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Explicación de TPs Nº 1 y 2
Herencia y técnicas de biología molecular utilizadas en el
diagnóstico de enfermedades hereditarias
Química Biológica PatológicaBioq. Mariana L. Ferramola
Dogma central de la biología molecular:
El ADN es la molécula responsable de contener toda la información genética de un ser vivo.
Nomenclatura de los cromosomas:
Genética Mendeliana:
Fraile Gregor Johann Mendel1822-1884
Considerado el padre de la genética, estudió
el genotipo y el comportamiento de
los genes en las distintas generaciones de guisantes a partir
de su fenotipo.
Conceptos básicos en genética:
GenAlelo
Locus (loci)mutaciónGenotipoFenotipo
Desórdenes genéticos
Cromosómicos.
Monogénicos o mendelianos.
Multifactoriales.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Autosómica. Ligada al cromosoma X.
El gen afectado se localiza en un autosoma.En general, estos trastornos afectan por igual a hombres y mujeres.
El gen afectado se localiza en el cromosoma X.La incidencia en hombres y mujeres es diferente, dependiendo de si es de herencia recesiva o dominante..
Un trastorno monogénico es aquel que está determinado principalmente por los alelos localizados en un único locus.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Patrones de herencia autosómica recesiva.
Patrones de herencia autosómica dominante.
Los individuos de ambos sexos tienen una probabilidad similar de presentar el trastorno.
En la mayoría de los casos , los padres de un individuo afectado son portadores asintomáticos de alelos mutantes.
Un hijo de padres heterocigotas presenta un 25% de probabilidades de presentar el trastorno.
Los padres de personas afectadas suelen presentar consanguinidad.
Se presenta típicamente alternando generaciones en el árbos genealógico.
Los individuos de ambos sexos tienen una probabilidad similar de presentar el trastorno.
Al menos uno de los padres del individuo afectado debe presentar el rasgo.
Cada hijo con un progenitor afectado presenta un riesgo del 50% de heredar el trastorno.
Los individuos fenotípicamente normales no transmiten el trastorno a sus hijos.
Se presenta en todas las generaciones del árbol genealógico.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Herencia dominante incompleta:
La existencia de individuos afectados por trastornos dominantes con genotipo AA es teórica. Los individuos con dicho genotipo, en general, no son viables.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Patrones de herencia recesiva ligada al X.
Patrones de herencia dominante ligada al X.
La incidencia del rasgo es mucho mayor en hombres que en mujeres.
Los hombres afectados no transmiten el gen a sus hijos varones, pero si a todas sus hijas mujeres.
Están afectados los varones hemicigotos y las mujeres homocigotas.
En un emparejamiento entre un hombre afectado y una mujer sana, todos los hijos serán sanos y todas las mujeres afectadas.
Una mujer heterocigota afectada transmitirá el rasgo a la mitad de sus hijos, estando igualmente afectados losvarones y mujeres.
La frecuencia de mujeres afectadas es aproximadamente el doble de la correspondiente a los hombres afectados.
Variación genética: mutación y
polimorfismo.
Mutaciones:
“Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido o en la organización del DNA”
Genómicas
Cromosómicas
Génicas
Mutaciones
“No todas las mutaciones tienen consecuencias clínicas”
Tipos de mutaciones génicas:
Deleciones e inserciones
Pequeñas (pueden producir corrimiento del marco de lectura).
Grandes (afectan la estructura génica).
Sustituciones de nucleótidos
Mutaciones de cambio de sentido
Mutaciones sin sentido
Mutaciones dinámicas
Amplificación de secuencias repetidas de trinucleótidos
Polimorfismos:
Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la
población general.
Aplicaciones: ForensesFiliaciónMedicina
Tipos de polimorfismos: SNPs
SNPs Son los más sencillos y frecuentes.En general existen solo dos alelos en la población.
El hecho de que los SNPs
sean comunes no implica que
sean neutrales.
Tipos de polimorfismos: de inserción-deleción
Polimorfismos de inserción-deleción
Aproximadamente el 50% son simples (tienen 2 alelos en la población)
El otro 50% son multialélicos.
Clasificación:
Microsatélites (STR)
Minisatélites (VNTR)
Polimorfismos de inserción-deleción: STRs
Segmentos de DNA que consisten en unidades de 2, 3 o 4 nucleótidos, cuya repetición varía entre una y unas pocas docenas de veces. Son multialélicos.
Muy usados en la actualidad para identificación de
individuos.
Polimorfismos de inserción-deleción: STRs
Gel de poliacrilamida
Amplificación por PCR
Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs
Segmentos de DNA que consisten en unidades de 10 a 100 nucleótidos, cuya repetición varía entre unos
cientos y miles de veces. Son multialélicos.
Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs
Detección por autorradiografía
Separación de fragmentos en
geles de agarosa
Tipos de polimorfismos: de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).
Se deben a cambios en la secuencia del DNA que modifican los patrones de corte de las endonucleasas
de restricción.
Han sido muy utilizados como
marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia
de una enfermedad/alelo
mutado en individuos .
