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PROFESOR PATROCINANTE DR. JORGE JARAMILLO INSTITUTO DE BOTÁNICA FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE PROFESOR CO-PATROCINANTE DR. GINO CASASSA GLACIOLOGÍA Y CAMBIO CLIMÁTICO CENTRO DE ESTUDIOS CIENTÍFICOS
DISTRIBUCIÓN ALTITUDINAL DE MICROALGAS SOBRE EL GLACIAR DEL VOLCÁN MOCHO-CHOSHUENCO
(XIV REGIÓN DE LOS RÍOS, CHILE)
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Biología Marina y Título Profesional de Biólogo Marino.
EDITHA ANTONIETA ELÍAS ZÚÑIGA
VALDIVIA - CHILE
2011
PROFESOR PATROCINANTE DR. JORGE JARAMILLO M. INSTITUTO DE BOTÁNICA FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE PROFESOR CO-PATROCINANTE DR. GINO CASASSA R. GLACIOLOGÍA Y CAMBIO CLIMÁTICO CENTRO ESTUDIO CIENTÍFICOS PROFESOR INFORMANTE PAMELA SANTIBÁNEZ A. GLACIOLOGÍA Y CAMBIO CLIMÁTICO CENTRO ESTUDIO CIENTÍFICOS
Lo más importante es no dejar de interrogarse.
La curiosidad tiene su propia razón de existir. Uno no puede evitar asombrarse
cuando contempla los misterios de la eternidad, de la vida, de la maravillosa
estructura de la realidad. Es suficiente si uno trata simplemente de comprender un
poco de este misterio cada día. No hay que perder jamás la sagrada curiosidad.
ALBERT EINSTEIN
A MI MADRE QUE SIEMPRE ME ACOMPAÑA……..
A MI PAPÁ Y MARÍA……...
A MIS HERMANOS……..
Gracias por su apoyo e infinito amor……..
AGRADECIMIENTOS Primero que todo, le quiero agradecer a la vida por haberme permitido estar acá, y por haber conocido a personas maravillosas, las cuales de alguna u otra forma me ayudaron en este largo camino. Con mucho amor agradezco a mis padres que me dieron la vida. A mi mamá que desde el cielo, me acompaña, me protege y me ayuda. A mi papá que ha estado conmigo en todo momento, gracias por darme una carrera para mi futuro, por creer en mí y por brindarme todo tu amor. A María que con su infinito cariño ha llenado un espacio de mi vida, por demostrarme que familia no es solo un lazo sanguíneo, gracias por ser como eres. A mis hermanos que llenan mi vida de alegría, por existir, porque con una sonrisa llenan mi alma y me muestran lo maravilloso de la vida. A mis profesores Dr. Gino Casassa y Dr. Jorge Jaramillo, por la confianza entregada, por toda su comprensión y apoyo. A Pamela S. por tu gran y sincera ayuda, por enseñarme a creer en mis capacidades, por compartir conmigo tu amor por la ciencia, por todos los consejos entregados, por tener la paciencia necesaria, por apoyarme en los momentos difíciles cuando no veía la solución y empezaba a derrumbarme. Agradezco el haber tenido una profesora y amiga tan buena como tú, simplemente gracias. Al Dr. Pedro Labarca y los integrantes de su laboratorio, por el apoyo y la gran ayuda que me han brindado. Al Centro de Estudios Científicos por haberme brindado la oportunidad de realizar este trabajo, al grupo de trabajo del CECS por el apoyo y la ayuda. A mis amigos de carrera Yoya, Jano, Vicky, Parri, Vainilla, Larguis, Feña, Andrea, Xime, Dany… por todo lo compartido, por hacer más gratos los años de universidad… les deseo las mejores de las suertes, jamás los olvidaré y pueden contar conmigo siempre… A la profe, a mis compañeras y amigas de futbol, por aprender junto a ustedes que las mayores alegrías se consiguen trabajando en equipo, por ayudarme a crecer como persona, por esos inolvidables entrenamientos bajo la lluvia y todos los viajes vividos… A mis amigas que encontré en este camino Xica, Maga, China y otr@s que se me quedan en el tintero, gracias por acompañarme y apoyarme siempre, por estar ahí, gracias por la confianza entregada… Les agradezco a todos ustedes el haber llegado a mi vida y el compartir momentos felices y momentos de tristeza, pero esos momentos son los que nos hacen crecer y valorar a las personas que nos rodean….
ÍNDICE GENERAL PÁGINA
RESUMEN…………………………………………………………………................ 1
ABSTRACT………………………………………………………………..………… 2
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN………………..………………………………… 3
1.1. MARCO TEÓRICO………………………………………...…………………… 3
1.2. PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA…………………………………………. 6
1.3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DEL TRABAJO…………………..……………… 10
1.3.1. Hipótesis Descriptivas…………………………………………………………. 10
1.3.2. Objetivo General………………………………………………………………. 11
1.3.3. Objetivos Específicos…………………………..……………………………… 11
CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODO……………………………................ 12
2.1. SITIO DE ESTUDIO……………………………………………………………. 12
2.2. OBTENCIÓN DE MUESTRAS SUPERFICIALES PARA ANÁLISIS
CUANTITATIVOS………...………………………………………………………… 14
2.3. OBTENCIÓN DE MUESTRAS SUPERFICIALES PARA ANÁLISIS
CUALITATIVOS…………….……………………………………………………… 16
2.4. ANÁLISIS CUANTITATIVOS………………………………………................ 16
2.4.1. Metodología, fijación y montaje de muestras…………………………………. 16
2.4.2. Cuantificación de las muestras………………………………………................ 17
2.4.3. Cuantificación del ensamble algal ………………………..…………............... 17
2.4.3.1. Abundancia…………………………………………………………… 18
2.4.3.2. Biovolumen microalgal……………………………………………….. 18
2.5. ANÁLISIS CUALITATIVOS………...………………………………………… 19
2.5.1. Cultivo de Microalgas…………………………………………………………. 19
2.5.2. Análisis Taxonómico………………..………………………………………… 21
2.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS……………………………………………………. 22
CAPÍTULO 3: RESULTADOS……………...……………………………………… 24
3.1. MUESTREO ANUAL 2006………...…...……………………………………… 24
3.1.1. Análisis Biológico…………………………...………………………………… 24
3.1.1.1. Abundancia…………………….……………………………………… 26
3.1.1.2. Biovolumen……………………………………………………………. 27
3.2. MUESTRAS ALTITUDINALES ENERO 2006………...……………………… 28
3.2.1. Análisis Biológico…………………………………...………………………… 28
3.2.1.1. Abundancia………………………….………………………………… 28
3.2.1.2. Biovolumen……………………………………………………………. 32
3.3. MUESTRAS ALTITUDINALES MARZO 2007….…………………………… 34
3.3.1. Análisis Biológico…………………………..…………………………………. 34
3.3.1.1. Abundancia……………………….…………………………………… 37
3.3.1.2. Biovolumen………………………………..…………………………... 38
3.4. COMPARACIÓN DE MUESTRAS ALTITUDINALES 2006 v/s 2007………. 40
3.4.1. Comparación de la abundancia total entre los años 2006 y 2007……………... 40
3.4.2. Comparación del biovolumen total entre los años 2006 y 2007……………..... 42
3.4.3. Comparación del ensamble microalgal entre los veranos del 2006 y 2007…… 43
3.5. CULTIVO DE MICROALGAS………………………………….……………... 44
3.5.1. Identificación de microalgas cultivadas………………………..……………… 45
CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN........................................................................................ 47
4.1. DISTRIBUCIÓN TEMPORAL, RESOLUCIÓN ESTACIONAL…………...…. 47
4.2. RELACIÓN DE LA ABUNDANCIA Y BIOVOLUMEN CON LA ALTITUD. 49
4.2.1. Estructura del ensamble microalgal, distribución temporal…...……………..... 49
4.3. COMPARACIÓN INTERANUAL DE LA ESTRUCTURA DEL ENSAMBLE 50
4.3.1. Comparación de la estructura del ensamble microalgal……………………….. 50
A. Abundancia………………………………………………………… 50
B. Biovolumen..………………………………………………………. 51
4.4. COMPOSICIÓN APROXIMADA DEL ENSAMBLE MICROALGAL
BASADO EN MORFOTIPOS……….………………………………………………. 52
4.4.1. Morfotipos dominantes……………………………………...………………… 52
4.4.2. Estadios microalgales como respuesta a cambios medioambientales…………. 53
4.5. CULTIVOS………………………………………………………….................... 56
CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES Y PROYECCIONES......................................... 59
LITERATURA CITADA………………………………..……………………….…... 61
ÍNDICE DE FIGURAS Figura Página
1 Localización del Volcán Mocho-Choshuenco………………………………... 13 2 (a) Imagen del Volcán Mocho-Choshuenco, se indican los sitios de muestreo
sobre la superficie del glaciar. Puntos rojos y amarillos corresponden al muestreo realizado durante enero 2006 y marzo 2007 respectivamente. La altura de la línea de equilibrio (ALE) está marcada con una línea de color amarillo. (b) Mapa de pendientes generada del modelo SRTM (Shuttle Radar Topography Mission) donde los puntos de color morado y azules corresponden a los años 2006 y 2007 respectivamente………………………. 13
3 Temperatura promedio mensual en el periodo 2006-2007. Datos obtenidos de la estación meteorológica automática localizada a 1995 m s.n.m…………. 14
4 (a) Montaje de la muestra. (b) Rotulación de la muestra……………………... 17 5 Esquema gráfico de la aislación de las microalgas mediante el uso de
micropipetas…………………………………………………………………... 21 6 Morfotipos de microalgas desde la A a la U, observados en las muestras
estacionales del año 2006 a los 2000 m s.n.m., cada morfotipo está señalado con la letra mayúscula que le corresponde. Las imágenes del lado izquierdo de cada columna, que se encuentran rotuladas con una letra de color negro, corresponden a imágenes obtenidas en campo claro. Las imágenes del lado derecho, rotuladas con una letra de color blanco, fueron adquiridas utilizando fluorescencia (filtro U-MWIG). Fotografías capturadas con microscopio de fluorescencia modelo OLYMPUS BX50WI. Barra 10 µm…………………... 25
7 Morfotipos de microalgas V, U y TRO observados en las muestras estacionales del año 2006 a los 2000 m s.n.m. Para más detalles ver leyenda Fig. 6. La longitud de la barra corresponde a 10 µm……………………….… 26
8 Perfil estacional de la abundancia algal y del biovolumen algal correspondiendo al sitio S1 para las muestras colectadas el año 2006 sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco. Barras de error = error estándar……. 27
9 Morfotipos de microalgas observados en las muestras altitudinales del año 2006. Para más detalles ver leyenda Fig. 6. Barra 10 µm…………………….. 30
10 Variación de la abundancia microalgal (cél mL-1) entre los diferentes sitios de muestreo sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en enero 2006. Barras de error indican el error estándar……………………………………… 31
11 Cambio altitudinal del biovolumen algal (µm3 mL-1) sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en el mes de enero del año 2006. Barras de error = error estándar……………………………………………………………….. 33
12 Morfotipos de microalgas desde el A al N observados en las muestras altitudinales de marzo del 2007. Para más detalles ver leyenda Fig. 6. Barra 10 µm…………………………………………………………………………. 35
13 Morfotipos de microalgas U, V, Y, TRO, CL y LG observados en las muestras altitudinales de marzo del 2007. Para más detalles ver leyenda Fig. 6. Barra 10 µm………………………………………………………………... 36
14 Cambio altitudinal de la abundancia (cél mL-1) sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en el mes de marzo del año 2007. Barras de error = error estándar……………………………………………………………………….. 37
15 Cambio altitudinal del biovolumen algal (µm3 mL-1) sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en el mes de marzo del año 2007. Barras de error = error estándar……………………………………………………………….. 39
16 Comparación del cambio altitudinal de la abundancia entre enero del 2006 y marzo del 2007. Barras de error = error estándar…………………………….. 41
17 Comparación del cambio altitudinal del biovolumen algal entre enero del 2006 y marzo del 2007. Barras de error = error estándar………….................. 42
18 Crecimiento de microalgas luego de 2 meses desde su siembra mediante la técnica de siembra en estrías………………………………………………….. 44
19 Estadios vegetativos de Chloromonas sp (a-e) y Chlamydomonas sp (f-j) obtenidos desde los cultivos realizados durante la Tesis. Células fijadas con Lugol excepto imagen b y g que son in vivo. (a) Célula alargada, biflagelada, con núcleo central; (b) Célula alargada con bandas de cloroplastos. (c) Célula al inicio del proceso de división, se observan 2 núcleos en la parte central de la célula; (d-e) Reproducción vegetativa, en (d) se observan 4zoosporas dentro de la célula parental y en (e) 8 zoosporas; (f) Célula biflagelada, con núcleo anterior y pirenoide en la parte posterior; (g) Célula esférica, cloroplasto en forma de copa con un pirenoide en la parte posterior y estigma en la parte anterior; (h-j) fase de reproducción vegetativa en (h) se observan 2 zoosporas en el interior de la célula parental, en (i) 4 zoosporas y n (j) 6 zoosporas. Barra 10 µm. F= flagelo, N=núcleo, P=pirenoide, S= estigma, BC=bandas de cloroplasto, CC= cloroplasto en forma de copa………………………………………………………………….
