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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE ESTOMATOLOGÍA
ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA
“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal
a diferentes concentraciones a base de extracto
etanólico de Stevia rebaudiana sobre el crecimiento
de Streptococcus mutans ATCC 25175”
AUTORA: Becerra Quiroz, Layla Marinés
ASESORA: Dra. Teresa E. Ríos Caro.
TRUJILLO – PERÚ
2016
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Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
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DEDICATORIA
A mi confidente y soporte en adversidades, Dios, por guiar mi camino de
tu mano haciéndome sentir que nunca estoy sola, enseñándome que todo
es posible con un corazón humilde, permitiendo que llegue hasta este
momento tan importante de mi formación profesional.
A mi querida mami: LUCINDA CHACÓN ROMERO, considerada por
todos los que te queremos como nuestro pilar, por tu amor infinito y gran
sapiencia.
A mis queridos padres: GLADIS Y ANTONIO. Por darme la vida y estar
conmigo en todo momento, por su apoyo, comprensión y enseñarme que
los sueños pueden ser más que eso.
A mis lindas hermanitas: CINTHYA Y KIARA, cómplices y amigas;
mosqueteras en la vida ―una para y todas para una‖.
A mi querida tía: HAYDEÉ, a quien considero como una madre y amiga,
por compartir momentos significativos y tu disposición para escuchar y
aconsejar a esta señorita de ―locas ideas‖.
A mi pequeña, SOFIA EMILIA, por tener esa inocencia que nos saca más
de una sonrisa y llena nuestras vidas de mucha felicidad.
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AGRADECIMIENTOS
―Donde hay fe hay amor, donde hay amor hay paz, donde hay paz esta
Dios y donde está Dios no falta nada‖. Mi agradecimiento será infinito
hacia ti y sobre todas la cosas, por darme lo más hermoso, mi familia.
A mis padres GLADIS Y ANTONIO, la vida no me alcanzará para
retribuirles todo cuánto me ha sido dado, a ustedes les debo mi formación
en principios y valores como persona. Los quiero mucho; en cada
elección y decisión son sus palabras las que me hace continuar con
coraje y perseverancia este arduo, pero gratificante camino.
A mis hermanitas CINTHYA, KIARA, y demás familiares; por depositar su
confianza en mi persona.
A la Dra. TERESA RÍOS CARO, por su gentileza, dedicación y excelencia
como mi asesora en la realización de este trabajo. Por su tiempo y
paciencia brindados.
A las Dras. ELVA MEJÍA RÍOS Y MARILÚ SOTO VÁSQUEZ, por su
paciencia, amabilidad, empeño y disposición para la ejecución del
presente trabajo.
A LUIS MIGUEL, por ser la persona maravillosa que eres y además de
ello, ser mi amigo. Destino o casualidad fueron los que permitieron
encontrarnos para compartir esta carrera, que es nuestra pasión.
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RESUMEN
Objetivo: El presente estudio de tipo experimental, tuvo como objetivo
determinar la actividad antibacteriana in vitro de un enjuague bucal a base
de extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus
mutans ATCC 25175.
Materiales y método: Los extractos se obtuvieron a partir de hojas
frescas de Stevia rebaudiana, para luego ser agregado con solventes en
la elaboración de un enjuague bucal a seis concentraciones en etanol de
70° y seis concentraciones en etanol de 30°. La concentración inhibitoria
mínima se obtuvo por el método de dilución en caldo y agar y para el
efecto bactericida se empleó la técnica de difusión de discos de Kirby y
Bauer.
Resultados: El análisis estadístico permitió seleccionar a la CMI en 1,07
mg/mL en el enjuague a base de extracto de Stevia rebaudiana en etanol
de 70° y la concentración de 2,14 mg/mL, en etanol de 30° (p> 0.05).
Mientras la CMB en 75mg/mL en el enjuague bucal trabajado en etanol de
70° y siendo estadísticamente nulo en etanol de 30° (p< 0.01).
Conclusión: El enjuague bucal a base extracto etanólico de Stevia
rebaudiana posee efecto antibacteriano sobre Streptococcus mutans
ATCC 25175.
Palabras clave: Bactericida, Stevia, antiséptico bucal, Streptococcus
mutans.
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ABSTRACT
Objective: This experimental study, aimed to determine the antibacterial
activity in vitro of a mouthwash based ethanol extract of leaves of Stevia
rebaudiana on Streptococcus mutans ATCC 25175.
Materials and Methods: The extracts were obtained from fresh leaves of
Stevia rebaudiana, before being added solvent in the preparation of a
mouthwash to six concentrations of ethanol 70 ° and six concentrations of
ethanol 30 °. The minimum inhibitory concentration was obtained by the
broth dilution method and agar and the bactericidal effect diffusion
technique of Kirby and Bauer disc was used.
Results: statistical analysis allows to select the MIC 1.07 mg / mL based
on the rinse extract Stevia rebaudiana in ethanol 70 ° and the
concentration of 2.14 mg / mL in ethanol 30 ° (p> 0.05). While the WBC
75mg / mL in the mouthwash worked in ethanol 70 ° and being statistically
null in ethanol 30° (p <0.01).
Conclusion: that the ethanol extract mouthwash Stevia rebaudiana has
antibacterial effect on Streptococcus mutans ATCC 25175.
Keywords: Bactericide, mouthwash, Stevia, Streptococcus mutans.
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ÍNDICE
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
ABSTRACT
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………….…..7
II. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………28
III. RESULTADOS……………………………………………………..51
IV. DISCUSIÓN………………………………………………………...54
V. CONCLUSIONES………………………………………………….62
VI. RECOMENDACIONES……………………………………………63
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………64
VIII. ANEXOS……………………………………………………………78
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I. INTRODUCCIÓN.
Actualmente en nuestro país, la caries dental es un problema de
salud pública, siendo aún la atención odontológica de elevado costo y no
accesible a toda la población; teniendo en cuenta que la fitoterapia es una
alternativa viable para todos los profesionales de la Salud en el
tratamiento de diversas patologías; por ello, se apuesta a tratamientos
preventivos en donde se propone el uso de la Stevia rebaudiana, por sus
bondades antibacterianas hipocalórias y accesible por su bajo costo lo
que la calificaría para ser usada como un método en la prevención de
múltiples enfermedades, entre las que podría estar la caries dental.
