EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES

INFECCIOSAS EN LA ANTIGÜEDAD. EL CASO DE LA

TUBERCULOSIS

Alberto J. Martín Rodríguez

• Estudio de enfermedades que afectaron a las sociedades del pasado.– Caracterizar el agente etiológico de las

mismas– Implicaciones históricas y culturales que

provocaron

• Ejemplos típicos:– Peste de Atenas: Fin de

la hegemonía Ateniense 430-426 a.C.

– Peste de Justiniano: Fin del renacimiento del Imperio Romano 542 d.C.

– Peste Negra: Fin de la Edad Media Siglo XIV

– Peste Blanca, Tisis o Tuberculosis: Romanticismo

• Hasta la década de los 80 del S.XX– Fuentes escritas– Crónicas– Tradición oral

• Desarrollo de la “Reacción en Cadena de la Polimerasa” o PCR (Mullis, 1987)

• Descubrimiento de ADN preservado en restos biológicos antiguos:– 1980 Momia china– 1984 Extracción de ADN de Quagga– 1984 Extracción de ADN de una momia egipcia

(Pääbo)

• La genética molecular se convierte en herramienta indispensable para arrojar luz sobre la caracterización e identificación de los agentes etiológicos de las enfermedades del pasado.

• Escasez de restos biológicos– Tejidos blandos

• Momificados• Calcificados

– Huesos

¿Qué enfermedades podemos buscar con las herramientas que nos ofrece la genética molecular?

• Infecciones víricas– Afectan a los tejidos blandos– No dejan rastros genéticos en el hueso

• Infecciones bacterianas– Sólo deja rastro genético cuando nos

encontramos ante una infección grave con presencia de septicemia

¿Qué tipo de resto es el adecuado?

• Características– Debe estar muy

vascularizado– Debe estar

suficientemente protegido de los agentes ambientales y contaminantes

– Sólo un candidato – “el diente”

La metodología

• Primer trabajo (Drancourt et al. 1998) con dientes “no edentados”

• Trabajos posteriores (Raoult et al., 2000; Gilbert et al., 2004 y Papagrigorakis et al., 2005) usan dientes “maduros”

La metodología

• Limpieza y descontaminación de la superficie dental– Lavado con solución de lejía– Lavado con solución ácida– Irradiación con rayos UV

• Extracción de la pulpa de la cavidad dental

• Extracción y purificación de ADN

La metodología

• Amplificación mediante técnicas de PCR– Uso de primers específicos para cada agente

infecciosoOrganismo Gen Primers Tª de annealing

Y. pestis pla YP12D 5’—CAGCAGGATATCAGGAAACA—3’ 52 148 bp YP11R 5’—GCAAGTCCAATATATGGCATAG—

3’

R. prowazekii ompB Rp1 5’—CTCCTCTTACACTTGGTG—3’ 53

190 bp Rp2 5’—ACCTGCTTGTAAATTTAAAG—3’

B. anthracis PA BAPA7 5’—ATCACCAGAGGCAAGACACCC—3’ 53

210 bp BAPA6 5’—ACCAATATCAAAGAACGACGC—3’

M. tuberculosis mtp40 MT1 5’—CTGGTCGAATTCGGTGGAGT—3’ 66

152 bp MT2 5’—ATGGTCTCCGACACGTTCGAC—3’

B. hensellae gltA BQ78 5’—GGGGACACCAGCTCATGGTGG—3’ 51

380 bp BQ11 5’—AATGCAAAAAGAACAGTAAACA—3’

S. enterica serovar Typhi osmC & clyA ST2 5’—CGCTTTTCGAGGTTCCTGACG—3’ 58

322 bp ST4 5’—CTTGATAAGGTGGAGGCGGGCTTC—3’

S. enterica serovar Typhi narG NARG1 5’—GTTCACTTCCTGCCATGAGGAGCG—3’ 58

360 bp NARG2 5’—TCAACCCATGGGGTGAACTG—3’

La metodología

• Análisis y obtención de secuencias

Validación

• Para que podamos tomar por ciertos nuestros resultados debemos:– Usar controles de extracción para evitar

contaminación– Trabajar en un laboratorio donde no existan

cepas de patógenos que puedan contaminar la muestra

– Hacer las pruebas en, al menos, dos laboratorios diferentes separados espacial y temporalmente

Resultados

• Drancourt y Raoult (1998,2000 y 2004)– Agente etiológico de la

peste negra es Yersinia pestis

– Una variedad a la que denominan: Yersinia pestis biovar Medievalis

– Muy similar a los biovares Antiqua (causante de la peste de Justiniano) y Orientalis (actual)

Resultados

• Papagrigorakis et al., 2005– Usando un protocolo

similar a Drancourt buscan un posible agente para la Fiebre de Atenas

– Ensaya una batería de marcadores de diferentes agentes infecciosos

• Ántrax, Peste, Cólera, Dengue, Ébola, Gripe, Meningitis, Viruela, Fiebre Tifoidea, Tifus, etc…

– Aparecen marcadores de Salmonella enterica serovar Typhi

¿Y la Tuberculosis?

• Características especiales– Pocos casos afectan al hueso (< 10%)– La huella de la enfermedad es fácilmente

reconocible

¿Y la Tuberculosis?

– Degrada el hueso• Expuesta a degradación

– Necesidades de hacer una aproximación diferente

¿Y la Tuberculosis?

• Buscar un marcador genético exclusivo de la bacteria.

• Que sea de pequeño tamaño• Esté presente con múltiples copias por

cromosoma.• Candidato: inserción multicopia IS6110

¿Y la Tuberculosis?

¿Y la Tuberculosis?

• Salo et al. 1994. Identification of Mycobacterium tuberculosis DNA in a pre-Columbian Peruvian Mummy.

• Taylor et al. 1996. DNA from Mycobacterium tuberculosis identified in mediaeval human skeletal remains using polymerase chain reaction

• Baron et al. 1996. Mycobacterium tuberculosis complex DNA in ancient human bones

• Nerlich et al. 1997. Molecular evidence for tuberculosis in an ancient Egyptian mummy.

¿Y la Tuberculosis?

¿Y la tuberculosis?

• Apenas hay diferencias entre las cepas actuales del bacilo y las encontradas en restos antiguos.

¿Y la tuberculosis?

• Confirmada la infección con Mycobacterium bovis en restos humanos de la Edad de Hierro (2000 años b.p.)

• Confirmada la infección de Mycobacterium tuberculosis en bisonte norteamericano hace 17.000 años.

Gracias