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ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y
ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON
DIARREA PERSISTENTE
MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
[2000]
ISABEL ARIAS BUSTAMANTEOMAR CACERES REY
EDUARDO SALAZAR LINDOMARIA LUZ ZAMUDIO
ROJAS JOSE CARLOS HUGUET TAPIA
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº34
ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON DIARREA PERSISTENTE
ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINSO AÑOS
CON DIARREA PERSISTENTE
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TITULO DE LA INVESTIGACION
CODIGO OGITT: 2-01-05-03-053
ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN
MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON DIARREA PERSISTENTE
NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES
ISABEL ARIAS BUSTAMANTE
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS
4719920 – 117, Capac Yupanqui 1400, Jesús María, iarias@ins.gob.pe
OMAR CACERES REYINSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS
4719920 – 129, Capac Yupanqui 1400, Jesús María.
EDUARDO SALAZAR LINDOHOSPITAL NACIONAL CAYETANO HEREDIA855 2049, Honorio Delgado . San Martín de Porres
MARIA LUZ ZAMUDIO ROJAS INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS
4719920 – 117, Capac Yupanqui 1400, Jesús María.
JOSE CARLOS HUGUET TAPIA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS
4719920 – 129, Capac Yupanqui 1400, Jesús María.
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RESUMEN
La presencia y el rol de Escherichia coli Enteropatógena y Enteroagregativa, en
diarrea persistente es desconocido en el Perú. A pesar que en el ámbito mundial
se ha detectado alguna relación de esta bacteria con cuadros de diarrea, sobre
todo persistente; en el Perú, éste patógeno no es considerado por muchos
laboratorios como agente infeccioso importante, desconociéndose de ésta
manera la prevalencia de éste agente en la población infantil.
El presente estudio tiene como objetivo describir la frecuencia de E. coli
Enteropatógena (EPEC) y Enteroagregativa (EAEC), en pacientes menores de
cinco años con diarrea persistente, tipificando los aislamientos de EPEC y EAEC
aislados de los diversos grupos de diarreas y establecer una correlación con la
clínica.
Se establecieron dos grupos de estudio, uno en el cual presentaron
características de diarrea persistente y el otro grupo con diarrea aguda, con la
finalidad de comparar frecuencias de E.coli. La metodología empleada en el
estudio fue el cultivo microbiológico, serotipificación y análisis molecular mediante
Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ).
Los resultados obtenidos en el presente estudio nos indica la presencia de
factores de virulencia ( Eagg ) en un 10.67 % para la categoría de E. coli
diarreogénica Enteroagregativa, en una población con diarrea persistente. Se
obtuvo el 13.40 % para los factores ( Eagg ) de E. coli Enteroagregativa en
diarrea aguda. También se encontraron los factores de virulencia ( eae, bfp ) de la
categoría de E. coli Enteropatógena en el 6.79 % y 4.12 %, dentro de la población
con diarrea persistente y aguda respectivamente.
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INTRODUCCION
La diarrea persistente es considerada en la actualidad como un problema en salud
publica, afectando niños menores de cinco años y principalmente lactantes(1). Se
estima que anualmente, alrededor de unos 2,2 millones de niños mueren por
deshidratación debido a la diarrea persistente que con frecuencia se agrava
debido a la desnutrición (1y 2). En el Perú, se considera a la diarrea en todas sus
formas como un problema grave, siendo los cuadros persistentes muy comunes
asociados a diferentes factores, tales como fisiológicos y nutricionales del
paciente, antecedentes de diarreas continuas y el factor infeccioso (1).
La presencia específica de organismos patógenos en diarrea persistente ha sido
demostrada en varias oportunidades, postulándose de esta manera al factor
infeccioso como un importante condicionante dentro del cuadro de diarrea
persistente en población infantil (9, 11, 12).
En la actualidad se reconoce que E. coli Enteropatógena y E. coli
Enteroagregativa, pueden estar involucradas y ser un importante factor en diarrea
persistente en población infantil (9,11,12). Numerosos estudios de casos y
controles han demostrado una mayor frecuencia tanto de E. coli Enteropatógena
como Enteroagregativa en pacientes con diarrea persistente que otros cuadros de
diarrea (1, 9, 10). Sin embargo, en el Perú la presencia de E. coli en coprocultivos
es mal interpretada ya que se piensa que es una bacteria de flora normal y se
ignora el verdadero potencial patogénico. De esta manera, queda un vacío de
información acerca de la frecuencia con que E. coli Enteropatógena es asociada a
cuadros de diarrea persistente, produciéndose además que la etiología real de una
diarrea puede ser sesgada.