46
20 Variación de la temperatura promedio diaria en los días previos a la colección de muestras altitudinales, los datos fueron obtenidos de la estación meteorológica automática ubicada en el volcán Mocho-Choshuenco, localizada a 1995 m s.n.m. (a) Muestras altitudinales enero 2006. (b) Muestras altitudinales marzo 2007…………………………………………… 55
ÍNDICE DE TABLAS Tabla Página
1 Muestras superficiales altitudinales colectadas en enero del 2006 sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco………………………………………... 15
2 Descripción de las muestras superficiales colectadas en marzo del 2007 sobre el glaciar del volcán Mocho Choshuenco……………………………………... 15
3 Muestras mensuales colectadas durante el año 2006………………………….. 15 4 Detalle de las muestras utilizadas para la realización de los análisis
cualitativos…………………………………………………………………….. 16 5 Características de los 19 morfotipos de microalgas registradas en las muestras
estacionales del año 2006……………………………………………………… 24 6 Abundancias de muestras mensuales para el año 2006 y morfotipos
dominantes…………………………………………………………………….. 27 7 Biovolumenes de muestras mensuales para el año 2006 y morfotipos
dominantes…………………………………………………………………….. 28 8 Características de los 19 morfotipos de microalgas registrados en la muestras
altitudinales de enero del 2006………………………………………………… 29 9 Cambio altitudinal de la abundancia microalgal para enero del 2006 y
morfotipos dominantes en cada sitio de muestreo…………………………….. 31 10 Matriz de comparación múltiple (Test de Tukey) entre la abundancia y las
diferentes alturas para el mes de enero del año 2006. Números en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas…………............................. 32
11 Cambios del biovolumen microalgal con la altitud para enero 2006 y morfotipos con mayores abundancias relativas para cada altura………............ 33
12 Matriz de comparación múltiple (Test de Tukey) del biovolumen entre las diferentes alturas para enero del 2006. Números en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas…………………………………….. 33
13 Características de los 21 morfotipos de microalgas registrados en la muestras altitudinales de marzo del 2007………………………………………………... 34
14 Cambio altitudinal de la abundancia microalgal para marzo del 2007 y morfotipos dominantes en cada sitio de muestreo…………………………….. 38
15 Matriz de comparación múltiple (test de Tukey) entre las abundancias de los diferentes alturas para marzo del 2007. Los datos en color rojo indican que existen diferencias significativas entre las abundancias a las diferentes altitudes………………………………………………………........................... 38
16 Cambios del biovolumen microalgal con la altitud para marzo del 2007 y morfotipos con mayores abundancias relativas para cada altura……………… 39
17 Matriz de comparación múltiple (test de Tukey) entre los biovolumenes de las diferentes alturas para marzo del 2007. Los datos en color rojo indican que existen diferencias significativas entre las abundancias a las diferentes altitudes………………………………………………………………………... 40
18 Resumen del Análisis de Varianza para la abundancia sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco. Valores en rojo indican diferencias estadísticamente significativas…………………………………………............
41
19 Test de Fisher LSD, comparación de las abundancias a las mismas alturas utilizando como factor los años. Valores en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas………………………………………………… 41
20 Resumen del Análisis de Varianza de dos vías para el biovolumen sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco entre enero del 2006 y marzo del 2007. Valores en rojo indican diferencias estadísticamente significativas…………………………………………………………………… 42
21 Test de Fisher LSD, comparación del biovolumen a una misma altura utilizando como factor los años. Valores en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas………………………………………………… 43
22 Comparación de los morfotipos dominantes para cada altura entre el muestro altitudinal del año 2006 y 2007, tanto para la abundancia y biovolumen. Entre paréntesis se indica la abundancia relativa y el biovolumen relativo para cada morfotipo respectivamente…………………………………………………….. 44
23 Comparación de las principales características morfológicas entre Chloromonas sp y Chlamydomonas sp………………………………………… 45
1
RESUMEN
Los glaciares son uno de los indicadores más visibles de los efectos del cambio climático
debido a su alta sensibilidad a la temperatura. Son útiles indicadores indirectos (proxies) de las
condiciones medioambientales y climáticas pasadas, debido a su capacidad de registrar las
variaciones de las propiedades físicas, químicas y biológicas. Dentro de los componentes
biológicos se encuentran las microalgas de nieve, que son tolerantes al frío y que crecen sobre el
hielo y nieve durante el periodo de derretimiento. Las microalgas son preservadas en el estrato
glaciar cada año, por lo que potencialmente pueden proveer nueva información acerca de las
condiciones climáticas y ambientales pasadas.
Los objetivos de la presente investigación son determinar cuantitativa y cualitativamente,
por medio de análisis biológicos, los cambios estacionales y altitudinales del ensamble
microalgal en el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco (39º55’S, 72º02’W) en la Región de Los
Ríos, Chile. Con este fin, se llevó a cabo un muestreo altitudinal en enero del 2006 en cinco sitios
(2000, 2100, 2200, 2300 y 2400 m s.n.m.) y en marzo del 2007 en seis sitios (1900, 2000, 2100,
2200, 2300 y 2400 m s.n.m.). Asimismo durante el año 2006 se realizaron muestreos mensuales a
los 2000 m s.n.m. para establecer los cambios temporales de las microalgas sobre el glaciar.
Los resultados indican que existe una clara variación estacional de microalgas en las
muestras mensuales del año 2006, concordando con estudios previos que el periodo de
crecimiento ocurre en la estación estival. En cuanto a los perfiles altitudinales de abundancia y
biovolumen, éstos muestran inicialmente una tendencia a disminuir a medida que se asciende
sobre el glaciar, al igual que en estudios previos en los glaciares Yala en el Himalaya o el
Tyndall, Patagonia, entre otros. Sin embargo, se observa un aumento del biovolumen algal en el
perfil de marzo del 2007 en la cumbre del volcán Mocho-Choshuenco, en respuesta a variables de
stress ambientales. Se propone que distintos estadios dominantes serían indicadores de periodos
de estabilidad y/o inestabilidad ambiental. Durante esta investigación se logró el desarrollo de
cultivos de microalgas de nieve del glaciar Mocho-Choshuenco, lográndose en primera instancia
la aislación e identificación de dos géneros comunes, presentes en este ambiente. Lo cual
permitirá proyectar y desarrollar estudios experimentales referentes a su fisiología, ecología y
filogenia y, de esta manera, aportar al desarrollo de las microalgas de nieve como bioindicadores
de las condiciones climáticas y ambientales pasadas.
2
ABSTRACT
Glaciers are one of the most visible indicators of the effects of climate change due to their
high sensitivity to temperature. Glaciers are also useful as indirect proxies on the past
environmental and climatic conditions due to their capability to register physical, chemical and
biological variations. Within the biological components a group of eukaryotes organisms can be
found, the snow algae. These microorganisms are cold-tolerant and capable of growing on ice
and snow during the melt season. Snow algae are preserved in the glacial strata every year,
providing potentially new information about the past environment and climate.
The aims of this study are to determine quantitative and qualitatively, through biological
analyses, the temporal and altitudinal changes of algal assemblages on the glacier of the Mocho-
Choshuenco volcano (39º55’S, 72º02’W) in the Chilean Lake district. To accomplish this
purpose, altitudinal samplings were carried out during January of 2006 at five locations (2000,
2100, 2200, 2300 and 2400 m a.s.l.) and in March of 2007 at six locations (1900, 2000, 2100,
2200, 2300 and 2400 m a.s.l.). In addition, during 2006 the snow surface samples were collected
at 2000 m a.s.l. to establish temporal changes of snow algae on the glacier.
The results show a clear seasonal variation of snow algae in the monthly samples of 2006,
in concordance with previous studies, where the growth period happens in the summer season. As
for the altitudinal profile of abundance and biovolume, these initially showed a tendency to
decrease with increasing altitude on the glacier, similar to previous studies on the Yala glacier in
the Himalaya or Tyndall glacier in Patagonia, amongst other cases. However, an increase of algal
biovolume on the summit of Mocho-Choshuenco volcano was observed as a response of
environmental stress variations. Different microalga stages are suggested to be indicators of
stability and instability environmental conditions. During this investigation we achieved the
establishment of snow algae culture from the glacier Mocho-Choshuenco, obtained based on the
isolation and identification of two common genera, present in this environment. This will allow
in the future devising and developing experimental studies about their physiology, ecology and
phylogeny and, in this way, contribute to develop snow algae as bioindicators of the past
environmental and climatic conditions.
3
Capítulo 1
INTRODUCCIÓN
1.1. MARCO TEÓRICO
Las principales componentes de la criósfera son la nieve, el hielo de ríos y lagos, hielo
marino, glaciares y casquetes de hielo, las plataformas de hielo flotante, los hielos continentales
y el permafrost (Khromova, 2010). En términos de la masa de hielo y su capacidad calórica, la
criósfera es el segundo más grande componente del sistema climático luego del océano (IPCC,
2007). Esto es relevante para la variabilidad y cambios climáticos basados sobre las propiedades
físicas, tales como la alta reflectividad de su superficie, el ciclo del agua, cambios del nivel del
mar y el calor latente asociado con las fases de cambio, las cuales tienen un fuerte impacto sobre
el balance de energía de la superficie (Allison et al., 2001). La criósfera integra variaciones del
clima sobre un amplio rango de escalas de tiempo, siendo un sensor natural de la variabilidad
climática que provee una expresión visible del cambio climático. Uno de los indicadores
criosféricos más visibles de los efectos del cambio climático son los glaciares, por su alta
sensibilidad en sus procesos de avance y retroceso, ya que su balance de masa está
principalmente determinado por el clima (Fitzharris et al., 1996).
Los glaciares son capaces de registrar las condiciones medioambientales y climáticas
pasadas por medio de las variaciones de las propiedades físicas, químicas y biológicas que son
almacenadas en la estratigrafía interna de la nieve, neviza y hielo (IPCC, 2007). Otra
característica crucial del hielo criosférico es el rol que juegan en la disponibilidad de agua dulce,
la que corresponde al 75% del agua dulce existente en todo el planeta. De ese importante
porcentaje el 77% se encuentra almacenada en los hielos continentales polares y glaciares de
montaña (Global Water Partnership, 2000; Diez-Cascón, 2003). Los glaciares de montaña son
4
importantes fuentes de agua congelada como consecuencia de que sus procesos de acumulación y
derretimiento juegan un rol fundamental en la regulación hídrica de las cuencas, junto con
constituir un factor significativo en el abastecimiento de los ecosistemas y la población (Bórquez
et al., 2006; Khromova, 2010). El aumento de la temperatura atmosférica durante el último
tiempo ha provocado el retroceso de los hielos continentales y los glaciares, induciendo un
ascenso del nivel del mar de 0,8 a 1,6 mm año-1 entre 1993 a 2003, lo que representa un aumento
notable con relación al ascenso de 0,2 a 1,2 mm año-1 consignado entre 1961 a 2003 (IPCC,
2007). Como consecuencia a lo expuesto anteriormente, los glaciares son reconocidos como los
mejores indicadores terrestres de alta resolución de los cambios climáticos y medioambientales
(IPCC, 2007).
Bajo la perspectiva biológica, los glaciares han resultado ser un ecosistema relevante
debido a que en un principio se creía imposible que ambientes como las superficies de hielo
pudiesen cobijar vida alguna. Ahora se sabe, en efecto, que algunos microorganismos son
capaces de metabolizar sobre la nieve o hielo glaciar y que sus tasas metabólicas dependen de la
temperatura, luz, el nivel de nutrientes y oligoelementos, entre otros factores (Price, 2000; Anesio
et al., 2009; Anesio et al., 2010). En esta perspectiva, los ecosistemas pueden ser apreciados
como una casi infinita red de interacciones entre componentes bióticos y abióticos balanceados
entre factores tanto internos como externos (Birks y Birks, 2006).
Gusanos de hielo y colémbolos han sido reportados como comunes en glaciares de Alaska
y en la costa oeste de Norte América (Shain et al., 2001) y en Patagonia (Kohshima, 1985).
Plecópteros (moscas de piedra, también conocidas como tijeretas o dragones de la Patagonia) han
sido encontrados en el glaciar Tyndall, en Patagonia (Kohshima, 1985; Takeuchi y Kohshima,
2004). También se han llevado a cabo estudios sobre hongos de nieve (Stein y Amundsen, 1967;
5
Hoham et al., 1993; Buzzini et al., 2005; Butinar et al., 2007) y hielo (Abyzov, 1993), y
eubacterias (Margesin y Schinner, 1994; Christner et al., 2003; Mikucki y Priscu, 2007; Christner
et al., 2008).
Kohshima (1984), en una expedición al glaciar Yala, en los Himalayas, encuentra al
primer insecto, perteneciente a la familia de los Chironomidae (Diamesa Meigen sp), que realiza
su ciclo de vida completo sobre la nieve y hielo glaciar (-18ºC). Los análisis estomacales
realizados a las larvas demostraron que se alimentan principalmente de algas verde azuladas
(Phormidium sp) y bacterias. Como conclusión, Kohshima (1987) propuso una comunidad
heterótrofa especializada compuesta de insectos y copépodos tolerantes al frío, cuya fuente de
energía serían las microalgas y bacterias.
Los glaciares temperados se encuentran usualmente en zonas de latitud media, donde la
información sobre las condiciones medioambientales pasadas es escasa, ya que en estos lugares
los análisis químicos e isotópicos pueden verse alterados por la percolación que ocurre en la
estación de derretimiento. Como una manera de aportar una nueva fuente de información para
estas zonas, ha surgido la utilización de las microalgas de nieve en la datación de testigos de
neviza/hielo y la estimación de balances de masa pasados de glaciares temperados, la cual ha
resultado de gran importancia, ya que como las microalgas año a año van siendo almacenadas en
la estratigrafía interna del glaciar, se transforman en útiles marcadores estacionales, resultando en
una nueva fuente de información sobre las condiciones medioambientales pasadas sobre el
glaciar que afectaron su crecimiento (Yoshimura et al., 2006). De esta manera las microalgas han
sido propuestas como potenciales bioindicadores de las condiciones medioambientales y
climáticas pasadas (Kohshima et al., 1993; Takeuchi et al., 2001a; Yoshimura et al., 2006). Esto
ha provocado un gran interés en el estudio biológico de los glaciares, los cuales son definidos
6
como ecosistemas extremos, relativamente simples, con una comunidad biótica especializada
(psicrófilos), comparables a algunos ambientes de agua dulce como lagos y ríos, en donde las
microalgas, como productores primarios, sustentan con biomasa y energía, vía interacción trófica,
a las poblaciones heterótrofas (Kohshima, 1987; Yoshimura et al., 1997; Takeuchi et al., 1998;
Kohshima et al., 2002). A su vez las microalgas de nieve tienen un impacto geofísico sobre los
glaciares ya que reducen el albedo de la superficie, afectando el balance de masa de los glaciares
debido al incremento de derretimiento (Kohshima et al., 1993; Thomas y Duval, 1995; Takeuchi
et al., 2001b), como también químicamente, liberando oxígeno, generando y secuestrando
dióxido de carbono (Williams et al., 2003).
En Chile, el análisis biológico de testigos de neviza/hielo realizado en la regiones de los
Lagos y de los Ríos, sobre los glaciares temperados del Volcán Osorno y el Volcán Mocho-
Choshuenco (Santibáñez et al., 2008), mostraron una clara variación estacional de microalgas,
polen y protozoos, a diferencia de los isótopos estables y especies químicas, permitiendo datar y
estimar los balance de masa pasados. Debido a esto, Santibáñez et al., (2008), concuerdan con
estudios previos (Yoshimura et al., 2000; Uetake et al., 2006; Kohshima et al., 2007), en cuanto a
que los microorganismos y polen son útiles marcadores estacionales y se realza su posible
utilización como bioindicadores de las condiciones climáticas pasadas, debido a la estrecha
relación que existe entre los componentes bióticos y abióticos dentro de un ecosistema
(Yoshimura et al., 2006).
