Post on 28-Jun-2015
CROMATOGRAFIAModalidades y Clasificación
FM = Líquido
FM = Gas
CromatografiaLíquida
CromatografiaGaseosa (CG)
En CG la FEpuede ser:
Sólida
Líquida
CromatografiaGas-Sólido (CGS)
CromatografiaGas-Líquido (CGL)
CROMATOGRAFIA GASEOSAAplicabilidad
Qué mezclas pueden ser separadas por CG ?
Mezclas cuyos constituyentes sean
VOLÁTILES
la sustancia debe poder ser
“arrastrada” por el flujo de un gas en elque se disuelva - por lo menos parcialmente -
DE FORMA GENERAL:CG es aplicable para separaciones y
análisis de mezclas cuyos constituyentes tengan PUNTOS DE EBULLICION de hasta 300o y que sean térmicamente estables.
Cromatógrafo Gaseoso
1
2
3
4
6
5
1 - Reservorio de Gas y Controles de Presión.2 - Inyector (Vaporizador) de muestra.3 - Columna Cromatográfica y horno.4 - Detector.5 - Electrónica de Tratamiento (Amplificación) de Señal.6 - Registro de Señal (Registrador del Computador).
INSTRUMENTACIONParámetros de Inyección
TEMPERATURA DEL INYECTOR Debe ser suficientemente elevada para que la muestra vaporice inmediatamente sin descomponerse.
Regla Gral: Tiny = 50oC encima de la temperatura de ebulición del componente
menos volátil
VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra
COLUMNA muestrasgaseosas
muestraslíquidas
empacada = 3,2 mm (1/4”)
0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L
capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L
Sólidos: convencionalmente se disuelven en un solvente adecuado y se inyecta la solución
INSTRUMENTACIONMicrojeringas para Inyección
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
émbolo
cuerpo (pirex)
aguja (inox 316)
Microjeringa de 10 L:
I NSTRUMENTACI ONColumnas: Definiciones
EMPACADA = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 mRellena con sólido pul-
verizado (FE sólida o FElíquida depositada sobrelas partículas de relleno)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m
Paredes internas recubier-tas con un film fino
(fracción de m) de FElíquida o sólida
INSTRUMENTACIÓNTemperatura de la Columna
La interacción con la FE y el tiempo que un analito demora para recorrer la columna
depende de su PRESIÓN DE VAPOR (p0).
p0 = f
Estructura químicadel analito
Temperatura de la columna
Temperaturade
columna
Presiónde
vapor
Velocidadde
migración
EL ANALITO ELUYE MAS RAPIDAMENTE (MENOR
RETENCIÓN)
INSTRUMENTACIONTemperatura de la Columna
TE
MP
ER
AT
UR
A D
E C
OL
UM
NA
EL CONTROL CONFIABLE DE LA TEMPERATURA DE COLUMNA ES ESENCIAL PARA OBTENER UNA
BUENA SEPARACION EN CG
INSTRUMENTACIONHorno de la Columna
Características Deseables de un Horno:
AMPLIO RANGO DE TEMPERATURA DE USO Por lo menos de Tambiente hasta
400oC. Sistemas criogénicos (T < Tambiente)
pueden ser necesarios en casos especiales.
TEMPERATURA INDEPENDIENTE DE LOS DEMAS MÓDULOS No debe ser afectado por la temperatura del inyector y del detector.
TEMPERATURA UNIFORME EN SU INTERIOR Sistemas de ventilación interna muy eficientes para mantener la temperatura homogénea en todo el horno.
INSTRUMENTACIONHorno de la Columna
Características Deseables de un Horno:
FÁCIL ACCESO A COLUMNA La operación de cambio de columna puede ser frecuente.
CALENTAMIENTO Y ENFRIAMIENTO RÁPIDO Importante tanto en análisis de rutina como durante el desenvolvimiento de metodologias analíticas nuevas.
TEMPERATURA ESTABLE Y REPRODUCIBLE
La temperatura debe ser mantenida con exactitud y precisión de ± 0,1°C.
En cromatógrafos modernos (después de 1980),el control de temperatura del horno es totalmente
operado por microprocesadores.
INSTRUMENTACIONProgramación Isotérmica
Mezclas complejas (constituyentes con volatilidades muy diferentes) separadas
ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAJA:
- Los componentes más volátiles son separados
- Los componentes menos volátiles demoran en eluir, saliendo como picos mal
definidos
TCOL ALTA:
- Los componentes más volátiles no son separados
- Los componentes menos volátiles eluyen más
rápidamente
INSTRUMENTACIONProgramación Lineal de Temperatura
La temperatura del horno puede modificarse linealmente durante la
separación:
Se consiguen buenas
separaciones de los componentes de la muestra en
menor tiempo
TIEMPO
TE
MP
ER
AT
UR
A
tINI tFIN
TINI
TFIN
R
Parámetros de una programación de temperatura:
TINI Temperatura Inicial
TFIN Temperatura Final
tINI Tiempo Isotérmico Inicial
tFIN Tiempo Final del Programa
R Velocidad de calentamiento
INSTRUMENTACIONProgramación Lineal de Temperatura
Posibles problemas asociados a PLT:
VARIACIONES DEL CAUDAL DEL GAS DE
ARRASTRE La viscosidad de un gas aumenta con la temperatura.
viscosidad caudal
DERIVA DE LA LINEA DE BASE Debido al aumento de volatilización de FE líquida
INSTRUMENTACIONDetectores
Dispositivos que examinan continuamente el material eluido, generando la señal al pasar el
analito
Gráfico Señal x Tiempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada sustancia separada aparece
como un PICO en el cromatograma.
INSTRUMENTACIONDetectores
Más Importantes:
DETECTOR POR CAPTURA DE ELECTRONES
(DCE O ECD) Supresión de corriente causada por la absorción de electrones por eluatos altamente electrófilos.