En la actualidad las técnicas rutinarias realizadas en el Perú para identificación de
E. coli no pueden distinguir con facilidad una bacteria patógena o no patógena.
Adicionalmente, se ha observado que en los Centros de Salud existe una
confusión en la definición de categoría patogénica de E. coli. A pesar que en las
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últimas convenciones internacionales en microbiología se reconoce y se define a
E. coli enteropatógena como aquella bacteria que posee dos genes específicos: el
de la intimina (AE) y el de la fimbria (bfp), dejando a la serotipificación como un
análisis referencial y no concluyente (13); en muchos centros de Salud se cree
aun que el serotipo justifica la patogenicidad de esta bacteria. En consecuencia se
reportan en muchos casos E. coli enteropatogena sólo teniendo en cuenta el
serotipo y sin haber analizado la real patogenicidad de esta bacteria.
Como resultado final de esta confusión, el tratamiento de la diarrea se basa con
frecuencia sólo en la experiencia clínica, sin detectar al agente etiológico
responsable del cuadro diarreico, teniéndose una información sesgada del
problema. Se encuentran además escasos registros detallados acerca del estudio
de E. coli enteropatógena, quedando un vacío de información acerca de la
epidemiología de esta bacteria en el Perú.
La E. coli enteroagregativa (EAEC) fue descrita por Cravioto y col, mediante el
análisis de biopsias en microscopía electrónica (14). En estos análisis se observó
un fenómeno de adhesión de las bacterias al epitelio intestinal con un patrón
característico de agregación, formando además una película o Biofilm sobre el
epitelio. Este mecanismo de adherencia más la presencia de una citotoxina
característica de la bacteria produce un cuadro de diarrea (15).
La identificación de esta bacteria se realiza principalmente por el cultivo celular del
aislamiento, tratando de repetir el fenómeno producido in vivo (16). Sin embargo la
metodología resulta un poco complicada de realizar por todos los laboratorios así
que en la actualidad se emplean técnicas de amplificación molecular dirigidas a
los genes característicos de esta bacteria, principalmente el gene de la adherencia
y de la citotoxina (17).
A pesar de las nuevas metodologías, el problema de identificación de EAEC
persiste y no esta resuelto, ya que laboratorios locales no tienen capacidad para
desarrollar técnicas moleculares o de cultivo celular. Una alternativa para el
diagnostico primario de esta bacteria es la correlación clínica, epidemiológica y la
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confirmación con el test de formación de Biofilm en tubo. Este método fue descrito
por Albert (18).
Objetivo General.-
Describir la frecuencia de Escherichia coli enteropatógena (EPEC ) y E. coli
enteroagregativa (EAEC), en diarrea persistente, de las cepas aisladas de
muestras de niños menores de 5 años.
Objetivos específicos.-
- Encontrar frecuencias de EPEC y EAEC en pacientes con diarrea persistente
mediante PCR y PCR Multiplex.
-Tipificar los aislamientos de EPEC y EAEC aislados de los diversos grupos de
diarreas por serologia.
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MATERIAL Y METODOS
Debido a que no se tiene mayor información sobre frecuencias de EPEC o EAEC
en el Perú, se realizó un estudio de tipo descriptivo.
El universo considerado en la población fueron niños menores de 5 años que
asistieron al Hospital Cayetano Heredia de la DISA Lima Norte y Hospital Sergio
Bernales - Collique. Se establecieron dos grupos de estudio, el primero que estuvo
conformado por pacientes (niños igual o menores de cinco años) que presentaron
diarrea persistente, teniendo en cuenta los criterios de Inclusión (Ver Anexo)
Adicionalmente se captaron pacientes con diarrea aguda, tomando en cuenta
también algunos criterios de inclusión (Ver Anexo).
De esta manera se formaron dos grupos: el grupo de estudio (con diarrea
persistente) y el grupo de comparación o contraste (con diarrea aguda ).
Se evaluaron 103 muestras de pacientes que cumplieron la definición de diarrea
persistente. El grupo de comparación conformado por 97 muestras de pacientes
que cumplieron la definición de diarrea aguda.