1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las microalgas de nieve habitan uno de los ambientes más extremos en la Tierra,
caracterizado por bajas temperaturas, bajas concentraciones de nutrientes y altos niveles de luz y
7
radiación ultravioleta, adaptándose a estas condiciones de vida sobre la nieve en derretimiento.
Estas especies forman ensambles de microalgas que por lo deducido colonizaron los campos de
nieve secundariamente, ya que sus ancestros se originan de otros hábitats (Komárek y Nedvalová,
2007). Hasta ahora se han descubierto comunidades de microalgas que habitan en campos de
nieve y sobre la superficie de glaciares, donde la temperatura atmosférica sobrepasa
periódicamente los 0°C (Hoham, 1973; Hoham, 1975b; Hoham et al., 2007; Komárek y
Nedvalová, 2007), provocando cambios localmente en la nieve desde un estado sólido a líquido.
Esto implica una adaptación de estos microorganismos a las bajas temperaturas para vivir en
estos ambientes extremos, tales como: 1) un aumento de la proporción de ácidos grasos
insaturados que aumentan la fluidez de la membrana en comparación a los ácidos grasos
saturados; 2) adaptación de enzimas para compensar la reducción en las tasas de reacción
química por medio del incremento de las concentraciones enzimáticas o mejorando la eficiencia
catalítica de éstas; y 3) producción de proteínas anticongelantes, todas adaptaciones que le
permiten a las microalgas comenzar intensamente sus actividades metabólicas inmediatamente
luego del cambio de estado celular sobre la nieve (Morgan-Kiss et al., 2006; Komárek y
Nedvalová, 2007). Otra adaptación a este ambiente extremo es la formación de estadios de
resistencia en las algas de nieve en el orden Chlamydomonadales, permitiéndole sobrevivir a
periodos con temperaturas bajo los 0ºC o a altas temperaturas del suelo y desecación cuando los
efímeros campos de nieve se derriten completamente (Müller et al., 2001). Los altos niveles de
luz y radiación ultravioleta en estos ambientes corresponden a otros de los factores con los cuales
deben lidiar estos microorganismos. Algunas microalgas poseen la cualidad de acumular
carotenoides como astaxantina, los que juegan un rol primordial en la protección de las células
8
contra el daño de la radiación ultravioleta y la potencial inhibición de sus fotosistemas (Gorton et
al., 2001).
Se sabe por la extensa literatura obtenida de estudios realizados en ambientes marinos y
continentales (Van den Hoek et al., 1995; Reynolds et al., 2006; entre otros), que las microalgas
poseen características particulares asociadas a las condiciones físicas y químicas de su medio
ambiente, lo cual ha permitido su utilización como bioindicadores, término que se define en
McGeoch (1998) como: “una especie o grupo de especies que fácilmente reflejen el estado
abiótico o biótico de un ambiente, representando el impacto de cambio ambiental sobre un
hábitat, comunidad, o ecosistema, o su indicativo de la diversidad de un conjunto de taxa, o de
un nivel de diversidad mayor, dentro de un área”. Bajo este contexto la información taxonómica,
fisiológica y ecológica sobre las algas de nieve es aún limitada, pero los estudios realizados en
los glaciares Yala y AX010 en los Himalayas, en el glaciar Gulkana en Alaska, en el glaciar
Tyndall en Patagonia, en el glaciar Akkem en Rusia y las montañas de Giant en República Checa,
entre otros, muestran que las microalgas que habitan un mismo glaciar difieren en cuanto a
composición de especies (Kohshima, 1987; Yoshimura et al., 1997; Takeuchi et al., 1998;
Takeuchi, 2001a; Takeuchi y Kohshima, 2004; Yoshimura et al., 2006; Nedbalová et al., 2008).
De acuerdo a la investigación realizada por Yoshimura et al., 1997 en el glaciar Yala en los
Himalayas, existen cambios altitudinales de los factores ambientales sobre el glaciar, tales como:
1. Tipo de sustrato
2.
, hielo en la parte baja del glaciar o nieve en la parte superior del glaciar,
que puede afectar la estabilidad del agua derretida, siendo menos estable el sustrato de
nieve por la mayor frecuencia de ciclos de congelamientos y descongelamiento.
Temperatura atmosférica, la cual disminuye linealmente con el incremento de la altitud, y
que puede afectar la longitud del periodo de derretimiento.
9
3. Cubierta de nieve
Estos cambios y gradientes altitudinales de las condiciones físicas sobre el glaciar son los
principales factores que afectan la distribución de las microalgas, lo que concuerda también con
las investigaciones realizadas en los glaciares AX010 en el Himalaya, Gulkana en Alaska y
Tyndall en Patagonia (Takeuchi et al., 1998; Takeuchi, 2001a; Takeuchi y Kohshima, 2004).
Estos cambios físicos sobre el glaciar han llevado a establecer comunidades específicas de
microalgas para cada ambiente en estos glaciares. Desde esta perspectiva se establece una
aproximación para clasificar a las microalgas de nieve, según su rango de distribución sobre el
glaciar que fue propuesta de manera inicial por Yoshimura et al., 1997:
, su espesor afecta la cantidad de luz que reciben las microalgas. Sin una
cubierta de nieve sobre sus microhábitats las microalgas podrían recibir directamente una
mayor intensidad de luz y lo contrario ocurre al tener una cubierta donde recibirán
radiación difusa.
• Especialistas de nieve: observados sobre la superficie de nieve.
• Especialistas de hielo: observados sobre el hielo descubierto.
• Generalistas: observados sobre nieve y hielo.
• Oportunistas: observados cuando hay un conjunto de condiciones especiales sobre
la superficie de nieve o hielo.
Los patrones de distribución de las comunidades de microalgas sobre el glaciar podrían
reflejar cambios en las condiciones climáticas locales (Yoshimura et al., 1997), debido a que si
las condiciones físicas se ven afectadas en el glaciar, esto queda reflejado en los cambios en la
distribución de las comunidades. Por esto es importante establecer las relaciones de las
microalgas con los factores ambientales para desarrollar su uso como bioindicadores climáticos y
medioambientales de las condiciones pasadas.
10
Debido a lo expuesto anteriormente, nace la importancia de aumentar el limitado
conocimiento taxonómico, fisiológico y ecológico que existe sobre las microalgas de nieve, como
una manera de desarrollar una nueva fuente de información sobre las condiciones climáticas
pasadas, en donde el uso de las especies químicas e isotópicas no es posible. Entonces, como una
manera de soslayar la carencia de información sobre estos microorganismos, que a su vez nos
permitirán obtener valiosa información paleoclimática y paleoambiental, surge el objetivo
principal de esta investigación, el cual es contestar preguntas básicas en ecología, determinar qué
microalgas habitan, cómo se distribuyen respecto al gradiente altitudinal y su relación con los
factores abióticos sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco.
1.3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DEL TRABAJO
1.3.1.
•
Hipótesis Descriptivas
Hipótesis alternativa 1:
•
Existen variaciones estacionales del biovolumen y abundancia del
ensamble de microalgas en la superficie glaciar del volcán Mocho-Choshuenco durante el
año 2006, quedando de manifiesto la ausencia de microalgas en la época invernal y la
presencia de éstas en la estación de verano, lo cual permitirá confirmar el periodo de
crecimiento microalgal.
Hipótesis alternativa 2:
•
Existe una disminución del biovolumen algal, abundancia y
cambios en la composición del ensamble de microalgas sobre el glaciar del volcán
Mocho-Choshuenco a medida que se va aumentando la altura sobre el glaciar.
Hipótesis alternativa 3: Existen diferencias anuales del biovolumen, abundancia total y
del ensamble de microalgas en la superficie glaciar del volcán Mocho-Choshuenco,
durante la estación de derretimiento de los años 2006 y 2007. Esto con el fin de establecer
11
si los cambios en las propiedades del ensamble microalgal sobre la superficie glaciar son
estables sobre escala anual de tiempo.
1.3.2.
• Caracterizar taxonómica y ecológicamente al ensamble de microalgas que habita sobre el
glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en relación con algunos factores abióticos en un
gradiente altitudinal.
Objetivo General
1.3.3.
• Determinar cuantitativa y cualitativamente las microalgas presentes en el glaciar.
Objetivos Específicos
• Analizar la abundancia, biovolumen algal y composición del ensamble microalgal en las
diferentes estaciones del año 2006.
• Analizar la abundancia, biovolumen algal y composición del ensamble de microalgas para
el verano 2006 y 2007.
• Formular patrones que describan la distribución espacial y temporal de las microalgas.
• Desarrollar cultivo de microalgas de nieve como una herramienta fundamental para
optimizar su identificación taxonómica.
12
Capítulo 2
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. SITIO DE ESTUDIO
El sitio de estudio corresponde al glaciar temperado ubicado al sur este del Volcán
Mocho-Choshuenco (Latitud 39º55´S; Longitud 72º02´W, 1900-2400 m s.n.m.), ubicado en la
XIV Región de Los Ríos. (Fig. 1 y 2). Este glaciar está ubicado sobre un volcán inactivo que
presenta una superficie libre de cenizas debido a que no ha mostrado actividad eruptiva ni
fumarólica desde 1864. El principal factor que explica las variaciones de los glaciares de la zona
de Los Lagos del sur de Chile está relacionado con el calentamiento troposférico en la columna
vertical de la atmósfera y la disminución en las precipitaciones, que a su vez han producido un
ascenso de la línea de equilibrio, adelgazamiento del hielo y retroceso frontal, generando
balances de masas negativos en la región (Bown y Rivera, 2007). La altura de la línea de
equilibrio (ALE o en inglés ELA., equilibrium line altitude), la cual se define como el límite
entre la zona de acumulación y ablación que exhibe un balance de masa neto anual igual a 0. La
ALE fue localizada a 1961 + 11 m s.n.m. para el periodo 2004-2005 en el glaciar sur este del
volcán Mocho (Fig 2a) (Bown et al., 2007).
El Centro de Estudios Científicos cuenta con una estación meteorológica automática
(Campbell Scientific, Inc.) en el volcán Mocho-Choshuenco desde enero 2006, la cual en la
actualidad se localiza a 1995 m s.n.m. sobre una roca dentro del área de ablación del glaciar. Los
datos que reporta esta estación se encuentran enfocados al comportamiento de la temperatura del
aire, humedad relativa y viento. En este caso para conocer el comportamiento de la temperatura
atmosférica durante el periodo en estudio, se utilizaron las mediciones que fueron almacenadas
cada 15 minutos por la estación meteorológica, con lo cual se calculó el promedio mensual de la
13
(a) (b)
temperatura durante el periodo de estudio, el que indica un comportamiento estacional y con
temperaturas promedio diarias bajo los 0ºC desde junio a octubre (Fig. 3).
Figura 1. Localización del volcán Mocho-Choshuenco.
Fig. 2. (a) Imagen del Volcán Mocho-Choshuenco, se indican los sitios de muestreo sobre
la superficie del glaciar. Puntos rojos y amarillos corresponden al muestreo realizado durante enero 2006 y marzo 2007 respectivamente. La altura de la línea de equilibrio (ALE) está marcada con una línea de color amarillo. (b) Mapa de pendientes generada del modelo SRTM (Shuttle Radar Topography Mission) donde los puntos de color morado y azules corresponden a los años 2006 y 2007 respectivamente.
14
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Ene'06
Feb'06
Mar'06
Abr'06
May'06
Jun'06
Jul'06
Ago'06
Sept'06
Oct'06
Nov'06
Dic'06
Ene'07
Feb'07
Mar'07
Meses
Tem
pera
tura
°C
Fig. 3. Temperatura promedio mensual en el periodo 2006-2007. Datos obtenidos de la estación meteorológica automática localizada a 1995 m s.n.m.
2.2. OBTENCIÓN DE MUESTRAS SUPERFICIALES PARA ANÁLISIS CUANTITATIVOS
La investigación se realizó en base a una serie de muestras colectadas previamente en el
sitio de estudio, por parte del grupo de Glaciología y Cambio Climático del Centro de Estudios
Científicos (CECS), cuya descripción detallada se entrega a continuación.
El 30 de enero del 2006 se colectaron muestras superficiales en cinco sitios del glaciar
(Tabla 1), desde los 2000 m s.n.m. a los 2400 m s.n.m. a intervalos de 100 m. Todas las muestras
colectadas en este verano corresponden a la zona de acumulación del glaciar, ya que se
encuentran sobre la línea de equilibrio. El 10 de marzo del 2007 se obtuvo otro set de muestras
superficiales en seis sitios (Tabla 2), en esta ocasión se colectó una muestra de la zona de
ablación a los 1900 m s.n.m. y el restante de muestras corresponde a la zona de acumulación
desde los 2000 m s.n.m. hasta los 2400 m s.n.m. (Fig. 2). El tercer set de muestras corresponde a
muestras recolectadas mensualmente durante el año 2006 en el glaciar a los 2000 m s.n.m.
correspondiendo al sitio S1 del año 2006 (Tabla 3).
15
Sitio Altura Réplicas Área réplicas Volumen muestra (m s.n.m.) (latitud) (longitud) (nº) (cm2) (mL)
S1 1900 + 10 39º55'38'' S 72º00'16'' W 5 10 x 10 100S2 2000 + 10 39º55'40'' S 72º00'31'' W 5 18 x 18 100S3 2100 + 10 39º55'41'' S 72º00'48'' W 5 18 x 18 100S4 2200 + 10 39º55'42'' S 72º01'06'' W 5 18 x 18 100S5 2300 + 10 39º55'44'' S 72º01'25'' W 5 10 x 10 100S6 2400 + 10 39º55'48'' S 72º01'42'' W 5 10 x 10 100
Ubicación geográfica
Mes Altitud Réplicas Volumen(m s.n.m.) (nº) (mL)
Marzo 2000 2 100Julio 2000 4 200
Septiembre 2000 5 250Octubre 2000 4 200
Diciembre 2000 2 100
Sitio Altura Réplicas Volumen muestra (m s.n.m.) (latitud) (longitud) (nº) (mL)
S1 2000 + 10 39º56'32'' S 72º01'10'' W 5 50S2 2100 + 10 39º55'50'' S 72º00'59'' W 5 50S3 2200 + 10 39º55'39'' S 72º01'22'' W 5 50S4 2300 + 10 39º55'42'' S 72º01'29'' W 5 50S5 2400 + 10 39º55'53'' S 72º01'42'' W 5 50
Ubicación geográfica
Tabla 1. Muestras superficiales altitudinales colectadas en enero del 2006 sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco.
Tabla 2. Descripción de las muestras superficiales colectadas en marzo del 2007 sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco.