RFLP: detección mediante Southern Blotting
Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tiene relación con la mutación que produce el trastorno.De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce el trastorno.Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia.Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estar ligados (separados por una distancia no mayor a 106 pb)
RFLP: detección mediante Southern Blotting
RFLP: PCR-RFLP
•Más simple y económico que el RFLP tradicional.•Se requiere
mayor información de la zona donde ocurre la mutación.•Generalmente es
la mutación que genera el trastorno la que da lugar al polimorfismo.
RFLP: PCR-RFLP
Métodos de análisis de los ácidos nucleicos.
Conceptos básicos en biología molecular:
ElectroforesisHibridación
SondaEndonucleasas de
restricciónLigación
PolimerasasCebadores
Transferasas
Endonucleasas de restricción:
Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena (dsDNA) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos, produciendo fragmentos de DNA definidos.
Endonucleasas de restricción:
Cuando se somete un fragmento de DNA a restricción con una endonucleasa, esta genera fragmentos definidos, que dependen del patrón de corte de la enzima.
Separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel:
Separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel:
Separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel:
Geles de poliacrilamida
Alta resolución. Separan fragmentos de DNA
<500pb.
Geles de agarosa
Baja resolución. Separan fragmentos de DNA
de entre 300 a 10000pb.
Sondas de ácidos nucleicos:
Molécula de DNA o RNA marcada, usada para identificar secuencias complementarias mediante
hibridación.
Marcación de sondas
Interna
Externa
Radiactiva
No radiactiva
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
DNA polimerasas
Marcación interna:
Desplazamiento de mella (*dNTP).
Random primer extension (*dNTP o
*cebador).
Automatizada
Sondas de oligonucleótidos
(*dNTP).
Marcación por desplazamiento de mella: Nick translation.
Marcación por elongación de cebadores aleatorios: random priming.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Polinucleótido quinasa
Marcación Externa:
Marcación con 32P en extremo 5’,utiliza
γ[32P]-ATP. Marcación no
radiactiva.
Transferasa terminal
Marcación con 32P en extremo 3’, utiliza
α[32P]-ATP. Marcación no
radiactiva.
Marcación externa: Polinucleótido quinasa
Marcación externa: Transferasa terminal.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Formas de marcación de sondas de ácidos
nucleicos:
Hibridación de ácidos nucleicos:
Las hebras complementarias de ácidos nucleicos pueden separarse (desnaturalización) y dadas las condiciones adecuadas pueden re asociarse (hibridación).
Hibridación de ácidos nucleicos:
Factores que afectan la velocidad y especificidad de hibridación:
Longitud del acido nucleico. Composición de base.
Fuerza iónica. Viscosidad.
Temperatura Presencia de agentes desnaturalizantes.
pH
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tan sensibles y selectivas que pueden usarse para detectar secuencias complementarias cuya concentración sea incluso de 1 sola molécula por célula.
Hibridación:
Rigurosa (bajo condiciones astringentes).
Poco rigurosa (bajo condiciones no astringentes).
Longitud de una sonda:
Desde 5 hasta miles de nucleótidos
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Métodos de análisis de ácidos nucleicos que utilizan sondas.
Transferencia Southern
Transferencia Northern
Dot Blot
Análisis de DNA.
Análisis de RNA.
Revelado mediante sondas ASO.
Transferencia Southern:
Se utiliza para analizar fragmentos de DNA
generados por digestión con enzimas de
restricción.
Transferencia Southern:
Transferencia Southern:
Principales usos:
Detección de secuencias relacionadas ( ej. familias de genes).
Detección de deleciones e inserciones grandes causantes de enfermedades (ej. Distrofia muscular de Duchenne).
Identificación de individuos mediante VNTR.
Detección de RFLP.
Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de actividad variable, dependiendo del uso.
Transferencia Northern:
Se utiliza para analizar fragmentos de RNA obtenidos a partir de extracción.
Transferencia Northern:
Transferencia Northern:
Se utilizan sondas de tamaño intermedio. Esta técnica permite estudiar la expresión génica celular.
Actualmente esta técnica ha caído en desuso, debido a la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Comparación entre transferencias Northern y Southern:
Dot Blot:
Se utiliza para detección de mutaciones puntuales, principalmente aquellas que no modifican el patrón de restricción de una secuencia de nucleótidos.
Revelado: Sondas ASO
Condiciones de hibridación de elevada astringencia.
Dot Blot:
Dot Blot:
Dot Blot:
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR.
Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés (DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).
Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR.
94ºC
Tm Primers
72ºC
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR.
Primer Forward
Primer Reverse
Pérdida de eficiencia de PCR: Efecto Pasteur
Factores que llevan a la pérdida de eficiencia de PCR:
Disminución de actividad de la polimerasa.
Disminución de la disponibilidad de dNTPs y
cebadores.Disminución de la
disponibilidad de Mg2+, para el funcionamiento de la
enzima.
Clases de PCR.
• PCR-semicuantitativa• PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo
real)• RT-PCR
• PCR-multiplex.• PCR-anidada.
• PCR-aleloespecífica.• PCR-mutagénesis dirigida.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática.
Se lleva a cabo una reacción de amplificación del DNA en presencia de los cuatro dNTPs y concentraciones mucho
menores de los cuatro análogos ddNTPs, que dan lugar a la terminación de la síntesis cuando son incorporados.
Resolución de bandas en geles de poliacrilamida
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación automática.