Obtención de muestra
La toma de muestra se realizó mediante hisopado rectal, el hisopo fue colocado en
medio de transporte Cary blair. La muestra fue tomada por el encargado del
servicio y remitida al Laboratorio de Enteropatógenos – INS, para ser procesada
de inmediato.
Envío de muestras al INS
Las muestras en Cary Blair, fueron enviadas al INS acompañadas de la ficha
clínico epidemiológica del paciente a excepción del Hospital Sergio Bernales que
remitió el agente aislado de la muestra, el mismo que fue remitido en medio de
mantenimiento de Tripticase soy agar, con la ficha respectiva.
Procesamiento de Muestras:
Se procedió al aislamiento e identificación del agente, orientándose a buscar
principalmente E. coli enteropatogena clásica (EPEC) y E. coli enteroagregativa
(EAEC); utilizando medios selectivos y diferenciales.
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Para E. coli enteropatógena clásica se realizó serología con antisueros
polivalentes y monovalentes para serotipos asociados a EPEC; mientras que para
EAEC se realizó la prueba de formación de biofilm, utilizando caldo Muller Hinton.
Detección de factores de virulencia de EPEC o EAEC
Los aislamiento de E. coli encontrados en cada grupo fueron procesados mediante
Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ), para lo cual se procedió a realizar
los siguientes pasos:
Aislamiento de ADN.- La extracción de ADN, se realizó mediante CHELEX 100 al
5 %, tomando una colonia de un cultivo de 24 horas, se suspendió en 200 uL.,de
solución CHELEX , se agitó en vortex (10 segundos) y luego se incubó en baño
maría a 60 ºC por 30 minutos, se agitó en vortex (10 segundos ) y se hirvió en
baño maría por 10 minutos, agitamos nuevamente en vortex (10 seg) y
centrifugamos a 12,000 rpm por 3 minutos, el sobrenadante fue sacado a otro tubo
para realizar el PCR. El sobrenadante fue cuantificado espectrofotometría a 0.6 ug
de ADN en un promedio aproximado de 0.3 ng/mL por cada muestra.
Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ).-
- Preparación del Master Mix.- Para ello utilizamos los siguientes reactivos,
cuya concentración final de la reacción fue de 1x para el Buffer de Reacción,
1mM de Cloruro de Magnesio, 0.8 uM para cada uno de los Primer EAgg
EC F, Primer EAgg EC R, Primer Euer P1, Primer Euer P2, Primer bfp F,
Primer bfp R, 100 uM para la mezcla de nucleótidos, 2 uL de ADN y 1 U de
Taq Gold ADN polimerasa, para 25 uL de volumen final de reacción.
- El PCR fue realizado en un termociclador AMPLITRON II, donde los ciclos
de amplificación fueron: 1 ciclo de denaturación inicial a 95 ºC x 10 minutos;
30 ciclos de 95 ºC x 40 segundos; 53 ºC x 1 minuto y 72 ºC x 1 minuto y
una extensión final de 72 ºC x 10 minutos.