Tabla 3. Muestras mensuales colectadas durante el año 2006.
Las muestras fueron colectadas con una cuchara de acero inoxidable estéril y almacenadas
en bolsas estériles Nasco Whirl-Pak. Luego fueron trasladadas al laboratorio del CECS, y
descongeladas a temperatura ambiente (20ºC), para luego ser envasadas en frascos plásticos
estériles y almacenadas en un congelador a una temperatura de -20ºC.
16
Año Mes Altitud Volumen(m s.n.m.) (mL)
2009 Abril 2000 11002009 Diciembre 1800 1002009 Diciembre 2000 1002009 Diciembre 2200 1002009 Diciembre 2400 1002010 Marzo 2400 500
2.3. OBTENCIÓN DE MUESTRAS SUPERFICIALES PARA ANÁLISIS CUALITATIVOS
Para el desarrollo de los análisis cualitativos se colectaron muestras superficiales del
glaciar con una cuchara de acero inoxidable estéril, almacenándolas en bolsas estériles Nasco
Whirl-Pak. Una vez arribadas las muestras al laboratorio, las muestras fueron traspasadas a
matraces Erlenmeyer bajo la Cámara de Flujo Laminar Vertical (CFLV) Factomet U24242, para
evitar contaminación. En la Tabla 4 se muestra una descripción de las muestras utilizadas para los
análisis cualitativos colectadas durante el año 2009 y 2010.
Tabla 4. Detalle de las muestras utilizadas para la realización de los análisis cualitativos.
2.4. ANÁLISIS CUANTITATIVOS
2.4.1.
Para poder realizar los análisis cuantitativos las muestras debieron ser montadas y fijadas.
Este proceso se llevó a cabo bajo la CFLV para evitar contaminación. Se procedió de la siguiente
manera:
Metodología, fijación y montaje de muestras
Las muestras se derritieron a temperatura ambiente, una vez descongeladas se filtraron
entre 3 a 10 mL de la muestra (la cantidad a filtrar dependió de la turbidez de la muestra) a través
de un filtro de membrana de politetrafluoroetileno hidrofílico (PTFE Millipore, JHWP01300 con
un diámetro de 13 mm y un tamaño de poro de 0,45 µm). Previo a la filtración, el portafiltro se
17
lavó con agua bidestilada nanopure para retirar cualquier tipo de impurezas, luego el filtro fue
instalado en el portafiltros. Una vez concluido el proceso de filtrado, se agregó una gota de
fijador (glicerol, formalina y agua; en una proporción 1:1:1) sobre un portaobjetos y se depositó
el filtro sobre la gota, seguido a esto se agregó otra gota de fijador sobre el filtro, se depositó
sobre éste un cubreobjetos, se selló con bálsamo de Canadá y fue rotulada (Fig. 4).
Fig. 4. (a) Montaje de la muestra. (b) Rotulación de la muestra.
2.4.2.
Los análisis cuantitativos se realizaron con un microscopio de fluorescencia (OLYMPUS
BX50WI). Solo se cuantificaron y se midieron las células en las cuales se detectó clorofila a
través de la emisión de luz roja (longitud de onda >580 nm) en respuesta a la excitación con una
longitud de onda incidente verde (longitud de onda entre 520-550 nm; filtro U-MWIG) lo que
indicó la presencia de fluorocromos de la clorofila. El recuento se llevó a cabo entre tres a cinco
transectos paralelos al diámetro central del filtro, para las muestras altitudinales y mensuales
respectivamente. Las microalgas fueron agrupadas de acuerdo a su morfología y tamaño, para lo
cual cada morfotipo fue caracterizado y rotulado con una letra mayúscula siguiendo el modelo
propuesto por Santibáñez (2007).
Cuantificación de las muestras
2.4.3.
El ensamble algal fue cuantificado a través de la abundancia (células mL-1), abundancia
relativa, biovolumen (µm3 mL-1) y biovolumen relativo. En este caso la utilización de ambos
Cuantificación del ensamble algal
18
parámetros se basa en que solo el uso de la abundancia como estimador puede inducir a
inferencias sesgadas sobre la importancia de un morfotipo en el ensamble microalgal, ya que se
puede sobrevalorar la importancia de especies pequeñas y abundantes, que se depositan pero no
se reproducen durante todo el año, y subestimar la presencia de estadios reproductivos de mayor
volumen; pero la abundancia sigue siendo un importante estimador ecológico. Por tanto, como
una manera de soslayar el sesgo que se produce al utilizar solo la abundancia como estimador y
obtener más información, se utilizó el biovolumen que es una expresión del tamaño celular y la
abundancia, que puede ser utilizado como una aproximación de biomasa (µg C ml-1) usando un
factor de conversión, el cual se pretende obtener específicamente para el ensamble microalgal del
Volcán Mocho-Choshuenco en un futuro cercano, con el fin de estimar con mayor precisión el
aporte de los diferentes morfotipos al ensamble microalgal, el cual es utilizado en testigo de
neviza/hielo para una observación clara de los periodos de reproducción durante el periodo de
derretimiento.
2.4.3.1.
Se estimó la densidad total para cada zona de muestreo, la cual se expresó en nº de células
mL-1. Los resultados fueron obtenidos al sumar las abundancias de cada morfotipo en cada sitio
muestreado. Con las densidades celulares obtenidas se realizaron comparaciones entre las
estaciones de derretimiento de los años 2006 y 2007. Además, con esta información se determinó
los morfotipos con las mayores abundancias relativas en cada uno de los sitios en los periodos
estudiados.
Abundancia
2.4.3.2
El biovolumen de las microalgas se obtuvo a través del volumen medio celular, para lo
cual fue necesario fotografiar entre 50 – 100 células por morfotipo, los cuales a su vez fueron
Biovolumen Microalgal
19
separadas por rangos de ancho o diámetro de 2 µm. Estas fotografías también fueron utilizadas
para realizar los análisis cualitativos de las microalgas sobre el glaciar. Para el cálculo del
biovolumen se utilizaron las ecuaciones propuestas por Hillebrand et al., (1999). El biovolumen
algal total (µm3 mL-1) se estimó multiplicando el volumen medio celular (µm3) de cada morfotipo
por su densidad (nº células mL-1). Luego se sumaron los biovolumenes de todos los morfotipos
en cada sitio de muestreo y se obtuvo como resultado un perfil altitudinal de los cambios del
biovolumen sobre el glaciar.
2.5. ANÁLISIS CUALITATIVOS
2.5.1.
El desarrollo del cultivo se llevo a cabo con muestras obtenidas en el periodo 2009-2010
(Tabla 4) y con muestras que se encontraban congeladas en el CECS que corresponden al verano
del 2008, todas provenientes del glaciar del Volcán Mocho-Choshuenco. Las muestras fueron
dispuestas en una serie de matraces bajo la CFLV, a los cuales se les adicionó 1/3 de volumen de
medio cultivo F/2 o Snow Algae ya que se quería observar la eficiencia de ambos medios, luego
éstas fueron colocadas en una cámara de refrigeración vertical con un fotoperiodo 16:8
(luz:oscuridad) y con un rango de temperatura entre 1ºC a 5ºC que es lo propuesto por Hoham
(1975a) para las microalgas de nieve.
Cultivo de Microalgas
Se realizaron siembras en agar enriquecido con medio de cultivo, sobre placas petri
utilizando dos metodologías, cabe mencionar que todo el material utilizado se encontraba estéril
y fue realizado bajo la CFLV para evitar cualquier tipo de contaminación:
• Siembra por estrías: se inocularon 80 µL de cultivo en uno de los extremos de la placa y
luego este se dispersó mediante estrías sobre el agar. Esta técnica se llevo a cabo con el
20
fin de aumentar la reproducción de las microalgas, sin que importarse que fueran cultivos
mixtos, por lo que cada 2 ó 3 semanas se les agregaba medio de cultivo para mantener
siempre un film de agua sobre la superficie que permitiese un buen desarrollo de las
microalgas (resultado que se observó a las pocas semanas), para cumplir en primera etapa
con el objetivo de lograr el crecimiento in vitro de las microalgas.
• Siembra con micropipetas:
1. Una alícuota de cultivo se depositó en un portaobjetos excavado, se montó y se
observó en un microscopio invertido.
con las microalgas ya reproduciéndose en el laboratorio se dio
comienzo al desarrollo de ésta técnica, con el fin de obtener cultivos clonales, se procedió
de la siguiente manera:
2. Una vez escogida la célula microalgal a aislar, ésta se extrajo con una micropipeta
(micropipeta fabricada a partir de un tubo capilar KIMAX-51 con la máquina
Flaming/Brown Micropipette Puller P-87) y se colocó sobre otro portaobjetos
excavado que solo contenía medio de cultivo. Luego, ésta nueva muestra se montó
y observó en el microscopio invertido para comprobar que solo se aisló una célula.
Este paso se repitió 3 veces, es decir, se extrajo la microalga y se depositó en un
nuevo portaobjetos, como una manera de aumentar la probabilidad de extracción
de solo una célula.
3. Con la seguridad de haber aislado solo una célula, ésta se sembró en una de las
orillas de una placa petri. En cada placa se sembraron 6 células, las cuales
presentaban las mismas características morfológicas, en puntos aislados entre sí
(Fig. 5).
21
Luego las placas fueron puestas en la cámara de cultivo, donde se mantuvieron por un
periodo aproximado de 3 meses sin ningún tipo de manipulación, ya que este fue el periodo
obtenido luego de una serie de observaciones semanales en los cultivos iniciales, donde se
concluyó que luego de 3 meses se observan resultados. Finalizado este tiempo, se observó el
crecimiento de cada colonia, y se seleccionaron los cultivos puros, luego estas fueron reubicadas
en tubos de ensayo con medio fresco para que continuaran su crecimiento.
Fig. 5. Esquema gráfico de la aislación de las microalgas mediante el uso de micropipetas
2.5.2.
Para la identificación de las microalgas se utilizó tanto las imágenes de las muestras
filtradas, con las que se realizaron los análisis cuantitativos, como las muestras que fueron
cultivadas en el laboratorio. Las muestras cultivadas fueron tratadas con Solución de Lugol con el
objetivo de resaltar características internas de las células como: ubicación del (los) cloroplasto(s);
ausencia o presencia de pirenoide; y el aparato flagelar, todos caracteres útiles en la
identificación de las microalgas que habitan el glaciar. Otros caracteres no menos importantes
para la identificación de las poblaciones presentes sobre el glaciar fueron:
Análisis Taxonómico
• Forma de la célula: filamentosa, esférica, cilíndrica, unicelular, colonial, etc.
• Medidas celulares: largo, ancho y diámetro.
• Sustancias de reserva: gránulos de almidón, lípidos.
• Pigmentación.
22
• Presencia o ausencia de estigma
Para llevar a cabo las observaciones se utilizaron diferentes microscopios:
• Microscopio óptico y de fluorescencia OLYMPUS BX50WI
• Microscopio invertido NIKON TMS
• Microscopio óptico OLYMPUS CX31
El microscopio OLYMPUS BX50WI además de poseer una fuente de luz clara y de
fluorescencia, cuenta con la cámara Photometrics cod stop cf, la cual se utilizó para la
adquisición de imágenes de las microalgas, tanto de muestras fijas como de cultivos, las cuales
posteriormente se utilizaron para la identificación de las diferentes microalgas y para la
realización de los análisis morfométricos. Las mediciones de las algas de nieve fueron realizadas
con el programa ImageJ, el cual es un software para procesar imágenes que posee una licencia de
dominio público.
Una vez realizada la caracterización de los diferentes morfotipos y debido a la carencia
de claves de identificación para microalgas de nieve, se utilizaron para la identificación de las
microalgas estudios previos realizados por varios autores como Kol (1942), Hoham (1975a),
Hoham y Mullet (1977), Hoham et al., (1979), Ling y Seppelt (1990), Yoshimura et al., (1997),
Ling y Seppelt (1998), Müller et al., (1998), Takeuchi et al., (1998), Takeuchi (2001a), Takeuchi
y Kohshima (2004), Takeuchi et al., (2006) y Uetake et al., (2006), entre otros.
2.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Los análisis de los datos fueron realizados con el programa SigmaPlot 11. Se llevaron a
cabo los siguientes análisis: test de normalidad Shapiro-Wilk, para corroborar que los datos
poseen una distribución similar a una distribución gaussiana o normal; y un test de
23
homocedasticidad de varianza, todo esto para comprobar los supuestos previos antes de realizar
los análisis de varianza (ANDEVA). Se realizaron ANDEVA de una vía para verificar si existían
diferencias significativas tanto para la abundancia y el biovolumen con la altura, en caso de
existir diferencias se realizó un test de Tukey para determinar entre que alturas existían
diferencias estadísticamente significativas. Asimismo se realizaron ANDEVA de dos vías con el
fin de determinar si habían diferencias de la abundancia entre los años muestreados y las
diferentes alturas, luego se realizó el test de Fisher LSD para determinar entre que años y alturas
hay diferencias significativas, este mismo análisis fue realizado para el biovolumen. Todos los
análisis fueron realizados con un nivel de confianza del 95%. Los perfiles altitudinales y
estacionales tanto para la abundancia y el biovolumen fueron realizados en el programa Excel
2007.
24
Morfotipos Tamaño y Morfología
Cianobacterias
A Célula esférica, incolora, diámetro 3-6 µm.
Chlorophytas
B Célula esférica, color verde tenue e incoloras, diámetro de 6-10 µm.C Célula ovalada con un extremo aguzado, color café claro, verde tenue e incoloras,
algunas tienen una ornamentación de pequeños puntos sobre la pared, 6-9 µm desde la parte mas ancha al final del extremo aguzado, 6-8 µm de ancho. Es 1,1 + 0,1 veces mas larga que ancha.
D Célula cilíndrica con ápices redondeados, incolora, 7-10 µm de largo, 2-4 µm ancho.Es 2,7 + 0,3 veces mas larga que ancha.
E Célula esférica, color verde tenue e incolora, diámetro 10-14 µm.EA Célula esférica, color verde tenue e incolora, diámetro 15-20 µm.G Célula ovalada, color café claro, 4-9 µm de largo, 3-6 µm ancho. Es 1,5 + 0,1 veces mas
larga que ancha.HC Célula esférica, color café rojizo, diámetro 9 µm. Solo se observó una célula de este tipo.J Célula cilíndrica alargada con ápices redondeados, color verde tenue e incolora,
15-21 µm de largo, 5-9 µm de ancho. Es 2,5 + 0,3 veces mas larga que ancha.L Célula esférica, color rojo, diámetro de 21 µm.