DETECTOR POR CONDUCTIVIDAD TÉRMICA
(DCT O TCD) Variación de conductividad térmica del gas de arrastre.
DETECTOR POR IONIZACION EN LLAMA ( FID) Iones generados durante la combustión de los eluatos en una llama de H2 + aire.
TEORIA BÁSICAEficiencia de Sistemas Cromatográficos
La migración de un analito por la
columna provoca inevitablemente el
ensanchamiento de su banda:TIEMPO
Efectos del ensanchamiento excesivo de picos:
Separación deficiente de analitos con retenciones
próximas.
Picos más largos y menos intensos = menor
detectabilidad
EFICIENCIA Capacidad de elución con el mínimo de dispersión del analito.
TEORIA BÁSICACuantificación de la Eficiencia
Suponga la columna cromatográfica como una serie de etapas separadas donde ocurre un equilíbrio entre
el analito, la FE y el gas de arrastre:
Cada “etapa” de equilíbrio se denomina
PLATO TEÓRICO
El número de platos teó-ricos de una columna (N) puede ser calculado por:
Columna más eficiente
tR
wb
N
TEORIA BÁSICACuantificación de la Eficiencia
ALTURA EQUIVALENTE A UN PLATO TEÓRI-CO (H) “Tamaño” de cada etapa de equilíbrio
Valores típicos de H e N:
dC df H N
0.10 0.25 0.081 3703700.25 0.25 0.156 1923080.32 0.32 0.200 1500000.32 0.50 0.228 1315790.32 1.00 0.294 1020410.32 5.00 0.435 689660.53 1.00 0.426 704230.53 5.00 0.683 43924
2.16 10% 0.549 36432.16 5% 0.500 4000
Capilares, L = 30 m
Empacadas, L = 2 m
Valores de H para columnas capilares y empacadas son parecidos, pero como L para capilares es
MUCHO mayor tipicamente ellas son más eficientes
(L = longitud de la columna)
TEORIA BÁSICAOptimización de la eficiencia
La altura equivalente de un plato teórico es función de la velocidad lineal media del gas de arrastre ū:
H
uuMAX
HMIN
El valor de H puede ser
minimizado optimizando-
se la velocidad del
gas de arrastre
Relaciones algebraicas entre H y u:
- Columnas Empacadas: Ecuación de van Deemter
- Columnas Capilares: Ecuación de Golay
(A, B, C = constantes)
(B, CM, CS = constantes)
FASES ESTACIONARIASConceptos Generales
LÍQUIDOS depositados sobre una superfície de: só-lidos porosos inertes (columnas empacadas) o de
tubos finos de materiales inertes (columnas capilares)
FElíquida
SOPORTESólido inerte
poroso
Tubo capilar de material inerte
SÓLIDOS Columnas rellenas con material finamente granulado (empacadas) o depositado sobre la
superfície interna del tubo (capilar)
Para minimizar la pérdida de FE líquida por volatilización, normalmente ella es:
Entrecruzada: las cadenas
poliméricas están químicamente
ligadas entre sí
Químicamente ligadas: las cadenas poliméricas
están “ligadas” al soporte por enlaces
químicos
FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal
SELECTIVA Debe interactuar diferencialmente con los componentes de la muestra.
Regla gral: la FE debe tener características que permitan la separación de dos solutos a ser
separados (polar, apolar, aromático ...)
FE Selectiva: separación
adecuada de los constituyentes
de
la muestra
FE poco Selectiva: poca resolución aún
con columna de buena eficiencia
FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal
AMPLIO RANGO DE TEMPERATURAS DE USO Mayor flexibilidad en la optimización de la separación.
BUENA ESTABILIDAD QUÍMICA Y TÉRMICA Mayor durabilidad de la columna, no reacciona con los componentes de la muestra
POCO VISCOSA Columnas más eficientes (menor resistencia a la transferencia del analito entre fases)
DISPONIBLE EN ELEVADO GRADO DE PUREZA Columnas reproducibles; ausencia de picos “fantasma” en los cromatogramas.
FASES ESTACIONARIASFE Sólidas: Adsorción
El fenómemo físico-químico responsable de la interacción entre el analito + FE sólida es la
ADSORCIÓN
La adsorción ocurre en la interfase entre el gas de arrastre y la FE sólida
ADSORCIÓN
Sólidos con grandes áreas superficiales (partículas finas, poros)
Solutos polares
Sólidos con gran número de sítios activos (hidroxilos, pares de electrones...)
FASES ESTACIONARIASFE Sólidas
Características Generales: - Sólidos finamente granulados (diámetros de par-
tículas típicos de 105 µm a 420 µm).- Grandes áreas superficiales (hasta 102 m2/g).
Más usados:Polímeros Porosos Porapak (copolímero estireno-divi-nilbenceno), Tenax (polióxido de difenileno)
Sólidos Inorgánicos Carboplot, Carboxen (carbones activos grafitizados), Alumina
Columna:Carboxen-1000 60-80 mesh; 15’ x 1/8”TCOL: 35oC a 225oC / 20oC. min-1
Gas de Arrastre: He @ 30 ml.min-1
Detector: TCD
Principales Aplicaciones:- Separación de gases - Compuestos livianos- Series homólogas
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
POLIGLICOLES Muy polares; sensibles a la oxidación. Principales: Polietilenglicol (nombres comerciales: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.)
CH2 CH2OH OH
n
Estructura Química:
AMINAS ALIFÁTICASColumna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH
TCOL: 200oC (isotérmico) Gas de Arrastre: N2 @ 20 mL.min-1
Detector: FID Muestra: 0,01 L de mezcla de aminas
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
Mayor parte de las aplicaciones en CG moderna
Cuatro grandes grupos estructurales:
PARAFINAS No polares; alta inercia química. Principal: escualeno (C30H62)
POLIÉSTERES Ésteres de dialcoholes con di-ácidos. Polares; altamente sensibles a la humedad y a la oxidación.
ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAsOS
Columna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport 100/120 mesh; 6’ x 1/8”TCOL: 200oC (isotérmico)Gas de Arrastre: N2 @ 20 ml.min-1
Detector: FIDMuestra: 0,5 L de solución en cloroformo conteniendo 0,5 g de cada éster
FASES ESTACIONARIASFE Líquidas: Absorción
El fenómeno físico-químico responsable de la interacción analito + FE líquida es la
ABSORCIÓN
La absorción ocurre en el interior del film de FE líquida (fenómeno INTRAfase)
ABSORCION
Films espesos de FE líquida
Interacción fuerte entre la FE líquida y el analito (gran solubilidad)
Gran superficie líquida expuesta al gas de arrastre
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
SILICONAS (polisiloxanos) Las FE más em-pleadas en CG. Cubren amplia rango de pola-ridades y de propiedades químicas diversas.
Si
CH3
H3C
CH3
O Si
R1
R2
O Si
CH3
CH3
CH3n
R1, R2 = qualquier
radical orgánico
- Unión Si-O extremadamente estable = elevada estabilidad térmica y química de la FE.
- Las siliconas son fabricadas en amplia escala para diversas aplicaciones = minimización del costo del producto + tecnologia de produción y purificación
ampliamente estudiada y conocida.
- Practicamente cualquier radical orgánico o inorgánico puede ser unido a la cadena polimérica =
FE “ajustables” a separaciones específicas + facilidad de inmobilización por entrecruzamiento de uniones
química al soporte
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
Separación de pesticidas - FE = 100 % PDMS
1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin
Columna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12
m)
TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)
Gas de Arrastre: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID
Muestra: 2L de solución de pesticidas “on-column”
17 min
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
Separación de piridinas - FE = 100 %CNpropilsilicone
1 - piridina2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina
3 minColumna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m)
TCOL:110oC (isotérmico)
Gas de Arrastre: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID
Muestra: 0,1L de solución 1-2% de piridinas en 3-metilpiridina
FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas
Separación de fenoles - FE = fenilmetilsiliconas
50% Ph
50% Me
5% Ph
95% Me
FASES ESTACIONARIASFE Quirales
Separación de isómeros ópticos:
FÁRMACOS En muchos fármacos apenas dos isómeros ópticos tienen actividad farmacológica.
PRODUCTOS BIOLÓGICOS Distinción entre productos de origen sintético y natural (natural = normalmente sustancias ópticamente puras; sintético = muchas veces son mezclas racémicas).
Las propiedades físico-químicas de los isómeros ópticos son MUY SIMILARES
Las FE convencionales no interaccionan diferencialmente con isómeros ópticos
La separación de mezclas de isómeros ópticos sólo es posible con FE
opticamente activas
=
FE Quirales
FASES ESTACIONARIASFE Quirales
FE ópticamente activas más importantes:
O Si
CH3
CH2
CHCH3
C
O N
H
C*
C
O
H
CH CH3
CH3
NH C
CH3
CH3
CH3
Si
CH3
CH3
O
n
Chiralsil-Val
Derivados de aminoácidos:
Mezclas de compuestos formadores de puentes
de hidrogeno.
Organometálicos:
Separación de enantiómeros formadores
de complejos.
n
O Si
CH3
CH2
Si
CH3
CH3
O
CH2
O
O
Ni
C3F7
/ 2
Chiralsil-Metal
FASES ESTACIONARIASFE Quirales
Derivados de ciclodextrinas alquiladas:
-ciclodextrina: oligosacárídos
cíclicos quirales
Chiralsil-Dex
- Introducidas en 1983
- ligadas a cadenas de polisiloxano: su uso es extremamente favorable como FE líquida (viscosidad
baja, estabilidad ...)
- Pueden ser químicamente inmobilizadas en las columnas
- Columnas disponibles comercialmente
FASES ESTACIONARIASFE Quirales: Aplicaciones
Aceite esencial artificial de limón: separación de terpenos primarios
1 - (+/-) -pineno2 - sabineno3 - (+/-) -pineno4 - (+/-) limoneno
Columna: Rt-ßDEXsm (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)
TCOL: 1 min a 40°C / 2°C min-1 / 3 min a 200°C
Gas de Arrastre: H2 @ 80 cm.min-1 Detector: FID
FASES ESTACIONARIASFE Quirales: Aplicaciones
Aceite esencial natural
Esencia artificial
Aroma de bergamota: distinción entre aroma natural y artificial
Columna: Rt-ßDEXse (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)
TCOL: 1 min a 40°C / 4°C min-1 / 200°C
Gas de Arrastre: He @ 80 cm.min-1 Detector: MS
FASES ESTACIONARIASFE Quirales: Aplicaciones
Anfetaminas: resolución de isómeros
Columna: Rt-ßDEXcst (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)
TCOL: 1 min a 120°C / 1,5°C min-1 / 3 min A 175°C
Gas de Arrastre: He @ 25 cm.min-
1
Detector: MS
COLUMNAS EMPACADASDefiniciones Básicas
Tubo de material inerte relleno con FE sólida gra-nulada o FE líquida depositada sobre soporte sólido.
