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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO
UNIDAD DE CIENCIAS DE DESARROLLO REGIONAL
DOCTORADO EN CIENCIAS AMBIENTALES
Seminario de Tesis I
Agentes entomopatógenos para la regulación de
poblaciones de Aedes aegypti transmisor de
chikungunya, dengue y fiebre Zika
Presenta:
MSP Abel Jiménez Alejo
Acapulco, Guerrero agosto de 2015
Tema de tesis
Interacción patógeno-hospedero.
Estado del arte
Palabras clave: entomopathogenic fungi, Aedes aegypti, nematodos, Bacillus
thuringiensis.
De las enfermedades infecciosas olvidadas un grupo importante son las
transmitidas por vector, las cuales están relacionadas fuertemente con la pobreza
y son altamente vulnerables a los cambios ambientales (Dujardin et al; 2010). El
mosquito Aedes aegypti es transmisor del virus de dengue, chikungunya (OMS,
2015) y virus zika (Derraik et al; 2015). El dengue es una enfermedad viral
transmitida por artrópodos, se estima que hay 390 millones de infecciones de
dengue por año, de los cuales 96 millones se manifiestan aparentemente (Bhatt
et al; 2013). La fiebre chikungunya es una enfermedad parecida al dengue que se
acentúa en las articulaciones las complicaciones graves no son frecuentes, sin
embargo en adultos mayores y personas con alguna enfermedad crónica
(diabetes, tuberculosis o VIH) puede contribuir a la muerte; hasta el 26 de junio de
2015 se habían reportado 387,115 casos sospechosos y se confirmaron 11,792
en la región del Continente Americano (OMS; 2015). La fiebre del Zika es una
enfermedad similar al del dengue, es causada por el virus Zika (ZIKV), y consiste
en fiebre leve, salpullido, dolor de cabeza, dolor en las articulaciones, dolor
muscular, malestar general y conjuntivitis no purulenta que ocurre entre tres a
doce días después de la picadura del mosquito; de acuerdo a la Dirección de
Epidemiologia de la Secretaria de Salud (2015) no hay casos de fiebre zika en
México ni importados ni autóctonos sin embargo es inevitable descartar el riesgo
de propagación del virus como sucedió con chikungunya por la presencia del
vector que transmite dichas enfermedades; el virus ya se encuentra en ocho
estados Brasil.
La única forma de disminuir las enfermedades transmitidas por Ae. aegypti es
reducir la densidad vectorial, para ello, actualmente se utilizan estrategias
verticales que incluyen uso de plaguicidas las cuales han fallado debido a que el
mosquito vector ha desarrollado resistencia a insecticidas organoclorados,
organofosforados, carbamatos y piretroides (De la Cruz Gallardo et al; 2014)
respecto a los piretroides se ha demostrado en Malasia (Ishak et al; 2015), en la
isla de Martinica (Marcombe et al; 2012) y en La Guayana Francesa (Dusfour et
al; 2011); en México particularmente en el estado de Guerrero también se ha
demostrado la resistencia a los piretroides (Aponte et al; 2013, Chino et al; 2014 y
Che et al; 2015) lo cual justifica el uso de grupos químicos distintos a los
piretroides con el consecuente impacto al ambiente y a la salud.
Por lo anterior es factible investigar nuevas alternativas amigables con el medio
ambiente, en este sentido Howard (2011), considera que una de las alternativas
es el uso de hongos entomopatógenos porque además de no contaminar son muy
eficaces para infectar o matar mosquitos, aunque las poblaciones sean
resistentes a los insecticidas.
Por otro lado Santos et al; (2009), han demostrado que la humedad es un factor
muy importante para que el hongo Metharizium anisopliae cumpla su función
ovicida, tales condiciones de saturación se dan fácilmente en las lluvias, sin
embargo en criaderos a la sombra y protegidos de la luz UV también son
adecuados para un control eficaz con M. anisopliae.
Diversos estudios (Benserradj y Mihoubi; 2014, Priyadarshini y
Lekeshmanaswamy; 2014 y Hazrat Bilal et al; 2012) han demostrado la
patogenicidad de M. anisopliae sobre larvas de 4º instar de Culex pipiens, Ae.
aegypti y Ae. albopictus bajo condiciones de laboratorio y consideran que es una
buena alternativa para reducir las poblaciones de los mosquitos. Éste hongo
entomopatógeno puede ser considerado como un bioinsecticida seguro que no
afecta al ser humano o los animales domésticos.