Las enfermedades bucodentales, como la periodontitis y los
cánceres de la boca y la faringe, en especial, la caries dental, son un
problema de salud de alcance mundial que afecta a los países
industrializados, y cada vez con mayor frecuencia, a los países en
desarrollo, en especial entre las comunidades más pobres. La
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha afirmado que «Existe la idea
de que la caries dental ha dejado de ser un problema en los países
desarrollados, cuando en realidad afecta entre el 60% y el 90% de la
población escolar y a la gran mayoría de los adultos y que la caries dental
es también la enfermedad bucodental más frecuente en varios países
asiáticos y latinoamericanos.»1
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En el paradigma actual se entiende la caries dental como una
―Enfermedad re-emergente, compleja y multifactorial, causada por un
desequilibrio en el balance fisiológico entre el mineral dental y el fluido de
la biopelícula, inducida microbiológicamente por bacterias endógenas y a
su vez, relacionada con procesos sociales de los individuos y las
colectividades‖ considerada a su vez, como el padecimiento de mayor
prevalencia y costo en el mundo.2
Hace casi 100 años Millar y Black identificaron los principales
componentes del proceso de la caries como dieta cariogénica, microflora
destructiva, y dientes susceptibles. A lo largo de los años, muchos
investigadores han demostrado la asociación de diferentes grados entre la
caries y factores bioquímicos, ambientales, físicos, microbianos,
sociodemográficos y de comportamiento. Desafortunadamente, ninguna
de estas asociaciones probó ser suficiente para permitir una predicción
exacta de la futura caries dental para el paciente individual.3
La OMS, en el 2003, reportó que 5 000 millones de personas
padecen caries, en América Latina afecta al 98 % de la población
adolescente. El índice de dientes cariados perdidos y obturados (CPO-d)
presenta incrementos permanentes de 5 dientes afectados a medida que
avanza la edad, este aumento en adolescentes sugiere que durante este
período se disminuye la prevención y control de la enfermedad que se
realiza en la etapa escolar y las consecuencias se evidencian en la alta
prevalencia en la adultez, por lo tanto, estudiar la experiencia de caries,
puede resultar útil para evaluar la efectividad de los programas de
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intervención de caries en la infancia y dirigir esfuerzos a la conservación
de lo logrado en las primeras etapas de la vida en materia de prevención.4
En el Perú, la condición de Salud Bucal, atraviesa una situación
crítica, el 90% de la población padece de caries dental, 85% enfermedad
periodontal y 80%, mal oclusión, constituyendo un problema de salud
pública; el índice de dientes cariados, perdidos y obturados (CPOD), a los
12 años es de aproximadamente 6, ubicándose según la OPS en un País
en estado de emergencia.5
La caries dental se define como un proceso o enfermedad dinámica
crónica, que ocurre en la estructura dentaria en contacto con los
depósitos microbianos y por el desequilibrio entre la sustancia dental y el
fluido de placa circundante, lo que da como resultado una pérdida de
mineral de la superficie dental, cuyo signo es la destrucción localizada de
tejidos duros; afecta tanto la corona como la raíz del diente y la ausencia
de atención es causa de la pérdida del órgano dentario, y constituye
además un foco de infección para el organismo. Se clasifica como una
enfermedad transmisible e irreversible6.
Fejerskov define la lesión cariosa como un mecanismo dinámico de
desmineralización y remineralización como resultado del metabolismo
microbiano agregado sobre la superficie dentaria, en la cual con el tiempo,
puede resultar una pérdida neta de mineral y es posible que
posteriormente se forme una cavidad. Concluyendo que la caries es el
signo de la enfermedad y no la enfermedad per se.7
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En numerosos estudios se describen los aspectos más importantes
del complejo mecanismo físico-químico de desmineralización del esmalte
y se conocen como principales factores: la influencia inhibitoria de las
proteínas salivales y del fluoruro, las variaciones anatómicas de los
elementos dentarios, el componente químico de los fosfatos, la
importancia de la carga y los coeficientes de difusión en el gradiente. La
estabilidad-inestabilidad del sistema dependen del pH del medio (está
demostrado que la descalcificación del diente se acentúa cuando el pH
disminuye por debajo de 5,5), de la concentración de fluoruros (los
dientes con esmalte fluorado son más resistentes a la descalcificación), y
a la fuerza iónica. Tanto in vitro como in vivo, la presencia la acidez
favorece la disolución, mientras que la reducción del tiempo de exposición
estimula la remineralización.3
La sacarosa, el carbohidrato más cariogénico presente en la dieta,
es un factor importante que contribuye a la formación y el desarrollo de la
placa bacteriana; esta es fácilmente metabolizada por las bacterias orales
quienes forman glucano8. Durante el metabolismo de carbohidratos,
liberan ácido láctico que se difunde de la placa dental al esmalte,
disolviendo el mineral, con la pérdida neta de minerales que puede
generar una cavidad.4
Entre 200 a 300 especies bacterianas aisladas de la placa dental las
más patógenas de la caries dental son: Streptococcus mutans,
Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus, Actinomices viscusus y
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Bifidobacterium dentium, entre otros, contribuyen a la formación de
biopelículas dentales.4
Las lesiones de caries no se desarrollan sin presencia de la placa
bacteriana y cuando la placa contiene altas proporciones de bacterias
acidogénicas como el Streptococcus mutans y es expuesta a azúcares
fermentables se produce suficiente concentración de ácidos para
desmineralizar el esmalte9. Conforme aumenta el número de bacterias,
aumenta el riesgo de la caries dental.10
Durante el desarrollo de la caries, primero aumentan los
Streptococcus mutans y después los lactobacilos incrementan
significativamente; esto indica que el Streptococcus mutans está
involucrado con el inicio de la lesión de caries, mientras que el
Lactobacillus acidophilus lo es con el progreso de la lesión.11
Streptococcus mutans es un coco Gram positivo, dispuesto en
cadena, no móvil, catalasa negativo, pueden clasificar en 8 serotipos
(serotipos c, e, f y k propiamente dichos), es productor rápido de ácido
láctico con capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2 en,
aproximadamente, 24 horas. Fermentador de glucosa, lactosa, rafinosa,
manitol, inulina y salicina con la producción de ácido.12
Los hábitats principales para Streptococcus mutans son la boca, la
faringe y el intestino. Es el principal microorganismo que contribuyen a la
caries dental en los pacientes libres de caries, el cual se encuentra como
flora normal en la cavidad oral, además es dominante en la placa de
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pacientes con múltiples lesiones de caries activas. El período crítico de la
colonización de Streptococcus mutans se produce a la edad de 19 a 31
meses en los que se establece la ventana de infectividad. Sin embargo,
las pruebas mostraron que Streptococcus mutans se podría encontrar
poco después de la erupción del diente, incluso en bebés de 6 meses de
edad que no tienen ningún diente.13
Existen varios factores relacionados con la virulencia de
Streptococcus mutans, los cuales le permiten acumularse dentro de la
placa dental y a la vez producir y tolerar los ácidos que causan las caries.
El inicio de la infección ocurre en dos fases distintas; primero las
proteínas de superficie de la bacteria interactúan con el hospedador o con
los productos bacterianos adsorbidos en la superficie del diente11. Luego,
se forma una biopelícula de bacterias agregadas de Streptococcus
mutans y otras especies bacterianas, mediante la síntesis de
polisacáridos extracelulares específicos como los glucanos, a través de
un sistema enzimático llamado glucosiltransferasas (Gtfs),
quien desempeñan papeles críticos en el desarrollo de la placa dental
virulenta absorbiéndose para producir glucanos in situ sobre el esmalte y
proporcionar los sitios para la colonización ávida por microorganismos así
como una matriz insoluble para la formación de la placa14. También se
adsorben a las superficies de otros microorganismos orales
convirtiéndolos en productores de glucanos12.Por tanto, Streptococcus
mutans produce las proteínas que enlazan éstos, fortaleciendo así la
biopelícula.11
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Esta capa de glucano insoluble es esencial para la adherencia de los
microorganismos a las superficies de los dientes15.Otra característica del
Streptococcus mutans es su corto efecto post-pH, que puede definirse
como el tiempo necesario para recuperar su actividad de crecimiento
habitual, tras estar sometido a un bajo pH éste vuelve a la normalidad.