LV Célula esférica, color verde tenue, diámetro de 21-24 µm.M Célula ovalada, ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 15-20 µm de largo,
10-13 µm de ancho. Es 1,6 + 0,1 veces mas larga que ancha.MP Célula ovalada, incolora, 13 µm de largo, 10 µm de ancho. Es 1,3 veces mas larga que
ancha.N Célula ovalada, ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 12-18 µm de largo,
6-11 µm de ancho. Es 1,7 + 0,2 veces mas larga que ancha.Q Célula cilíndrica con ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 18-24 µm de largo,
8-15 µm ancho. Es 1,9 + 0,2 veces mas larga que ancha.TRO Célula esférica, elíptica o cilíndrica, incolora, presentan ornamentaciónen la pared.
Células esféricas van de los 24-27 µm de diámetro, elípticas de 22-34 µm de largo, 17-26µm de ancho y las cilíndricas de 22 µm de largo, 12 µm de ancho.
U Célula cilindricas con un ápice aguzado, verde tenue e incolora, 15-22 µm de largo, 5-8µm de ancho. Es 2,7 + 0,2 veces mas larga que ancha.
V Célula esférica, incolora, 7-8 µm de diámetroY Célula ovalada, ápices redondeados, verde tenue e incolora, 9-13 µm de largo, 5-8 µm
de ancho. Es 1,6 + 0,2 veces mas larga que ancha.
Capítulo 3
RESULTADOS
3.1. MUESTREO ANUAL 2006
3.1.1.
Se registraron y se describieron 19 morfotipos de microalgas, donde 18 morfotipos
pertenecen al Dominio Eukarya (Woese, 1990), Reino Protista, División Chlorophyta (algas
verdes) y solo 1 morfotipo corresponde al Reino Monera, División Cyanophyta (algas verde-
azuladas) (Tabla 5; Fig 6 y 7).
Análisis Biológico
Tabla 5. Características de los 19 morfotipos de microalgas registradas en las muestras estacionales del año 2006.
25
Fig. 6. Morfotipos de microalgas desde la A a la U, observados en las muestras estacionales del año 2006, cada morfotipo está señalado con la letra mayúscula que le corresponde. Las imágenes del lado izquierdo de cada columna, que se encuentran rotuladas con una letra de color negro, corresponden a imágenes obtenidas en campo claro. Las imágenes del lado derecho, rotuladas con una letra de color blanco, fueron adquiridas utilizando fluorescencia (filtro U-MWIG). Fotografías capturadas con microscopio de fluorescencia modelo OLYMPUS BX50WI. Barra 10 µm.
26
Fig. 7. Morfotipos de microalgas V, U y TRO observados en las muestras estacionales del
año 2006. Para más detalles ver leyenda Fig. 6. La longitud de la barra corresponde a 10 µm.
3.1.1.1. Abundancia
El perfil estacional de la abundancia algal realizado con las muestras colectadas en la zona
de acumulación del glaciar a los 2000 m s.n.m. durante el año 2006 (Fig. 8), revela que la
máxima abundancia se registra en enero (354 cél mL-1), mes en el cual se aprecia la presencia de
todos los morfotipos con la excepción del morfotipo D, donde además resalta el morfotipo N con
la mayor densidad relativa (77%). Al ir finalizando el verano, en el mes de marzo, la abundancia
decae junto con la presencia de los morfotipos, ya que solo se registran 10 de ellos, de los cuales
el morfotipo C logra la mayor abundancia relativa (45%). En los meses siguientes, es decir julio,
septiembre, octubre y diciembre, la abundancia disminuye, no superando las 10 cél mL-1, periodo
donde los morfotipos con mayor presencia son A, C, D y G (Tabla 6).
27
Sitio Altura Mes Abundancia Error estándar Morfotipos Abundancias m s.n.m. cél mL-1 cél mL-1 dominantes relativas %
S1 2000 Enero 354 34 N; Q 77; 8S1 2000 Marzo 43 9 C; A 45; 21S1 2000 Julio 8 1 G; D 39,8; 26,5 S1 2000 Septiembre 8 3 A; G 44,5; 39,8S1 2000 Octubre 1 0,4 G; C; D 33; 25; 25S1 2000 Diciembre 2 1 C 100
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Ene Mar Jul Sept Oct Dic
Bio
volu
men
alg
al (µ
m3
mL-1
)
Abu
ndan
cia
(cél
mL-1
)Abundancia
Biovolumen
Fig. 8. Perfil estacional de la abundancia algal y del biovolumen algal, correspondiendo al
sitio S1 para las muestras colectadas el año 2006 sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco. Barras de error = error estándar.
Tabla 6. Abundancias de muestras mensuales para el año 2006 y morfotipos dominantes.
3.1.1.2. Biovolumen
En cuanto al perfil estacional del biovolumen algal (Fig. 8), para las muestras
estacionales, este indica que el valor máximo se registra en el mes de enero, donde el morfotipo
que presenta el mayor biovolumen relativo es el N (71%); para el mes de marzo el biovolumen
disminuye casi 40 veces en comparación con enero y Q corresponde al morfotipo predominante.
En los meses siguientes el biovolumen microalgal logra valores <1000 µm3 mL-1, donde el
28
Altura Mes Biovolumen Error estándar Morfotipos Biovolumenes m s.n.m. µm3 mL-1 µm3 mL-1 dominantes relativos %
2000 Enero 391.022 46.014 N; Q 71; 152000 Marzo 10.682 3.984 Q; C 43; 362000 Julio 799 11 G; C 37; 302000 Septiembre 637 163 G; C 39; 342000 Octubre 125 11 C; B 44; 242000 Diciembre 328 175 C 100
morfotipo G predomina en julio y septiembre. En los meses de octubre y diciembre los mayores
biovolumenes relativos fueron para el morfotipo C, el cual en el último mes alcanza un 100% de
dominancia (Tabla 7).
Tabla 7. Biovolumenes de muestras mensuales para el año 2006 y morfotipos dominantes.
3.2. MUESTRAS ALTITUDINALES ENERO 2006
3.2.1.
En el perfil altitudinal se caracterizaron 19 morfotipos de microalgas de los cuales 18
corresponden a microalgas del Dominio Eukarya (Woese, 1990), Reino Protista, División
Chlorophyta y un morfotipo corresponde al Reino Mónera, División Cyanophyta (Tabla 8; Fig.
9).
Análisis Biológico
3.2.1.1. Abundancia
El perfil de abundancia microalgal para enero del 2006 (Fig. 10) indica que la máxima
densidad celular (354 cél mL-1) se registra a los 2000 m s.n.m. en el sitio S1. Luego, a medida
que aumenta la altura sobre el glaciar la abundancia algal va disminuyendo paulatinamente hasta
llegar a la cumbre donde ésta aumenta levemente pero no significativo. Se observa además el
predomino del morfotipo N a los 2000 m s.n.m. y 2400 m s.n.m., y del morfotipo C a los 2100 m
s.n.m., 2200 m s.n.m. y 2300 m s.n.m. (Tabla 9).
29
Tabla 8. Características de los 19 morfotipos de microalgas registrados en la muestras altitudinales de enero del 2006.
Morfotipos Tamaño y Morfología
Cianobacterias A Célula esférica, incolora, diámetro 3-6 µm. Chlorophytas B Célula esférica, color verde tenue e incoloras, diámetro de 6-10 µm.
C Célula ovalada con un extremo aguzado, color café claro, verde tenue e incoloras,
algunas tienen una ornamentación de pequeños puntos sobre la pared, 6-9 µm desde
la parte más ancha al final del extremo aguzado, 6-8 µm de ancho. Es 1,1 + 0,1 veces
más larga que ancha. D Célula cilíndrica con ápices redondeados, incolora, 7-10 µm de largo, 2-4 µm ancho.
Es 2,7 + 0,7 veces más larga que ancha. E Célula esférica, color verde tenue e incolora, diámetro 10-14 µm.
EA Célula esférica, color verde tenue e incolora, diámetro 14-19 µm. F Célula fusiforme incolora, 13 µm largo, 7-8 µm ancho. Solo dos células de este tipo
fueron observadas y cuantificadas. G Célula ovalada, color café claro, 5-9 µm de largo, 3-6 µm ancho. Es 1,7 + 0,2 veces mas
larga que ancha. J Célula cilíndrica alargada con ápices redondeados, color verde tenue e incolora,
15-21 µm de largo, 5-9 µm de ancho. Es 2,5 + 0,3 veces más larga que ancha. L Célula esférica, color rojo, diámetro de 21 µm.
LV Célula esférica, color verde tenue, diámetro de 21-24 µm. M Célula ovalada, ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 15-20 µm de largo,
10-13 µm de ancho. Es 1,6 + 0,1 veces más larga que ancha. MP Célula ovalada, incolora, 13 µm de largo, 10 µm de ancho. Es 1,3 veces más larga que
ancha. N Célula ovalada, ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 12-18 µm de largo,
6-11 µm de ancho. Es 1,7 + 0,2 veces más larga que ancha.
Q Célula cilíndrica con ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 16-24 µm de largo,
8-15 µm ancho. Es 1,9 + 0,2 veces más larga que ancha. TRO Célula esférica, elíptica o cilíndrica, incolora, presentan ornamentación en la pared.
Células esféricas van de los 22-29 µm de diámetro, elípticas de 20-33 µm de largo, 16-23
µm de ancho y las cilíndricas de 22-23 µm de largo, 9-12 µm de ancho. U Célula cilíndricas con un ápice aguzado, verde tenue e incolora, 12-22 µm de largo, 4-8
µm de ancho. Es 2,7 + 0,2 veces más larga que ancha. V Célula esférica a ovalada, incolora, 10 µm de largo, 9 µm ancho. Es 1,2 veces más larga
que ancha. Y Célula ovalada, ápices redondeados, verde tenue e incolora, 9-13 µm de largo, 4-8 µm
de ancho. Es 1,6 + 0,2 veces más larga que ancha.
30
Fig. 9. Morfotipos de microalgas observados en las muestras altitudinales del año 2006.
Para más detalles ver leyenda Fig. 6. Barra 10 µm.
31
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
2000 2100 2200 2300 2400
Altitud (m s.n.m)
Abu
ndan
cia
(cél
mL-1
)
Sitio Altura Abundancia Error estándar Morfotipos Abundancias m s.n.m. cél mL-1 cél mL-1 dominantes relativas %
S1 2000 354 34 N; Q 77; 8S2 2100 23 4 C; B 42; 11S3 2200 21 6 C; B; G 62; 9; 9S4 2300 19 4 C; TRO 72; 8S5 2400 33 6 N; C 55; 25
Fig. 10. Variación de la abundancia microalgal (cél mL-1) entre los diferentes sitios de muestreo sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en enero 2006. Las barras de error indican el error estándar.
Tabla 9. Cambio altitudinal de la abundancia microalgal para enero del 2006 y morfotipos dominantes en cada sitio de muestreo.
En orden a comprobar si existen diferencias de la abundancia algal entre las diferentes
alturas los resultados fueron analizados mediante un Análisis de Varianza (ANDEVA) de una
vía, para lo cual datos debieron pasar los supuestos de normalidad (Shapiro-Wilk P 0,357) y
homocedasticidad de varianza (P 0,822). El resultado del análisis indica que existen diferencias
significativas entre la abundancia y la altitud al 5% (F4,17 = 32,384; P < 0,001), por lo que se
32
Altitud 2000 2100 2200 230020002100 < 0,0012200 < 0,001 0,9862300 < 0,001 0,911 0,9962400 < 0,001 0,849 0,566 0,389
llevó a cabo un test post hoc indicando que existen diferencias significativas para la abundancia
de los 2000 m s.n.m. con respecto a las otras alturas (Tabla 10).
Tabla 10. Matriz de comparación múltiple (Test de Tukey) entre la abundancia y las diferentes alturas para el mes de enero del año 2006. Números en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas.
3.2.1.2. Biovolumen
El perfil altitudinal del biovolumen algal de enero del 2006 (Fig. 11), el cual se llevó a
cabo con muestras provenientes solo del área de acumulación del glaciar debido a que todos los
sitios de muestreo se ubicaban sobre la altura de la línea de equilibrio, indican que el peak del
biovolumen microalgal se registra en la zona más baja muestreada, es decir a los 2000 m s.n.m.
Luego el perfil revela un brusco descenso de aproximadamente 40 veces del biovolumen a los
2100 m s.n.m. en comparación a la altura anterior. Seguido a esto el biovolumen microalgal
aumenta levemente (no significativo) hasta llegar a la cumbre del glaciar. En este perfil destacan
los morfotipos N con un 71% para los 2000 m s.n.m. y un 44% para los 2400 m s.n.m., C con
17% para los 2100 m s.n.m., TRO con 74% para los 2200 m s.n.m y un 70% para los 2300 m
s.n.m. con los mayores biovolumenes relativos (Tabla 11).
Un ANDEVA de una vía, posterior a la aceptación de los supuestos de normalidad
(Shapiro-Wilk P 0,077) y homocedasticidad (P 0,756), se realiza con el fin de analizar si existen
cambios del biovolumen microalgal con la altitud, arrojando como resultado que existen
diferencias significativas entre las diferentes altitudes para el biovolumen de enero del 2006 al
5% (F(4,17) = 19,775; P < 0,001). Para determinar entre que alturas existen diferencias
33
Altitud 2000 2100 2200 230020002100 < 0,0012200 < 0,001 0,9962300 < 0,001 0,997 1,0002400 0,005 0,191 0,269 0,263
050000
100000150000200000250000300000350000400000450000500000
2000 2100 2200 2300 2400
Altitud (m s.n.m.)
Biov
olum
en (u
m3 m
L-1)
Altura Biovolumen Error estándar Morfotipos Biovolumenes m s.n.m. µm3 mL-1 µm3 mL-1 dominantes relativos %
2000 389.382 46.095 N; Q 71; 152100 9.562 3.069 C; E 17; 162200 13.175 5.100 TRO; C 74; 172300 13.461 3.407 TRO; C 70; 162400 35.437 8.026 N; TRO 44; 34
estadísticamente significativas se realiza un test de comparación múltiple (Tukey), el cual
demuestra que el biovolumen algal de los 2000 m s.n.m. difiere significativamente de los otros
sitios de muestreados sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco (Tabla 12).
Fig. 11. Cambio altitudinal del biovolumen algal (µm3 mL-1) sobre el glaciar del volcán
Mocho-Choshuenco en el mes de enero del año 2006. Barras de error = error estándar. Tabla 11. Cambios del biovolumen microalgal con la altitud para enero 2006 y
morfotipos con mayores abundancias relativas para cada altura.
Tabla 12. Matriz de comparación múltiple (Test de Tukey) del biovolumen entre las
diferentes alturas para enero del 2006. Números en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas.