MATERIALDEL
TUBO
ø = 3 mm a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
ac. inox
vidro pirex
níquel
TEFLON
Granulometriadel
relleno80 - 100 mesh 149 - 177 m
100 - 120 mesh 125 - 149 m
60 - 80 mesh 177 - 250 m
MESH dp
Eficiencia maximizada con:
- Disminuc. de dC
- Disminuc. de dp
- Relleno regular
Limitados por la resistencia al pasaje de gas de arrastre
COLUMNAS EMPACADASFE Líquidas: Soporte
La FE líquida debe ser dispuesta sobre
un SOPORTE sólido
área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1
microporos regulares (~ 1 m)
NO interactuar con la muestra
buena resistencia mecánica
Uso casi universal: TIERRA DE DIATOMEAS
Esqueletos fósiles
(SiO2 + óxidos
metálicos) de algas
microscópicas
ChromosorbAnachrom
Supelcoport...
secado
calcinación
fusión con NaOH
lavado con ácido
silanización
COLUMNAS EMPACADASFE Líquidas: Soporte
Chromosorb - características generales
Áre
a S
up
erfi
cial
Den
sid
ade
Ap
aren
te
Tam
anh
o d
e P
oro
% M
áx.
de
FE
NOME m 2 .g -1 g.ml -1 m
Chromosorb P 4,0 0,47 0,4 - 2 30Chromosorb W 1,0 0,24 8 - 9 15Chromosorb G 0,5 0,58 - 5
Ord
en c
resc
ien
ted
e in
erci
a
Tratamientos especiales:
AW Lavado con ácido, para remover metales
HP o DMCS o HDMS Silanizados (menor adsorción)
NAW Sin lavado con ácido
Chromosorb P muy activo.
Chromosorb W mas inerte que el P.
Chromosorb G Similar al W, mayor resistencia mecánica
COLUMNAS EMPACADASFE Líquidas: Carga de FE
TIPICAMENTE % FE = 1 % a 30 % de relleno
Mayores vol. de muestra
Mejor reproducibilidad en la preparación del relleno
Mayor eficiencia (d f = N)Menor sangria de FE con temperatura programada
Separaciones rápidas con temperaturas menores
% FE
df = f (% FE en relleno)
COLUMNAS CAPILARESDefiniciones Básicas
Tubo fino de material inerte con FE líquida o sólida depositada sobre las paredes internas.
MATERIALDEL
TUBO
ø = 0,1 mma 0,5 mm
L = 5 ma 100 m
sílica fundidavidro pirexac. inoxNylon
Silcosteel
Las columnas de sílica están revestidas externamente con película de polímero (poliimida) para aumentar resistencia mecánica y
química
Columnas Capilares vs Empacadas:
CA
PIL
AR
ES L = N más eficientes
FC = 1 ... 10 mL.min-1 Control de elusión más difícil
Vi Dispositivos especiales de
inyecciónFamilias de Columnas Capilares :
PLOT (Porous layer open tube) Película de FE sólida adherida a las paredes internas
SCOT (Support coated open tube) Paredes internas revestidas con material de relleno similar a las columnas empacadas
WCOT (Wall coated open tube) FE liquida depositada (ligada // entrecruzada) sobre las paredes internas.
COLUMNAS CAPILARESDiámetro Interno
dC = Eficiencia
0,10 mm 0,25 mm0,32 mm 0,53 mm
1 2 3
1Columnas de altísima eficiencia (muestras complejas, “Fast GC”); limitada capacidad
volumétrica de procesamiento de la muestra
2Diámetros más comunes; limitada capacidad
volumétrica de la muestra
3Columnas “megabore”: menor eficiencia, pero mayor capacidad de procesamiento, permite el
uso de inyectores convencionales
COLUMNAS CAPILARES“Fast GC”: Columnas Capilares Finas
Destilación simulada de óleo diesel:
Columna: HP-1 (1 m x 0.10 mm x 0.40 µm)
TCOL: 35°C / 40°C min-1 / 0,75 min A 310°C
Gas de Arrastre: He @ 90 ml.min-
1
Detector: FID
Necesario control exacto flujo (control electrónico de presión) y altas velocidades de
calentamiento de la columna.
COLUMNAS CAPILARESColumnas Capilares: Inyección
1
2
3
45
6
1 - Septo;2 - Entrada de gas de arrastre;3 - “Liner” (mezclador);4 - Columna Capilar5 - Purga de gas de arraste;6 - Válvula de control de purga.
Baja capacidad de procesamiento de la muestra (sub-microlitro)
La inyección directa con microjeringa es muy difícil
Inyectores con división (“splitters”)
- Menor sensibilidad (buena parte de la muestra es despreciada)
- División de muestra raramente es uniforme (la fracción purgada de los constituyentes menos volátiles es siempre
menor)
COLUMNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)
Separación de PAH con LVI (Viny = 25 L, solución 400 ppb en CH2Cl2)
Columna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)
TCOL: 5 min a 50°C / 20°C min-1 / 2 min A 320°C
Gas de Arrastre: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID
COLUMNAS CAPILARESColumnas Multicapilares
“Líneas” paralelas de columnas capilares
con dC convencional
- Eficiencia próxima a las columnas convencionales- Capacidad similar a las columnas empacadas- Columnas más cortas: análisis más rápidos
Separación de explosivos en columna
multicapilar (OV-17, 1000 capilares x 6 m)
1 - 2,6-DNT2 - 2,4-DNT3 - 2,4,6-TNT4 - 3,4,5-TNT5 - 2,3,4-TNT6 - RDX ?7 - tetryl
DETECTORESDefinición General
Dispositivos que generan una señal eléctrica proporcional a la cantidad eluída de un analito
~ 60 detectores usados en CG
~ 15 equipados en cromatógrafos comerciales
4 responden para la mayor parte de las aplicaciones
DCT TCDDetector porCondutividad
Térmica
DIC FIDDetector porIonización en
llama
DCE ECDDetector porCaptura deEletrones
EM MSDetector Es-
pectrométrico de Masas
DETECTORESParámetros Básicos de Desempeño
CANTIDAD MÍNIMA DETECTABLE Masa de un analito que genera un pico con altura igual a tres veces el nível de ruído
SIN
AL
(S
)
RUÍDO (N)
= 3SN
RUIDO cualquier componente de la señal generada por el detector que no es originado por la muestra
Fuentesde
Ruído
Contaminantes en los gases
Impurezas acumuladas en detector
Descarga a tierra deficiente
DETECTORESParámetros Básicos de Desempeño
LIMITE DE DETECCION Cantidad de analito que
genera un pico con S/N = 3 y wb = 1 unidad de tiempo
Mismo detector, nível de ruido y masa de analito PERO diferentes anchos de base:
wb
QMD = f
Detector (señal generada, ruido)
Ancho del pico cromatográfico
Definiendo límite de deteción como:
LD es independente de la eficiencia del sistema cromatográfico !