Según lo expuesto, no es de extrañar que estas especies bacterianas
sean las que consigan alcanzar más rápidamente el pH crítico 4.5
necesario para iniciar el proceso de desmineralización.16
A partir del metabolismo de la sacarosa estos microorganismos, en
particular el Streptococcus mutans, producen principalmente ácido láctico,
el cual es fundamental en la virulencia debido a que, aparentemente, es el
ácido más potente que interviene en la desmineralización del diente,
causando daño en la presencia de hidratos de carbono fermentables tales
como sacarosa, fructosa, y glucosa.9, 11
Tanto el Streptococcus mutans como el Lactobacillus acidophilus
producen ácido láctico a partir de azúcares fermentables y son capaces
de vivir en ambientes muy ácidos17. El Lactobacilo rhamnosus y el
Lactobacilo acidophilus son las dos especies más abundantes que se
encuentran con frecuencia en lesiones de caries superficiales y
profundas, en donde el pH tiende a ser ácido.18
Mientras el Streptococcus mutans es el principal microorganismo
que contribuyen a la caries dental en los pacientes libres de caries, ya que
se encuentra como flora normal en la cavidad oral, además de ser
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dominante en la placa de pacientes con múltiples lesiones de caries
activas12; el Lactobacillus acidophilus está más asociado con la dentina
cariada y al avance de las lesiones cariosas en vez de iniciar con la
enfermedad. Normalmente los lactobacilos son menos de 1% del total de
la microflora cultivables. Sin embargo, sus proporciones y la prevalencia
pueden aumentar en lesiones de caries avanzadas, tanto del esmalte y de
la superficie de la raíz19. Es por ello, que se encuentran con frecuencia en
grandes cantidades en las lesiones de caries superficiales y profundos.20
El Lactobacillus acidophilus no puede formar la placa en el diente
por si solo y dependerá del polisacárido extracelular producido por otros
microorganismos orales, principalmente los estreptococos, para la
colonización.21
Históricamente y en la actualidad, se ha observado una tendencia
hacia la investigación sobre el uso de sustancias de origen natural en
diversas áreas de la odontología; con el fin de evaluar su actividad y
posible aplicación para controlar la biopelícula dental22. Ha sido bien
documentado que las plantas medicinales confieren actividad
antimicrobiana para bacterias orales23. El control de la placa se puede
lograr mediante procedimientos de higiene oral mecánicas, pero en
muchos casos eso no es suficiente. Por tanto, la adición de agentes
antiplaca o antimicrobianos para productos de cuidado de la salud dental
ha sido de valor.24
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Hay varias tipos de edulcorantes en el mercado que varían en su
nivel de dulce; natural o artificial, éstos últimos son productos de un
proceso químico y su uso afecta al organismo humano de manera
negativa. Con el aumento en obesidad y diabetes mundialmente nació la
creación de edulcorantes naturales. Los creadores de estos productos
abogan en la posibilidad de ser una alternativa eficaz y saludable para los
diabéticos y/o para aquellas personas que buscan una estrategia para el
control de peso, entre otros problemas crónicos.25
La mayor parte de las enfermedades en la boca comienza con la
formación de la placa dental, por ello, tanto la caries dental y las
enfermedades periodontales pueden ser controladas si la formación de la
placa dental se reduce8. Los hábitos alimentarios son difíciles de cambiar,
especialmente cuando se relaciona con el consumo de productos dulces.
La búsqueda de un sustituto saludable del azúcar es una forma
importante de contribuir a la prevención de las enfermedades dentales y
de otro tipo. 26
No obstante, son muchos los estudios epidemiológicos que
correlacionan el consumo de azúcar con la prevalencia de caries y en los
que se demuestra una clara asociación entre frecuencia de consumo, la
ingesta entre comidas y el desarrollo de la misma27. La sacarosa se
metaboliza fácilmente por las bacterias orales que se encuentran en los
tejidos de la placa dental en el proceso dinámico de la caries26,
promoviendo la firme adhesión bacteriana a los dientes, límites ácidos de
la placa y tampón28. Por ello, el aumento de la disponibilidad de sustitutos
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seguros y eficaces para la sacarosa en la dieta durante períodos críticos
del desarrollo de los dientes, sería vital para la salud pública a largo
plazo.29
Una alternativa tanto al azúcar como a la fructosa es el uso de
edulcorantes no nutritivos. El consumo de alimentos y bebidas que
contienen edulcorantes no nutritivos ha aumentado dramáticamente en
las últimas décadas, se estima que en Estados Unidos un 15% de la
población consume edulcorantes no nutritivos como Sacarina, Aspartame,
Sucralosa, Ciclamato, Acesulfame K, Neotamo, Alitamo. En cambio un
estudio realizado en escolares chilenos muestra que la ingesta es cercana
al 99%.30
Cabe mencionar que la actividad antimicrobiana de sustancias de
origen natural como son los flavonoides, xylitol y el propóleo está bien
documentada. En el contexto de las bacterias cariogénicas, los
flavonoides han demostrado ser activos31, debido a sus diversas
propiedades muy apreciadas en la medicina, como antimicrobianos,
anticancerígenos, disminución del riesgo de enfermedades cardíacas,
entre otros efectos.32
Entre los edulcorantes no nutritivos ya incorporado cabe mencionar
a la Stevia, cuyo sabor es lo más parecido al azúcar, distinguiéndose de
los edulcorantes artificiales por no tener sabor metálico y no ser
cancerígeno30. Un conjunto considerable de evidencia científica apoya la
eficacia y la seguridad en la promoción de la salud humana de los
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extractos de la hoja de la "hierba dulce" Stevia (Stevia rebaudiana
Bertoni), pues es no calórico, no sintético y un potente edulcorante.28
La Stevia Rebaudiana Bertoni, es una planta originaria del Sudeste
de Paraguay y pertenece a la familia Asteraceae, conocida como "hoja
dulce"33. Considerada en varios estudios como un edulcorante natural que
ha demostrado responder beneficiosamente a la salud general y oral34.
Resulta efectiva mientras que el azúcar blanco, fructosa, miel y jarabe de
maíz que califican como edulcorantes naturales, ninguno de ellos es libre
de calorías, ni son los componentes dietéticos beneficiosos para aquellos
que sufren de trastornos de azúcar en la sangre y otras condiciones.35
Durante su desarrollo inicial no posee ramificaciones, tornándose
multicaule después del primer ciclo vegetativo, llegando a producir hasta
20 tallos en tres a cuatro años; puede alcanzar hasta 90 cm de altura en
su hábitat natural y en los trópicos puede llegar a tener alturas superiores
a 100 cm. La raíz es, pivotante, filiforme, y no profundiza, distribuyéndose
cerca de la superficie34. Hojas elípticas, ovales o lanceoladas, algo
pubescentes23, tienen aproximadamente 5 cm de longitud y 2 cm de
ancho y se disponen alternadas, enfrentadas de dos en dos35. En su
estado natural, crece en la región subtropical, semihúmeda de América,
con precipitaciones que oscilan entre 1.400 a 1.800 mm, distribuidos
durante todo el año, temperaturas que van desde los 24 a 28°C y
humedad relativa de 75% a 85%.36
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El botánico suizo Moisés Santiago Bertoni fue el primero que la
describió, en 1887, detallando su sabor dulce. En 1900 el químico
paraguayo Ovidio Rebaudi, logró aislar dos principios activos
responsables del dulzor30. Posteriormente, estos compuestos fueron
llamados esteviósido y rebaudiosido, que son de 200 a 300 veces más
dulces que la sacarosa, estables al calor y no fermentan.35
La propiedad más importante de la Stevia Rebaudiana Bertoni se
encuentra en sus hojas. Se utilizan como edulcorante natural o en
suplementos dietéticos por su contenido de glucósidos37. Se trata del
edulcorante natural llamado esteviósido, que está constituido por una
