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DETECTORES PARA HPLC
DETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) - longitud de onda fija- longitud de onda variable - arreglo de fotodiodos
• DETECTOR ÍNDICE REFRACCIÓN
• DETECTOR FLUORESCENCIA
• DETECTOR ELECTROQUÍMICO
• MS/FTIR/Conductividad
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LINEALIDAD DEL DETECTOR
.
Seña
l del
det
ecto
r
Concentración de la muestra
Respuesta lineal máxima
Concentración mínima detectable
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RUIDO Y DERIVA DEL DETECTOR
Ruido de alta frecuencia
Ruido baja frecuencia
Deriva y ruido de baja frecuencia
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TIPOS DE FUENTES LUMÍNICASFUENTE DE LÍNEAS 253.7 nm
Lámpara deHg
Longitud de ondaFUENTE CONTÍNUA Lámpara de
Deuterio
Longitud de onda
E
E
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FACTOR DE RESPUESTA
Concentración
PENDIENTE = BD / AB
A B
CPENDIENTE = BC / AB
D
.
Res
pues
ta
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USO DE DETECTORES DE HPLC
Analytical Chemistry, 54 (1982) 323R.
TIPO PORCIENTO DE USOAbsorbancia 70.7
Ultravioleta, fija (28.0)Ultravioleta, filtro (8.7)Espectrofotométrica (34.0)
Fluorescencia 15.0Índice de Refracción 5.5Electroquímico 4.4Otros 4.4
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DETECTOR UV DE FIJA
Lente de Cuarzo Filtro
ReferenciaFotoDetectores
Registrador
Pre-AmpsFiltro UV
Fuente de mercurio
Muestra
Comparador LOG
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CELDA DE FLUJO: DOS CANALES
REFERENCIA
SALIDA
DE LA FUENTE
1 mm
AL DETECTOR
VENTANA DE CUARZO
ENTRADA
MUESTRA
SALIDA
ENTRADA
10 mm
1 mm
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LOS BENEFICIOS DE LA DETECCIÓN CON VARIABLE
Mantequilla hidrolizada 40 nanogramos de Estándar de Vitamina A en Alcohol
Vitamina AAlcohol
0 5 0 5
= 254 nm
= 325 nm
Tiempo de Retención ( Minutos)
Selectividad y sensibilidad mejoradas
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MUESTRAS IMPOSIBLES A 254nm
• Azúcares • Triglicéridos
• Esteroides • Barbitúricos
• Ésteres Metílicos • Ácidos carboxílicos
• Hidrocarburos • Polímeros
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DETECTOR DE UV DE VARIABLE : ESQUEMA
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DE ABSORCIÓN DE CROMÓFOROS
CHROMOPHORE FORMULA MAX (nm)
Amine – NH2 195
Ethylene – C C – 190
Ketone > C = O 195
Ester – COOR 205
Aldehyde – CHO 210
Carboxyl – COOH 200-210
Nitro – NO2 310
Phenyl 202, 255
Naphthyl 220, 275
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DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS:ESQUEMA
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SALIDA 3-D DE UN DETECTOR PDA
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USO DEL MODO 3 - D DE PDA
• Número de picos
• de máxima sensibilidad
• de mínima interferencia
• programación en f (tiempo)
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PDA: PROCESOS CUALITATIVOS
• Pureza de pico
• Confirmación del compuesto - ( max. y tR )
• Identificación del compuesto (no es fácil)
• Índice de pureza (relación de 1/2, 10 pts)
intervalo : <1.5 puro, > 1.5 impuro
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VERIFICACIÓN DE PUREZA DE PICO
A C
BEl problema:¿está este pico “puro”?