34
Morfotipos Tamaño y Morfología
Cianobacterias A Célula esférica, incolora, diámetro 3-6 µm. Chlorophytas
B Célula esférica, color verde tenue e incoloras, diámetro de 6-9 µm. C Célula ovalada con un extremo aguzado, color café claro, verde tenue e incoloras,
algunas tienen una ornamentación de pequeños puntos sobre la pared, 6-9 µm desde
la parte más ancha al final del extremo aguzado, 6-8 µm de ancho. Es 1,2 + 0,1 veces
más larga que ancha. CL Célula ovalada con una gruesa pared, color verde anaranjado, 21-42 µm de largo, 13-36
µm de ancho. Es 1,2 + 0,1 veces más larga que ancha. D Célula cilíndrica con ápices redondeados, incolora, 8-9 µm de largo, 3 µm ancho.
Es 2,8 + 0,2 veces más larga que ancha. E Célula esférica, color verde tenue e incolora, diámetro 10-14 µm.
EA Célula esférica, color verde tenue e incolora, diámetro 14-19 µm. G Célula ovalada, color café claro, 5 µm de largo, 4 µm ancho. Es 1,2 veces más larga que
ancha. Es 1,2 veces más larga que ancha. J Célula cilíndrica alargada con ápices redondeados, color verde tenue e incolora,
15-16 µm de largo, 5-7 µm de ancho. Es 2,5 + 0,2 veces más larga que ancha. L Célula esférica, color rojo, diámetro de 18-26 µm.
LG Célula esférica, color rojo, gruesa capa mucilaginosa, diámetro de 48-50 µm. LV Célula esférica, color verde tenue, diámetro de 20-27 µm. M Célula ovalada, ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 15-24 µm de largo,
9-16 µm de ancho. Es 1,6 + 0,3 veces más larga que ancha. MG Célula ovalada, ápices redondeados, coloración verde, 28 µm de largo, 23 µm de ancho.
Es 1,2 veces más larga que ancha. MP Célula ovalada, ápices redondeados, verde tenue e incolora, 12-13 µm de largo, 10 µm
de ancho. Es 1,2 + 0,05 veces más larga que ancha. N Célula ovalada, ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 12-19 µm de largo,
6-11 µm de ancho. Es 1,7 + 0,2 veces más larga que ancha. Q Célula cilíndrica, ápices redondeados, color verde tenue e incolora, 16-24 µm de largo,
9-12 µm ancho. Es 1,8 + 0,2 veces más larga que ancha. TRO Célula esférica, elíptica o cilíndrica, incolora, presentan ornamentación en la pared.
Células esféricas van de los 17-29 µm de diámetro, elípticas de 20-33 µm de largo, 17-26
µm de ancho y las cilíndricas de 21-39 µm de largo, 15-22 µm de ancho. U Célula cilíndricas con un ápice aguzado, verde tenue e incolora, 17 µm de largo, 6-7 µm
de ancho. Es 2,5 + 0,3 veces más larga que ancha.
V Célula esférica a ovalada, incolora, 10-12 µm de largo, 9-10 µm ancho. Es 1,1 + 0,1 veces
más larga que ancha. Y Célula ovalada, ápices redondeados, verde tenue e incolora, 7-13 µm de largo, 4-8 µm
de ancho. Es 1,7 + 0,2 veces más larga que ancha.
3.3. MUESTRAS ALTITUDINALES MARZO 2007
3.3.1.
En el perfil altitudinal del año 2007 se caracterizaron 21 morfotipos de microalgas de los
cuales 20 corresponden a microalgas del Dominio Eukarya (Woese, 1990), Reino Protista,
División Chlorophyta y un morfotipo corresponde al Reino Mónera, División Cyanophyta (Tabla
13; Fig. 12 y 13).
Análisis Biológico
Tabla 13. Características de los 21 morfotipos de microalgas registrados en la muestras altitudinales de marzo del 2007.
35
Fig. 12. Morfotipos de microalgas desde el A al N observados en las muestras
altitudinales de marzo del 2007. Para más detalles ver leyenda Fig. 6. Barra 10 µm.
36
Fig. 13. Morfotipos de microalgas U, V, Y, TRO, CL y LG observados en las muestras
altitudinales de marzo del 2007. Para más detalles ver leyenda Fig. 6. Barra 10 µm.
37
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1900 2000 2100 2200 2300 2400
Altitud (m s.n.m.)
Abun
danc
ia (c
él m
L -1)
3.3.1.1. Abundancia
En el perfil de abundancia microalgal para marzo del 2007 (Fig. 14) muestra que el valor
de máxima densidad algal pertenece al sitio S1, que corresponde a la zona de ablación del glaciar
a los 1900 m s.n.m., en donde resalta el morfotipo N con la mayor abundancia relativa (73%). Al
llegar al sitio S2 ya en la zona de acumulación del glaciar, la abundancia decae más de 8 veces en
comparación a la abundancia de la zona de ablación y continúa con la tendencia de disminución
en los sitios S3 y S4. En los siguientes puntos de muestreo S5 y S6 se observa un aumento de la
densidad algal; en la zona de acumulación del glaciar destacan los morfotipos LV, N, C, L y N
con las mayores abundancias relativas desde el S2 al S6 respectivamente (Tabla 14).
Fig. 14. Cambio altitudinal de la abundancia (cél mL-1) sobre el glaciar del volcán
Mocho-Choshuenco en el mes de marzo del año 2007. Barras de error = error estándar.
38
Altitud 1900 2000 2100 2200 230019002000 0,0022100 < 0,001 0,0132200 < 0,001 0,140 0,8742300 < 0,001 0,618 0,316 0,9122400 0,006 0,998 0,005 0,060 0,367
Sitio Altura Abundancia Error estándar Morfotipos Abundancias m s.n.m. cél mL-1 cél mL-1 dominantes relativas %
S1 1900 378 113 N; C 73; 12S2 2000 45 16 LV; L 26; 23S3 2100 8 2 N; C 37; 20S4 2200 11 2 C; TRO 65; 10S5 2300 19 4 L; C 43; 28S6 2400 53 15 N; CL 33; 26
Tabla 14. Cambio altitudinal de la abundancia microalgal para marzo del 2007 y morfotipos dominantes en cada sitio de muestreo.
Una vez comprobados los supuestos de normalidad (Shapiro-Wilk P 0,072) y
homocedasticidad de varianza (P 0,969) para los datos de abundancia de marzo del 2007, se
ejecuta un ANDEVA de una vía para evidenciar si existen diferencias entre las abundancias de
los diferentes sitios muestreados, el cual indica que se hay discrepancias estadísticamente
significativas con un nivel de confianza del 95% (F(5,24) = 16,470; P < 0,001). Para determinar
entre que sitios existen diferencias se realiza el test de Tukey (Tabla 15).
Tabla 15. Matriz de comparación múltiple (test de Tukey) entre las abundancias de los diferentes alturas para marzo del 2007. Los datos en color rojo indican que existen diferencias significativas entre las abundancias a las diferentes altitudes.
3.3.1.2. Biovolumen
El biovolumen algal para marzo del 2007 (Fig. 15), no muestra una correlación con el
gradiente altitudinal de temperatura. El sitio S1, correspondiente a la zona de ablación del glaciar,
registra 481.274 µm3 mL-1, el cual corresponde al mayor biovolumen registrado en comparación
al resto de los sitios analizados. Al pasar a la zona de acumulación del glaciar en el sitio S2 el
39
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
1900 2000 2100 2200 2300 2400
Altitud (m s.n.m)
Biov
olum
en ( µ
m3 m
L-1)
Altura Biovolumen Error estándar Morfotipos Biovolumenes m s.n.m. µm3 mL-1 µm3 mL-1 dominantes relativos %
1900 481.274 144.138 N; LG 57; 172000 185.112 90.212 LV; L 39; 372100 12.839 4.927 L; TRO 37; 322200 11.863 5.098 TRO; L 52; 232300 66.061 20.718 L; TRO 81; 112400 375.290 96.339 CL; L 82; 9
biovolumen disminuye a un poco menos de la mitad en comparación al sitio S1. En los siguientes
sitios muestreados el biovolumen continúa decreciendo a medida que aumenta la altura hasta
llegar al sitio S5, donde este aumenta casi 6 veces en comparación al sitio anterior y continúa con
esta tendencia hasta llegar a la cumbre del glaciar. En cuanto a los morfotipos con mayores
proporciones de biovolumen encuentran el N, LV, L, TRO, L y CL para cada uno de los sitios
estudiados (Tabla 16).
Fig. 15. Cambio altitudinal del biovolumen algal (µm3 mL-1) sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en el mes de marzo del año 2007. Barras de error = error estándar.
Tabla 16. Cambios del biovolumen microalgal con la altitud para marzo del 2007 y morfotipos con mayores abundancias relativas para cada altura.
40
Altitud 1900 2000 2100 2200 230019002000 0,1822100 < 0,001 0,1412200 < 0,001 0,134 1,0002300 0,011 0,776 0,798 0,7842400 0,986 0,485 0,003 0,002 0,048
Posterior a la aceptación de los supuestos de normalidad (Shapiro-Wilk P 0,927) y
homocedasticidad (P 0,240), se realizó un ANDEVA de una vía para comprobar si existen
cambios del biovolumen microalgal con la altitud. Los resultados concluyen que hay diferencias
significativas entre las diferentes altitudes para el biovolumen de marzo del 2007, con un nivel de
significancia al 5% (F(5,24) = 9,416; P < 0,001). Como hay diferencias entre el biovolumen y las
alturas se realiza un test de comparación múltiple (Tukey) indicando que el biovolumen algal de
los 1900 m s.n.m. difiere significativamente de los biovolumenes obtenidos para los 2100, 2200 y
2300 m s.n.m. Además muestra que el biovolumen de los 2400 m s.n.m. difiere
significativamente con los sitios de 2100, 2200 y 2300 m s.n.m. (Tabla 17).
Tabla 17. Matriz de comparación múltiple (test de Tukey) entre los biovolumenes de las diferentes alturas para marzo del 2007. Los datos en color rojo indican que existen diferencias significativas entre las abundancias a las diferentes altitudes.
3.4. COMPARACIÓN DE MUESTRAS ALTITUDINALES 2006 v/s 2007
3.4.1.
Para comprobar si existen diferencias significativas entre el cambio altitudinal de la
abundancia entre enero del 2006 y marzo del 2007 (Fig. 16) se realiza un ANDEVA de dos vías,
luego de comprobar los supuestos de normalidad (Shapiro-Wilk, P 0,214) y homocedasticidad de
varianzas (P 0,461), el cual muestra que existen diferencias significativas de la abundancia entre
los años y la altitud con un nivel de significancia al 5% (Tabla 18). El test de comparación
múltiple de Fisher LSD se realiza para determinar entre que alturas existen diferencias
Comparación de las abundancia total entre los veranos del 2006 y 2007
41
Fuente de Variación G.L Suma cuadrados Cuadrado medio F P Años 1 94.029 94.029 37.164 < 0.001Altura 4 546.539 136.635 54.004 < 0.001Años x Altura 4 289.025 72.256 28.559 < 0.001Residual 37 93.613 2.53Total 46 1047.702 22.776
Altitud (m s.n.m.)2000 LSD(alfa=0,050) P valor
2.038 <0.0012100 LSD(alfa=0,050) P valor
2.162 0.062200 LSD(alfa=0,050) P valor
2.038 0.2822300 LSD(alfa=0,050) P valor
2.038 0.9792400 LSD(alfa=0,050) P valor
2.354 0.276
Comparación años 2006 vs 2007
0
100
200
300
400
500
600
1900 2000 2100 2200 2300 2400
Altitud (m s.n.m.)
Abu
ndan
cia
(cél
mL-1
) 20062007
significativas de la abundancia, utilizando como factor los años. Los resultados arrojan que solo
existen diferencias del biovolumen a los 2000 m s.n.m. entre los años 2006 y 2007 (Tabla 19).
Fig. 16. Comparación del cambio altitudinal de la abundancia entre enero del 2006 y
marzo del 2007. Barras de error = error estándar. Tabla 18. Resumen del Análisis de Varianza para la abundancia sobre el glaciar del
volcán Mocho-Choshuenco. Valores en rojo indican diferencias estadísticamente significativas.
Tabla 19. Test de Fisher LSD, comparación de las abundancias a las mismas alturas utilizando como factor los años. Valores en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas.
42
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
1900 2000 2100 2200 2300 2400
Altitud (m s.n.m.)
Bio
volu
men
( µm
3 mL-1
)
20062007
Fuente de Variación G.L Suma cuadrados Cuadrado medio F P Años 1 37389.844 37389.844 2.794 0.103Altura 4 1253171.467 313292.867 23.415 < 0.001Años x Altura 4 457584.582 114396.146 8.55 < 0.001Residual 37 495052.664 13379.802Total 46 2357696.269 51254.267
3.4.2.
Para comprobar si existen diferencias significativas entre el cambio altitudinal del
biovolumen entre enero del 2006 y marzo del 2007 (Fig. 17) se realiza un ANDEVA de dos vías,
el cual muestra que existen diferencias significativas del biovolumen entre los años y la altitud
con un nivel de confianza del 95% (Tabla 20). El test de comparación múltiple de Fisher LSD se
llevo a cabo para determinar entre que alturas existen diferencias significativas del biovolumen
entre los años en estudio, los resultados indicaron que hay diferencias estadísticamente
significativas del biovolumen a los 2000 m s.n.m. y 2400 m s.n.m. entre los años 2006 y 2007
(Tabla 21).
Comparación del biovolumen total entre los veranos del 2006 y 2007
Fig. 17. Comparación del cambio altitudinal del biovolumen algal entre enero del 2006 y marzo del 2007. Barras de error = error estándar.
Tabla 20. Resumen del Análisis de Varianza de dos vías para el biovolumen sobre el
glaciar del volcán Mocho-Choshuenco entre enero del 2006 y marzo del 2007. Valores en rojo indican diferencias estadísticamente significativas.
43
Altitud (m s.n.m.)2000 LSD(alfa=0,050) P valor
148.23 0.0032100 LSD(alfa=0,050) P valor
157.221 0.9412200 LSD(alfa=0,050) P valor
148.23 0.8922300 LSD(alfa=0,050) P valor
148.23 0.0842400 LSD(alfa=0,050) P valor
171.161 < 0.001
Comparación años 2006 vs 2007
Tabla 21. Test de Fisher LSD, comparación del biovolumen a una misma altura utilizando como factor los años. Valores en color rojo indican diferencias estadísticamente significativas.
3.4.3.