mezcla de ocho glucósidos diterpénicos28. Esteviósido (300 veces más
dulce que la sacarosa) y rebaudiósidos: A (Reb A, 250 - a 450 veces más
dulce), B (reb B, 300 - a 350 veces más dulce), C (Reb C, 50 - a 120
veces más dulce), D (Reb D, 250 - a 450 veces más dulce), E (Reb E (150
- a 300 veces dulce), Esteviolbiósido (100 - a 125 veces más dulce),
Dulcósido A (50 - a 120 veces más dulce); isosteviol y dihydroisosteviol;
cuyas características químicas y farmacológicas son adecuadas para el
uso en la alimentación humana.28, 30
Las hojas de la planta silvestre de Estevia contienen 0,3%
Dulcósido, 0,6% Rebaudiósido C, 3,8% Rebaudiósido A y el 9,1% de
Esteviósido. De las 110 especies estudiadas por el sabor dulce solo 18
muestran esta característica. De todas las especies la Stevia rebaudiana
Bertoni es la más dulce30. Debido a que son ricas en metabolitos como el
β-caroteno, tiamina, austroinulina, riboflavina, diversos terpenos y
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flavonoides, estos dan a la planta las ventajas de ser usado como
medicamento30, 37. En 1997 Ngowata purificó el extracto de Estevia
obteniendo un Esteviósido, un polvo blanco y altamente higroscópico, por
lo cual hay que mantenerlo en un envase hermético para evitar la
humedad.36
Muchos estudios de toxicidad llevados a cabo con extractos de
Stevia rebaudina indican que es seguro para el consumo humano38. Se ha
demostrado que los glucósidos de steviol cumplen con los criterios de
pureza establecidos por el Comité Conjunto de Expertos en Aditivos
Alimentarios de la OAA/OMS (JointFAO/WHO Expert Committee on Food
Additives, JECFA), no tienen efecto en la respuesta de la presión
sanguínea ni de la glucosa en sangre, lo cual indica que los edulcorantes
de Stevia son seguros para ser utilizados por las personas que tienen
diabetes39. Además, los esteviosidos han sido usados durante muchos
años en América del Sur y en Japón. Otros estudios sugieren que este
producto puede inhibir el desarrollo de microorganismos en la zona
bucal37. Además de ser antioxidante, no cariogénico, quimioprotector,
antiinflamatorio, digestiva, y vasodilatadora.28, 36
El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios
(JECFA) en sus reuniones 68a y 69a del año 2008, estableció la Ingestión
Diaria Admisible (IDA) para los glucósidos de Esteviol de mg por kg de
peso corporal por día, es decir, peso molecular del total de Esteviol
presente en la mezcla30. Llevó a cabo a un minucioso análisis de los datos
científicos existentes sobre los glucósidos de steviol y ha concluido que
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son seguros para utilizarse en alimentos y bebidas. La revista Food and
Chemical Toxicology publicó un suplemento especial sobre el tema de la
seguridad de los edulcorantes de Stevia en mayo de 2008.38
Un 70% de la producción mundial de stevia es destinada para
procesar cristales de esteviósido, el otro 30% se destina a herbarios40. A
escala comercial la utilización de este edulcorante está de moda desde
principios de los setenta en Japón. Actualmente se cultiva en Japón,
Brasil, Canadá y China, siendo este último el principal exportador de
esteviósido.30
El cultivo de este fitoquímico en el Perú, ha sido introducido hace ya
una década mediante numerosos proyectos dado que es perfectamente
adaptable a sus regiones tropicales y subtropicales, pues presenta
condiciones ideales en altitud, clima, suelo y situación geográfica.
Actualmente está incluida en el portafolio de pequeñas extensiones de
Cajamarca, en la ceja de la selva; Amazonas, San Martin, Ucayali,
Apurímac y Arequipa.41
Las hoja de Stevia en América del sur contiene en promedio de 8 a
12% de esteviósido, en cambio las hojas de China contiene de 5 a 6% de
esteviósido que es compensado con el gran volumen de producción.42
En Perú se ha demostrado que es un cultivo viable en la Amazonía
alta, es muy rentable. Debido a su clima, así, la Amazonía es apta para su
cultivo, mucho más que en Paraguay, Brasil y Argentina, razón por la que
existe mayor productividad: hasta siete toneladas de hoja seca por
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hectárea frente a 1.5, 3 y 4 toneladas en otras regiones sudamericanas.
La variedad peruana contiene hasta un 80% de rebaudiósido A43. Su ciclo
de vida es de 8 años y rinde en promedio 7 TM de hoja seca por Ha/año a
partir del año 2 y en esteviósido 700 kgr/ha/año (10% del peso de las
hojas) 36. En otros países como Paraguay y Brasil se efectúan 3 ó 4 cortes
por Ha/año, siendo los rendimientos mucho menores (3 TM /Ha/año).44
A nivel nacional, se comercializa en bolsas plásticas transparentes,
básicamente en tiendas naturistas y ferias. Los envases son de 15 grs
con un precio al público de S/. 2.0 c/u y de 50 grs al precio de S/. 10 c/u.
En la actualidad hay solamente 3 empresas que comercializan la hoja de
Stevia seca en esta forma. Se debe indicar que muchos de estos
industriales no producen Stevia sino que compran a un promedio de S/.
20 soles el Kg.44
Hay estudios que informan de la actividad antimicrobiana de
extractos obtenidos de Stevia rebaudiana sobre los hongos y bacterias
Gram-negativas y Gram-positivas de los géneros Streptococcus y
Lactobacillus.45
Amaya Varas R46, en Perú. En 2015; demostró el efecto
antibacteriano del extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. Según su estudio in vitro, las
concentraciones mínimas inhibitorias del extracto etanólico de Stevia
rebaudiana fueron de 1,07mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70°
y 2,14 mg/mL en extracto trabajado en etanol de 30°; y las
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concentraciones mínimas bacterianas fueron de 5 mg/mL en el extracto
trabajado en etanol de 70° y 10,7 mg/mL en etanol de 30°.
Deniņa L.et al47. En Letonia. En 2013. Demostraron inhibición en el
crecimiento de seis cepas de Lactobacillus reuteri en presencia de los
edulcorantes de los glucídos de la Stevia: Esteviósido y Rebaudiósido A.
Pérez Guevara S48, en Perú. En 2013; demostró el efecto
antibacteriano del extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre
Streptococcus mutans ATCC 25175. Según su estudio in vitro, las
concentraciones mínimas inhibitorias del extracto etanólico de Stevia
rebaudiana fueron de 1,07mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70°
y 4,28mg/mL en extracto trabajado en etanol de 30°; y las
concentraciones mínimas bacterianas fueron de 10mg/mL en el extracto
trabajado en etanol de 70° y 42,8mg/mL en etanol de 30°.
Mohammadi-Sichani M, Karbasizadeh V, Aghai F, Mohammad M, 33
en 2012, reportó que extractos de Stevia rebaudiana, tienen actividad
antibacteriana moderada contra SM, comparada con la concentración de
1% del antibiótico empleado (tetraciclina). El estudio mostró que los
extractos de Stevia rebaudiana en acetona y etanol presentan un efecto
inhibidor mejor en S. mutans que los de cloroformo y metanol. Por otra
parte, el extracto acuoso de hojas de Stevia rebaudiana, era
prácticamente ineficaz contra SM.
Vitery et al.49 en el 2010, compararon el efecto in vitro de diferentes
concentraciones de extractos de Stevia, en agua, metanol, etanol, hexano
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y acetato de etilo, en cepas de Streptococcus mutans y Lactobacillus
acidophilus utilizando vancomicina como control positivo. El extracto de
Stevia que mostró los mejores resultados en la inhibición del crecimiento,
fue en hexanoico, en el que después de 48 horas, se formaron halos de
inhibición con una media de 14,5 mm de Streptococcus mutans y 15,5
mm de Lactobacillus acidophilus en una concentración de 50 mg / ml.
Sathishkumar et al.50 en 2008, evaluaron la actividad antibacteriana
de la Stevia rebaudiana, extraída por medio de diversos disolventes frente
a Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella
typhi y Vibrio cholerae; encontrando que el extracto de acetona mostró
una mayor actividad contra las bacterias Gram positivas que las bacterias
Gram negativas.
