclinadasAgitador de paletas planas o Rushton
Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Proceso para la producción de shikonina a partir de células
de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.
Caracterización La caracterización de las variedades locales
es una labor imprescindible que permite conocer en profundidad los recursos fitogenéticos que estamos conservando.
Las diferencias entre las variedades, sus características, tanto morfológicas como agronómicas y por último sus cualidades nutritivas, representan una información muy útil, que puede dar una idea del valor real y potencial de las variedades locales que conservamos.
Marcadores Morfológicos
Marcadores basados en características
fenotípicas cualitativas o cuantitativas:
forma, altura, etc.
Caracterización
morfológica
La
caracterización
morfológica se
basa en la
observación de
aquellos
caracteres que
pueden ser
visualmente
diferentes.
Caracterización
morfológica
El conjunto de todos estos caracteres se
conocen como "Descriptores«
Existen listas de descriptores elaborados
por organismos internacionales de
referencia cuya utilización permite
obtener resultados homogéneos y que
además están adaptados a las
variedades tradicionales.
Obtenemos así medidas de longitud,
anchura, diámetro, área... de diferentes
partes de la planta, (flor, hojas, fruto, etc.)
y otras características, como el color,
forma, pilosidad, rugosidad, etc.
Esto permitirá establecer las diferencias y
similitudes entre las distintas variedades
de un mismo cultivo.
Variedades de Lycopersicon sculentum
Homo sapiens
Liguus
fasciatus
Harmonia axyridia
Caracterización
agronómica
Mediante la evaluación agronómica
podemos conocer mejor aspectos
relacionados con la adaptación de las
variedades a las condiciones
ambientales locales.
Estudiamos así las características
productivas de las variedades, su
eficiencia fotosintética o la tolerancia a
plagas y enfermedades.
Este nivel de caracterización permite
conocer qué variedades son más
adecuadas para la producción con
estándares de cantidad y calidad.
Marcadores Bioquimicos Son marcadores basados en reacciones
enzimáticas:
1. Isoenzimas, son enzimas de función idéntica pero de estructura diferente.
2. Aloenzimas, son enzimas de función idéntica pero expresados por alelos diferentes.
3. Western Blot, técnica de separación y detección inmunológica de proteínas.
Lactato deshidrogenasa (LDH)
F1
P1
P2
aloenzimas
Patron simple de aloenzima
P1 P2 F1
Gel de electroforesis
Fig. 1. Patrones de isoenzimas Peroxidasas de cultivares de caña de azúcar en explotación comercial en el Ecuador. Carriles 2: Ragnar; 3: Cali-Colombia; 4: C87-51; 5: Mex64-1487; 6: Ragnar; 7: Ragnar; 8: CC85-92; 9: CC95-¿?; 10: CR74-??; 11: CR74-250; 12: RD75-??; 13: RD75-11; 14: PR??; 15: Esmeraldas; 16: BJ70-??; 17: BJ70-46; 18: SP70-1143; 19: CP??; 20: PCG127-4.
Identificación de cultivares comerciales de caña de azúcar (Saccharumspp. híbrido) mediante el empleo de isoenzimas peroxidasas
Figure 3.11 Allozymeelectrophoresis. (A) A tissue sample is homogenized in a buffer solution and centrifuged. (B) The supernatant liquid is placed in the gel with filter paper inserts. (C) Proteins migrate at different rates in the gel because of differences in their charge, size, or shape. (D) Specific enzymes are visualized in the gel by biochemical staining procedures. FromUtter et al. (1987).
MARCADORES MOLECULARES
Marcadores de ADN, ARN o proteinas
Que son los cromosomas?
Esqueleto desoxirribosa
fostato
Puentes de hidrógeno entre pares de bases
ADN
Esqueleto ribosa fostato
Bases nitrogenadas
Bases nitrogenadas
ARN
Tipos de bases nitrogenadas
Pirimidina
Guanina (G)Adenina (A)
Citosina (C)
Purina
Timina (T)Uracilo (U)
Nucleósidos y nucleótidos
Esqueleto de ribosas y fosfatos
Grupo fosfato
Enlace fosfodiéster
Pentosa
Base nitrogenada
Formación de puentes de hidrógeno entre las bases del ADN
CODIGO GENÉTICO: DEL ADN A LAS PROTEINAS
Cadena sentido (+) o codificante
Cadena molde (-) o codogenica
Codón o triplete
ADNARN mensajero proteína
El Código Genético
ADN
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA
PROTEINAARN
Replicación del ADN
Replicación del ARN
Trascripción Reversa
Replicación de la proteina
La Expresión genética o Síntesis de proteinas
Términos importantes
• GENOMA
• LOCUS (singular) o LOCI (plural) - Un segmento o region unica del ADN
• ALELO - Variantes de un locus
– Ejemplo
• Considere el siguiente segmento de ADN (polimorfismos de unico nucleotido = SNP):
......TACCGT….Alelo 1
.….TACCAT….Alelo 2
• En un organismo diploide:
– Si un individuo tiene 2 alelos diferentes en un locus , es denominado HETEROCIGOTO
– Si un individuo tiene 1 unico alelo en ambos cromosomas de un locus, es denominado HOMOCIGOTO
Términos importantes
Omicas
Genómica: ADN
Transcriptómica: ARN
Proteómica: proteinas
Metabolomica, etc.
Que es un marcador de ADN?
Es una forma de determinar una posición a lo largo de un cromosoma.
Pueden identificar un nucleótido especifico o puede representar una gran longitud del ADN.
Pueden estar constituidos por segmentos clonados o simplemente amplificados por PCR.
Tipos de marcadores de ADN
Marcadores de única copia, ocurren en regiones de secuencia única.
Marcadores de múltiples copias, contienen secuencias que están repetidas en el genoma y por eso están en múltiples posiciones (aunque están siempre flanqueados por ADN de única copia)
Marcadores polimórficos
Son marcadores genéticos detectan un polimorfismo (diferencia) en el ADN entre dos individuos.
Las diferencias genéticas detectables son un pre-requisito para la construcción de mapas genéticos.
Marcadores polimórficos
Los marcadores polimórficos pueden ser anotados para determinar el origen ancestral de una porcion de ADN.
Marcadores polimórficos
Pueden ser codominantes, es decir, los genotipos heterocigota se distingue del homocigota.
Polimorfismos
de único
nucleótido
Obtención del
material
genético
EDTA -> Mg+2
Muestra de pelo
Separación de las moléculas
de ADN
Electroforesis
Visualización de los
Fragmentos Amplificados
Polimorfismo
A B A B
Electroforesis de agarosa
Electroforesis de agarosa
Electroforesis de agarosa
Camara de electroforesis horizontal: Whatman Horizon 11.14
Fuente de poder: Whatman Powerpack P25
Camara vertical de electroforesis
Secuenciamientodel ADN
Tecnica del shotgun
Applied Biosystems PRISM 377(Gel, 34-96 lanes)
Applied Biosystems PRISM 3100(Capillary, 16 capillaries)
Applied Biosystems PRISM 3700(Capillary, 96 capillaries)
Electroforesiscapilar
“virtual autorad” – generador en tiempo real de secuencias de ADN del ABI 377
1. Trace files (dye signals) are analyzed and bases called to create chromatograms.
2. Chromatograms from opposite strands are reconciled with software to create double-stranded sequence data.
Aplicaciones de los Marcadores moleculares
Deteccion de la variación
somaclonal
ENTRECRUZAMIENTO Y MAPEO
Tipos de Mapas
Mapa
Genetico
Mapa Físico
Secuencia
Mapa Genetico Moderno
Marcadores
fenotipicos para
el genoma del
tomate
Un grupo
clasico de
marcadores
geneticos
LOCALIZACION GENÉTICA DE FACTORES DE
RIESGO PARA ENFERMEDADES
MAPA GÉNETICO
MAPA FISICO
Superposición de clones (YAC, BAC,...)
SECUENCIA DEL ADN ...GGCCAAATCGACCAGGTT...CGCGGATCAATTCCCCGCGA...
Marcador A Marcador B
Especies
Tamaño del genoma
(Kpb)
Longitud (centiMorgans)
Kilobases/ centiMorgan
Yeast 2.2 x 104 3,700 6 Neurospora 4.2 x 104 500 80 Arabidopsis 7.0 x 104 500 140 Drosophila 2.0 x 105 290 700 Tomato 7.2 x 105 1,400 510 Human 3.0 x 105 2,710 1,110 Corn 3.0 x 105 1,400 2,140
Gen de
ResistenciaGenes (QTLs, genes conocidos,...) Marcadores Geneticos
(RAPD, RFLP, AFLP,...)
¿Importancia de un mapa genético?... Un paso hacia el descubrimiento de genes...
Bacterial artificial Chromosome
Trazabilidad molecular
Centro Internacional de la PapaEjemplos de tecnología genómica
• Identificación de secuencias microsatelites en EST en papa
>p2OB8 (TA)9 and (GGT)6 (S109) y (S110)AAACAGCTTTACTCTGCTCAACAAAAACATATATATATATATATATAAAAAAAAAACTAACAGTGAGAAGAAGGAGAAAGCAAATATGCCAATCGCCGCCGCCGTCAACTTCCACCCGGTGACGACACGATATGGCGGCGCACTCGCCTTACAACCATCTCCTTCCTTACGTACCTCCGTATCTGTTTGTAATAACGCCGTCAATACTAACGCGGCGCGTGTTGCTTCCCTCTCGCTTTCCATGAATTCCAGCCCTAATTTCACCTCAGGCCGTCGCACATTTCTAATGTTATCCTTCGCTGCTGTTGGAGGTGGCGGTGGAGATAGTGATGATAATTTTAACGGTGGAAATGGAGGCGGTAACGGTGGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGGAAATGAGGAGAGTGGCGATCAGAAAAAAAAAAAAAAA
>p23L21 (ACC)5 (S111)CTCTGTTTTTTTTTTGTAGATGATGGAAATGGAAGATAAAGAGAGTACAGAATCTGGGTCACTAGGGGTTAACTCGGAGTATGATTCACCACCACCACCACCGGCGGCAGCAGTGGTGGCAGCAGCAGTAGCAGGAACAAATGGGAGTTTTAACAGTGGGGGTGGTGGGGTGGTGGTTCCCCAAGTGATGAATATGAGTTTAGGAGTAACTGGGGGTGGAGGG
>p2lMl (TTC)6 (S112)GAAAAGTGATGGCACTTAGAGCTTCAGCCACCGCTAAATCACCTCTTCCTCCGCCCCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTACTTCATCACCACCTATAGTCTTAAATCTTCCTAAACTTACTCAAAAAACTGTGTCAGTGGCATTCTCTACATCCACTGCACTTTTCCTCTTTCCCCTTTTCACTGCGACCCATGAAGCCAGAGCAATCAGCTTACCCAAGGAAGACATAGTCTCTTCCCTTAATCAGGTAGAATCTGCAGTTAATCAAGCTCAAGAGGTTGGTTCGAACATCTTTG ATACTATAAGCGGAGTGATTGGGCCCGTG
W. Dejong, R. Waugh SCRIProjecto de secuenciamiento por EST en Papa
Biologia in silico
Evolucion de las ballenas: cual es el pariente mas cercano?