Se ha demostrado que el tegumento larvario es más favorable para la colonización
por M. anisopliae, sin embargo con el tegumento de los mosquitos la eficacia de
los conidios se reduce al 50% en medios acuosos, por lo que es más prometedor
trabajar con los adultos (Vieira et al; 2013).
En este sentido Munguía et al. (2011), transmitieron el hongo Beauveria bassiana
a través de la copula de machos a hembras de Ae. aegypti y obtuvieron 90% de
mortalidad en 15 días; en otro estudio realizado por Villanueva et al. (2011)
evaluaron dos cepas de M. anisopliae una de alta virulencia y otra de baja
virulencia sobre adultos de Ae. aegypti y en donde a través de la copula se
diseminaron las cepas y se logró reducir la fecundidad en un 99% con una alta
mortalidad y permitió una baja tasa de fecundación.
Por su parte Paula et al. (2011), encontró que la susceptibilidad de las hembras de
Ae. aegypti se modifica después de su alimentación con sangre, debido a que
están llenas y se ponen a reposar sobre los paños negros impregnados de los
hongos entomopatógenos y se optimizan las tasas de infección.
También Mendoza-Ledesma et al. (2015), consideran que el hongo Gliocladium
virens en combinación con el insecticida clorpirifos-etil puede ser una alternativa
para disminuir las poblaciones de Ae. aegypti en Tapachula, Chiapas.
Así también Paula et al. (2013), midieron la eficiencia de paños impregnados con
M. anisopliae con el imidacloprid y paños sin tratamiento como control,
demostrando la eficiencia del tratamiento en condiciones simuladas de
intradomicilio, sin controlar la humedad o la temperatura, además consideran muy
importante ocupar paños negros.
Del mismo modo Carolino et al; (2014), monitorearon la persistencia de M.
anisopliae en condiciones simuladas de campo para controlar a Ae. aegypti,
consideraron que al añadir el hongo más una mezcla de aceite vegetales y
sintéticos aumenta la persistencia del entomopatógeno y solo es necesario
cambiar el paño negro cada mes.
Existen estudios que proponen controlar los mosquitos vectores con hongos
entomopatógenos pero en combinación con insecticidas (Paula et al; 2011 y
Ledesma et al; 2015) para sinergisar su efecto; sin embargo ese sinergismo se
puede lograr también utilizando extractos vegetables que tienen actividad larvicida
como el estudio de Angel-Ríos et al. (2015), en donde evaluaron por separado
extractos de paraíso, guanábano e higuerilla y dos especies de hongos
entomopatógenos (M. anisopliae y Paecilomyces sp) sobre larvas del gusano
cogollero (Spodoptera frugiperda) a nivel de laboratorio con M. anisopliae y
encontraron 55% de mortalidad
El uso de hongos entomopatógenos es una alternativa amigable con el ambiente
para el control del vector del dengue y reducir el impacto de los insumos químicos
al ambiente, de ahí la importancia de este estudio.
Problema
Dengue, chikungunya y virus zika son enfermedades de importancia en la salud
pública a nivel mundial; el dengue provoca la muerte si no se atiende a tiempo y la
otra es incapacitante y puede contribuir a la muerte en personas de edad
avanzada o que padecen enfermedades crónicas como diabetes, tuberculosis o
VIH. Guerrero es uno de los estados de México que a lo largo de la historia del
dengue siempre ha estado dentro de los primeros lugares en casos de dengue y
recientemente se han reportado de manera masiva casos por fiebre Chikungunya
a finales de 2014 y principios de 2015 principalmente en municipios de la región
Costa Grande, Costa Chica y Acapulco.
Tales municipios cumplen con las características adecuadas para la reproducción
del vector Ae aegypti transmisor de Dengue y Chikungunya el cual se reproduce
en agua limpia.
El control del mosquito vector de dichas enfermedades desde hace más de 40
años se realiza con el uso de insecticidas principalmente por aspersiones, rociado
espacial y la colocación de abate en los depósitos de agua limpia, adicionalmente
se ha utilizado la descacharrización, sin embargo dichas medidas no han tenido
efecto, ya que por un lado la enfermedad de dengue sigue en aumento año con
año y con la introducción de casos de chikungunya la situación se complica.