Sato en Japón en 2000, reportado por Jarma A et. al42. Demostró la
acción antimicrobiana selectiva del extracto de Stevia; mencionado
extracto eliminó a E. coli, Salmonella, Estafilococcus, bacilos, y no afectó
bacterias útiles, lo que indicó una acción selectiva.
En un estudio in vivo, se midió la acumulación de la placa dental
después de enjuagar con una solución de sacarosa al 10% cuatro veces
al día durante 5 días y se comparó con un enjuague de solución al 10%
de la Stevia rabaudiana Bertoni cuatro veces al día, durante 5 días; El
análisis de los índices de Silness-loe y O'Leary después de 5 días del uso
de la solucion de Stevia demostró una menor capacidad para la formación
de la placa dental. El nivel de placa fue de 57, 82% menos en el índice de
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Silness-LOE y 10, 40% menos en el índice de O'Leary26. La transmisión y
colonización de Streptococcus mutans en la cavidad oral son factores
importantes para prevenir la caries dental teniendo en cuenta que
Streptococcus mutans tiene un papel potencial en la formación de caries
inicial13.
Existen diferentes estudios que evidencian que las principales
bacterias cariogénicas son Lactobacillus acidophillus y Streptococcus
mutans. Dentro de las medidas preventivas para esta patología se ha
propuesto el remplazo de los azúcares energéticos dentro de la dieta por
carbohidratos no energéticos, tal como la Stevia Rebaudiana Bertoni.51
En el ámbito odontológico, el importante crecimiento mundial de la
fitoterapia dentro de programas preventivos y curativos ha estimulado la
investigación con el fin de avalar la actividad antimicrobiana de distintos
extractos de plantas con el fin de ayudar en el control de la placa
bacteriana y por consiguiente en la disminución de la incidencia de caries
dental y enfermedad periodontal.52
El enfoque preventivo se debe encaminar a controlar los factores de
riesgo e instaurar tratamientos curativos antes de la aparición de lesiones
irreversibles que requieran la eliminación de la estructura cariada y
obturación de la lesión. La OMS y la Organización Panamericana de la
Salud comparten la ideología de atender a la caries dental como aspecto
fundamental de las condiciones generales de salud. Se pretende como
meta global establecida para el año 2020 que el 50% de los niños de 5 y 6
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años de edad estén libres de caries, que el promedio de CPOD no sea
mayor de 3 en niños de 12 años de edad y por ende que el 85% de la
población tenga todos sus dientes a los 18 años de edad52. Por tanto, la
atención odontológica debería visualizar el tratamiento contra la caries
dental desde un enfoque preventivo más que curativo teniendo en cuenta
la relación entre el gasto sanitario público de un país con la salud
bucodental.2
Teniendo en cuenta los estudios encontrados donde se observa una
relación directa entre el metabolismo de la sacarosa y su influencia en
crear un ambiente propicio para el desarrollo de la caries dental, y en
especial para el establecimiento de niveles nocivos de Streptococcus
mutans en cavidad oral; habiéndose demostrado su capacidad de
inhibición sobre los patógenos principales de la caries dental
Streptococcus mutans y Lactobacillus acidophillus buscamos evaluar su
efectividad como componente principal de un enjuague bucal, objetivo de
esta investigación, mismo que pueda ser utilizado como agente preventivo
de la caries dental teniendo en cuenta además que esta especie vegetal
es considerada como cultivo rentable y cuya industrialización es
prometedora en el marcado nacional e internacional. Actualmente estos
estudios han ido incrementándose siendo ya algunos de ellos
concluyentes; y habiéndose comprobado su efectividad en el crecimiento
del Streptococcus mutans.46, 48
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Por lo antes expuesto, dentro de esta misma línea de investigación,
el presente estudio propone establecer la efectividad e impacto en el
control de la caries dental de un colutorio a base de extracto etanólico de
Stevia rebaudiana in vitro sobre el crecimiento de sobre una cepa
estándar Streptococcos mutans.
1.1 PROBLEMA
¿Cuál es efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal
a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de
Stevia rebaudiana sobre el crecimiento de Streptococcus mutans
ATCC 25175?
1.2 HIPÓTESIS
El enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de
extracto etanólico de Stevia rebaudiana presenta algún efecto
antibacteriano in vitro sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo General:
Determinar el efecto antibacteriano in vitro de
un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base
de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el
crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175.
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1.3.2 Objetivos Específicos:
1.3.2.1 Determinar la concentración mínima
inhibitoria (CMI) in vitro de un enjuague
bucal a diferentes concentraciones a base
de extracto etanólico de Stevia rebaudiana
sobre el crecimiento de Streptococcus
mutans ATCC 25175.
1.3.2.2 Determinar la concentración mínima
bactericida (CMB) in vitro de un enjuague
bucal a diferentes concentraciones a base
de extracto etanólico de Stevia rebaudiana
sobre el crecimiento de Streptococcus
mutans ATCC 25175.
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II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1 TIPO DE ESTUDIO
La presente investigación es básica de acuerdo a su
orientación, experimental de acuerdo a su diseño de contrastación.
2.2 DEFINICIÓN DE LA POBLACIÓN MUESTRAL:
La población bajo estudio estuvo conformada por el conjunto
de placas petri que contenían cada una de las diferentes
concentraciones del enjuague bucal a diferentes concentraciones a
base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el
crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175 (3x108 UFC),
en el laboratorio de Microbiología, de la Facultad de Medicina de la
Universidad Nacional de Trujillo.
2.2.1 Criterios de Inclusión
Placas con presencia adecuada de Streptococcus
mutans (3x108 UFC/mL) a priori al enfrentamiento
con el enjuague bucal a diferentes concentraciones
a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana.
Placas utilizadas para la determinación de la
Concentración Mínima Bactericida (CMB) que
presentaron efecto antibacteriano (ausencia o
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presencia de halos de inhibición de un diámetro
mayor de 8mm).
Placas utilizadas para la determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que no
presentaron crecimiento bacteriano ni
contaminación por otros microbios.
2.2.2 Criterios de Exclusión
Placas que después del proceso de incubación,
mostraron contaminación por otros microbios
(hongos).
2.3 CONSIDERACIONES ÉTICAS:
Esta investigación contó con la autorización del Comité
Permanente de Investigación de la Facultad de Medicina de la
Universidad Nacional de Trujillo y siguió los principios de la
Declaración de Helsinki de la asociación médica mundial,
adoptada por la 18a Médica Mundial (Helsinki 1964) y revisada
por la 64a Asamblea General de Fortaleza - Brasil 2013.
2.4 DISEÑO ESTADÍSTICO DE MUESTREO:
2.4.1 Unidad de análisis
La unidad de análisis para determinar la CMI lo
constituye cada una de las placas Petri que se
utilizaron. Las que contenían caldo de cultivo de
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Tioglicolato, enjuague dental a base de extracto
etanólico de Stevia rebaudiana a determinadas
concentraciones, y el inóculo de Streptococcus mutans
ATCC 25175.
La unidad de análisis para determinar la CMB lo
constituye cada una de las placas Petri inoculadas con
las suspensiones obtenidas a partir de la CMI.
2.4.2 Unidad de muestreo:
Las unidades de muestreo estuvieron
conformadas por las unidades de análisis. Éstas
cumplieron con los criterios de selección.
2.4.3 Marco de muestral
El marco muestral es el listado o registro de las
unidades de muestreo, es decir de las placas petri.
2.4.4 Tamaño de muestra
Para determinar el tamaño de muestra se hizo
uso de la fórmula que nos brinda el muestreo cuando el
interés es comparar la media de dos o más grupos de
estudio, para variable cuantitativa:
n = 2(Zα/2 + Zβ)2 (DE) 2/d2 donde:
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n : Tamaño (Número de elementos) de cada
grupo de estudio.