Taxonomia Clasica:Las ballenas estan en un grupo hermano de las Artiodactyla
ancestro comun de las ballenas y otras Artiodactyls
Nueva hipotesis:las ballenas estan en un grupo hermano de los hipopotamos
MAPEO GENETICO ASISTIDO POR MARCADORES MOLECULARES
Figure 3 | Marker-assisted pre-selection forprogeny testing. Because milk production is asex-limited trait, dairy bulls go through aprogeny test, in which they are evaluated onthe basis of the milk production of 60–100daughters. After the progeny test, the bestbulls are selected for widespread use in thepopulation through artificial insemination.Because of the high cost involved, only alimited number of bulls can be progeny testedeach year. Selection of bulls to be tested isbased on ancestral information, which meansthat all members of a full-sib family have thesame estimated breeding value. Molecularscores will, however, differ between full-sibs ifthey inherited different marker alleles. Throughreproductive technology, such as multipleovulation and embryo transfer, several bullcalves are produced per female and selectionof bulls to progeny test can be on the basis ofmolecular score. The combination of marker-assisted pre-selection and progeny testing hasa greater chance of producing highlyproductive animals.
MAPEO GENETICO ASISTIDO POR MARCADORES MOLECULARES
GENES DE DEFENSA – ESTUDIO DE PAPA
MPMI Vol. 15, No. 6, 2002, pp. 587–597
AFLP RAPD SSR
TIPOS
Marcadores de ADN
• Basados en Hibridación: RFLP• Basados en Secuenciamiento: SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms).• Basados en PCR:
TIPOS
Marcadores de ARN
• Basados en hibridación: Microarrays (Microchips).
• Basados en PCR: RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR, usa la transcriptasa reversa).
• Basados en secuenciamiento: EST (ExpressedSequence Tags – etiquetas de secuencia expresada).
RFLP
Restriction Fragment Length
Polymorphism.
Polimorfismo en longitud de Fragmentos de restriccion
Pasos:
1. Digestion con enzimas de restriccion.
2. Southern Blotting.
3. Hibridizacion con sondas (“Probing”).
4. Deteccion (radiactiva o no radiactiva).
Enzimas de Restricción
Análisis RFLP
PCR
o
Polimerase Chain Reaction
Reaccion en cadena de la polimerasa o Polymerase Chain Reaction (PCR)
Conocida como Amplificación del ADNProceso multiplica exponencialmente una
region especifica del ADN. Los limites del producto amplificado lo
determinan los iniciadores o “primers”. El producto amplificado se le llama amplicón. Es altamente sensible, rapido, especifico y
pocas veces limitado por la calidad o cantidad de ADN.
Bacteria de aguastermales: Thermusaquaticus.
De la cual se produce la Taq ADN polimerasa.
Life at High Temperatures by Thomas D. BrockBiotechnology in Yellowstone© 1994 Yellowstone Association for Natural Sciencehttp://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27
La PCR típicamente involucra tres diferentes temperaturas:
(94 - 96oC) o desnaturalizacion, las hebras de AND se separan.
(55-72oC) o alineamiento, los primers se unen o “alinean” con el ADN molde.
(72oC) o extension, la ADN polimerasa “extiende” los primers copiando la region de ADN molde, añadiendodesoxirribonucleotidos.
Perfil Típico de Temperatura en PCR
El Proceso de Amplificación del ADN
Denaturacion
Alineamiento
Extension
Repetir…
1. Molde de ADN.2. Iniciadores (primers)3. ADN polimerasa termoestable (Taq, Pfu, etc.)
4. MgCl25. Buffer 10X: KCl, Tris-HCl y/o gelatina.6. dNTPs (desoxirribonucleotidos: dATPs, dGTPs,
dCTPs, dTTPs7. Agua destilada estéril.8. Albumina de suero bovino (BSA), sulfoxido de
dimetilo (DMSO), formamida, glicerol9. Aceite mineral
Reactivos PCR
PCR Se realiza en un volumen
de 0,05 – 0,1 ml.
Se utilizan tubos de 0,2
ml. De pared delgada.
Tambien se pueden usar
placas de 96-384 pocillos.
Controles (para monitorear la PCR)
Control negativo: mezcla de reaccion PCR mix sin ADN molde. Para asegurarse que ninguno de los reactivos de PCR estan contaminados con el PCR.
Control Positivo: se usa ADN molde estandar de fuente conocida, que se puede amplificar con los mismos primers. Para asegurarse que los componentes y las condiciones de la reaccion estan funcionando.
Blanco de extracción: Para asegurarse que los reactivos de extraccion de ADN están libres de ADN extraño.
Termociclador: GeneAmp PCR System 240
Bloque
Termociclador: Whatman Biometra
Para prevenir la contaminación
Las áreas de extraccion de ADN y del procesamiento de la PCR deben estar fisicamente separadas.
Lo mismo para los equipos y reactivos.
Los guantes descartables de latex deberian ser cambiados frecuentemente.
Instalar los tubos de reaccion PCR en una camara de flujo laminar.
Usar puntas de micropipeta a prueba de aerosoles.
Los reactivos deber ser libres de nucleasas.
Irradie con luz UV las areas de trabajo.
Extracción y pre-PCR
PCR y electroforesis
Clonación y procesamiento de productos PCR
Ventajas de la PCR
Se requieren de cantidades minúsculas de ADN molde (gran sensibilidad).
Generalmente el ADN contaminante de bacterias y hongos no amplifican dado que los primers son especificos (gran especificidad).
Los fragmentos de ADN degradado pueden ser amplificados (gran versatilidad).
Se pueden instalar reacciones “multiplex” Se disponen de kits comerciales.
Desventajas de la PCR
Existen inhibidores de la PCR, presentes en el ADN extraído (vg: ácidos húmicos, polifenoles).
Puede haber fallas en la amplificación debido a cambios en la secuencia de la unión al primer.
Contaminación de ADN de otras fuentes (de la misma especie).
Marcadores de ADN basados en PCR
RAPD (Random
Amplified
Polimorphism
DNA)
polimorfismos
de ADN
amplificado al
azar
Variantes: • AP-PCR (Arbitrarily Primed-
PCR)• DAF (DNA Amplification
Fingerprinting)
Técnica RAPD
Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria
Normalmente se usa un solo iniciador de 10 nucleótidos de longitud
CAGGCCTTCT
Los RAPDs son marcadores dominantes
1
3
2
1 2 3AA
aA
aa
AA Aa aa
Origen del polimorfismo de los RAPDs
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5
Primers de Operon Technologies Inc.
______________________________________________
Código 5´ ………………… 3´ PM mg/tubo____________________________________________________________________________________________________________________________________
OPA- 01 CAGGCCCTTC 2955 18.0
OPA 02 TGCCGAGCTG 3035 16.5
OPA 03 AGTCAGCCAC 2988 15.5
OPA 04 AATCGGGCTG 3059 15.5
OPA 05 AGGGGTCTTG 3090 16.0
OPA 06 GGTCCCTGAC 2995 17.0
OPA 07 GAAACGGGTG3108 14.5
OPA 08 GTGACGTAGG 3099 15.0
OPA 09 GGGTAACGCC 3044 15.5
OPA 10 GTGATCGCAG 3059 15.5________________________________________________
Microsatélites
o
Secuencias simples repetitivas
(SSR)
o
Secuencias cortas repetitivas en tándem
Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivasde secuencia simple.
Estas unidades o motivos se componen de 1 a 5 paresde bases y su grado de repetición es relativamentebajo.
Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para suamplificación
¿Que son microsatélites?
TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
TCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
Homocigote
Heterocigote
Los SSR son marcadores codominantes
1
2
3
4
1 2 3 4
X
Geles de electroforesis con
microsatélites
Selección de la
Colección
Núcleo para
Solanum
phureja
mediante el
Uso de
Marcadores
MicrosatélitesBach. Daniel Andrade
Sánchez
Coeficiente de Asociación Simple
0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
1PER-Puno
17PER-Lambayequ 6COL-Nothing 53COL-Boyacá
91COL-Boyacá
120COL-Cauca 7PER-Cajamarca
20COL-Narino
77ECU-Cotopaxi 9COL-Cauca 71COL-Cundinama
47ECU-Azuay 110ECU-Cotopaxi 38COL-Valle 75COL-Narino 85COL-Cauca 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá
87COL-Boyaca 74COL-ValleDelC 118COL-Boyacá 90COL-Nariño 107COL-Nariño 2COL-Valle 51ECU-Azuay 44ECU-Imbabura 100COL-Boyacá
94COL-Boyacá 14COL-Boyacá 46COL-Cauca 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 26COL-Cauca 82COL-Boyacá 109ECU-Tungurah 102COL-Boyacá 108ECU-Imbabura 45COL-Narino 104COL-Narino
86ECU-Cotopaxi 54COL-Boyacá 126COL-Nariño 98COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 83COL-Cauca 36COL-Narino
4COL-Cauca 22COL-Cauca 8COL-Narino 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 23PER-Huanuco
13COL-Narino 101COL-Boyacá
50PER-Puno 122PER-Junin
89ECU-Azuay 15COL-Nariño
16COL-Cundinama 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz
117COL-Cundinam
105COL-Nothing
116COL-Nariño 70ECU-Imbabura
127COL-Cauca
24BOL-LaPaz 35PER-Piura
19BOL-LaPaz 68COL-Nariño 121COL-Boyaca
RAPD
0.59 0.98
0.73
0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
1PER-Puno 50PER-Puno 35PER-Piura 2COL-Valle 51ECU-Azuay 94COL-Boyacá
100COL-Boyacá 44ECU-Imbabura 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 46COL-Cauca 101COL-Boyacá 70ECU-Imbabura 17PER-Lambayequ 47ECU-Azuay 89ECU-Azuay
122PER-Junin 6COL-Nothing 16COL-Cundinama 24BOL-LaPaz 4COL-Cauca 104COL-Narino 8COL-Narino 108ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño
45COL-Narino 82COL-Boyacá 86ECU-Cotopaxi 102COL-Boyacá 20COL-Narino 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 110ECU-Cotopaxi 117COL-Cundinam 87COL-Boyaca
127COL-Cauca 7PER-Cajamarca 120COL-Cauca 23PER-Huanuco 118COL-Boyacá 9COL-Cauca 71COL-Cundinama 26COL-Cauca 77ECU-Cotopaxi 109ECU-Tungurah 14COL-Boyacá 53COL-Boyacá
91COL-Boyacá 13COL-Narino 54COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 121COL-Boyaca 98COL-Boyacá 126COL-Nariño 36COL-Narino 68COL-Nariño 22COL-Cauca
38COL-Valle 85COL-Cauca 75COL-Narino 74COL-ValleDelC 83COL-Cauca 90COL-Nariño 107COL-Nariño 116COL-Nariño 19BOL-LaPaz 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá
105COL-Nothing 15COL-Nariño 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz
SSR
Coeficiente de Asociación de DICE
0.45 0.98
0.74
AnálisisArcview
SSR
AnálisisArcview
RAPD
Los marcadores microsatélites nos permitieron seleccionar
una colección núcleo, formada por 16 genotipos, para
Solanum phureja,
Existe una correlación muy pobre entre la información
provista por los marcadores moleculares, RAPD y SSR en S.
phureja.