El mosquito ha creado resistencia a los insecticidas empleados en su control por lo
cual es pertinente investigar alternativas ecológicas en la lucha contra estas
enfermedades. Por lo cual se plantean las siguientes preguntas de investigación.
¿Es posible controlar el mosquito que transmite el dengue y chikungunya a través
del uso de agentes entomopatógenos?
¿Cuál será la fase más viable del mosquito para atacar con los hongos
entomopatogenos?
¿Cuál será la dosis letal media y noventa y cinco de un hongo entomopatógeno
para infectar larvas y mosquitos de Aedes aegypti?
¿Cuál será la dosis letal media y noventa y cinco de un nematodo
entomopatógeno para infectar larvas y mosquitos de Aedes aegypti?
¿Cuál será la dosis letal media y noventa y cinco de btacillus thurringiensis var.
israeliensis para infectar larvas y mosquitos de Aedes aegypti?
¿Cuál será la actitud que tienen las personas que viven en Acapulco sobre el uso
de hongos entomopatogenos en su agua limpia?
¿Cuál será el método más eficaz para aplicar los hongos entomopatógenos en los
recipientes de agua de los hogares?
¿Cada cuánto hay que aplicar o reemplazar los hongos para que el efecto se
mantenga constante?
¿Existirá la posibilidad de incorporar el uso de hongos entomopatogenos como
parte del programa de vectores para controlar el vector de dengue y
chikungunya?
Variable dependiente: reducción de la densidad vectorial de Aedes aegypti.
Variables independientes: patogenicidad del hongo, interacción hongos-
mosquitos, interacción hongos-larvas, aceptación del uso de hongos
entomopatógenos, suministro de agua, uso del agua, tiempo de efectividad de los
hongos.
Hipótesis
En la interacción huésped-patógeno formada por los cosmopolitas Aedes aegypti-
hongos imperfectos, la variación genética inherente y aleatoria ha seleccionado
poblaciones del vector más susceptible a las micosis pero también a hongos más
patógenos, y esta asociación sigue patrones desconocidos.
Objetivo general
Determinar la patogenicidad de hongos entomopatogenos nativos aislados en
Guerrero sobre Aedes aegypti bajo condiciones controladas de laboratorio y su
manejo en campo para el uso como posibles controladores biológicos.
Objetivos específicos
Identificar macroscópicamente cepas de hongos entomopatógenos de
suelos e insectos de la localidad Acapulco y algunas localidades de la
región Costa chica de Guerrero.
Realizar el cultivo d los hongos entomopatógenos aislados.
Implementar criaderos a nivel laboratorio para obtener larvas de cuarto
instar y adultos de Aedes aegypti.
Evaluar la patogenicidad de hongos aislados contra larvas de cuarto instar
de Aedes aegypti, así como su efecto en la sobrevivencia.
Evaluar la patogenicidad de hongos aislados sobre adultos de Aedes
aegypti, así como su efecto en la fecundidad, fertilidad y sobrevivencia.
Determinar la cepa más patógena de los diferentes hongos aislados para
larvas de cuarto instar y adultos de Aedes aegypti en condiciones de
laboratorio.
Evaluar la cepa más patógena bajo condiciones de campo para comprobar
su efectividad en el control de Aedes aegypti en varias localidades de
Acapulco con altos índices de casos de dengue y chikungunya.
Evaluar la implementación de los hongos entomopatogenos a través de la
mediciones de índices entomológicos de estados larvales y pupales y de
adultos de Aedes aegypti.
Material y métodos
Colección y cría de mosquitos
Los experimentos se realizarán en el laboratorio de Control Biológico de la Unidad
Académica de Desarrollo Regional de la Universidad Autónoma de Guerrero se
establecerá una colonia de mosquitos de Ae. aegypti.
Para establecer la colonia de mosquitos se colectarán, huevos de Aedes aegypti
mediante el uso de ovitrampas colocadas en cinco localidades del Municipio de
Acapulco. Se colocará una misma cantidad de ovitrampas en cada localidad las
ovitrampas serán elaboradas con botellas de plástico de 1L y adentro se le pondrá
papel filtro para que las hembras grávidas ahí coloquen sus huevos.