α : Probabilidad de cometer error tipo I.
β : Probabilidad de cometer error tipo II.
Z : Valor estándar (Coeficiente de confianza) de
la distribución normal asociada a un tipo de error.
DE : Desviación estándar de la variable
cuantitativa.
d : Diferencia mínima que se desea detectar
entre los promedios de ambos grupos, para rechazar
la igualdad de medias.
Asumiendo las exigencias del 95% de confianza
(α = 0.05 Zα/2= 1.96), una potencia de la prueba del
80% (β =0.20 Zβ= 0.842), una desviación estándar de
DE=37 para CMI según referencia, y una diferencia
mínima de d=55 para rechazar la igualdad de medias,
se obtiene:
n= 2*(1.96 +0.842)2*(37)2 = 7
552
Con estos valores se empleó una muestra de 7
repeticiones para cada grupo de estudio.
El total de tubos de ensayo y/o las placas Petri
que se utilizó como muestra, se determinó por el
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número de concentraciones que se utilizaron en el
experimento. Estas concentraciones fueron en total de
12 para la determinación de la Concentración Mínima
Inhibitoria y en número de 12 para la determinación de
la Concentración Mínima Bactericida, incluyendo los
controles. Por lo tanto la muestra total fue de:
n = n° de concentraciones x 7 repeticiones.
Para CMI:
n = 12 x 7 = 84 placas Petri.
Control A = 02 placas Petri.
Control B = 02 placas Petri.
Para CMB:
n = 12 x 7 = 84 discos de Kirby y Bauer. (21 placas).
Control = 01 placa Petri.
2.4.5 Diseño de contrastación:
El presente estudio es un diseño experimental,
con varios grupos de estudio y medición posterior. El
esquema puede representarse de la siguiente
manera:
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Grado de alcohol Grupo Variable dependiente Variable independiente
Concentración X
I UFC
Diámetro de halo. X1
IV
UFC
Diámetro de halo. X4
II UFC
Diámetro de halo. X2
III UFC
Diámetro de halo. X3
V UFC
Diámetro de halo. X5
VI UFC
Diámetro de halo. X6
30°
I UFC
Diámetro de halo. X1
IV UFC
Diámetro de halo. X4
II UFC
Diámetro de halo. X2
III UFC
Diámetro de halo. X3
V UFC
Diámetro de halo. X5
VI UFC
Diámetro de halo. X6
70°
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Donde:
X: Concentración del enjuague bucal a base de
extracto etanólico de Stevia rebaudiana.
X1: 1.07% usando etanol de 70° y 2.14% usando
etanol de 30°.
X2: 5 % usando etanol de 70° y 4.23 % usando
etanol de 30°.
X3: 10 % usando etanol de 70° y 10.7 % usando
etanol de 30°.
X4: 25 % usando etanol de 70° y 21.4 % usando
etanol de 30°.
X5: 50 % usando etanol de 70° y 32.1 % usando
etanol de 30°.
X6: 75 % usando etanol de 70° y 42.8 % usando
etanol de 30°.
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2.5 PROCEDIMIENTO E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE
DATOS:
2.5.1 Recolección e identificación taxonómica
02 Kg de hojas se Stevia rebaudiana fueron
recolectadas el día 12 de Julio del 2015, de la localidad
de Timaruca, distrito de San Ignacio (1050 m.s.n.m)
provincia de San Ignacio, región de Cajamarca.
Un ejemplar completo de planta fue llevado al
Herbarium Truxillensis de la Universidad Nacional de
Trujillo, para su identificación y verificación taxonómica.
2.5.2 Preparación de la muestra54:
Selección y lavado de la muestra: El material
recolectado fue transportado al laboratorio de
Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y
Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo,
en donde se seleccionó las hojas en buenas
condiciones. Luego se procedió a lavar el material
vegetal con agua destilada, seguido de una
desinfección, utilizando hipoclorito de sodio al 0.5
%. Posteriormente se realizó un enjuague de la
planta con suficiente agua destilada estéril, esto es
para retirar los residuos de hipoclorito.
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Secado: Las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni
fueron colocadas sobre papel Kraft y sometidas a
secado primero a temperatura ambiente por 24
horas, y luego en la estufa a una temperatura de
40°C, por cinco días . Se realizó la determinación
de peso cada 24 horas hasta valores constantes.
Pulverización: Una vez secadas las hojas, estas
se pulverizaron con ayuda de un mortero.
Tamizaje: El material obtenido de la pulverización,
se pasó a través de los tamices Nº 2, 1.2, 0.7, 0.3.
La muestra de trabajo correspondió al tamiz 0.7.
Almacenamiento: El polvo de las hojas de Stevia
rebaudiana bertoni obtenidas, se guardaron en
frascos de vidrio de color ámbar de boca ancha.
2.5.3 Preparación del extracto etanólico54:
Se pesó 20g de la muestra previamente pulverizada
y tamizada. Luego se humectaron por separado
con 20 mL de etanol de 70º G.L., se colocaron en
una cápsula de porcelana y se mezclaron con
cantidad suficiente de arena lavada.
Luego se vertió en un cartucho de papel de filtro y
se colocó en el extractor del equipo de soxhlet y se
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extrajo con 150 mL de etanol de 70° Gay Lussac a
una temperatura de 60oC a 80oC durante 4 horas.
El producto se filtró 3 veces, primero con papel
filtro Whatman N° 41, un segundo filtrado se realizó
con papel filtro Whatman N°4 y por último un tercer
filtrado fue en papel Whatman N°2. Así se obtuvo
un extracto purificado libre de gérmenes.
La solución resultante fue llevada a sequedad en
una cámara de secado al vacío a una presión
reducida y a una temperatura de 40 °C; luego se
pesó el residuo seco y se guardó en refrigeración a
2°C en frasco de vidrio de color ámbar estéril. Del
residuo seco, se prepararán las concentraciones
de 1,07%, 5%, 10%, 25%, 50% y 75% disueltas en
etanol de 70ºGay Lussac respectivamente; y las
concentraciones de 2,14%, 4,23%, 10,7%, 21,4%,
32,1% y 42,8% en etanol de 30º Gay Lussac.
2.5.4 Preparación del enjuague bucal55:
El material recolectado fue trasportado al laboratorio
de Farmacología de la Facultad de Farmacia y
Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo Se
tomó el extracto etanólico de Stevia rebaudiana
como edulcorante del mismo, acompañado de
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saborizantes, conservantes y preservantes. Por
medio de procedimientos como:
2.5.4.1 Formulación del enjuague bucal a base de
extractos etanólicos de Stevia rebaudiana
Bertoni.
Para la formulación del enjuague bucal se
procedió de acuerdo a lo establecido por De
los Ángeles y Veloz (2011) con
modificaciones. Dentro de la formulación se
consideraron las materias primas más
importantes: un tensioactivo o detergente
(lauril éter sulfato de sodio), sustancias
humectantes (sorbitol y glicerina), y el
principio activo (extracto etanólico de Stevia
rebaudiana bertoni). Las concentraciones
utilizadas de cada materia prima estuvieron
dentro de los rangos sugeridos por la
bibliografía (Muñoz, 2000). En las Tablas del
1 al 12 se presentaron las fórmulas del
enjuague bucal para una presentación de 80
mL y en la tabla 13 el enjuague bucal sin el
extracto (control negativo). (Anexo 01)
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5.6.4.2 Elaboración del enjuague bucal a base de
extracto etanólico de Stevia rebaudiana
Bertoni.