No se pueden dar conclusiones de patrones geográficos de
diversidad, debido a que el muestreo de las entradas no es
representativo en todas las regiones muestreadas.
Conclusiones
“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR MEDIANTE
MARCADORES ISSR DE UNA COLECCIÓN DE 50 ÁRBOLES CLONALES e HÍBRIDOS DE CACAO (Theobroma cacao L.) DE LA UNAS – TINGO
MARIA”
Julio A. Chia Wong
Fuente: Ing. Luis Garcia Carrion UNAS
Fuente: Ing. Luis Garcia Carrion UNAS
Colecta de muestras
Conservación en silicagel
Extracción de ADN de 50 genotipos
Extracción de ADN de 4 genotipos
OK
Pruebas PCR con 59
iniciadores ISSR
13 iniciadores
OK (con replica por genotipo)
Elección de 5 iniciadores anclados
Amplificación del ADN de 50
genotipos con 5 iniciadores
Datos binarios Cross Checker 2.9
-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20-0.37
-0.23
-0.08
0.06
0.20
0.34
EET400
EET228EET233
EET62ICS6 ICS78
ICS1ICS95
ICS39
M18.16
M1.7
UF667
U1
CAT4
U9
U12
U15
U26
U43
U48
U54
U60
U68
U70
SCA6C42
C53
C65HTM1
CCN51
IMC67
I12.12
I14.20
I16.20
C69
C81
C85
SilvHu
H12H61
Pand
PA150
P7ChuC
ChuS
SeñoA
Dimensión 1
Dim
en
sió
n 2
PCoA50 OTUs
Marcadores de expresión
genética
Marcadores basados en
secuenciamiento
Single nucleotide polymorphisms
(SNPs) polimorfismo de unico
nucleotido
Las secuencias de ADN de la mayoría de
individuos es casi idéntica, >99%.
Las diferencias de unico par de bases
ocurren cada 500-1000 pb.
En la mayoria de las poblaciones, hay un
comun SNP, y pocos SNPs raros.
Cerca de 3 millones de SNPs ocurren en el
genoma humano, y estos se han
convertido en marcadores geneticos
populares.
Los SNPs pueden ser usados como
cualquier marcador para genotipado,
pero una mayor cantidad de loci deben
ser usados tipicamente debido a que solo
4 alelos (G, G, C, T) son posibles.
Como detectar SNPs:
Los SNPs pueden ser obtenidos por
hibridizacion de un oligonucleotido
complementario.
Muchos cientos de SNPs pueden ser
obtenidos simultaneamente usando:
microarrays de ADN (DNA-chips, Gene-
Chips, SNP-chips)
Esquema de un chip paraensayos SNP
Fig. 9.2 Typing a SNP with an oligonucleotide.
Que son los cromosomas?
El Código Genético
ADN ARN PROTEINA
Dogma central de la Biología molecular
Replicación del ADN
Replicación del ARN
Trascripción Reversa
Replicación de la proteina
Transcripción Traduccion
La Expresión genética o Síntesis de proteinas
Términos importantes
• LOCUS (singular) o LOCI (plural) - Un segmento o region unica del ADN
• ALELO - Variantes de un locus
– Ejemplo
• Considere el siguiente segmento de ADN (polimorfismos de unico nucleotido = SNP):
......TACCGT….Alelo 1
.….TACCAT….Alelo 2
• En un organismo diploide:
– Si un individuo tiene 2 alelos diferentes en un locus , es denominado HETEROCIGOTO
– Si un individuo tiene 1 unico alelo en ambos cromosomas de un locus, es denominado HOMOCIGOTO
Términos importantes
MARCADORES MORFOLOGICOS
Marcadores basados en caracteristicas fenotipicascualitativas o cuantitativas: forma de hoja, forma de frutos, altura, etc.
Variedades de Lycopersicon sculentum
Homo sapiens
Liguus
fasciatus
Harmonia axyridia
MARCADORES BIOQUIMICOS
Son marcadores basados en reacciones enzimáticas:
1. Isoenzimas, son enzimas de función idéntica pero de estructura diferente.
2. Aloenzimas, son enzimas de función identica pero expresados por alelos diferentes.
3. Western Blot, técnica de separación y detección inmunológica de proteínas.
F1
P1
P2
aloenzimas
Patron simple de aloenzima
P1 P2 F1
Gel de electroforesis
MARCADORES MOLECULARES
Marcadores de ADN, ARN o proteinas
Omicas
• Genómica: ADN
• Transcriptómica: ARN
• Proteómica: proteinas
• Metabolomica, etc.
Que es un marcador de ADN?
• Es una forma de determinar una posición a lo largo de un cromosoma.
• Pueden identificar un nucleótido especifico o puede representar una gran longitud del ADN.
• Pueden estar constituidos por segmentos clonados o simplemente amplificados por PCR.
Tipos de marcadores de ADN
• Marcadores de única copia, ocurren en regiones de secuencia única.
• Marcadores de múltiples copias, contienen secuencias que están repetidas en el genoma y por eso están en múltiples posiciones (aunque están siempre flanqueados por ADN de única copia)
Marcadores polimórficos
• Son marcadores genéticos detectan un polimorfismo(diferencia) en el ADN entre dos individuos.
• Las diferencias genéticas detectables son un pre-requisito para la construcción de mapas genéticos.
• Los marcadores polimórficos pueden ser anotados para determinar el origen ancestral de una porcionde ADN.
• Pueden ser codominantes (los genotipos heterocigotase distingue del homocigota) o dominante/recesivo (+/-)
EDTA -> Mg+2
Muestra de pelo
Electroforesis
Visualización de los
Fragmentos Amplificados
Polimorfismo
A B A B
Electroforesis de agarosa
Electroforesis de agarosa
Electroforesis de agarosa
Camara de electroforesis horizontal: Whatman
Horizon 11.14
Fuente de poder: Whatman Powerpack P25
Camara vertical de electroforesis
Secuenciamientodel ADN
Tecnica del shotgun
Applied Biosystems PRISM 377(Gel, 34-96 lanes)
Applied Biosystems PRISM 3100(Capillary, 16 capillaries)
Applied Biosystems PRISM 3700(Capillary, 96 capillaries)
Electroforesiscapilar
“virtual autorad” – generador en tiempo real de secuencias de ADN del ABI 377
1. Trace files (dye signals) are analyzed and bases called to create chromatograms.
2. Chromatograms from opposite strands are reconciled with software to create double-stranded sequence data.
Aplicaciones de los Marcadores moleculares
Deteccion de la variación
somaclonal
ENTRECRUZAMIENTO Y MAPEO
Tipos de Mapas
Mapa
Genetico
Mapa Físico
Secuencia
Mapa Genetico Moderno
Marcadores
fenotipicos para
el genoma del
tomate
Un grupo
clasico de
marcadores
geneticos
LOCALIZACION GENÉTICA DE FACTORES DE
RIESGO PARA ENFERMEDADES
MAPA GÉNETICO
MAPA FISICO
Superposición de clones (YAC, BAC,...)
SECUENCIA DEL ADN ...GGCCAAATCGACCAGGTT...CGCGGATCAATTCCCCGCGA...
Marcador A Marcador B
EspeciesTamaño del
genoma(Kpb)
Longitud(centiMorgans)
Kilobases/centiMorgan
Yeast 2.2 x 104 3,700 6Neurospora 4.2 x 104 500 80Arabidopsis 7.0 x 104 500 140Drosophila 2.0 x 105 290 700Tomato 7.2 x 105 1,400 510Human 3.0 x 105 2,710 1,110Corn 3.0 x 105 1,400 2,140
Gen de
ResistenciaGenes (QTLs, genes conocidos,...) Marcadores Geneticos
(RAPD, RFLP, AFLP,...)
¿Importancia de un mapa genético?... Un paso hacia el descubrimiento de genes...
Trazabilidad molecular
Centro Internacional de la PapaEjemplos de tecnología genómica
• Identificación de secuencias microsatelites en EST en papa
>p2OB8 (TA)9 and (GGT)6 (S109) y (S110)AAACAGCTTTACTCTGCTCAACAAAAACATATATATATATATATATAAAAAAAAAACTAACAGTGAGAAGAAGGAGAAAGCAAATATGCCAATCGCCGCCGCCGTCAACTTCCACCCGGTGACGACACGATATGGCGGCGCACTCGCCTTACAACCATCTCCTTCCTTACGTACCTCCGTATCTGTTTGTAATAACGCCGTCAATACTAACGCGGCGCGTGTTGCTTCCCTCTCGCTTTCCATGAATTCCAGCCCTAATTTCACCTCAGGCCGTCGCACATTTCTAATGTTATCCTTCGCTGCTGTTGGAGGTGGCGGTGGAGATAGTGATGATAATTTTAACGGTGGAAATGGAGGCGGTAACGGTGGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGGAAATGAGGAGAGTGGCGATCAGAAAAAAAAAAAAAAA
>p23L21 (ACC)5 (S111)CTCTGTTTTTTTTTTGTAGATGATGGAAATGGAAGATAAAGAGAGTACAGAATCTGGGTCACTAGGGGTTAACTCGGAGTATGATTCACCACCACCACCACCGGCGGCAGCAGTGGTGGCAGCAGCAGTAGCAGGAACAAATGGGAGTTTTAACAGTGGGGGTGGTGGGGTGGTGGTTCCCCAAGTGATGAATATGAGTTTAGGAGTAACTGGGGGTGGAGGG
>p2lMl (TTC)6 (S112)GAAAAGTGATGGCACTTAGAGCTTCAGCCACCGCTAAATCACCTCTTCCTCCGCCCCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTACTTCATCACCACCTATAGTCTTAAATCTTCCTAAACTTACTCAAAAAACTGTGTCAGTGGCATTCTCTACATCCACTGCACTTTTCCTCTTTCCCCTTTTCACTGCGACCCATGAAGCCAGAGCAATCAGCTTACCCAAGGAAGACATAGTCTCTTCCCTTAATCAGGTAGAATCTGCAGTTAATCAAGCTCAAGAGGTTGGTTCGAACATCTTTG ATACTATAAGCGGAGTGATTGGGCCCGTG
W. Dejong, R. Waugh SCRIProjecto de secuenciamiento por EST en Papa
Biologia in silico
Evolucion de las ballenas: cual es el pariente mas cercano?
