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DEFENSAS ANTIOXIDANTESDEFENSAS ANTIOXIDANTES
EN PLATHELMINTOSEN PLATHELMINTOS
Curso de Biología Parasitaria2013
PLATHELMINTOS PLATHELMINTOS
- Organismos multicelulares
- Hábitat variados: - intestino- vasos sanguíneos- órganos linfáticos- varios
- Ciclos de vida complejos: - varios estadios de desarrollo- migración tisular
PREVALENCIA GLOBAL DE INFECCIÓN POR HELMINTOS HUMANOS
Parásito Estimación
Helmintos intestinales 1/3 población mundial
Esquistosomas 200-300 millones
Parásitos filariales >150 millones
DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN
ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO Y DEL NITRÓGENO
DAÑO CELULARDAÑO CELULAR
Daños en el DNADaños en el DNA
Ribosilación deRibosilación depoly ADPpoly ADP
Alteración de laAlteración de laexpresión genéticaexpresión genética
Ruptura de ATPRuptura de ATPy NAD(P)(H)y NAD(P)(H)
Bases de schiffBases de schiff
AGEsAGEs(Advanced glycation (Advanced glycation
end products)end products)
LipoperoxidaciónLipoperoxidación
DañosDaños en las en las
membranasmembranas
Oxidación de grupos tiolesOxidación de grupos tiolesFormación de grupos Formación de grupos carboniloscarbonilos
Daños a los sistemas Daños a los sistemas transportadores ionicostransportadores ionicos
Inestabilidad para Inestabilidad para mantener gradientes mantener gradientes
iónicos normalesiónicos normales
Activación/Desactivación de Activación/Desactivación de varios sistemas enzimáticosvarios sistemas enzimáticos
BLANCOS DE LAS EROs
LIPIDOS PROTEÍNAS ADN CARBOHIDRATOS LIPIDOS PROTEÍNAS ADN CARBOHIDRATOS
Si los EROs no son neutralizados o sus efectos reparados puede
producirse la muerte del organismo
Por lo tanto todos los organismos aeróbicos han desarrollado sistemas
antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para prevenir o reparar el
daño oxidativo.
ALTAS CONCENTRACIONES
DE EROs
ESTRÉSOXIDATIVO
DAÑO OXIDATIVO
● SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)
MECANISMOS ENZIMÁTICOS
● CATALASA
● GLUTATIÓN-S-TRANSFERASA (GST)
● SISTEMA GLUTATIÓN
NADPH
NADP+
GlutatiónGlutatiónreductasareductasa
GlutarredoxinaGlutarredoxina
red red
ox ox
Blancos
red
ox
GlutatiónGlutatión
red
ox
redox Glutatión Glutatión peroxidasaperoxidasa
MECANISMOS ENZIMÁTICOS
● SISTEMA TIORREDOXINA
NADPH
NADP+
Tiorredoxina Tiorredoxina reductasareductasa TiorredoxinaTiorredoxina
red red
ox ox ox
red
Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos
red
ox
DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN
● El estadio adulto de S. mansoni es más resistentes al ataque oxidativo generado
in vitro.
Nare et al. Experimental parasitology (1990) 70:389-397.
ESTUDIOS DE RESISTENCIA AL ATAQUE OXIDATIVO
NIVELES DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES
Nare et al., 1990. Experimental parasitology, 70:389-397.
Mei and LoVerde. Experimental Parasitology (1997) 86:69-78.
● La mayor resistencia del estadio adulto al ataque oxidativo se correlaciona con niveles altos de enzimas antioxidantes.
● Se inmunolocalizaron en el tegumento y en el aparatato digestivo
Mei and LoVerde. Experimental Parasitology (1997) 86:69-78.
LOCALIZACIÓN DE LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
Experimentos realizados con juveniles de F. hepatica incubados en conjunto con schistosómulas vuelven resistentes a estas últimas frente al ataque oxidativo generado
ESTUDIOS REALIZADOS CON F. hepatica
Piedrafita et al. Parasite Immunology (2000), 22: 287-295.