[QMD] =masa
(ng, pg ...)
[LD] = masa / tiempo
(ng.s-1, pg.s-1 ...)
DETECTORESParámetros Básicos de Desempeño
VELOCIDAD DE RESPUESTA Tiempo recorrido entre la entrada del analito a la celda del detector y la generación de la señal eléctrica.
63,2% FSD
TIEMPO
SE
ÑA
L
Constante de Tiempo, : tiempo necesario para que
la señal llegue a 63,2 % FSD (full scale deflection)
luego de la entrada de la muestra
La constante de tiempo del sistema (detector + dispositivos de registro de señal) igual o menor a 10% del ancho de
banda a media altura (w0.5 ) del pico más estrecho del
cromatograma
>> w0.5
t R medido > t R real
w medida > w real
Deformación del pico
Disminuición del ruido (“damping”)
DETECTORESParámetros Básicos de Desempeño
SENSIBILIDAD Relación entre el incremento de área del pico y el incremento de masa del analito
MASA
ÁR
EA
Factor de Respuesta, S:
pendiente de la recta Área del
pico x Masa del analito
el mismo incremento de masa causa un
mayor incremento de área
SensibilidadS
En ausencia de errores determinados:
A = área del pico cromatográfico
m = masa del analito
DETECTORESParámetros Básicos de Desempeño
RANGO LINEAL DINAMICO Intervalo de masas dentro del cual la respuesta del detector es lineal
MASA
ÁR
EA
A partir de cierto punto la
señal no aumenta
linearmente
El fin de la zona de linearidad puede ser detectado cuando la razón (Área / Masa) diverge en más de 5 %
de la inclinación de la recta en la región lineal:
MASA
ÁR
EA
/ M
AS
A
0,95 S
1,05 S
DETECTORESClasificación
UNIVERSALES:Generan señal para cualquier
sustancia eluida.
SELECTIVOS:Detectan solamente sustancias
con determinada propiedadfísico-química.
ESPECÍFICOS:Detectan sustancias que
poseen determinado elementoo grupo funcional en sus
estructuras
DETECTORESDetector por Condutividad Térmica
PRINCIPIO Variación de la conductividad térmica del gas cuando eluye un analito.
Celda de Detección de DCT:
12
35
4
i
1 Bloque metálico
2 Entrada de gas de arrastre
3 Salida del gas de arrastre
4 Filamento metálico ( W-Re)
5 Alimentación de corriente eléctrica para calentar el filamento
La cantidad de transferencia de calor entre un cuerpo caliente y un cuerpo frio depende de la condutividad térmica del gas en el espacio que
separa los cuerpos
Si la condutividad térmica del gas disminuye, la cantidad de calor transferido también disminuye
- el cuerpo caliente se enfría.
DETECTORESDetector por Condutividad Térmica
Configuración tradicional del DCT: bloque metálico con cuatro celdas interligadas en par - por dos pasa el efluente de la columna y por dos el gas de arrastre
puro:CELDAS DE MUESTRA
CELDAS DE REFERENCIA
CO
RT
E S
UP
ER
IOR
CELDAS DE
MUESTRA
CELDAS DE REFERENCIA C
OR
TE
LA
TE
RA
L
Cuando eluye un compuesto con condutividad térmica menor que la del gas de arrastre puro:
Diferencia de resistencia
eléctrica entre los
filamentos de la muestra y la referencia
Filamentos de las celdas de la muestra se
enfrian
Resistencia eléctrica de los
filamentos de las celdas de la
muestra aumenta
Filamentos de las celdas de refencia no se
enfrian
Resistencia eléctrica de los
filamentos de las celdas de
referencia se mantiene constante
DETECTORESDetector por Condutividad Térmica
Los filamentos del DCT están montados sobre un puente de Wheatstone que transforma la diferencia de resistencia
cuando la elución de la muestra produce una diferencia de voltaje:
V Fuente de CC / Bateria (18 V a 36 V, típico)
F Ajuste de la corriente de los filamentosI Medida de la corriente de los filamentos (100 mA - 200 mA, típico)
B1 B2 Ajuste de cero
R1 R2 Filamentos de las celdas de referenciaA1 A2 Filamentos de las celdas de la
muestra
DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCT
SELECTIVIDAD Se observa señal para cualquier sus-tancia eluida diferente del gas de arrastre = UNIVERSAL
SENSIBILIDAD / LINEALIDAD Dependiendo de la configuración particular y del analito: QMD = 0,4 ng a
1 ng con linealidad de 104 (ng - decenas de g)
CAUDAL DE GAS DE ARRASTRE La señal es proporcional a la concentración del analito en el gas
de arrastre que pasa por la celda.
CAUDAL DE GAS DE ARRASTRE CONSTANTE DURANTE LA ELUCIÓN
VARIACION DEL CAUDAL DEL GAS DE ARRASTRE DURANTE
LA ELUCION
Fc = 0
Con DCT, el área de los picos cromatográficos es MUy dependiente del caudal del gas de arrastre !!!
DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCT
FACTORES DE RESPUESTA Cuanto menor es la condutividad térmica del analito, mayor es la señal.
Cantidades iguales de sustancias diferentes generan picos cromatográficos con áreas diferentes !!!
Los factores de respuesta dependen de la condutividad térmica del analito
Mezclas de cantidades equimolares de:
Etano = 17,5
Clorofórmio = 6,0
Etanol = 12,7
C2H6
CHCl3
C2H5OH
X
DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCT
TEMPERATURAS DE OPERACION Cuanto mayor es la diferencia entre la temperatura de los filamentos y del
bloque metálico mayor es la respuesta.
Temperatura del filamento, TF: entre 300oC y 350oC. Es función de la corriente de alimentación de los filamentos, i.
i TF Señal
Limitaciones:- Corrientes excesivas pueden fundir el filamento
(Ø típicos del filamento = 20 m)- Disminución del tiempo de vida útil de los
filamentos (oxidación por trazas de O2 en gas de arrastre)
Temperatura del bloque, TB: mantenerla tan baja como sea posible
TB Señal
Limitación:- Temperaturas excesivamente bajas pueden provocar a condensación de analitos en las
celdas (error analítico, daños a los filamentos)
DETECTORESDCT: Aplicaciones
1 Separaciones de cuantificación de los compuestos que no generan señal en otros detectores (gases nobles,
gases )
2 Por ser un detector no-destructivo, puede ser usado en CG preparativa o detección secuencial con dos detectores
en “tandem”
Columna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5 µm)
Gas de Arrastre: He @ 3 ml.min-
1
TCOL: 40°C Detector: DCT
1 N2 2 CH4
3 CO2 4 n-C2
5 NH3 6 n-C3
7 i-C4 8 n-C4
Separación de Gases y Carbohidratos:
DETECTORESDetector por Ionización en llama
PRINCÍPIO Formación de iones cuando un compuesto se quema en una llama de hidrógeno y oxígeno
El efluente de la columna se mezcla con H2 y O2 y se
quema. Como en una llama de H2 + O2 no existen íones, no
conduce corriente eléctrica.
Cuando un compuesto orgánico eluye, él también se
quema. Como en su combustión se forman íones,
la llama pasa a conducir la corriente eléctrica
DETECTORESDetector por Ionización de llama
Química de la llama de Hidrógeno:
Incandescencia
Reacción
Combustión
Estructura de la llama
tres regiones básicas
Región de combustión Mezcla de los gases, precalentados, inicio de la ruptura de las moléculas de H2, O2 y de los analitos.
Zona de reacción Reacciones exotérmicas con producción y/o consumo de radicales H, O, OH, HO2 (provenientes del H2), CH e C2 (provenientes del analito) e íones CHO+ (analito).
Zona de incandescencia Emisión de luz por decaimiento de especies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visíble).
Combustión de sustancias con
uniones C-H
CH + O CHO+ + e-
1 íon formado de cada ~105 átomos de C quemados
Combustión de H2
Apenas se forman radicales !!!
DETECTORESDetector por Ionización de llama
SELECTIVIDAD Selectivo para sustancias que contienen uniones C-H en su estructura química.
(como virtualmente todas las sustancias analizables por CG son
orgánicas, en la práctica el detector por ionización de llama es UNIVERSAL)
Compuestos que NO producen respuesta:
Gases nobles
H2, O2, N2
CO, CO2, CS2
CCl4, perhalogenados
NH3, NxOy
SiX4 (X = halógeno)
H2O
HCOOH, HCHO *
SENSIBILIDAD / LINEALIDAD QMD típicas = 10 pg a
100 pg com linealidade entre 107 e 108 (pg a mg)
DIC
DCT N2
CH4
CO2
O2
DETECTORESCaracterísticas Operacionales de DIC
FLUJO DE GASES Según el gas de arrastre, las variaciones de alimentación de aire (comburente) e
hidrogeno (combustíble) deben ser optimizadas.
Gráficos Señal x Flujo de Gases típicos:
SE
ÑA
L
150 300 450 600 15 30 45 60
AR H2
La señal se mantiene aproximadamente constante en un amplio rango de flujos de aire e H2
VARIACIONES EN LOS FLUJOS DE AIRE E H2 AFECTAN APENAS MARGINALMENTE LA SEÑAL = MAYOR REPRODUTIBILIDAD Y REPETIBILIDAD
DETECTORESCaracterísticas Operacionales del DIC
TEMPERATURA DE OPERACION El efecto de la temperatura sobre la señal del DIC es despreciable.
TRATAMENTO DE LA SEÑAL Por causa de la baja magnitud de la corriente eléctrica generada (pA a nA) ésta debe ser amplificada para poder ser registrada.
1
23
4
Diagrama eletrónico
simplificado de un DIC
1 Llama / Colector
2 Batería o Fuente de CC Voltajes de operación de no más de 200 V a 300 V
3 Amplificador Electrométrico Debe amplificar una señal y convertir una corriente variable en un
voltaje variable (pA mV).
4 Salida de Registro de Señal
DETECTORESCaracterísticas Operacionales del DIC
FACTORES DE RESPUESTA El factor de respuesta de determinado compuesto es aproximadamente proporcional
al número de átomos de carbono. La presencia de heteroelementos diminuye el factor de respuesta.
Número Efectivo de Carbonos (NEC) Prevée con ~20% de aproximación el factor de respuesta de un compuesto.