Taxonomia Clasica:Las ballenas estan en un grupo hermano de las Artiodactyla
ancestro comun de las ballenas y otras Artiodactyls
Nueva hipotesis:las ballenas estan en un grupo hermano de los hipopotamos
MAPEO GENETICO ASISTIDO POR MARCADORES MOLECULARES
Figure 3 | Marker-assisted pre-selection forprogeny testing. Because milk production is asex-limited trait, dairy bulls go through aprogeny test, in which they are evaluated onthe basis of the milk production of 60–100daughters. After the progeny test, the bestbulls are selected for widespread use in thepopulation through artificial insemination.Because of the high cost involved, only alimited number of bulls can be progeny testedeach year. Selection of bulls to be tested isbased on ancestral information, which meansthat all members of a full-sib family have thesame estimated breeding value. Molecularscores will, however, differ between full-sibs ifthey inherited different marker alleles. Throughreproductive technology, such as multipleovulation and embryo transfer, several bullcalves are produced per female and selectionof bulls to progeny test can be on the basis ofmolecular score. The combination of marker-assisted pre-selection and progeny testing hasa greater chance of producing highlyproductive animals.
MAPEO GENETICO ASISTIDO POR MARCADORES MOLECULARES
GENES DE DEFENSA – ESTUDIO DE PAPA
MPMI Vol. 15, No. 6, 2002, pp. 587–597
AFLP RAPD SSR
TIPOS
Marcadores de ADN
• Basados en Hibridación: RFLP• Basados en Secuenciamiento: SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms).• Basados en PCR:
TIPOS
Marcadores de ARN
• Basados en hibridación: Microarrays (Microchips).
• Basados en PCR: RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR, usa la transcriptasa reversa).
• Basados en secuenciamiento: EST (ExpressedSequence Tags – etiquetas de secuencia expresada).
RFLP
• Restriction Fragment Length
Polymorphism.
• Pasos:
1. Digestion con enzimas de restriccion.
2. Southern Blotting.
3. Hibridizacion con sondas (“Probing”).
4. Deteccion (radiactiva o no radiactiva).
Enzimas de Restricción
Análisis RFLP
PCR
o
Polimerase Chain Reaction
Reaccion en cadena de la polimerasa o Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Conocida como Amplificación del ADN
• Proceso multiplica exponencialmente una region especifica del ADN.
• Los limites del producto amplificado lo determinan los iniciadores o “primers”.
• El producto amplificado se le llama amplicón.
• Es altamente sensible, rapido, especifico y pocas veces limitado por la calidad o cantidad de ADN.
Bacteria de aguastermales: Thermusaquaticus.
De la cual se produce la Taq ADN polimerasa.
Life at High Temperatures by Thomas D. BrockBiotechnology in Yellowstone© 1994 Yellowstone Association for Natural Sciencehttp://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27
La PCR típicamente involucra tres diferentes temperaturas:
• (94 - 96oC) o desnaturalizacion, las hebras de AND se separan.
• (55-72oC) o alineamiento, los primers se unen o “alinean” con el ADN molde.
• (72oC) o extension, la ADN polimerasa“extiende” los primers copiando la region de ADN molde, añadiendodesoxirribonucleotidos.
Perfil Típico de Temperatura en PCR
El Proceso de Amplificación del
ADN
Denaturacion
Alineamiento
Extension
Repetir…
1. Molde de ADN.2. Iniciadores (primers)3. ADN polimerasa termoestable (Taq, Pfu, etc.)
4. MgCl25. Buffer 10X: KCl, Tris-HCl y/o gelatina.6. dNTPs (desoxirribonucleotidos: dATPs, dGTPs,
dCTPs, dTTPs7. Agua destilada estéril.8. Albumina de suero bovino (BSA), sulfoxido de
dimetilo (DMSO), formamida, glicerol9. Aceite mineral
Reactivos PCR
PCR
• Se realiza en un volumen
de 0,05 – 0,1 ml.
• Se utilizan tubos de 0,2
ml. De pared delgada.
• Tambien se pueden usar
placas de 96-384 pocillos.
Controles (para monitorear la PCR)
• Control negativo: mezcla de reaccion PCR mix sin ADN molde. Para asegurarse que ninguno de los reactivos de PCR estan contaminados con el PCR.
• Control Positivo: se usa ADN molde estandar de fuente conocida, que se puede amplificar con los mismos primers. Para asegurarse que los componentes y las condiciones de la reaccion estan funcionando.
• Blanco de extracción: Para asegurarse que los reactivos de extraccion de ADN están libres de ADN extraño.
Termociclador: GeneAmp PCR System 240
Bloque
Termociclador: Whatman Biometra
Para prevenir la contaminación
• Las áreas de extraccion de ADN y del procesamiento de la PCR deben estar fisicamente separadas.
• Lo mismo para los equipos y reactivos.
• Los guantes descartables de latex deberian ser cambiados frecuentemente.
• Instalar los tubos de reaccion PCR en una camara de flujo laminar.
• Usar puntas de micropipeta a prueba de aerosoles.
• Los reactivos deber ser libres de nucleasas.
• Irradie con luz UV las areas de trabajo.
Extracción y pre-PCR
PCR y electroforesis
Clonación y procesamiento de productos PCR
Ventajas de la PCR
• Se requieren de cantidades minúsculas de ADN molde (gran sensibilidad).
• Generalmente el ADN contaminante de bacterias y hongos no amplifican dado que los primers son especificos (gran especificidad).
• Los fragmentos de ADN degradado pueden ser amplificados (gran versatilidad).
• Se pueden instalar reacciones “multiplex”
• Se disponen de kits comerciales.
Desventajas de la PCR
• Existen inhibidores de la PCR, presentes en el ADN extraído (vg: ácidos húmicos, polifenoles).
• Puede haber fallas en la amplificación debido a cambios en la secuencia de la unión al primer.
• Contaminación de ADN de otras fuentes (de la misma especie).
Marcadores de ADN basados en PCR
RAPD (Random AmplifiedPolimorphism DNA)
polimorfismos de ADN amplificado al azar
AP-PCR (Arbitrarily Primed-PCR)
DAF (DNA Amplification Fingerprinting)
Técnica RAPD
Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria
Normalmente se usa un solo iniciador de 10 nucleótidos de longitud
CAGGCCTTCT
Los RAPDs son marcadores dominantes
1
3
2
1 2 3AA
aA
aa
AA Aa aa
Origen del polimorfismo de los RAPDs
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5
Primers de Operon Technologies Inc.
______________________________________________
Código 5´ ………………… 3´ PM mg/tubo____________________________________________________________________________________________________________________________________
OPA- 01 CAGGCCCTTC 2955 18.0
OPA 02 TGCCGAGCTG 3035 16.5
OPA 03 AGTCAGCCAC 2988 15.5
OPA 04 AATCGGGCTG 3059 15.5
OPA 05 AGGGGTCTTG 3090 16.0
OPA 06 GGTCCCTGAC 2995 17.0
OPA 07 GAAACGGGTG 3108 14.5
OPA 08 GTGACGTAGG 3099 15.0
OPA 09 GGGTAACGCC 3044 15.5
OPA 10 GTGATCGCAG 3059 15.5________________________________________________
MICROSATELITES
o
SECUENCIAS SIMPLES REPETITIVAS
o
SECUENCIAS CORTAS REPETITIVAS EN TÁNDEM
Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivasde secuencia simple.
Estas unidades o motivos se componen de 1 a 5 paresde bases y su grado de repetición es relativamentebajo.
Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para suamplificación
¿Que son microsatélites?
TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
TCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT
AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA
5’
5’
Homocigote
Heterocigote
Los SSR son marcadores codominantes
1
2
3
4
1 2 3 4
X
Selección de la Colección Núcleo paraSolanum phureja mediante el Uso de
Marcadores Microsatélites
Bach. Daniel Andrade Sánchez
Coeficiente de Asociación Simple
0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
1PER-Puno
17PER-Lambayequ 6COL-Nothing 53COL-Boyacá
91COL-Boyacá
120COL-Cauca 7PER-Cajamarca
20COL-Narino
77ECU-Cotopaxi 9COL-Cauca 71COL-Cundinama
47ECU-Azuay 110ECU-Cotopaxi 38COL-Valle 75COL-Narino 85COL-Cauca 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá
87COL-Boyaca 74COL-ValleDelC 118COL-Boyacá 90COL-Nariño 107COL-Nariño 2COL-Valle 51ECU-Azuay 44ECU-Imbabura 100COL-Boyacá
94COL-Boyacá 14COL-Boyacá 46COL-Cauca 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 26COL-Cauca 82COL-Boyacá 109ECU-Tungurah 102COL-Boyacá 108ECU-Imbabura 45COL-Narino 104COL-Narino
86ECU-Cotopaxi 54COL-Boyacá 126COL-Nariño 98COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 83COL-Cauca 36COL-Narino
4COL-Cauca 22COL-Cauca 8COL-Narino 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 23PER-Huanuco
13COL-Narino 101COL-Boyacá
50PER-Puno 122PER-Junin
89ECU-Azuay 15COL-Nariño
16COL-Cundinama 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz
117COL-Cundinam
105COL-Nothing
116COL-Nariño 70ECU-Imbabura
127COL-Cauca
24BOL-LaPaz 35PER-Piura
19BOL-LaPaz 68COL-Nariño 121COL-Boyaca
RAPD
0.59 0.98
0.73
0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
1PER-Puno 50PER-Puno 35PER-Piura 2COL-Valle 51ECU-Azuay 94COL-Boyacá
100COL-Boyacá 44ECU-Imbabura 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 46COL-Cauca 101COL-Boyacá 70ECU-Imbabura 17PER-Lambayequ 47ECU-Azuay 89ECU-Azuay
122PER-Junin 6COL-Nothing 16COL-Cundinama 24BOL-LaPaz 4COL-Cauca 104COL-Narino 8COL-Narino 108ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño
45COL-Narino 82COL-Boyacá 86ECU-Cotopaxi 102COL-Boyacá 20COL-Narino 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 110ECU-Cotopaxi 117COL-Cundinam 87COL-Boyaca
127COL-Cauca 7PER-Cajamarca 120COL-Cauca 23PER-Huanuco 118COL-Boyacá 9COL-Cauca 71COL-Cundinama 26COL-Cauca 77ECU-Cotopaxi 109ECU-Tungurah 14COL-Boyacá 53COL-Boyacá
91COL-Boyacá 13COL-Narino 54COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 121COL-Boyaca 98COL-Boyacá 126COL-Nariño 36COL-Narino 68COL-Nariño 22COL-Cauca
38COL-Valle 85COL-Cauca 75COL-Narino 74COL-ValleDelC 83COL-Cauca 90COL-Nariño 107COL-Nariño 116COL-Nariño 19BOL-LaPaz 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá
105COL-Nothing 15COL-Nariño 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz
SSR
Coeficiente de Asociación de DICE
0.45 0.98
0.74
AnálisisArcview
SSR
AnálisisArcview
RAPD
Los marcadores microsatélites nos permitieron seleccionar
una colección núcleo, formada por 16 genotipos, para
Solanum phureja,
Existe una correlación muy pobre entre la información
provista por los marcadores moleculares, RAPD y SSR en S.
phureja.