En enero del 2006 se registran 19 morfotipos de microalgas, donde la mayor parte de los
tipos celulares corresponde a células con un tamaño < 20µm y de una coloración verde o
incolora. En este periodo resaltan dos morfotipos por su gran tamaño L y TRO, el primero de
ellos además destaca por su coloración rojiza y el morfotipo TRO por poseer una vistosa cubierta
exterior de espinas.
Comparación del ensamble microalgal entre los veranos del 2006 y 2007
En marzo del 2007 se registran 21 morfotipos de microalgas, aparecen nuevos morfotipos
como lo son CL, LG y MG que presentan grandes tamaños con una coloración anaranjada, rojiza
y verdosa respectivamente. Asimismo en este periodo no se registra el morfotipo F que fue
observado en el muestreo altitudinal del año anterior.
Al comparar los muestreos altitudinales se observan diferencias entre los morfotipos
dominantes para la abundancia y el biovolumen entre las diferentes alturas, las cuales son
resumidas en la tabla 22.
44
Morfotipodominante 1900 2000 2100 2200 2300 2400
AbundanciaEnero 2006 - N (77%) C (42%) C (62%) C (72%) N (55%)Marzo 2007 N (73%) LV (26%) N (37%) C (65%) L (43%) N (33%)BiovolumenEnero 2006 - N (71%) C (17%) TRO (74%) TRO (70%) N (44%)Marzo 2007 N (57%) LV (39%) L (37%) TRO (52%) L (81%) CL (82%)
Altitud (m s.n.m.)
Tabla 22. Comparación de los morfotipos dominantes para cada altura entre el muestro altitudinal del año 2006 y 2007, tanto para la abundancia y biovolumen. Entre paréntesis se indica la abundancia relativa y el biovolumen relativo para cada morfotipo según el caso.
3.5. CULTIVO DE MICROALGAS
El resultado de la primera siembra en placas por estrías al cabo de 2 meses mostró una
coloración verdosa y homogénea en las placas (Fig. 18), estas microalgas fueron traspasadas a
matraces y tubos de ensayos para que continuaran su crecimiento, con lo cual se demuestra que
con las condiciones ofrecidas en laboratorio era posible su cultivo.
Los siguientes aislamientos celulares fueron realizados mediante la técnica de
micropipetas, permitiendo el desarrollo de cultivos clonales. De estos últimos, se extrajeron
alícuotas para la identificación de los microorganismos. Las muestras fueron observadas en
fresco y teñidas con solución de Lugol para observar los caracteres de cada grupo de células
clonales.
Fig. 18. Crecimiento de microalgas luego de 2 meses desde su siembra mediante la
técnica de siembra en estrías.
45
3.5.1.
Dentro las observaciones realizadas se pudieron diferenciar dos géneros comunes de
microalgas de nieve como lo son Chloromonas y Chlamydomonas (Fig. 19), diferenciándose en
que el primer género carece de un pirenoide en la célula vegetativa (Hoham, 1975a). Hasta el
momento se ha podido desarrollar la fase de reproducción vegetativa de ambos géneros en los
cuales se pueden observar células parentales con 2- 4- 8 ó 16 células hijas en su interior, estos
incluyen tanto células alargadas como esféricas con o sin flagelos, la fase sexual no ha sido
detectada. Además es posible observar cambios en la forma celular (células transicionales) como
una separación entre la pared celular y el protoplasto en ambos tipos celulares. Las características
de los géneros clonales cultivados con muestras del glaciar Mocho-Choshuenco son dadas en la
Tabla 23.
Identificación de microalgas cultivadas
Tabla 23. Comparación de las principales características morfológicas entre Chloromonas sp y Chlamydomonas sp.
Chloromonas sp Chlamydomonas spCélulas vegetativas
Forma Células alrgadas y esféricas Células elipsoidales y esféricasLargo (µm) 8 - 25 7 - 17Ancho (µm) 6 - 22 5 - 16Diámetro (µm) 7 - 25 8 - 19Flagelos (µm) Biflageladas, 7 - 13 Biflageladas, 6 - 17Cloroplasto Bandas parietales Forma de copaPirenoide Ausente Presente, parte posterior de la célulaNúcleo Central, a veces parietal Central a la parte anterior con un gran nucléoloEstigma Ausente Presente, parte anterior de la célula
Formación zoosporasNº células dentro célula parental 2 - 4 - 8, raras veces 16 2 - 4 - 8, raras veces 16Largo (µm) 6 - 15 7 - 13Ancho (µm) 3 - 10 4 - 11
46
Fig. 19. Estadios vegetativos de Chloromonas sp (a-e) y Chlamydomonas sp (f-j)
obtenidos desde los cultivos realizados durante la Tesis. Células fijadas con Lugol excepto imagen b y g que son in vivo. (a) Célula alargada, biflagelada, con núcleo central; (b) Célula alargada con bandas de cloroplastos; (c) Célula al inicio del proceso de división, se observan 2 núcleos en la parte central de la célula; (d-e) Reproducción vegetativa, en (d) se observan 4 zoosporas dentro de la célula parental y en (e) 8 zoosporas; (f) Célula biflagelada, con núcleo anterior y pirenoide en la parte posterior; (g) Célula esférica, cloroplasto en forma de copa con un pirenoide en la parte posterior y estigma en la parte anterior; (h-j) fase de reproducción vegetativa. En (h) se observan 2 zoosporas en el interior de la célula parental, en (i) 4 zoosporas y n (j) 6 zoosporas. Barra 10 µm. F= flagelo, N=núcleo, P=pirenoide, S= estigma, BC=bandas de cloroplasto, CC= cloroplasto en forma de copa.
47
Capítulo 4
DISCUSIÓN
Un glaciar es un ecosistema único de agua dulce con una comunidad biológica simple y
especializada, basada sobre la producción primaria de microalgas de nieve (Kohshima, 1984).
Microorganismos de algunos glaciares de Chile han sido utilizados como indicadores
estacionales en testigos de neviza/hielo, tales como el glaciar Tyndall, donde además se realizó
un estudio de la distribución altitudinal de las microalgas (Shiraiwa et al., 2002; Takeuchi y
Kohshima, 2004; Kohshima et al., 2007) y en los glaciares del volcán Osorno y Mocho-
Choshuenco donde se utilizaron microalgas, polen y tecamebas para la estimación de balance de
masas pasados (Santibáñez et al., 2008). No obstante, la información taxonómica, fisiológica y
ecológica de estos microorganismos es aún insuficiente, es por esto que la interrogante a
dilucidar en este estudio es identificar el ensamble microalgal, y como este se distribuye en un
gradiente altitudinal sobre el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco. De esta manera se
incrementará el uso potencial de los microorganismos como bioindicadores y biomarcadores de
las condiciones medioambientales y climáticas pasadas sobre este ecosistema.
4.1. DISTRIBUCIÓN TEMPORAL, RESOLUCIÓN ESTACIONAL
El muestreo mensual durante el año 2006 en el glaciar Mocho-Choshuenco mostró el
patrón estacional de las microalgas reportado en estudios previos (Yoshimura et al., 2000;
Kohshima et al., 2002; Uetake et al., 2006). La Fig. 5 confirma que el periodo de crecimiento de
las microalgas de nieve ocurre en la estación de derretimiento (finales de primavera-verano). Esto
indica, una vez más, la conducta estacional de las microalgas, y por consiguiente su uso en la
48
datación de testigos de neviza/hielo. La tendencia de abundancia algal es claramente seguida por
los valores de biovolumen durante todo el año 2006.
El comportamiento estacional que se ha observado en las microalgas del glaciar posee una
estrecha relación con las características climáticas de la zona, temperatura atmosférica,
precipitación y nubosidad, las cuales regulan la disponibilidad de agua de derretimiento la cual es
fundamental para el desarrollo de la vida, que junto con la luz y nutrientes, crea el ambiente
propicio para la proliferación de microorganismos (Yoshimura et al., 1997; Price, 2000;
Yoshimura et al., 2000; Takeuchi, 2001a).
De todos los morfotipos descritos en las muestras estacionales, los A, C, G y D fueron
observados durante todo el periodo de muestreo sin mostrar variaciones estacionales
significativas en su abundancia a lo largo del año, ni siquiera en el periodo estival donde se
conjugan las condiciones adecuadas para la proliferación de las microalgas. Se sugiere que la
presencia de los morfotipos A, C, G y D durante todo el muestreo estacional podría deberse a que
son transportados y depositados sobre el glaciar por la acción del viento, por lo tanto se sugiere
que no deben ser usados morfológicamente como bioindicadores estacionales en testigos de
neviza/hielo en el glaciar Mocho-Choshuenco. Esta idea se apoya en la presencia de estos
morfotipos durante los meses de julio, septiembre y octubre, donde la temperatura promedio
mensual está bajo los 0ºC (Fig. 4), hay presencia de precipitaciones y nubosidad, condiciones no
aptas para el derretimiento de capas superficiales imposibilitando su crecimiento. En los testigos
obtenidos del glaciar del volcán Mocho-Choshuenco en el año 2005 también se observó una
distribución homogénea de estos morfotipos, por lo cual fueron excluidos de la interpretación
(Santibañez, 2007). Sería interesante comprobar en laboratorio, a través de cultivos y en terreno,
a través de estudios de campo, si estos morfotipos realmente son parte del ciclo de microalgas de
49
nieve, o simplemente corresponden a células que se depositan pero que no son viables en las
condiciones medioambientales que presenta el glaciar, y que son arrastradas desde una fuente
cercana. Además, estos resultados entregarían información que contrasta la sugerencia realizada
por Uetake et al., (2006), en donde indican que los morfotipos pequeños (< 7 µm) deben ser
eliminados de la datación de testigos de hielo ya que se distribuyen homogéneamente a lo largo
del testigo debido a la posible percolación de estos, este estudio concluye que esto podría deberse
también a la depositación homogénea observada. La posible percolación de morfotipos pequeños
debe ser comprobada a través de estudios de campo y captadores de partículas aéreas.
4.2. RELACIÓN DE LA ABUNDANCIA Y BIOVOLUMEN CON LA ALTITUD
4.2.1.
Los perfiles de abundancia total altitudinal para las muestras de enero del 2006 y marzo
del 2007 indican que existe una disminución de la abundancia hasta los 2300 m s.n.m. y
2200 m s.n.m. respectivamente. Sobre estas altitudes se observó un leve incremento de la
abundancia no estadísticamente significativo, por lo tanto los datos se encuentran en acuerdo a lo
indicado por estudios previos (Yoshimura et al., 1997; Takeuchi et al., 1998; Takeuchi, 2001a;
Takeuchi y Kohshima, 2004). Esta tendencia también se observa en el perfil de biovolumen total
altitudinal de enero del 2006. Sin embargo, el perfil de biovolumen total de marzo del 2007
mostró un aumento significativo desde los 2200 m s.n.m. al llegar a la cumbre del glaciar
(2400 m s.n.m.). En estudios previos, citados anteriormente, los autores indican que la
disminución en la zona de acumulación es causada por factores ambientales físicos tales como
disminución de la temperatura, aumento de la precipitación nival; radiación y UV, los cuales
poseen un gradiente altitudinal.
Estructura del ensamble microalgal, distribución espacial
50
El incremento significativo en biovolumen total, observado en el perfil altitudinal de
marzo del 2007, se explica por la presencia de morfotipos de mayor tamaño (> 20 µm), los cuales
son los estadios de resistencia de estas microalgas. Una interpretación más detallada sobre los
cistos de resistencia será dada en el párrafo 4.4.2.
Respecto a los cambios de la abundancia y biovolumen totales en la zona de ablación,
no es posible establecer algún tipo de tendencia ya que solo existe un sitio de muestreo en marzo
del 2007, ubicado a una altitud de 1900 m s.n.m. Al comparar la zona de ablación y acumulación
se puede observar que los valores en la zona de acumulación son significativamente menores a
los de la zona de ablación, tanto para abundancia y biovolumen, coincidente con estudios
previos (Yoshimura et al., 1997; Takeuchi, 2001a; Takeuchi y Kohshima 2004) donde se señala
que el cambio más significativo de la abundancia y el biovolumen ocurre entre la zona con
sustrato de hielo (zona de ablación) y la zona con sustrato de nieve (zona de acumulación).
4.3. COMPARACIÓN INTERANUAL DE LA ESTRUCTURA DEL ENSAMBLE
4.3.1.
A.
Comparación de la estructura del ensamble microalgal
La comparación de las abundancias entre ambos años solo indicó diferencias
significativas a los 2000 m s.n.m (Tabla 19). Entre ambos periodos de muestreo se observa
diferencias en la temperatura media mensual, la que registra en el mes de enero de 2006 un valor
de 7,9°C mayor que el mes de marzo de 2007 que alcanzó 6,5°C (Fig. 3). La diferencia de
abundancia no puede ser atribuida al factor de la temperatura, ya que si éste hubiese sido el factor
causal de la discrepancia de la abundancia entre ambos periodos, también hubiese modificado la
abundancia de los otros sitios de muestreo, por lo tanto la temperatura no corresponde a una
Abundancia
51
variable que pueda explicar la diferencia observada por si sola. Es interesante apreciar que la
abundancia fue estable de una estación de muestreo a la siguiente estación sobre los 2000 m
s.n.m. a pesar de la diferencia mensual, y de temperatura, lo cual sugiere estabilidad en los
cambios de abundancia microalgal sobre un año. Por tanto, la diferencia de la abundancia entre
ambos años observada a los 2000 m s.n.m. podría ser una respuesta a otros factores in situ que no
fueron considerados en esta investigación, que tienen relación con la características abióticas de
película de agua en la cual habitan estos microorganismos, tales como: disponibilidad de oxígeno
y nutrientes, radiación, irradiación, exposición, fotoperiodo, y UV, en adición a los factores
bióticos como la competencia.
B.
La comparación de los biovolumenes entre ambos años indica que existen diferencias
significativas a los 2000 m s.n.m., registrándose el mayor valor en enero del 2006, y a los
2400 m s.n.m. donde el biovolumen fue significativamente mayor en marzo del 2007 (Tabla 21).
Las diferencias en el primer caso pudiesen ser explicadas en base a que la densidad celular
(abundancia algal), la cual fue casi 9 veces menor en marzo del 2007 en comparación al año 2006
a los 2000 m s.n.m., lo que se tradujo en un menor biovolumen. En cuanto a la diferencia de
biovolumen a los 2400 m s.n.m. ésta no puede ser explicada por la abundancia algal, ya que no
existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos años, pero si puede ser explicada
por los morfotipos de gran tamaño que fueron registrados en marzo del 2007 en la cumbre del
glaciar y que están relacionados con la época de colección de las muestras.