Ocho microlitros fueron colocados en un gel de agarosa al 2 % en buffer TAE 1X,
junto con 5 microlitros de un marcador de peso molecular. El gel fue sometido a
electroforesis horizontal a 170 V por una hora, posteriormente fue teñido con una
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solución de 0,5 ug/mL de bromuro de etidio por 15 minutos, los productos fueron
visualizados en un transiluminador de luz UV (UVP) y luego fueron fotografiados
usando un documentador de geles de la marca UVP. (Ver Foto)
PCR-MULTIPLEX PARA E. coli ENTEROPATOGENA (EPEC)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
RESULTADOS
M : marcador de Peso Molecular 100pb1 : E.coli no EPEC2 : EPEC eae +, bfp +3 : E.coli no EPEC4 : E.coli no EPEC5 : E.coli no EPEC6 : E.coli no EPEC7 : E.coli no EPEC8 : E.coli no EPEC9 : E.coli no EPEC10 : EPEC eae +11 : E.coli no EPEC12 : E.coli no EPEC13 : E.coli no EPEC14 : E.coli no EPEC15 : E.coli no EPEC16 : Control Positivo EPEC eae +, bfp +17 : Control Positivo EPEC bfp +18 : Control Negativo Klebsiella sp19 : Control de sistema
320pbgen bfp
920pbgen eae
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PCR PARA E. coli ENTEROAGREGATIVA (EAEC)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
A
B
RESULTADOSAM : marcador de Peso Molecular 100pb1 : E.coli no EAEC2 : E.coli no EAEC3 : EAEC eagg +4 : E.coli no EAEC5 : E.coli no EAEC6 : EAEC eagg +7 : EAEC eagg +8 : E.coli no EAEC9 : E.coli no EAEC10 : E. coli no EAEC11 : EAEC eagg +12 : EAEC eagg +13 : E. coli no EAEC14 : E. coli no EAECBM : marcador de Peso Molecular 100pb1 : E.coli no EAEC2 : EAEC eagg +3 : EAEC eagg +4 : E. coli no EAEC5 : E. coli no EAEC6 : E. coli no EAEC7 : EAEC eagg +8 : E. coli no EAEC9 : E. coli no EAEC10 : E. coli no EAEC11 : E. coli no EAEC12 : E. coli no EAEC13 : E. coli no EAEC14 : E. coli no EAEC15 : E. coli no EAEC16 : E. coli no EAEC17 : E. coli no EAEC18 : Control Positivo EAEC eagg +19 : Control de sistema
630pbgen eagg
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en el presente estudio nos indica la presencia de
factores de virulencia ( Eagg ) en un 10.67 % para la categoría de E. coli
Enteroagregativa, de una población de 103 muestras procedentes de diarrea
persistente. De 97 muestras con diarrea aguda se obtuvo el 13.40 % para los
factores ( Eagg ) de E. coli Enteroagregativa. También se encontraron los factores
de virulencia (eae, bfp) correspondiente a la categoría de E. coli Enteropatógena
en el 6.79 % y 4.12 %, para ambas poblaciones respectivamente.
Dentro de la población con diarrea persistente encontramos otros agentes
patógenos como Campylobacter (2.91 %), Aeromonas (1.94 %), Salmonella (0.97
%) y en un 7.76 % no se encontraron E. coli. En la población con diarrea aguda
también se encontraron agentes patógenos como Campylobacter (5.15 %),
Shigella (2.061 %) de igual modo hubieron muestras en las que no se aisló E. coli
(10.30 %).
Con respecto a los serotipos encontrados en la población con diarrea persistente
obtuvimos el 9.70 % y 12.37 % para la población con diarrea aguda.
Lo obtenido en el estudio muestran valores relativamente bajos para las
categorías de E. coli, motivo del estudio. Si comparamos ambos grupos
encontramos que los resultados obtenidos son similares.
Estudios realizados a nivel internacional revelan una frecuencia mayor de
aislamientos de E. coli Enteropatogena y E. coli Enteroagregativa en diarrea
persistente en comparación con otros cuadros clínicos de diarrea (9, 11, 12, 13)
Los datos obtenidos servirán de base para establecer estudios que puedan
identificar otras Categorías de E. coli, dentro de una población infantil a mediano y
largo plazo y que puedan realizarse en el ámbito nacional y conocer la situación
epidemiología de E. coli enteropatógena en el Perú.
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ANEXOS
Criterios de Inclusión
Pacientes con diarrea persistente
Diarrea persistente de 14 días o más al tiempo de la primera evaluación, sin
sangre visible en las deposiciones, durante las 24 horas posteriores a la admisión
del Hospital).
Pacientes con diarrea aguda
Diarrea aguda que dura entre 3 y 7 días del tiempo de la primera evaluación
No presentar sangre visible en cualquiera de las deposiciones pasadas dentro
durante las 24 horas posteriores a la admisión al Hospital u observada por la
persona que cuida al paciente, dentro de la 72 horas previas a la admisión
No presentar sepsis clínica o cualquier otra condición clínica severa presente a la
admisión o desarrollada dentro de las primeras 24 horas posteriores a la admisión,
Ausente episodio de diarrea la semana previa al episodio actual
Criterios de exclusión
Pacientes con diarrea persistente
Episodio actual que dura más de seis semanas al momento de la primera
evaluación.
Antibióticos usados a dosis terapéuticas las últimas 72 horas
Pacientes con diarrea aguda
Antibióticos usados a dosis terapéuticas las últimas 72 horas
Paciente con diarrea disentérica o sanguinolenta.