No se pueden dar conclusiones de patrones geográficos de
diversidad, debido a que el muestreo de las entradas no es
representativo en todas las regiones muestreadas.
Conclusiones
“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR MEDIANTE
MARCADORES ISSR DE UNA COLECCIÓN DE 50 ÁRBOLES CLONALES e HÍBRIDOS DE CACAO (Theobroma cacao L.) DE LA UNAS – TINGO
MARIA”
Julio A. Chia Wong
CONCYTEC
Fuente: Ing. Luis Garcia Carrion UNAS
Fuente: Ing. Luis Garcia Carrion UNAS
Colecta de muestras
Conservación en silicagel
Extracción de ADN de 50 genotipos
Extracción de ADN de 4 genotipos
OK
Pruebas PCR con 59
iniciadores ISSR
13 iniciadores
OK (con replica por genotipo)
Elección de 5 iniciadores anclados
Amplificación del ADN de 50
genotipos con 5 iniciadores
Datos binarios Cross Checker 2.9
-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20-0.37
-0.23
-0.08
0.06
0.20
0.34
EET400
EET228EET233
EET62ICS6 ICS78
ICS1ICS95
ICS39
M18.16
M1.7
UF667
U1
CAT4
U9
U12
U15
U26
U43
U48
U54
U60
U68
U70
SCA6C42
C53
C65HTM1
CCN51
IMC67
I12.12
I14.20
I16.20
C69
C81
C85
SilvHu
H12H61
Pand
PA150
P7ChuC
ChuS
SeñoA
Dimensión 1
Dim
en
sió
n 2
PCoA50 OTUs
Marcadores basados en secuenciamiento
Single nucleotide polymorphisms (SNPs) polimorfismo de uniconucleotido:
1. DNA sequences of most individuals are almost identical, >99%.
2. Single base pair differences occur about once every 500-1000 bp.
3. In most populations there is a common SNP, and several less common SNPs.
4. About 3 million SNPs occur in the human genome, and these are becoming popular genetic markers.
5. SNPs can be used just like other genotyping markers, but more loci typically must be used because only 4 alleles (G, G, C, T) are possible.
How to type SNPs:
1. SNPs can be typed by hybridizing a complementary oligonucleotide (e.g., single-base extension assay).
2. If the stringency is high (i.e., temperature), the oligonucleotide will fail to bind to DNAs showing polymorphism.
3. Many hundreds of SNPs can be tested simultaneously using:
DNA microarrays (DNA-chips, Gene-Chips, SNP-chips)
First developed in the early 1990s.
Ordered grid of short, complementary, known sequence oligonucleotides placed at fixed positions on silicon, glass, or nylon substrate.
Fig. 9.2, Typing a SNP with an oligonucleotide.
How to type SNPs (cont.):
1. SNP chip is designed with an array of user defined oligonucleotides attached to the substrate (the SNP chip is the probe).
2. Oligonucleotides match each of the common and variant alleles in the population (all alleles of interest).
3. Target DNAs are labeled with a fluorescent tag and hybridized (or not) to the chip.
4. Fluorescence pattern is detected by a laser.
5. Because the oligonucleotides are known, the pattern indicates the type of alleles the individual possesses.
6. Many different alleles at thousands of different loci can be screened simultaneously in the same experiment.
Fig. 9.5, Schematic of a SNP chip assay.
Transformación genética
o
Ingeniería Genética
o
Tecnología del ADN recombinante
Plantas transgénicas
Mejoramiento Tradicional
Tecnologia del ADN
Recombinante
Los resultados del mejoramiento tradicional son
buenos, pero es necesario un tiempo prolongado
teosinte
cob
corn
John Doebley photo
Tomate silvestre
(Lycopersicon pimpinellifolium)
D = 1 cm
www.quirkyworks.com/design/ Samples/plant-breeding.jpg
Hybrid plants
(heterosis)
La Biotecnología en la Agricultura
http://www.insp.mx/xcongreso/ponencias/5
Crossbreeding Recombinant DNA
Species Related Related/unrelated
Efficiency
Susceptibility to external
gene influences
Genes shuffled in one
exepriment
10s of 1000s 1 – few
Random insertion + +
Insecti and herbicides
Fertilizers
Pollution/run off
Potential toxins/risk + +
Introducción de genes en plantas
1) Infectar a celulas
vegetales con plasmidos
como vectores
transportando el gen
deseado
2) Disparando pellets
microscopicos conteniendo al
gen directamente en la celula.
Tres pasos para una transformación
estable
• Transporte del ADN dentro de una unica
celula vegetal.
• Integración del ADN dentro del genoma.
• Regeneracion de la celula transformada
en una plant completa.
Transformación de Plantas
Biobalística
o
Agrobacterium
Mejoramiento
Genético
Color Postcosecha
Resistencia a
Patógenos
MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Insectos
Resistencia a
HerbicidasEsterilidad
Sexual
Calidad del
Producto
Hongos BacteriasMaterna
Paterna
Roundup
Listo
Tomate (1994) Flavr Savr CalgeneSabor de madurez
en rama, larga vida.
ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS
TRANSGÉNICAS (Birch, 1997)
CULTIVO
(FECHA
LIBERACIÓN)
NOMBRE
COMERCIALCOMPAÑÍA CARACTERÍSTICAS
Tomate (1995) ZenecaConsistencia de
pasta de tomate
Algodón
Papas
Maiz (1996-97)
Bollgard
NewLeaf
YieldGuardMonsanto
Toxina deBacillus
thuringiensis para
resistencia insectos
Soya
Raps
Algodón (95-96)
Roundup Ready MonsantoResistencia a
Glifosato (herbicida)
OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS
AbetoAcelgaAlfalfaAlgodónAlamoArabidopsisArrozArvejaCamoteCaña de azucarCebadaCentenoClavelCrisantemoEspárrago
EucalyptusFrambuesaFrutillaKiwiLechugaLirioMaízManíManzanaMaravillaOrquideaPapaPapayaPetuniaPera
PinoPlátanoPorotoPoroto de soyaRemolachaRepolloRosaSorgoTabacoTomateTulipánTrigoVidesZanahoriaZapallo
GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO ENPLANTAS TRANSGÉNICAS
Tipo de gen utilizado en transgénesis Caracter que confiere
a la planta
Toxina de Bacillus thuringensis Resistencia a Insectos
Proteína de la cubierta viral Resistencia a Virus
Quitinasas, glucanasas de plantas y de otros
organismosResistencia a Hongos
Lisozima humana y de cerdo. Otros péptidos
bactericidasResistencia a Bacterias
Genes cuyos productos afectan la biosíntesis
de aminoácidos, o la fotosíntesis
Resistencia a
HerbicidasGenes cuyos productos afectan la biosíntesis
del etileno, o la formación de pared celular
Retraso maduración de
frutos
Transgenic Virus-Resistant Papaya:The Hawaiian ‘Rainbow’ was Rapidly Adopted by Farmers and is of
Major Importance in Hawaii Today
Carol Gonsalves789 Hoolaulea StreetHilo, Hawaii 96720David R. Lee
Applied Economics and Management, Dept.248 Warren Hall
Cornell UniversityIthaca, NY 14853
Dennis GonsalvesU.S. Pacific Basin Agricultural Research Center
99 Aupuni Street, Suite 204Hilo, HI 96720
Corresponding author: Carol Gonsalves. carol.gonsalves@verizon.net
Comparacion de un arbol de papaya productiva (izq.) versus una infectada
con el virus Papaya ringspot (der.)
Efecto de la diseminacion
rapida del virus en campos
comerciales.
A
C
B
Técnicas básicas
• Enzimas de restricción
• Clonación de genes
• Secuenciación
• Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN
• Hibridación con anticuerpos (western blot)
• Hibridación de ácidos nucleicos (southern,
northern)
• Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)
Secuenciación
Electroforesis (ADN, ARN, proteinas)
southern
northern
western
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Tecnología del ADN recombinante
• El uso de la biotecnología moderna implica,el conocimiento y aislamiento de secuenciasde ADN que corresponden a genesresponsables de conferir una característicadeseada (fenotipo)
• El aislamiento de los genes de interés esrealizado por medio de técnicas de clonadomolecular
Estructura del gen de interés
Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico
Promotores
ExonesSitio de inicio de la Transcripción Sitio de terminación
de la Transcripción
Realzadores
< 100 Kb
Intrones
La actividad del gen depende de los Factores de Transcripción (FT) que activan las ARN
polimerasas• Los FT pueden ser: los Factores de Transcripción General
(se unen a secuencias promotoras genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras específicas).
• Los FT pueden encenderse o apagarse en respuesta a estímulos del entorno del individuo.
• Entre los promotores de los genes que desarrollan la capacidad cerebral o talento de los individuos están la alimentación, la salud, el estímulo temprano con experiencias motivadoras (el juego), el amor.
Clonación molecular
• Amplificación en un organismo vivo de unasecuencia de ADN.
• Vectores de clonación (plásmidos o virus):Vectores en los que la secuencia de ADN esintroducida usando una DNA ligasa. Cuando serequiera, el fragmento de ADN de interés, puedeser liberado del vector por medio de enzimas derestricción.
• Una vez aislados los genes de interés sonincorporados al organismo blanco resultando enun organismo genéticamente modificado (OGM)y esta característica adquirida pasa a serhereditaria.