En primer lugar se procedió a pesar y medir
todos los ingredientes de la fórmula de cada
enjuague bucal. Seguidamente se mezcló el
lauril éter sulfato de sodio junto con la
glicerina, el sorbitol en un agitador
magnético a 800 rpm durante 10 minutos y,
poco a poco, se añadió las ¾ partes del
disolvente (agua), luego el alcohol y el
extracto etanólico de Stevia. Así se fue
completando la formulación con el resto del
disolvente hasta alcanzar el volumen total
especificado en la fórmula.
Posteriormente, se procedió al envasado y
etiquetado del enjuague bucal en un frasco
de vidrio, dejándolo reposar por 24 horas
para que desaparezca la espuma formada
durante el proceso de manufactura.
Finalmente, se determinó el efecto
antibacteriano del enjuague bucal preparado
a las diferentes concentraciones.
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2.5.5 Método microbiológico56.
A. Obtención de la cepa:
Este estudio utilizó un cultivo liofilizado de la cepa
de Streptococcus mutans ATCC 25175, el cual se
obtuvo del laboratorio GenLab, de Lima.
La cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175
se reactivó cultivándola en Agar Soya Tripticasa –
Sangre, en microanaerobiosis utilizando el
método de la vela por 04 días a 37 °C.
La cepa preparada se diluyó en medio Tioglicolato
hasta alcanzar la turbidez del tubo 0.5 de la
escala de Mc Farland correspondiente a 108
bacterias/mL.
B. Preparación del inóculo:
Las cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175
se cultivaron en tubos de ensayo cerrados
herméticamente conteniendo el medio Agar Soya
Tripticasa - Sangre.
Se incubaron bajo condiciones de
microanaerobiosis a 37oC con el fin de obtener
colonias jóvenes. Luego de 24 horas cada cepa
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de Streptococcus mutans ATCC 25175 se diluyó
en caldo de Tioglicolato hasta que se obtuvo una
turbidez semejante al tubo número 05 de la escala
de Mac Farland. Los tubos con la bacteria fueron
girados entre las manos durante 30 segundos
antes de proceder al sembrado para distribuir los
microorganismos adecuadamente.
C. Determinación de la concentración mínima
inhibitoria (CMI):
Para determinar la concentración inhibitoria
mínima del extracto etanólico de la Stevia
rebaudiana se realizó lo siguiente: Se colocó 0.8
ml del del enjuague bucal a base de extracto
etanólico de la Stevia rebaudiana al 1,07%, 5%,
10%, 25%, 50% y 75% disueltas en etanol de
70ºGay Lussac respectivamente; y las
concentraciones de 2,14%, 4,23%, 10,7%, 21,4%,
32,1% y 42,8% en etanol de 30º Gay Lussac, cada
concentración en un tubo de ensayo, previamente
etiquetado. Después del proceso de dilución se
colocó un inoculo de 0.2 ml del cultivo preparado
de Streptococcus mutans ATCC 25175, en los
tubos que contenían las diversas concentraciones
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del enjuague bucal; así como al control A (tubo
que no contuvo extracto etanólico a base de
Stevia rebaudiana), y al control B (tubo que
contuvo la bacteria sin tratar) obteniéndose un
volumen final de 10mL para cada tubo y se llevó a
incubación a 37º C por un periodo de 24 horas en
condiciones de microanaerobiosis.
Luego de 24 horas se realizó la
determinación de la CIM con Agar Müller Hinton –
Sangre, tomando 0,1 ml de las suspensiones de
los tubos y se dispersó en toda la placa para
determinar las unidades formadoras de colonias
(UFC).Después del sembrado, se llevó a
incubación a 37oC por 24 horas en jarra Gaspak
en condiciones de microanaerobiosis 5 a 10% de
CO2.
Todo el procedimiento fue realizado bajo
condiciones asépticas y se efectuaron 07
repeticiones por concentración. Luego de 24
horas se realizó el conteo de las colonias en cada
una de las placas. La concentración inhibitoria fue
aquella en la que se llegó a inhibir completamente
el desarrollo de los gérmenes.
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D. Determinación de susceptibilidad de
Streptococcus mutans ATCC 25175 frente al
enjuague bucal a diferentes concentraciones
(CMB):
Determinación de la sensibilidad o resistencia
antibacteriana (Efecto antibacteriano).
Un hisopo estéril fue embebido con la cepa
preparada a una distancia de 10 cm de la llama
del mechero se procedió al sembrado en camada
en placas Petri conteniendo Agar Müeller Hinton -
Sangre, se estrió el hisopo uniformemente sobre
toda la superficie del agar, girando cada placa 30
grados, 10 veces aproximadamente. Las placas
recién sembradas fueron incubadas en
condiciones de microanaerobiosis a 37º C en
atmósfera con 5% de CO2 durante 24 horas. Para
el efecto antibacteriano se empleó la técnica de
difusión de discos de Kirby y Bauer, la cual
consiste en preparar discos de papel de filtro
estériles, los que fueron sumergidos dentro de
cada concentración del enjuague bucal a base de
extracto etanólico de Stevia rebaudiana, por el
periodo no menor de una hora. Además se
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colocaron los discos embebidos con cada
concentración del enjuague bucal empleando una
placa de control; se utilizó como control
Clorhexidina al 0.12% (Perio·Aid®), el cual fue
embebido de la misma forma que los discos
experimentales.
Luego con una aguja estéril, estos se colocaron
sobre los cultivos de Streptococcus mutans ATCC
25175 en las placas petri previamente
preparadas; las placas se mantuvieron en la
misma posición por un periodo de 5 minutos.
Luego de este tiempo las placas se voltearon de
posición y se incubaron en microanaerobiosis
utilizando la jarra de GasPack, con el método de
vela, mediante el cual se obtuvo un ambiente
aproximadamente de 5 a 10% de CO2, a 37º C
durante 24 horas.
Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro
del diámetro de 10 cm de la llama de un mechero.
La lectura de los resultados se llevó a cabo
después de las 24 horas, mediante la inspección
visual de cada placa. Se efectuó tomando el
registro en milímetros de los halos de inhibición
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del crecimiento de Streptococcus mutans ATCC
25175.
Después de ese tiempo se observó si hubo o
no efecto, es decir, si hubo sensibilidad o
resistencia del Streptococcus mutans ATCC
25175 al enjuague bucal a las diferentes
concentraciones.
La sensibilidad se medió empleando una
regla calibrada (Vernier) y se utilizó la Escala de
Duraffourd para determinar cualitativamente el
efecto inhibitorio in vitro, según el diámetro del
halo de inhibición, zona alrededor del disco donde
una sustancia antibacteriana es capaz de impedir
el crecimiento de la bacteria al cabo de 18 a 24
horas de incubación.
La Escala de Duraffourd comprende 04
valores; siendo nula (-) para un diámetro inferior a
8 mm, de sensibilidad límite (sensible = +) para un
diámetro comprendido entre 8 a 14 mm, medio
(muy sensible = ++) para un diámetro entre 14 y
20 mm, y sumamente sensible (+++) para un
diámetro superior a 20 mm.57
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E. Controles:
Para la concentración inhibitoria mínima
(CIM): Se utilizó como control A el enjuague bucal
sin extracto etanólico a base de Stevia
rebaudiana, y como control B Streptococcus
mutans ATCC 25175 sin tratamiento suspensión
estándar (3x108 UFC/ mL).
Para determinar la susceptibilidad (CMB): Se
utilizó como control Clorhexidina al 0.12 %
(Perio·Aid®) de la Empresa DENTAID.
F. Instrumento
El instrumento de recolección de los datos
fue estructurado para el registro de la CMI y CMB
(Anexo 01, 02, 03 y 04).