Átomo X
C alifático +1,00C aromático +1,00C olefiníco +0,95C carbonila +0,00
O álcool prim. -0,60Cl alifático -0,12
(X = Contribuición de cada átomo al NEC)
C2H6 NEC = 2,00
C2H5OH NEC = 1,40
CH3CHO NEC = 1,00
Mezcla con cantidades equimolares de:
DETECTORESDetector de Nitrógeno - Fósforo
Modificación de un DIC altamente selectiva para compuestos orgánicos nitrogenados y fosforados
cuenta de vidrio que contiene sal de metal alcalino:
RbCl (normal), KCl
Rb2SO4
QMD = 0,4 pg a 10 pg (N) y 0,1 a 1 pg (P)
Pesticidas Triazínicos usando DNP:
1 Desetilatrazina2 Desisopropilatrazina3 Atraton4 Atrazina5 Trietazina6 Secbumeton7 Sebutilazina8 Simetrin9 Dipropretrina10 Dimetametrina11 Metroprotrina
(100 pg cada)
DETECTORESDetector por Captura de Electrones
PRINCIPIO Supresión de un flujo de electrones lentos causada por la absorción de éstos por especies electrofílicas
Un flujo contínuo de electrones lentos se
establece entre un ánodo (fuente radioativa
-emisora) y un cátodo.
Al pasaje de una substancia electrofílica algunos electrones son absorbidos, resultando
una supresión de corriente elétrica.
DETECTORESDetector por Captura de Eletrones
12
3
4
5
1 Anodo (fuente radioativa - emisora)
2 Salida de gases 3 Cátodo
4 Cavidad 5 Columna cromatográfica
DETECTORESDetector por Captura de Eletrones
Mecanismo de Captura de Eletrones
1 Generación de electrones lentos por la interacción entre la radiación moléculas del gas de arrastre G y moléculas de bloqueador Q
- + G G + + e - + e* energia
- + G G* + Q G + e - + Q energia
2 Los electrones lentos son capturados por la especie eletrofílica AB
AB + e - AB - + energía
La disminución de corriente eléctrica que fluye por la celda de detección es proporcional a la concentración
a de la especie absorbente del gas de arrastre
Ib corriente de repuesta
Ie corriente en la elución del analito
K constante de captura
DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCE
FUENTE RADIOACTIVA Electrones de alta energía (rayos ) que se emiten desde una lámina delgada
que contiene Ni o H radiactivos
Empleo universal en DCE comerciales:
3H (-, 0,02 MeV)
Con la forma de Ta3H3
Tdet debe ser < 225oC
Mayor sensibilidad
63Ni (-, 0,06 MeV)
Usado como 63Ni 0
Mayor linearidad
útil hasta ~400oC
85Kr, 90Sr, 99Tc, 147Pm, 241Am, 226RaRaramente
usados:
El 63Ni es el preferido en
equipamientos modernos
- Mayor durabilidad (t1/2 = 100 a x 12 a para 3H)
- Mayor estabilidad térmica
- Menor riesgo de uso (radioactividad)
DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCE
GAS DE ARRASTRE El funcionamiento del DCE es muy dependiente de la natureza del gas de arrastre
MAS USADOS:N2
Ar + 5% CH4
Generan electrones lentos cuando son bombardeados con
-
El gas debe ser lo más puro posible!!!(trazas de H2O y O2 comprometen la señal del DCE)
FLUJO DEL GAS DE ARRASTRE La señal depende directamente del flujo de gas en el detector
SeñalF
!La adsorción de contaminantes sobre los electrodos causa deformación en los
picos
DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCE
SENSIBILIDAD / LINEAlIDAD QMD = 0,01 pg a 1 pg
(organoclorados), linearidad ~ 104 (pg a ng)
10 fg Lindano (C6H6)-ECD HP-6890
PESTICIDAS 1 tetracloro-m-xileno 2 - BHC 3 Lindano 4 Heptachlor 5 Endosulfan 6 Dieldrin 7 Endrin 8 DDD 9 DDT10 Metoxychlor10 decaclorobifenila
~250 fg cada analito
EL DCE ES EL DETECTOR DE ELECCIÓN PARA ANÁLISIS DE TRAZAS DE ORGANOHALOGENADOS Y
SIMILARES
DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCESELECTIVIDAD / FACTORES DE RESPUESTA Valores de S maximizados para compuestos
electrofílicos
hidrocarburos y ésteres alifáticos, dienos
alcoholes, cetonas y aldehídos alifáticos, aminas, nitrilos, mono - Cl, mono - F
enoles, oxalatos, mono - Br, di - Cl, hexa - F
tri - Cl, alquil - Pb, anhidridos
mono - I, di - Br, tri - Cl, mono - nitro, CS2
di - I, tri - Br, poli - Cl, di - nitro, 1,2 - dicetonas, fumaratos, organo - Hg
S típicos (clorobenzeno: S = 1)
Comparandose organoalogenados:
I > Br > Cl > F
Terc > Sec > Prim
Tri > Di > Mono
> >
trans > cis
ANÁLISIS CUALITATIVOConceptos Generales
Fuentes de Información Cualitativas
RETENCIÓN Uso de datos de retención de un analito para su identificación
DETECCIÓN Detectores que generan información estructural sobre las sustancias eluídas
Identificación individual de las especies presentes en la
muestra
Determinación de la identidad de la muestra propiamente
dicha
Aplicaciones cualitativas
de CG
Para un análisis cualitativo confiable por CG se recomienda la combinación de
datos provenientes de por lo menos dos fuentes
ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención
t’R = fInteracciones analito / FE
Presión de vapor del analito
Condiciones operacionales (TCOL, FC ...)
Fijadas las condiciones operacionales, el tiempo de retención ajustado de un analito es una
constante
MUESTRA
PATRÓN
Comparación de
cromatogramas de la muestra y
de una solución patrón
del analito buscado
ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención
La identificación por t’R es poco confiable:
Dependencia con FC y TCOL Variaciones en
estas condiciones afectan sensiblemente los t’R
VARIACIÓN DE 1% EN
EL t’R
TCOL = 0,1%
FC = 1%
Sobrecarga en la columna Aumento excesivo en la masa de material eluído deforma el pico
cromatográfico y altera su t’R
MA
SA
Saturación de la columna
cromatográfica con aumento de la
masa eluída provoca “caída
frontal” en el pico
ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención
Comparación de t’R usando agregado (“spiking”)
en la muestra del analito sospechado: aumento en la confiabilidad de identificación.