Herramientas Básicas para el clonado de Genes
• ADN BLANCO O SECUENCIA DE INTERES, que puede ser:
– ADN genómico (aislado directamente del cromosoma).
– ADN complementario (ADNc) preparado in vitro a partir de un molde de ARNm, usando la transcriptasa reversa.
– ADN sintético, sintetizado a partir de oligonucleótidos o por amplificación de fragmentos mediante PCR.
• ENZIMAS:
– DNA polimerasa.
– Transcriptasa reversa.
– DNA ligasa.
– Endonucleasas de restriccion (cortan el DNA en sitios especificos)
.
EXTRACCION DEL ADN FUENTE
VECTOR DE
CLONADO
FRAGMENTACION ENZIMATICA
LINEARIZACION
AISLAR CELULAS CON EL GEN
CELULA HUESPED
PROTEINAS CODIFICADAS POR EL GEN CLONADO
PRODUCCION DE PROTEINAS
LIGADO
INTRODUCCION DEL ADN EN EL HUESPED
VECTORES RECOMBINANTES
Transformación Genetica
Requerimientos:
• Mecanismo de transferencia del gen
– Mecanismos de transferencia genética indirecta
– Mecanismos de transferencia genética directa
• Sistemas de regeneración
Transformación genetica indirecta
Mediada por Agrobacterium:
• Agrobacterium es una bacteria patógena del suelo para dicotiledóneas y algunas coníferas.– Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease
(tumores)– Agrobacterium rhizogenes – enfermedad de raices
pilosas (hairy roots)
• Las Monocotiledóneas presentan resistencia natural a Agrobacterium.
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes
¿Como se realiza la transformacion de las plantas con Agrobacterium?
Co-cultivar la cepa de A. tumefaciens que contiene el gen de interes con un explante del cual se pueden obtener regenerantes.
Cultivar el explante en medio de cultivo en presencia de un agente selectivo (tal como la kanamycina si el T-DNA contiene NPT II) y un antobiotico para eliminar el Agrobacterium o disminuir su crecimiento (carbinecillin, cefotaxime, timitin).
Después de un periodo de tiempo, seleccionar los brotes regenerantes (o embriones) que son resistentes.
Probar los brotes regenerados para comprobar la expresion del marcador.
Enraizar los tallos.
¿Como se realiza la transformacion de las plantas con Agrobacterium?
Haciendo plantas transgenicas
• Dos vias usando plasmidos Ti:
1. Cointegración
2. Sistema de vector binario
Transformando con A. tumefaciens
• El proceso es relativamente ineficiente.
• Solo una pequeña fraccion de las celulas infectadas son transformadas.
• El ADN debe ser integrado a un cromosoma para una transformacion estable.
• Cada célula transformada es única.
Transformación genética
Marcador génico seleccionable
• Se cuenta con pocos.• Resistancia a kanamicina, nptII• Resistancia a higromicina, hpt• Gen Bar (resistancia al herbicida
fosfinotricina = PPT)• Gen DHFR (resistancia al metotrexato)• Gen ESPS (resistancia al herbicida Round-
up)
Transformación de la caña de
azúcar por Agrobacteriumtumefaciens.
Selección de callos resistentes a PPT.
Medio selectivo con 4 mg/L of PPT.
Un marcador genico observable (opcional, pero de mucha utilidad)
• Actividad NPT II
• Producción de opinas
• Actividad beta-Glucuronidasa (GUS)
• Green fluorescent protein (GFP)
• Actividad Luciferasa
Glifosato
Bromoxinil
Glifosato
Gen de interés
• Puede provenir de cualquier organismo.
• Usualmente quimericos (hechos de diferentes partes de genes)
• Promotor: CaMV 35S, etc.
• Terminador: Nos, CaMV 35S, etc.
CaMV es un virus de genome circular con ADN de doble cadena
Transferencia directa del ADN
• Bombardeo de microparticulas (biolistica).
• Poración química con PEG o electroporación de protoplastos.
Transformación por Biolística
• El ADN es mezclado y precipitado con particulas microscopicas (1 a 10 micras de diametro) de tungsteno u oro.
• Estas partículas son colocadas en el extremo de un proyectil más grande de plástico.
• La “bala” o proyectil es colocado en un en una “pistola” y el tejido a bombardear se coloca en el extremo de la “pistola”.
• El “arma” es disparada, acelerando el proyectil.
Transformación por Biolística
• Una placa con un pequeño agujero detiene al proyectil de plastico.
• Las particulas cubiertas del ADN, mediante la fuerza inercial pasan a traves del agujero y golpean al tejido vegetal.
Transformación por Biolística
“Pistola” de ADN para transformación de plantas
• Algunas de las partículas pasarán a través de la pared celular y entrarán a las células individuales.
Transformación por Biolística
• Algunos de las moleculas de ADN se liberarán de la partícula, viajarán al nucleo y se integrarán en un cromosoma, resultando al final, la tranformación.
Transformación por Biolística
• Rango ilimitado de hospederos.
• El tejido no requiere ser totipotente.
• Multiple copias del transgen puede llevar al silenciamiento.
• Los reactivos y materiales son costosos.
Transformación por Biolística
Transformación por bombardeo de Coffea arabica cv. Catuaí Vermelho
Análisis molecular
Transformacion mediada por PEG
• El polietilen glicol (PEG) induce unapermeabilizacion reversible de la membrana plasmatica.
• Baja viabilidad de los protoplastos.
• Baja eficiencia de transformacion (1-2%).
• Dificultades para regenerar.
Transformación de Arabidopsis
Los transgénicos
1. Definiciones y conceptos básicos
2. Métodos de obtención
3. Las generaciones de transgénicos
4. Detección de OVMs
DEFINICIONES Y CONCEPTOS BÁSICOS
1. OVMs
2. Ingeniería Genética
3. Gen (estructura)
4. Transgen
ORGANISMO VIVO MODIFICADO (OVM)
• Es aquél que ha sufrido la alteración de su material hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un gene exógeno (transgén), esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente.
• Tambien incluye a los híbridos somaticos (fusionde protoplastos), y los CISGENICOS (OVM con genes provenientes de especies relacionadas)
INGENIERÍA GENÉTICA
• Conjunto de metodologías y técnicas dirigidas a lograr la modificación del material hereditario de una especie, con el fin de conferirle atributos (por ejemplo características del individuo o capacidad de producir sustancias) que no los tenía hasta ese momento.
ESTRUCTURA DE UN GEN
¿QUE ES UN TRANSGEN?
• Es el gen construido mediante ingeniería genética que se transfiere a una especie.
• Ejemplo: El gen cp4 epsp tomado de la bacteria Agrobacterium tumefaciens (cepa CP4).
ORIGEN DE UN TRANSGEN
Su origen puede ser :
• Vegetal
• Animal
• Microbiano
• Sintético
ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DELTRANSGENICO
• Identificación del problema
• Identificación del gen de interés para el hospedero adecuado.
• Construcción del transgen (“constructo”)
• Transformación genética
• Selección y ensayos en espacio confinado
• Ensayos en campo y liberación
ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN
Identificación del problema que se desea resolver.
• Identificación y valoración de los problemas que pueden no pueden ser fácilmente resueltos con métodos convencionales.
• Identificación del tipo de problema que se quiere solucionar: resistencia plagas, sequía, patógenos, valor nutricional, otros.
ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN
• Construcción del transgén (“constructo”)
Genmarcador deselección:resistencia aantibióticos
PromotorGen deinterés
Gen determinación
• Un promotor es una secuencia de ADN que actúa
• como un “interruptor” para “encender” un “gen”.
• • Su secuencia contiene regiones que funcionan
• como “sensores” para modular la expresión del
• gen que gobiernan. Algunas veces, estas regiones
• dan una señal para detener la expresión del gen.
Promotores constitutivos
• • Actividad independiente de factores ambientales y del desarrollo,• pues su expresión no está condicionada por factores endógenos• • Producción de compuestos necesarios en todos los estadíos de• desarrollo de la planta• • Altos niveles de producción de proteínas en diferentes células o• tejidos• • Altos niveles de expresión de proteínas reporteras o marcadores,• permitiendo una fácil detección y cuantificación• • Altos niveles de producción de factores de transcripción que sean• parte de la regulación de un sistema más complejo• • Producción de compuestos con actividad permanente en toda la• planta
Promotores constitutivos y 35S CaMV
• • Los promotores más utilizados para expresar genes en forma• constitutiva son aquellos derivados de virus que atacan plantas.
Dentro• de ellos el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor o
35SCaMV• (Cauliflower Mosaic Virus) ha sido uno de los más utilizados (Odell
et al.,• 1985).• • Este promotor, al igual que la mayoría de los promotores
derivados de• genomas virales, utilizan la maquinaria de transcripción de la célula• vegetal (RNA polimerasa y factores asociados) y no requieren de• factores en trans o proteínas virales para su activación.
• • 35SCaMV es capaz de inducir una alta expresión del transgén tanto en• monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se ha descrito que el• fragmento de 343 pb de este promotor es suficiente para activar en• forma constitutiva la transcripción (Fang et al., 1989). Además se• identificaron dos regiones involucradas en la expresión tejido específica• del promotor, el dominio A (‐90 a +8) que posee un elemento regulador• (‐82 a ‐64) capaz de unir al factor de transcripción ASF‐1 de tabaco, el• que está involucrado en la expresión en raíz (Lam et al., 1989), y el• dominio B (‐343 a ‐90) que contiene un motivo GATA altamente• conservado, ubicado entre ‐185 y ‐105.• • Al utilizar dos copias de este promotor, se incrementa la expresión del• transgén.• • Otros promotores utilizados, en menor frecuencia que el promotor• 35SCaMV, son el promotor del CsVMV (cassava vein mosaic virus) y el• promotor del BSV (Australian banana streak virus).
Promotores inducibles
• • Inducción química:
• – Tetraciclina (operón de resistencia a tetraciclina)
• • Inducción física/mecánica:
• – Luz (“small subunit” del promotor de la ribulosa‐1,5‐
• bifosfato‐carboxilasa de la soya)
• – Heridas (super promotor)
Promotores tejido‐específicos
• • Dirigen la expresión de un gen en un tejido en particular y/o
• en ciertas etapas del desarrollo• • Los elementos que se encuentran en los promotores de• genes de plantas, definen la especificidad de la expresión• tejido específica ya sea ésta en tubérculos, raíces, tejidos• vasculares u otros tejidos vegetativos, semillas u otros• órganos reproductivos. Estos elementos pueden• encontrarse también en sistemas heterólogos (por ejemplo• en otra especie) pero la regulación que ellos cumplen debe• ser evaluada caso a caso.
