Post on 13-Apr-2017
Efecte de les nanopartícules cisplatí
i doxorrubicina en cèl·lules tumoralsAida Giol Castro, Ignasi Solé Clua, Manel Queral Martínez
Tutors: Julia Lorenzo i Javier García
IBB: Departament d’enginyeria de proteïnes i proteòmica
Programa Argó 2016
1. Introducció 2. Cèl·lules Hela 3. Preparació de portaobjectes per comprovar la
internalització de NPs en cèl·lules Hela 4. Observació de la incorporació de les NPs en microscopi
confocal 5. Proves de citotoxicitat en NPs amb cisplatí i/o doxorrubicina
◦ 5.1 Gràfiques IC50
Sumari
Càncer: Conjunt de patologies relacionades amb la divisió descontrolada de cèl·lules d’un teixit.
Tumor: Massa amorfa de cèl·lules , símptoma del càncer.◦ Benigne◦ Maligne (Metàstasi)
1. Introducció
Una nanopartícula càpsula amb fàrmacs a l’interior d’un tamany que oscil·la entre 80-120nm de diàmetre.
Ddiàmetre més gran que les partícules de fàrmac + elevadaelectronegativitat Aconsegueix superar les defenses i els filtres delcos
NPs contra el càncer
Venes i capil·lars defectuosos en un tumors Coàguls, major concentració de NPs en cèl·lules cancerígenes (menys danys a les cèl·lules no tumorals)
Cisplatí i doxorrubicina fàrmacs per combatre les cèl·lules tumorals.
Objectiu Veure si encapsulant aquests fàrmacs, s’augmenta l’eficiència en vers els fàrmacs lliures.
Pt
O
O
NH3Cl
NH3Cl
OOH
O
O
O
HO
DoxorrubicinaCisplatí
2. Cèl·lules Hela Cèl·lules de cultiu cel·lular utilitzades en investigació científica
Pertanyen a Henrietta Lacks (HeLa) pacient de càncer cèrvix-uterí
Línia de cèl·lules tumorals molt duradora i prolífera
3. Preparació de portaobjectes per comprovar la incorporació de NPs en
cèl·lules Hela
Nivell 2 de seguretat biològica
Bany tèrmic 37ºC Netejar en PBS i tripsinitzar Centrifugar a 1400 rpm
Preparar les càpsules de Petri
amb cobreobjectes
1,5 ml dissolució / càpsula
Tota la nit incubadora 20 μl NPs doxo+cis 2 plaquetes 1 plaqueta control
2 h incubadora
Aspirar medi Posem 1ml PBS, agitem i
aspirem
Posem 500 μl metanol/càpsula fixar les cèl·lules al cobreobjectes
15min. congeladorTraiem metanol
Posem 0,5ml PBS Dissolució 1:500 Dapi+PBS (1,5 ml
total)
Aspirem PBS i afegim 0,5ml
dissolució Dapi+PBS
15min. agitador Traiem Dapi+PBS, netejem amb PBS i ho aspirem
Posar els cobreobjectes del fons de les plaquetes en un portaobjectes
MICROSCOPI DE FLUORESCÈNCIA
CPPs Cis Doxo 6,58 μg/ml
4. Observació de la incorporació de les NPs en microscopi confocal
• NPs cis (50 μg/ml)
•NPs cis + doxo (50μg/ml)
(10 μg/ml)
3h incubadora
Raigs ultraviolats esterilitzar
Posar el marcador Hoescht
MICROSCOPI CONFOCAL
CPPs Cis Doxo 10 μg/ml
NPs Cis Doxo 50 μg/ml
CNT
CNT
5. Proves de citotoxicitat en NPs de doxorrubicina i cisplatí
Cèl·lules sobrants del dia anterior
Netejar en PBS i tripsinitzar Centrifugar a
1400 rpmPreparem una dissolució 1:13
Pipeta multicanal sembrem
les cèl·lules
96 pouets (200μl)60medi+cèl·lules+fàrmac
36 medi
CisplatíCNT150 μg/ml24 h
Doxorrubicina0,5 μg/ml 30 μg/ml
Doxorrubicina0,5 μg/ml 30 μg/ml
NPs Cisplatí125 μg/ml 250 μg/ml
NPs Cisplatí + Doxorrubicina0,5 μg/ml 125 μg/ml
Neuroblastoma cells
0 1 11 27 54 108
188
269
538
0
20
40
60
80
100
120
DOXO-CPPs Concentration (Pt M)
Cell
viab
ility
(%)
Neuroblastoma cells
0 1 11 27 54 108
188
269
538
0
20
40
60
80
100
120
PtIV Concentration (Pt M)
Cel
l via
bilit
y (%
)
IC50 > 500 µM IC50 ~ 7 µM Pt- 175 ng/ml Doxo
5.1 Gràfiques IC50
Gràcies per la vostra atenció