Muestra compleja: incerteza en los t’R
medidos puede llevar a una identificación
errónea
Comparación con cromatogramas de la
muestra con el agregado del analito de
interés permite una identificación más
confiable del mismo
ANÁLISIS CUALITATIVOÍndice de Retención de Kovàts
FUNDAMENTO Los t’R isotérmicos para una serie
homóloga de compuestos dependen logaritmicamente del número de átomos de carbono
de la cadena.
Separación isotérmica de una mezcla de n-alcanos
(n-C4, n-C5, ... n-C16)
Un gráfico de log(t’R) en función del número de átomos de carbono del
analito nC es LINEAL
ANÁLISIS CUALITATIVOÍndice de Retención de Kovàts
El índice de retención de Kovàts I para un analito se define por:
t’R (A) Tiempo de retención
ajustado del analito A
t’R (N) Tiempo de retención
ajustado de n-alcano con N carbonos
t’R (n) Tiempo de retención
ajustado de n-alcano con n carbonos (n = N + 1)
Ej.: un analito con I = 874 tendría un tiempo de retención ajustado equivalente al de un n-alcano
hipotético con una cadena de 8,74 átomos de carbono
Interpolación logarítmica de los
t’R
ANÁLISIS CUALITATIVOÍndice de Retención de Kovàts
REPETITIBILIDAD - REPRODUCIBILIDAD Los
efectos de TCOL y FC en los índices de Kovàts son
pequeños
ANALITO I/TCHCl3 +0,02 %
CH3CH2OH -0,12 %CH3CHO -0,05 %
CH3(CO)CH3 -0,04 %
Dependencia de I para algunas sustancias en
una columna apolar en el
rango de TCOL = 70oC a
TCOl = 130oC
La identificación por índices de retención es más
confiable que comparaciones basadas en t’R
ÍNDICE DE RETENCIÓN DE KRATZ Para programación lineal de temperatura la relación entre
t’R y nC es lineal: cálculo en los índices de retención
se modifica
ANÁLISIS CUALITATIVORetention Time Locking (RTL)
PRINCIPIO En cromatógrafos con: controles neumáticos y térmicos con microprocesadores,
inyectores automáticos y columnas cromatográficas de calidad excepcional es posible lograr alta
repetibilidad de los t’RCORRIDA #1
TCOL (1)
FC (1)
Columna A
CORRIDA #2
TCOL (2)
FC (2)
Columna BLos software RTL (Hewlett-Packard) automaticamente
ajustan las condiciones operacionales en un segundo CG para reproducir los t’R obtenidos en un primer equipamento
Cromatogramas obtenidos en diferentes
equipamientos y columnas con condiciones
operacionales de la segunda corrida
ajustadas por el software de RTL
ANÁLISIS CUALITATIVOMétodos de Detección Cualitativos
Métodos de detección que aportan informaciones cualitativas sobre los analitos eluídos:
Cromatografía Gaseosa con Detección Espectrométrica por Absorción en el Infra-rojo (CG-EIR)
Cromatografía Gaseosa con Detección Espectrométrica de Masas (CG-EM)
Cromatografía Gaseosa con Detección Espectrométrica por Emisión Atómica (CG-EA)
Identificación confiable cuando se combinan a técnicas de identificación basadas en retención
ANÁLISIS CUALITATIVOEspectrometría de Masas
PRINCIPIO La muestra se fragmenta y ioniza en un patrón característico de la especie química.
1 Moléculas de la muestra son bombardeadas por electrones (electron impact = EI) o íones (chemical ionization = CI):
ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-
2 El íón formado se fragmenta:
ABCDE.+ AB. + CDE+
ABCDE.+ AB+ + CDE.
ABCDE.+ A+ + BCDE.
3 Los fragmentos iónicos formados son separados magneticamente de acuerdo con sus masas moleculares y contados:
AB
UN
DA
NC
IA
MASA / CARGA
El gráfico del número de íones formados en
función de la razón Masa / Carga de los íones es el
ESPECTRO DE MASAS del analito
ANÁLISIS CUALITATIVOEspectrómetro de Masas
1
2
3
4
1 Cámara de Ionización Los electrones generados por un filamento enriquecido bombardean la muestra. Los fragmentos ionizados (carga +1) son repelidos por el electrodo positivo y conducidos al separador magnético.
2 Salida de Vacío Todo el interior del EM debe estar con alto vacío.
3 Separador Magnético La acción del campo magnético deja íones con determinada relación Masa / Carga atravesar esta zona del equipo.
4 Detector Una válvula fotomultiplicadora o un fotodiodo genera una señal eléctrica proporcional al número de íones que incide sobre el elemento.
ANÁLISIS CUALITATIVOEspectro de Masas
m/Z = 118
m/Z = 80
m/Z = 79
- CO
- (CO + H)
m/Z = 90
20 40 60 80100
120
0
m / Z
ANÁLISIS CUALITATIVOAcoplamiento CG - EM
ANÁLISIS CUALITATIVOAcoplamiento CG - EM
ANÁLISIS CUALITATIVOAcoplamiento CG - EM
2,2,4-trimetilpentano2,2,4-trimetilpentano
n-octanon-octano
ANÁLISIS CUALITATIVOAcoplamiento CG - EM
2,3-dimetilbutano2,3-dimetilbutano
dodecanododecano
ANÁLISIS CUALITATIVOAcoplamiento CG - EM
naftalenonaftaleno
etilbencenoetilbenceno