• A promoter sequence must be added for the gene to be correctly expressed (i.e., translated into a protein product). The promoter is the on/off switch that controls when and where in the plant the gene will be expressed. To date, most promoters in transgenic crop varieties have been "constitutive", i.e., causing gene expression throughout the life cycle of the plant in most tissues. The most commonly used constitutive promoter is CaMV35S, from the cauliflower mosaic virus, which generally results in a high degree of expression in plants. Other promoters are more specific and respond to cues in the plant's internal or external environment. An example of a light-inducible promoter is the promoter from the cab gene, encoding the major chlorophyll a/b binding protein.
• Sometimes, the cloned gene is modified to achieve greater expression in a plant. For example, the Bt gene for insect resistance is of bacterial origin and has a higher percentage of A-T nucleotide pairs compared to plants, which prefer G-C nucleotide pairs. In a clever modification, researchers substituted A-T nucleotides with G-C nucleotides in the Bt gene without significantly changing the amino acid sequence. The result was enhanced production of the gene product in plant cells.
• The termination sequence signals to the cellular machinery that the end of the gene sequence has been reached.
• A selectable marker gene is added to the gene "construct" in order to identify plant cells or tissues that have successfully integrated the transgene. This is necessary because achieving incorporation and expression of transgenes in plant cells is a rare event, occurring in just a few percent of the targeted tissues or cells. Selectable marker genes encode proteins that provide resistance to agents that are normally toxic to plants, such as antibiotics or herbicides. As explained below, only plant cells that have integrated the selectable marker gene will survive when grown on a medium containing the appropriate antibiotic or herbicide. As for other inserted genes, marker genes also require promoter and termination sequences for proper function.
ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN
Construcción del transgén (“constructo”)
• En plantas existen tres clases de genes marcadores seleccionable:
• Genes que dan resistencia a los antibióticos.
• Genes que dan resistencia a herbicidas
• Genes involucrados con varias vías metabólicas.
ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN
• Construcción del transgén (“constructo”)
• Promotor:
• Inicia la transcripción.
• Controla la expresión del gen.
• Los mas comúnmente usados son los derivados del virus del mosaico de la coliflor (CaMV),19S CaMV y 35S CaMV.
ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN
• Construcción del transgen (“constructo”)
• Genes de interés:
• Tolerancia al herbicida Glyphosato Zea mays L. (Maize) Roundup Ready®
• Tolerancia al herbicida Phosfinotricina PPT –Glifocinato de amonio
• Resistencia a Ostrinia nubilalis (European cornborer )
Métodos para generar plantas transgénicas
1. Microinyección
2. Electroporación de Protoplastos
3. Biolística
4. Inmersión floral
5. Agrobacterium (A. tumefaciens y A. rhizogenes)
Microinyección
Microinyección
Transformación genética por electroporación
• La electroporación es un proceso mediante el cual se aplica un campo eléctrico (pulsos) a una célula viva por un pequeño período de tiempo, ocasionando una ruptura transitoria reversible de la membrana celular.
• Esta ruptura transitoria resulta en la formación de poros que permiten que moléculas exógenas (ADN, proteínas o drogas) ingresen a la célula.
Transformación genética por electroporación
Electroporador: equipo que crea un campo magnético que altera la permebilidadde las membranas celulares.
Transformación genética por electroporación
http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/CultivosTransgenicos/sp_animation.html
ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN
• Transformación genética mediada por biolística (Biolistic Particle Delivery System)
Transformación genética mediada porbiolística (Biolistic Particle Delivery
System)• Método físico de transformación de células
mediante el cual se bombardea a éstas con partículas de alta densidad, de tamaño sub-celular que son aceleradas a gran velocidad para introducir ADN dentro de células vivas.
• Fue inicialmente propuesto para su uso con
plantas m ahora tiene mayores aplicaciones.
Helios™ Gene Gun (Bio Rad)
Transformación genética mediada porbiolística (Biolistic Particle Delivery
System)Emplea partículas de oro recubiertas con ADN, precipitadas en la superficie interna de un disco de plástico, y aceleradas mediante un flujo de helio presurizado.
• Transformación genética mediada por Agrobacterium
ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN
• Transformación genética
• Mediada por Agrobacterium
• Por biolística (Gene Gun)
• Por electroporación
Transformación genética mediada porAgrobacterium
• Agrobacterium es una bacteria que causa una enfermedad conocida como “agalla de la corona” en plantas.
• Es un parásito y puede causar grave daño a la planta afectada.
• Se encuentra en el suelo.
Transformación genética mediada porAgrobacterium
• La relación Agrobacterium – planta es un caso único de transferencia de ADN entre bacterias y plantas (reinos diferentes).
• Esta situación es aprovechada para emplear a la bacteria como un vector natural para la transformación en plantas.
Transformación genética mediada porAgrobacterium
• Durante el proceso de infección Agrobacteriumintroduce en la célula vegetal una parte de su ADN (ADN-T, de transferencia).
• Los genes ADN-T son integrados a la planta y su expresión induce la formación de tumores y la síntesis de opinas (derivados de aminoácidos) que la bacteria provecha.
• El ADN-T esta localizado en el plásmido Ti (Plásmido inductor de tumor).
Transformación genética mediada porAgrobacterium
Transformación genética mediada porAgrobacterium
Las generaciones de transgénicos
• 1ra Generación.
• 2da Generación.
• 3ra Generación.
Transgénicos de 1ra Generación
• Características introducidas como insumos agrícolas y combate de plagas - plantas Bt y plantas RR (Resistencia a las plagas ... la resistencia a los insectos (Maíz Bt.)
• Es una combinación de resistencia al taladro y al herbicida glifosato. Incorpora el gen de la endotoxina - Bt (Bacillus thuringiensis).
Aplicaciones
• Alimento para animales
• Grasas comestibles: Margarina, aceites
• Edulcorantes: Bebidas de frutas, cereales y helados.
• Maíz molido: Harina, copos de maíz.
Plantas transgénicas Bt
Transgénicos de 1ra Generación
• Tolerancia a Herbicidas La soja “Roundup Ready” contiene un gen bacteriano que codifica la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa, que participa en la síntesis de los a.a. aromáticos. El vegetal que no contiene dicho gen, es inhibido por el glifosato, de ahí su acción herbicida.
• Aplicaciones: harina, concentrados proteicos, lecitinas, aceite,...
Transgénicos de 2da Generación
• La deficiencia de vitamina A causa ceguera en 200 millones de personas
• Golden Rice: Arroz transgénico enriquecido con pro-vitamina A
Transgénicos de 2da Generación
• Tecnologías que incluyen productos de calidad mejorada para la nutrición y procesos industriales “ALIMENTOS FUNCIONALES”
Transgénicos de 3ra Generación
• Cultivos o animales utilizados como “biofábricas” para la producción de fármacos (vacunas, enzimas industriales).
• En el caso de produccion de anticuerpos o vacunas, se conoce como «Biopharming»
Transgénicos de 3ra Generación
• Ejemplo: SemBioSys Genetics Inc.
Algunos transgénicos disponibles (hasta el 2010)
Detección de OVMs
Detección de OVMs
• Se requiere contar con metodologías que permitan realizar la detección e identificación de «eventos» transgénicos de manera sensible, reproducible, rápida y de bajo costo.
Detección de OVMs
1. Detección inmunoquímica de las proteínas Modificadas
– ELISA (Ensayo de inmunodetección)
– Strips o tiras reactivas
– Western Blot
2. Detección del ADN de los OVMs
– PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa)
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
• Esta metodología se basa en el reconocimiento específico de una porción de proteína expresada por el OVM mediante un anticuerpo, recreando una respuesta inmune.
• Puede permitir la detección específica de determinado anticuerpo por un epítope único.
• Alta especificidad.
Detección inmunoquímica de las proteínas modificadas
ELISA “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”• Básicamente, esta prueba es una reacción
antígeno-anticuerpo que se lleva a cabo en una fase sólida (placa de 96 pozos).
• El antígeno-anticuerpo reacciona y produce un complejo estable que puede ser visualizado por la adición de un segundo anticuerpo unido a una enzima.
• La adición de un sustrato que reacciona con la enzima resulta en una formación de color, que puede ser medida fotométricamente.
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Kit ELISA
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Tiras de flujo lateral
• Variación comercial de las pruebas de ELISA que permiten obtener resultados semicuantitativos de forma sencilla y rápida.
• Se emplean para la detección de OVMs en hojas, semillas y granos. Como soporte se emplean tiras de papel o plásticas, que es donde ocurre la reacción.
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Tiras de flujo lateral
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Ventajas de las tiras de flujo lateral
• No requiere mucha preparación de la muestra.
• Ensayo relativamente rápido (2-4 horas, incluyendo preparación de la muestra).
• Produce resultados cualitativos o semi-cuantitativos.
• Costo relativamente bajo.
• Aplicable para el análisis de muestras numerosas.
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Desventajas de las tiras de flujo lateral
• Faltan anticuerpos relevantes para los diversos eventos OVM.
• Pueden producirse falsos positivos debido a contaminación cruzada por otros componentes derivados de la muestra analizada.
Marco contextual
• Objetivo 1: Erradicar la pobreza extrema y el hambre.
• Objetivo 2: Lograr la enseñanza primaria universal.
• Objetivo 3: Promover la igualdad entre los géneros y la autonomía de la mujer.
• Objetivo 4: Reducir la mortalidad infantil.
• Objetivo 5: Mejorar la salud materna
• Objetivo 6: Combatir el VIH/SIDA, el paludismo y otras enfermedades.
• Objetivo 7: Garantizar el sustento del medio ambiente.
• Objetivo 8: Fomentar una asociación mundial para el desarrollo.
Objetivos del Desarrollo del Milenio 2000 - 2015
ODS 2015 - 2030
El Plan Bicentenario: El Perú hacia el 2021
1. Un Estado basado en la plena vigencia de los derechos fundamentales y el respeto a la dignidad de las personas.
2. Una economía competitiva basada en la generación masiva de empleos con alta productividad.
3. Una economía que ofrezca igualdad de oportunidades y acceso irrestricto a los servicios.
4. Un crecimiento económico basado en el aprovechamiento sostenible de los recursos naturales.
5. Desarrollo de una infraestructura adecuada y distribuida adecuadamente entre las regiones.
6. Lograr desde el Estado una gestión pública eficiente que facilite la gobernabilidad y llegue a todos los sectores de la sociedad y rincones del país.
Plan Nacional Estratégico de Ciencia, Tecnología e Innovación para la Competitividad
y el Desarrollo Humano
PNCTI 2006-2021
(D.S. Nº 001-2006-ED)
PNCTI: Objetivos Específicos al 2021
1. Promover el desarrollo y la transferencia de innovaciones tecnológicasen las empresas elevando la competitividad productiva y el valoragregado con criterio de sostenibilidad económica y ambiental.