Cada papel filtro se guardara en una bolsa hermética y será transportado al
Laboratorio cada bolsa se etiquetara debidamente con la información siguiente:
número de ovitrampa, localidad y fecha. La eclosión de huevos se inducirá
sumergiendo los huevos en agua tibia (35ºC) y se les adicionará 0.5 g de extracto
de levadura. Las larvas se alimentarán diariamente con 0.5g de comida para
peces distribuida uniformemente en la superficie hasta llevarlos a larvas de cuarto
instar, cuando sean adultos los mosquitos serán alimentados con una solución de
sacarosa al 10% suministrada a través de un algodón.
Colección y aislamiento de hongos entomopatógenos
Los hongos serán colectados de suelos cercanos a cultivos de maíz y de insectos
infectados por hongos en diferentes localidades. Las muestras se colocarán en
cajas de petri con medio papa-dextrosa-agar (PDA), las cajas en oscuridad y a
una temperatura de 22 ± 3°C. Los hongos serán identificados en base a sus
características morfológicas: el color, forma de la colonia, formas y color de
estructuras morfológicas, según las claves y descripciones de Subramanian (1971)
Egorova (1980) y Barnet y Hunter (1998). Después de obtener las conidias para
infectar los adultos y las larvas de Aedes aegypti.
Bioensayos
Se colocaran en cámaras de infecciones adultos para lograr su infección con los
hongos entomopatogenos en condiciones de laboratorio, los adultos serán
alimentados con una solución azucarada de sacarosa al 10% para que se
alimenten durante el tiempo del ensayo se llevara a cabo una bitácora donde la
mortalidad se registrara diariamente. Los adultos muertos diariamente se
colocaran cajas Petri con medio de cultivo PDA. Las cajas se sellarán e incubarán
a una temperatura de 25±2 °C y después de 5 días se observarán al microscopio
estereoscópico para evidenciar cualquier crecimiento fúngico.
Las conidias de los hongos serán probadas contra las larvas de mosquito
mediante la adición suspensión fúngica de vasos de plástico que contendrá 50 ml
de agua destilada con 25 larvas del cuarto estadio. Cada vaso estará inoculado
con 1 ml de suspensiones de hongos (109, 108, 107, 106 y 105 conidia / ml).
Tratamientos de control se llevaran a cabo por adición de 10 ml de agua destilada.
Cada ensayo se llevará a cabo tres veces. Las larvas serán alimentadas con
alimento para peces, la mortalidad de larvas será evaluada sobre una base diaria
de 15 días.
Pruebas de campo
Después de analizar la bibliografía adecuada se elegirá la técnica más adecuada
para comprobar la efectividad de los hongos sobre mosquitos y larvas de Aedes
aegypti en condiciones de campo.
Encuestas entomológicas
Se diseñara un formato para registrar la información de la inspección
entomológica, incluyendo tipo y ubicación del recipiente; presencia y tiempo del
abate en el recipiente; estación del año y la presencia de larvas y/o pupas.
Se realizarán dos mediciones con seguimiento a los hogares, la finalidad fue
documentar los potenciales criaderos del vector Aedes aegypti;
Previo consentimiento informado en cada hogar se realizará la inspección
entomológica de los recipientes con agua. Sistemáticamente la revisión se hará
dentro y fuera de la casa (peridomicilio) en el sentido de las manecillas del reloj.
Un criadero será positivo cuando se encuentre al menos una larva y/o pupa en el
recipiente.
Recolección, clasificación y cuantificación de larvas y pupas
Para recolectar todas las larvas y pupas se utilizarán pipetas o dullas de plástico y
coladores adaptados con un mango de madera, en el caso de los recipientes que
estén bajo la sombra se usarán linternas para facilitar la recolección. Las larvas y
pupas se guardarán en bolsas de plástico debidamente identificadas con la
siguiente información: código del hogar, nombre y número de recipiente, sitio y
fecha de recolección. Se colocarán en termos para transportarlos durante el
trabajo de campo. Posteriormente se almacenarán a -20ºC hasta el momento de
ser identificadas y cuantificadas por entomólogos en el Laboratorio de Control
Biológico de Unidad de Ciencias de Desarrollo Regional.
Para la clasificación y cuantificación se utilizarán claves taxonómicas de Ibañez-
Bernal (1994) y un microscopio estereoscópico marca Olympus CX41.
Posteriormente se conservarán en viales con alcohol al 70%.
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