LOS PARÁSITOS ESTÁN MUY BIEN ADAPTADOS
AL ESTRÉS OXIDATIVO
- alta expresión de enzimas antioxidantes
- alta concentración de estas enzimas en la interfase huésped-parásito:
- Productos de excreción/secreciones
- Superficie de los parásitos
- (CuZn)SOD: formas citosólica y secretadas
- MnSOD
- GPx
- Grx
- GST
- Sistema Tiorredoxina
ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN LAS
DIFERENTES CLASES DE PLATHELMINTOSDIFERENTES CLASES DE PLATHELMINTOS
SCHISTOSOMA MANSONI
A. Anti-GST26 tratados con GFP dsRNA.B. Anti-GST26 tratados GST26 dsRNA.C. Anti-Prx1/2 tratados con GFP dsRNA.D. Anti-Prx1/2 tratados con Prx1/2 dsRNA
50uM H2O2
Mourao et at. PLOS Neglected Tropical Diseases (2009), 3:1-9.
● Las enzimas antioxidantes prometen ser buenos blancos para vacunas mediante: - Inmunización con enzimas purificadas - Diseño de drogas que inhiban selectivamente estas enzimas
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
● Los niveles de enzimas antioxidantes en plathelmintos se correlacionan positivamente con la capacidad de supervivencia frente a los EROs generados por el huésped.
● Los niveles de enzimas antioxidantes son regulados a lo largo del ciclo de desarrollo del parásito y se encuentran influenciados por: - Hábitat parasitado - Metabolismo energético en los diferentes estadios - Presión inmunológica
● Las distintas clases de helmintos presentan diferentes tipos y niveles de expresión enzimática.
SISTEMAS LIGADOS Trx-GSH EN PLATHELMINTOS
TPX GPX
SOD
SISTEMA GLUTATIÓN
NADPH
NADP+
GlutatiónGlutatiónreductasareductasa
GlutarredoxinaGlutarredoxina
red red
ox ox
Blancos
red
ox
GlutatiónGlutatión
red
ox
redox Glutatión Glutatión peroxidasaperoxidasa
SISTEMA TIORREDOXINA
NADPH
NADP+
Tiorredoxina Tiorredoxina reductasareductasa TiorredoxinaTiorredoxina
red red
ox ox ox
red
Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos
red
ox
ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR
TR CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUG
Grx CPYC GSH
dominio Grx
dominioTR
CVNVGC FAD NADPH región interfase GCUGTGR CPYC GSH
GR CVNVGC FAD NADPH región interfase
66 kDa
PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA
10 mM GSH
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
45 kDa36 kDa
29 kDa24 kDa
66 kDa
PM 9 10
66 kDa
45 kDa
36 kDa
TR
Fasciola 1 ----------------------------------------MAPIPDDTS-----------SmanTGR 1 -----------------------------------------MPPADGTS-----------EgraTGR 1 -------------MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV---------
Fasciola 9 ---------SWVKKTINSSAVLLFSKS--------RCPYCRAVKQIFNDDKVNHAVIELD
SmanTGR 8 ---------QWLRKTVDSAAVILFSKT--------TCPYCKKVKDVLAEAKIKHATIELDEgraTGR 38 ---------EKLRNKINNAAVLVFAKS--------FCPYCKKVMERFNNLKIPFGYLDLD
Fasciola 53 KRPDGAKIQQVLSQISGISTVPQVFVRGEFVGDSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTYDYDLSmanTGR 52 QLSNGSAIQKCLASFSKIETVPQMFVRGKFIG DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKYDYDLEgraTGR 82 LKKNGSDYQKMLQEITGRTTVPQVFFRGEFIG GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKYDYDM
Fasciola 292 V VGASYVALECAGFLTRFGF DTTVMVRSIFLRGFDQQMADMIGEYMKEHGTKFVRSCVPTSmanTGR 291 VIGASYVALECAGFLASLGG DVTVMVRSILLRGFDQQMAEKVGDYMENHGVKFAKLCVPDEgraTGR 318 CVGASYVSLECAGFLSSIGC DVTVMVRSIFLRGFDQQMAGLISDYIAKYGVKFVRPCVPT