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SUPERPOSICIÓN ESPECTRAL
• No, el pico representa al menos dos compuestos coeluyendo.
mAU
nm190 230 270 310
A
B
C
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DETECTORES DE ARREGLO DE DIODOS
• Ampliamente usados, aceptados
• Principal uso – verificación de pureza de pico
• Ahorra tiempo - no se requiere volver a analizar cuando los picos no han sido bien detectados
A. Se pueden registrar distintas 'sB. Se puede re-graficar y re-integrar
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ABSORBANCIA AL UV DE SOLVENTES LC
n-Hexano
Tetracloruro
Benceno
Clorofromo
Cloruro de metileno
Acetona
Acetonitrilo
Metanol
Agua
UV CORTESOLVENTE
254 nm Fuente Hg
200 250 300
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DETECTOR UV : RESUMEN
• Buena sensibilidad 10-6 a 10-10 g
• Selectivo
• Se puede eluir con gradiente
• Costo variable
• El más empleado
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DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN :ESQUEMA
filtro
SOLVENTE PURO
EFLUENTE COLUMNA
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DETECTOR IR : RESUMEN
• Respuesta universal
• Mala sensibilidad ~ 10-6 g
• No se pueden gradientes
• Se afecta por la temperatura
• Básico para GPC
• Empleado en escalas preparativas
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COMPARACIÓN DE IR Y UV
A B C D E
Inyección
Inyección
Tiempo
IR
UV
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DETECTOR DE FILTRO FLUOROMÉTRICO :ESQUEMA
TUBO FOTOMULTIPLICADOR
FILTRO (EMISIÓN)LENTE
CELDA DE MUESTRA
EFLUENTE DELA COKUMNA
SALIDALENTEFILTRO (EXCITACIÓN)
LÁMPARA DE MERCURIO
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DETECTOR DE FLUORESCENCIA:CROMATOGRAMA DE EJEMPLO
Tiempo
Inyección
CROMATOGRAMA DE FLUORESCENCIA 5 picogramos
benzo(a)pireno
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DETECTOR AMPEROMÉTRICO DE PELÍCULA DELGADA PARA HPLC
DUALPARALLEL
LOCKINGCOLLAR
AUXILIARYELECTRODE
WORKINGELECTRODEBLOCK
MINIATUREREFERENCEELECTRODE
MOBILE PHASEPREHEATER COLUMN
GASKET
QUICK RELEASEMECHANISM
OUTLET
INLET
TOP VIEW
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EXTRACTOS DE BUPRENORFINADE PLASMA Y ORINA (ECD)
BLANCO DE PLASMA
8 1240
(a) (b)40 ng/ml (STD)
1.5
0 4 8 12 min
(c)
BLANCO DEORINA
0 4 8 12
(d)
ORINA
40 ng/ml
0 4 8 12
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DETECTOR ELECTROQUÍMICOENTRADA
SALIDASALIDA
Electrodo deReferencia Ag/AgCl
Electrodo de trabajo de grafito
Contraelectrodo
Tapón de vidrio poroso
B. Fleet, C.T. Little, J.Chrom.Sci, 12 (1974) 747
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DETECTOR ELECTROQUÍMICOAPLICACIONES
EN REDUCCIÓN
• Quinonas
• Compuestos nitro, nitroso y azo
• Compuestosorganometálicos
• Metales pesados
EN OXIDACIÓN
• Hidrocarburos aromáticos
• Aminas primarias, secundarias y terciarias
• Aminas aromáticas
• Compuestos fenólicos
• Compuestos heterocíclicos
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DERIVADOS SENSIBLES AL UV
Analyte ReagentRNH2 N-Succinimidyle
p-Nitrophenylacetate
RCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-Diisopropylisourea
ROH 3,5-DinitrobenzoylChloride
R2CO p-Nitrobenzyloxyamine-Hydrochloride 2,4-D.N.P.H.
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DERIVADOS SENSIBLES FLUORESCENCIA
Analyte ReagentRNH2 Dansyl Chloride
Fluorescamine
RCOOH 4-Bromomethyl-7-methoxycoumarin
R--OH Dansyl Chloride
R2C = ONH2
Dansyl Hydrazine
RCH-COOH Phthaldehyde
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DERIVADOS CON PROPIEDADES ELECTROQUÍMICAS
Analyte ReagentROH, R2NH,RNH2
2,4-DinitrobenzoylChloride
R-CH-COOH 2,4-Dinitrofluorobenzene
RCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-Diisopropylisourea
R2C = O 2, 4-Dinitrophenyl-Hydrazine
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ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas
Sistema de datos
Espectro de masasMuestra concentrada
AlVacío
Solvente
Muestra
Efluente LC