2. Impulsar la investigación científica y tecnológica orientada a la soluciónde problemas y satisfacción de demandas en las áreas estratégicasprioritarias del país.
3. Mejorar, cuantitativa y cualitativamente, las capacidades humanas enCTI, con énfasis en una formación de excelencia en el postgrado y en elámbito técnico especializado.
4. Fortalecer, dinamizar y articular sinérgicamente la institucionalidad de laciencia, la tecnología y la innovación, en el marco del Sistema Nacionalde Planeamiento Estratégico.
Los Programas de CTI: Programas Nacionales Sectoriales
• Programa de Agricultura y Agroindustria Alimentaria.• Programa de Plantas Medicinales, Nutracéuticas y Afines.• Programa Forestal Maderable.• Programa de Zoocría y Manejo de Fauna Silvestre.• Programa de Camélidos Sudamericanos.• Programa de Acuicultura.• Programa de Pesca.• Programa de Educación.• Programa de Salud.• Programa de Minería.• Programa de Transporte.• Programa de Turismo.
Programas Nacionales Transversales
• Programa de Investigación Básica.• Programa de Valorización de la Biodiversidad.• Programa de Biotecnología.• Programa de Ciencia y Tecnología de Materiales.• Programa de Ciencia y Tecnología Ambiental.• Programa de Ciencia y Tecnología de Recursos
Hídricos.• Programa de Tecnologías de la Información y
Comunicación.• Programa de Ciencia y Tecnología de la Energía.
Importancia de la Biotecnología
Las Biotecnologías y los sectores económicos de influencia
Salud y Farmacia Agricultura
Enzimas Procesamiento alimentos
Foresteria Biorremediación
Industria química
Pulpa y papel
Textiles
Cosméticos
Electrónica
Minería
Energía
Manejo ambiental
etc. etc. etc.
Tecnologías
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Cadena de valor en el tiempo
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Las Biotecnologías
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¿Qué es la Biotecnología?
Uso o modificación de organismos vivos o partes de los mismos, para obtener productos o servicios para la humanidad; usándose con responsabilidad social y medioambiental
Clasificación
Clasificación de la biotecnología
1. Biotecnología tradicional
2. Biotecnología clasica
3. Biotecnología moderna
Aplicaciones de la Biotecnología
Bioreactor o tanque fermentador
Inserción del gen para la hormona del crecimiento
Clonación de Dolly
Clonación de toros de lidia
Animales clonados en el mundo
Las enzimas más utilizadas a nivel industrial y las
características enzimáticas que han sido
modificadas por ingeniería de proteínas
ESQUEMA DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA S DEL VIRUS DE
LA HEPATITIS B EN CÉLULAS DE LEVADURA
Colonia de Penicillium, productor de
penicilina (antibiótico)
Tecnología biotecnológica para el tratamiento de aguas residuales
Armas de destrucción masiva
Ventajas de la Biotecnología
• Bajo consumo energético.
• Facilidad de acceso a materias primas (producción in situ).
• Contrastados y probados a lo largo de toda la Evolución Biológica.
• Especificidad.
• Sustentabilidad medioambiental
Inconvenientes de la Biotecnología
• Requerimiento de muy alta tecnología y personal altamente cualificado.
• Inversiones de alto riesgo.
• Consecuencias biológicas y medioambientales difícilmente predecibles.
• Problemas éticos.
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Western Blot
• Es un método altamente específico que permite determinar si la muestra contiene la proteína objetivo, eficiente con proteínas insolubles.
• Se basa en la separación de proteínas de una muestra en función de su tamaño mediante electroforesis y posterior detección mediante anticuerpos específicos para la proteína.
Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas
Western Blot
Detección del ADN de los OVMs
• La detección de una secuencia específica de ADN es uno de los métodos más utilizados para la identificación y cuantificación de OVMsy sus productos derivados.
• Los métodos que permiten la detección cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa de OVMs.
• Se emplea la tecnología de la PCR, ya sea en punto final (convencional) o en tiempo real.
Detección del ADN de los OVMs
• Primers no específicos de evento: diseñados sobre secuencias presentes en la mayoría de las construcciones vegetales (promotores, terminadores, etc), por lo tanto, permiten detectar varios eventos.
• Primers específicos de evento: diseñados sobre el inserto y sobre una región genómica adyacente, por lo tanto, permiten detectar un sólo evento.
• Primers específicos: diseñados usualmente sobre la secuencia codificante del transgén, permiten detectar uno o pocos eventos.
PCR Multiplex
• Variación de la técnica de PCR en la cual se usan dos o mas sets de primers en un único tubo de mezcla.
• Tiene por objetivo lograr la amplificación simultánea de múltiples segmentos de ADN.
• Debe ser estandarizado.
Ejemplo de detecciónempleando PCR
Inia, 2010
Ejemplo de detecciónempleando PCR
Inia, 2010
BIOSEGURIDAD
• Normativa: Protocolo de Cartagena
• Movimiento transfronterizo
• Análisis de Riesgo
• Evaluación de Riesgo
• Biosafety Clearing House
Plantas como Biofábricas
Llamadas también “farmaplantas” o (molecular) Pharming
• No sólo podemos hacer Ingeniería genética para fines agrícolas, sino que también podemos transferir genes que hagan que las plantas fabriquen sustancias valiosas en la industria farmacéutica o química: plantas transgénicas convertidas en fábricas vivas (biorreactores) de sustancias de alto valor añadido.
• El atractivo de esto es enorme, ya que podemos disponer de campos de tabaco, girasol, tomate, colza, etc., produciendo enormes cantidades de sustancias difíciles o caras de obtener por otros medios. Además, a diferencia de las fermentaciones industriales, aquí no hacen falta grandes inversiones ni trabajadores especializados. Ya hay ensayos a pequeña escala de plantas productoras de medicamentos: – encefalina
– seroalbúmina humana
– interferón humano
– vacunas comestibles (p. ej., tomate-vacuna antirrábica para animales)
Sin embargo, quizá lo más espectacular ha sido comprobar que las plantas pueden fabricar anticuerpos monoclonales funcionales. Incluso son capaces de ensamblar correctamente la IgA dimérica, con su cadena J y su componente secretor. Esto es muy interesante, ya que no es fácil de obtener por otros métodos. Se han hecho pruebas con éxito que demuestra que confieren protección mucosal pasiva en boca (contra caries), tracto intestinal, etc.
• Posibilidad de protegernos comiendo fruta fresca transgénica (!)
• Primeros ensayos de producción en plantas (colza, soja) de plásticos totalmente biodegradables (PHA, polihidroxialcanoatos a partir de genes bacterianos).
Definición• Plantas geneticamente transformadas para producir
moleculas que no son originalmente vegetales.
• Productos: terapeuticos, vacunas, antibioticos, proteínas industrial, bioplásticos, etc.
• Pros: grandes cantidades, sin contaminación bacteriana o viral, bajo costo de producción.
• Contras: seguridad y biodiversidad, residuos diferentes de azucares; estabilidad.
• Vacunas comestibles: minimizan la necesidad de costos de refrigeración, de distribución y administracion. Ejemplo: cólera, sarampión, enterotoxina de la E. coli (agente causante de la diarrea), hepatitis B.
Procesos clave
• Transformación
• Expresión
• Patente
Potencial
• Primeros productos lanzados en el 2006.
• La demanda de biofarmacos es creciente en 13% por año (Estados Unidos).
• Se espera que el Molecular Pharming se valore en $100 millones de millones en el 2020.
Ventajas del “Pharming” en plantas
• La mayoría de la investigación se ha enfocado en el uso de plantas geneticamente modificadas o transgénicas.
– Porque son mas facilmente modificables que los animales.
– Se reproducen fácilmente y son rápidamente clonables.
– Vienen en diferentes formas útiles para casi cada necesidad de producción y crecimiento.
Ejemplo: SemBioSys Genetics Inc.
Insulina de SemBioSys
• El problema: 1 nuevo diagnóstico cada 5 segundos; para el 2025 habrán 380 millones de casos en todo el mundo; 50% de ellos no tendrán acceso a la insulina.
• La solucion: insulina en plantas usando la tecnologia “oilbody”
• Estatus: Fase I/II pruebas clinicas empezaron en Diciembre del 2008, y los resultados fueron presentados en Junio del 2009.
http://www.sembiosys.com/Default.aspx
SemBioSys ApoA1 (Apoproteína A1)
• El problema: Las enfermedadesCardiovasculares se convertiránen una de las causas principalesde muerte en el mundo; los tratamientos disminuyen la enfermedad, pero el ApoA1 disminuye el tamaño de lasplaquetas; dificultad para produciren masa ApoA1.
• La solución: ApoAI en los cuerposlipidicos (oilbodies)
• Estatus: niveles comerciales de ApoAI se producen y se muestrafuntionalidad ensayos celulares.
Otras aplicaciones del “oilbody”
• Aceites nutricionales: acidos grasos omega-6; DHA (Ácido docosahexaenoico) como suplementos e ingredientes.
• Vacunas animales.
• Immunosphere™, un aditivo alimenticio que mejora la sobrevivencia contra enfermedades virales.
• Quimosina para la producción de queso.
Ejemplo: Geneware® de Advanced Cancer Therapeutic (ACT)
• Virus modificado del mosaico del tabaco (TMV) más un promotor ARN insertado y gen(es) estructurales para codificar la proteína de interés.
http://www.advancedcancertherapeutics.com/
Organización del genoma del TMV
HPV (virus del papiloma humano)
• El problema: el HPV infecta la epidermis y las membranas mucosas; verrugas; pueden conducir a cancer de la cervix y genitales; la vacuna vale $350.
• La solución: un equivalente de Gardasil® por Merck, sera producido con produced by ACT using Geneware® technology.
• Estatus: la vacuna de ACT está en etapa preclinica.
Otros productos ACT y su estatus
Macrophage migration inhib factor vs cancer, autoimm MS
Synthetic oligonucleotide vs c-myc
3PO block gluc uptake by cancer cell
CK37 inh choline kinase in cancer
Salvando el planeta
• Si todos los plasticosfueran bioplasticos, entonces el consumo del petroleo bajaria 90-145 millones de barriles/año , casi como el petroleo queconsume Estados unidosen una semana.
• Las algas no son usadaspara producción de alimentos y pueden ser transformadas en combustible.
• Biopolimeros: producir termoplasticos biodegradables tales como el polihidroxibutirato (PHB) por ingenieria metabolica en la semilla de canola.
Consideraciones normativas
• Pruebas clinicas of terapeuticos y vacunas
• Las mismas normas concernientes para los alimentos transgenicos.