Fasciola 584 TKD -ASAKVTACUGSmanTGR 584 TKK -VSPIVSGCU GEgraTGR 610 TKS
SGSGSG-ASATVTGCUG
SmanTGR 111 IVIGGGSGGLAAGKEAAKYGAKTAVLDY VEPTPIGTTWGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAGLEgraTGR 140 VIIGGGSGGLALAKESAKSG AKVALLDFVVPTPMGTTWGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAAL
Fasciola 112 VVIGGGSGGLAASKEAARFGAKTAVFDFVVPTPQDTTRGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAAL
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA
Grx
sitio de unión al FAD centro redox
sitio de unión al NADPH
selenocisteína
TIORREDOXINA GLUTATIÓN REDUCTASA
Tiorredoxina Tiorredoxina glutatión reductasaglutatión reductasa
TiorredoxinaTiorredoxina
red red
ox ox
NADPH NADP+
Blancos
red
ox
Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos
red
oxdominioTR
dominioGrx
- La enzima purificada posee actividad TR, GR y Grx
La fusión de dominios codificada en el gen de la TGR hace posible que la enzima sea capaz de transferir electrones a los blancos de ambos sistemas
- Todas estas actividades son inhibidas con sales de oro
ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR
Tiorredoxina Tiorredoxina glutatión reductasaglutatión reductasa
TiorredoxinaTiorredoxina
red red
ox ox
NADPH NADP+
Blancos
red
ox
Tiorredoxina Tiorredoxina peroxidasaperoxidasa Blancos
red
oxdominioTR
dominioGrx
¿Hay TGR en los compartimientos
mitocondrial y citosólico?
Mic Mit Cit Nuc Tot
66 kDa
Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR
Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales?
EN OTROS PLATHELMINTOS
Taenia crassiceps:
Seguimiento de una actividad GR y TR resultaron en la purificación de una TGR
(Rendon et al. 2004)
Schistosoma mansoni:
Auranofin inhibe las actividades GR y TR en extractos de parásitos
(Alger and Williams, 2003)
S. mansoni S. Japonicum
cTGR 38* 18*
mtTGR 4 2
GR 0 0
TR 0 0
cGrx 0 0
mtGrx 8* 0
cTrx1 6 26
cTrx2 2 1
mtTrx 15 3
cTPx1 12 29
cTPx2 30 20
mtTPx 16 10
cGPx 39 20
secGPx 10 1
- Resultados similares se encontraron en E. granulosus y E. multilocularis
. Ausencia de GR y TR
. Presencia de Trx y TPx mitocondrial y citosolica
En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR
ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica
- 100 μg FhTGR- PBS
1º inmunización
- 100 μg FhTGR- PBS
2º inmunización
- 50 metacercarias
semana 0 semana 4 semana 6
Desafío
semana 18
Sacrificio
Schistosoma mansoni
Auranofin: En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente.
Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086
Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito.
Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086
Tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásitos encontrados.
Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086
Echinococcus granulosus
A- Control B- 12h C- 30h
Bonilla et al. The journal of biological chemistry, (2008) 283:17898-17907.
Fasciola hepatica
Ross et al. Plos One (2012) 7:1-12.
NEJ de F. hepatica incubados con 20 mM de diferentes drogas inhibidoras de TGR durante 48 h. A. 2 (oxadiazole N-oxide), B. 1(oxadiazole N-oxide), C. 4 (oxadiazole N-oxide), D. 61(quinoxaline), E. 50 (thiadiazole), F. control.