Biovolumen
52
4.4. COMPOSICIÓN APROXIMADA DEL ENSAMBLE MICROALGAL BASADO
EN MORFOTIPOS
La mayoría de las teorías ecológicas depende del concepto de especie: la ecología de
poblaciones cuantifica individuos de la especie mientras que la ecología de comunidades y
macroecología cuenta el número de especies. El concepto de especies más utilizado es el
biológico (Mayr, 1957), desafortunadamente los microorganismos (procariotas y eucariotas) son
asexuales, lo cual viola los supuestos de definición de especie biológica. Este es un problema
actual en ecología microbiana y algunos de los conceptos que utiliza esta área son: el concepto de
ecotipo (Begon, 1990; Cohan y Perry, 2007) como concepto ecológico de especies o el OTU
basado en el filotipo. En el caso de las microalgas de nieve este problema está presente y fue
observado en este estudio, por lo tanto la composición del ensamble no es basada en especie sino
en una aproximación de ésta. Los morfotipos corresponden a diferentes estadios microalgales y
estos responden a factores ambientales por lo tanto también nos entregan información de los
factores abióticos.
4.4.1.
Se compara los morfotipos con mayores abundancias relativas de cada año entre las
diferentes alturas y se observan tres sitios con diferencias (2000, 2100 y 2300 m s.n.m.) y dos
sitios en los cuales dominan los mismos morfotipos (2200 y 2400 m s.n.m.) de un año para otro
(Tabla 22). Las dos alturas que no presentan diferencias en el morfotipo dominante indican
hábitat estables, por otro lado las alturas que presentan diferencias en los morfotipos dominantes
indican variabilidad anual y/o mensual, inducidos en respuesta a factores bióticos y/o abióticos a
micro-escala que no es posible comprobar con la cantidad de muestras y los periodos
Morfotipos dominantes
53
muestreados que se poseen. Sin embargo estas diferencias y similitudes de morfotipos
corresponden a un dato potencial para el uso de microalgas como paleobioindicadoras
ambientales y climáticas. Por lo tanto un muestreo continuo semanal y/o mensual es sugerido.
Fue posible identificar que los morfotipos LG y N podrían corresponder a un especialista
de hielo y generalista respectivamente, de acuerdo a las definiciones sugeridas por Yoshimura et
al., (1997). Esto debido a que la presencia del morfotipo LG solo fue registrada en la zona de
ablación del glaciar en marzo del 2007 y el morfotipo N domina en la zona de acumulación y en
dos sitios de la zona de ablación (Tabla 22), lo que sugiere que se trata de un morfotipo de una
especie generalista, sin mostrar una preferencia por ningún tipo de ambiente.
4.4.2.
Los morfotipos dominantes en biovolumen del muestreo altitudinal de enero del 2006,
corresponden mayoritariamente a células vegetativas, las cuales se caracterizan por poseer una
coloración verdosa, pequeños tamaños y flageladas (inferiores a 20 µm). Al contrario, los
morfotipos dominantes para marzo del 2007, L, LV, TRO y CL (Tabla 22), presentan grandes
tamaños (>20 µm) y poseen una vistosa coloración rojiza y/o anaranjada por la presencia de
carotenos, como astaxantina, que corresponden a cistos y células de resistencia obligatorias.
Estadios microalgales como respuesta a cambios medioambientales
Las células vegetativas están relacionadas a periodos de estabilidad ambiental, en la cual
la proliferación celular se produce por reproducción asexual, estos estadios vegetativos podrían
indicarnos que las condiciones son estables y favorecen la colonización o dispersión de las
microalgas sobre el glaciar.
Cuando las condiciones de crecimiento se tornan desfavorables las células esféricas y las
flageladas desaparecen y las microalgas se transforman de verdes a rojas (Lemoine y Schoefs,
54
2010), esto ocurre como respuesta a altos niveles de radiación UV, baja disponibilidad de
nutrientes (Bidigare et al., 1993), stress oxidativo, pH, alta salinidad o drásticos cambios en la
temperatura (Britton et al., 1998; Ip y Chen, 2005 en Leya et al., 2009), sin embargo el
entendimiento de la síntesis de carotenoides secundarios permanece aun parcial (Lemoine y
Schoefs, 2010). Una característica común entre los cistos y las células de resistencia obligatorias
es la presencia de carotenos, pero se diferencian en que los cistos son estadios donde las células
se encuentran fotosintéticamente activas, a diferencia de los estadios de resistencia obligatorios o
también conocidos como zigosporas que son parte del ciclo de reproducción sexual de las
microalgas. Los estadios de resistencia de las microalgas son parte fundamental en el ciclo de
vida las microalgas de nieve, ya que estos aseguran la supervivencia de las microalgas en estos
ambientes extremos (Sigee, 2005).
La formación de estos cistos está influenciada por las condiciones ambientales como se
menciona anteriormente, por tanto la dominancia de estos estadios, en las muestras altitudinales
de marzo del 2007, puede ser condicionadas por los cambios ambientales que se producen al
termino de la estación estival, como lo son la disminución de la temperatura, fotoperiodo y días
nublados, provocando una señal ambiental que marca el desarrollo de los estadios de resistencia y
la reproducción sexual, como una manera de preservar la especie a lo largo del tiempo.
Según lo expuesto anteriormente se sugiere que la presencia de diferentes morfotipos con
biovolumenes dominantes sobre el glaciar podría estar relacionada con las épocas de colección de
las muestras. Además se plantea que la presencia de estadios vegetativos representa periodos de
estabilidad ambiental (mediados de la estación de derretimiento), lo cual puede apoyarse en la
leve fluctuación de la temperatura que se registró en los días previos a la colección de las
muestras altitudinales de enero del 2006 (Fig. 20 a) y que apoyan la idea de un lapso de tiempo
55
sin grandes cambios ambientales y que se correlaciona con la mayor presencia de estadios
vegetativos. Esta idea es corroborada por los cultivos desarrollados, los cuales han sido
mantenidos con las condiciones ambientales estables, y como resultado solo existe presencia de
estadios vegetativos. En efecto, cuando las condiciones son estables, los microorganismos se
reproducen asexualmente como una manera de colonizar rápidamente los ambientes (Sigee,
2005). A su vez se propone que los estadios de resistencia podrían indicar un periodo de
inestabilidad ambiental, vale decir, un periodo con fluctuaciones de temperatura, precipitaciones
tanto sólidas como líquidas o días de gran nubosidad, o alto índice UV. Una de las variables
observadas que muestra variabilidad ambiental es la temperatura, la que fluctúa con mayor
intensidad en marzo del 2007 en comparación a enero del 2006 (Fig. 20).
Para dilucidar esta idea de los efectos ambientales sobre los diferentes estadios
microalgales es necesario llevar a cabo muestreos semanales y estudios experimentales, tanto en
terreno como en laboratorio, para poder entender qué factores ambientales inducen el desarrollo
de estadios de resistencia o favorecen la presencia de estadios vegetativos y además estudios
fisiológicos de la síntesis de pigmentos secundarios.
Fig. 21. Variación de la temperatura promedio diaria en los días previos a la colección de
muestras altitudinales, los datos fueron obtenidos de la estación meteorológica automática
02468
10121416
Tem
pera
tura
ºC
Fecha
02468
10121416
Tem
pera
tura
ºC
Fecha
(a) (b)
56
ubicada en el volcán Mocho-Choshuenco, localizada a 1995 m s.n.m. (a) Muestras altitudinales enero 2006. (b) Muestras altitudinales marzo 2007.
4.5. CULTIVOS
Uno de los objetivos iniciales de esta investigación era realizar una caracterización
taxonómica de las microalgas de nieve que habitan el glaciar del volcán Mocho-Choshuenco.
Esta finalmente no pudo ser realizada a cabalidad por la dificultad en la identificación de estos
microorganismos reportada en estudios previos por Hoham (1975), Hoham y Mullet (1977),
Hoham et al., (1979), Ling y Seppelt (1993, 1998). Esta dificultad se basa en la presencia de
lípidos en el interior de la celula, los diferentes estadios en la ontogenia de las microalgas y en la
similitud de estadios entre diferentes especies.
La presencia de lípidos que enmascaran el interior celular, son producto de un
mecanismo de adaptación en este tipo de microalgas para soportar la formación de cristales de
hielos, que se producen debido a los constantes ciclos de congelamiento y descongelamiento que
sufren sobre el glaciar (Hoham 1975a, b; Morgan-Kiss et al., 2006), que a su vez imposibilitan
las observación de los principales caracteres diagnósticos para las microalgas. De acuerdo a lo
expuesto anteriormente se sugiere que ésta complejidad está dada por su carácter de organismo
extremófilo. Otro ejemplo adaptativo es el aumento de los niveles de ácidos grasos insaturados en
las membranas celulares.
Lípidos:
Los ciclos de vida complejos que presentan estas microalgas están relacionados con la
presencia de diferentes estadios durante su ontogenia. Esto ha provocado la incorrecta
identificación de estos microorganismos, debido a que los variados estadios fueron considerados
Estadios:
57
como distintas especies de microalgas, basados sobre la estructura de su pared celular, diferencias
en la forma y pigmentación, en ausencia de la observación de ciclos de vida completos (Hoham y
Mullet, 1977; Hoham et al., 1979; Komárek y Nedbalová, 2007).
Esta problemática es confirmada por el Dr. Hoham (Universidad de Colgate, Estados
Unidos, comunicación personal; Hoham, 1975a; Hoham y Mullet, 1979; Hoham et al., 1979;
Hoham et al., 1993; Hoham et al., 2006; Hoham et al., 2007), él cual señala que uno de los
problemas más grandes es la no diferenciación entre estadios de una célula con los estadios de
otras células. Igualmente el Dr. Hoham señala que las microalgas con morfotipos esféricos son
difíciles de identificar porque estas células pueden estar en un proceso de transición que las
conduce a células más grandes que llegan a ser pigmentadas rojas o naranjas (comunicación
personal Dr. Ronald Hoham). Las apreciaciones hechas por el Dr. Hoham coinciden con lo
expuesto por el Dr. Othani (Universidad de Shimane, Japón), quien también afirma la
imposibilidad de realizar la identificación de las microalgas de nieve y que es necesario observar
el ciclo de vida para llevar a cabo la identificación (comunicación personal Dr. Shuji Ohtani,
Universidad de Shimane, Japón). Lo anterior apoya lo propuesto por Ling y Seppelt (1998),
quienes indican que una combinación de detallados estudios de campo y de cultivos es esencial
para la identificación de las algas de nieve y para desentrañar sus complejos ciclos de vida,
indicando que su identificación es mucho más compleja que la de microalgas de lagos o de
ambientes marinos. Cabe entonces preguntarse, ¿será posible realmente la identificación de
microalgas basada en su morfología? o ¿solo necesitamos identificar uno o dos estadios
característicos de una especie, usando como bioindicadores por ende estadios de una especie y no
la especie en sí?
58
La problemática expuesta en la identificación de las microalgas de nieve a través de
microscopia (baja resolución), fue lo que finalmente condujo a que la identificación de las
microalgas del glaciar Mocho-Choshuenco fuera en base a las características morfométricas de
las microalgas y llevó a definir diferentes morfotipos, lo cual a su vez, sugiere la necesidad
imperiosa de incorporar otras metodologías como el uso de herramientas moleculares para su
identificación, precisar el concepto taxonómico es clave para el uso de las microalgas como
bioindicador ambiental.
En el contexto de estas dificultades en la identificación de las microalgas de nieve, se
sugiere la necesidad de estudiar diferentes parámetros que estén relacionados con las microalgas
para su correcta identificación. Por ejemplo se podrían utilizar los niveles de radiación,
fotoperiodo y pH, entre otros, ya que la combinación de estos parámetros podría crear ambientes
específicos que permitan el desarrollo y éxito de estos microorganismos en este ambiente
extremo. En adición se sugiere el desarrollo de estudios moleculares que permitan suplir las
carencias de la identificación de las especies mediante la taxonomía clásica, con el fin de
aumentar el limitado conocimiento taxonómico y contestar una de las preguntas básicas en
ecología ¿Quiénes están ahí?.
59
Capítulo 5
CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
• El perfil estacional del año 2006 para la abundancia y biovolumen demuestran que el
periodo de crecimiento de las microalgas de nieve ocurre en la estación de verano,
mostrando resolución estacional.
• Los perfiles de abundancia, tanto para enero del 2006 y marzo del 2007, muestran una
disminución a medida que se asciende sobre el glaciar.
• La disminución de la abundancia y biovolumen al pasar de la zona de ablación a la de
acumulación concuerda con estudios previos.
• Las diferencias que se observan al comparar los morfotipos dominantes, abundancia y
biovolumen relativos, en los muestreos altitudinales en enero de 2006 y marzo de 2007,
sugieren que serían debidas a las diferencias de la época de colección, como respuesta a
factores abióticos que van cambiando de acuerdo a las épocas de muestreo, por lo que los
morfotipos dominantes podrían ser indicadores de periodos de inestabilidad y/o
estabilidad ambiental.
• Se encontró que el morfotipo LG solamente se registró en la zona de ablación del glaciar.
Esto nos lleva a plantear que el morfotipo LG podría corresponder a una especie
especialista de hielo.
• Los morfotipos dominantes que servirían para indicar inestabilidad o estabilidad
medioambiental podrían estar estrechamente relacionados con la temperatura, nubosidad,
precipitación, radiación solar, irradiancia, UV y nutrientes, entre otros. Para discernir cuál
de estas variables podría explicar la reproducción sexual y la formación de estadios de
60
resistencia se necesitaría llevar a cabo muestreos semanales y estudios experimentales
tanto en terreno como en laboratorio.
• El desarrollo de los cultivos ha permitido la aislación e identificación de dos géneros
comunes de microalgas, como lo son Chloromonas y Chlamydomonas, lo que en un
futuro permitirá la realización de estudios moleculares y el desarrollo de estudios
experimentales para realizar modelos empíricos que permitan conocer sus niveles óptimos
de luz, fotoperiodo, pH y temperatura óptima entre otros, proveyendo una nueva fuente de
información que en conjunto con estudios in situ nos permita entender como estos
factores interactúan con el crecimiento y ciclo de vida de estas microalgas y comprobar su
posible utilización como paleobioindicadores de las condiciones climáticas y ambientales.
• Para usar estos ensambles microalgales como bioindicadores es de suma importancia la
realización de muestreos sistemáticos y sus relaciones con los parámetros
medioambientales mencionados para dilucidar y precisar gradientes espaciales sobre los
cuales se distribuye el ensamble. Estos estudios deben ser realizados a microescala para
establecer como estos microorganismos responden a los gradiente microambientales.
61
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