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2.6 Variables de estudio:
2
2.6.1 Definición de las variables:
2.6.1.1 Streptococcus mutans ATCC 25175:
Conceptual: El Streptococcus mutans es un coco
Gram positivo, dispuesto en cadena, no móvil,
catalasa negativo12 está involucrado con el inicio de
la lesión de caries11. Cepa estándar de Streptococcus
Variable
Indicador
Tipo
Escala de
medición
Dependiente
Streptococcus
mutans ATCC 25175
UFC/ mL
mm
Cuantitativa
De razón
Independiente
Efecto
antibacteriano
del enjuague
bucal a
diferentes
concentracion
es a base de
extracto
etanólico de
Stevia
rebaudiana.
CMI
mg/ mL
Cuantitativa
De razón
CMB
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mutans con nomenclatura 25175 asignada por la
American Type Culture Collection.58
Operacional: Para efectos de la investigación fue
valorada mediante el conteo UFC/mL a la Cepa
estándar de Streptococcos mutans ATCC 25175.
2.6.2 Efecto antibacteriano del enjuague bucal a base de
extracto etanólico de Stevia rebaudiana
Conceptual:
Acción de una sustancia obtenida a partir de un
edulcorante natural como Stevia rebaudiana sobre la
inhibición y susceptibilidad de Streptococcos mutans
ATCC 25175.8
Operacional:
En la presente investigación el enjuague bucal a base
de extracto etanólico de Stevia rebaudiana fue a
diferentes concentraciones y su efecto antibacteriano
se evaluó mediante la determinación de la
concentración mínima inhibitoria (CMI), siendo
efectiva siempre que se inhiba completamente el
desarrollo bacteriano; y la Concentración Mínima
Bactericida (CMB), teniendo en cuenta la Escala de
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Duraffourd57. Donde la CMI fue la medición principal
que determine la acción antibacteriana.
EFECTO ANTIBACTERIANO
CON EFECTO
SIN EFECTO
CMI < 200 UFC > 200 UFC
CMB ≥ 8 mm < 8 mm
- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Conceptual: Fue interpretada como la mínima
concentración del enjuague bucal a base de
extracto que inhibe el crecimiento del
microorganismo después de su incubación.
Operacional: La definición coincidió con la
conceptual al ser valorada mediante el número
obtenido en mg/ mL del enjuague bucal a
diferentes concentraciones a base de extracto
etanólico de Stevia rebaudiana donde se
pretendió apreciar crecimiento del
Streptocococcus mutans menor a 200 UFC.33
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- Concentración Mínima Bactericida (CMB)
Conceptual: Fue interpretada como la mínima
concentración del enjuague bucal a diferentes
concentraciones a base del extracto donde se
pretendió apreciar el diámetro del halo de
inhibición mayor a 8 mm.33
Operacional: Para efectos de la investigación la
definición coincidió con la conceptual al ser
valorada mediante el valor numérico obtenido
midiendo el halo de inhibición y escoger la
concentración del enjuague bucal a diferentes
concentraciones a base de extracto etanólico de
Stevia rebaudiana en mg/ mL.
2.7 Análisis estadístico e interpretación de datos:
Para analizar la información se aplicó el ANVA de un Diseño
Completamente Aleatorizado, con 3 repeticiones por cada
concentración. Para determinar cuál es la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB),
se hizo uso de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey
usando el software SPSS 18.0, con un nivel de significancia del
5% (p < 0.05).
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III. RESULTADOS
El presente estudio de tipo experimental in vitro, tuvo como
objetivo determinar el efecto antibacteriano in vitro de un enjuague
bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de
Stevia rebaudiana sobre una muestra de 86 placas con el inóculo
Streptococcus mutans ATCC 25175, al análisis de los datos se
encontraron los siguientes resultados:
La acción inhibitoria del enjuague bucal a base de extracto
etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC
25175, se presentó a partir de la concentración de 1,07mg/mL en
el enjuague trabajado en etanol de 70° y a partir de la
concentración de 2,14 mg/mL, en el enjuague trabajado en etanol
de 30°. TABLA 01.
La acción bactericida del enjuague bucal a base de extracto
de etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans
ATCC 25175, se presentó a partir de la concentración de 75
mg/mL en el enjuague a base de extracto trabajado en etanol de
70° mientras que fue estadísticamente nula en etanol de 30°.
TABLA 02.
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TABLA 01
Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) de un enjuague bucal a diferentes concentraciones sobre
Streptococcus mutans ATCC 25175, usando extracto etanólico de Stevia rebaudiana en OH 30° Y 70°.
OH 30° OH 70°
2.14% 4.28% 10.70% 21.40% 32.10% 42.80% 1.07% 5.00% 10.00% 25.00% 50.00% 75.00%
Control
A
Control
B
Media 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 4760.5 109
Desv. estándar 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 753.1 0.0
Media ± DE
(OH)
0.0
±
0.0
0.0
±
0.0
Prueba entre
OH
Prueba entre concentración
Control A : Contiene solo excipientes Control B : Solo bacteria
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TABLA 02
Determinación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ATCC 25175 frente al enjuague bucal a diferentes
concentraciones (CMB), usando extracto etanólico de Stevia rebaudiana en OH 30° Y 70°.
Indicador OH 30° OH 70°
2.14% 4.28% 10.70% 21.40% 32.10% 42.80% 1.07% 5.00% 10.00% 25.00% 50.00% 75.00%
Clorhexidina
0.12%
Media 6.0 6.0 6.0 7.9 7.9 6.9 6.0 6.0 6.0 8.4 10.8 11.8 26.4
Desv. estándar 0.0 0.0 0.0 1.4 0.7 0.6 0.0 0.0 0.0 0.7 0.9 1.9 5.1
Media ± DE (OH) 6.7 ± 0.9 8.2 ± 2.6
Prueba entre OH
Prueba entre concentración
Prueba Duncan* a a a b b c a a a b c d
*: Dos concentraciones con la misma letra no difieren estadísticamente en cada OH
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IV. DISCUSIÓN
La microflora oral es un complejo ecosistema que contiene
una amplia variedad de especies microbianas, el concepto actual
contempla en la patogénesis de la caries dental a microorganismos
que incluyen Lactobacillus acidophilus, Actinomyces spp y
Streptococcus mutans como el agente más importante asociado a
ella12. El reconocimiento de la importancia de estos
microorganismos en el inicio y progresión de la caries, conduce a
tomar medidas dirigidas a la disminución de estas bacterias en la
cavidad oral.
La humanidad tiene una marcada preferencia hacia los
alimentos dulces y con base en ello es que actualmente se
promociona el uso edulcorantes naturales quienes producen las
mismas sensaciones que el azúcar. Entre los edulcorantes no
nutritivos destacan: la Sacarina, Aspartame, Sucralosa, Ciclamato,
Acesulfame K, Neotamo, Alitamo, Xylitol, Sorbitol y recientemente
se ha incorporado a la Stevia rebaudiana bertoni, cuyo sabor es lo
más parecido al azúcar, distinguiéndose de los edulcorantes
artificiales por no tener sabor metálico y no ser cancerígeno30, 45.
En tal sentido el presente estudio fue realizado con la
finalidad de determinar la efectividad in Vitro de un enjuague bucal
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concentraciones, sobre el crecimiento de una cepa estándar de
Streptococcus mutans ATCC 25175 para el control de la caries
dental.
Los resultados muestran que el enjuague bucal en estudio a
diferentes concentraciones, tanto en alcohol de 70° como en el de
30° son ciento por ciento efectivos para el control del
Streptococcus mutans ATCC 25175 (p 0.05). Resultados similares
fueron encontrados por Pérez S48, 2013, usando extracto etanólico
de Stevia rebaudiana en un estudio in vitro con las mismas
concentraciones.
De este modo es notoria la capacidad antibacteriana del
enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana
bertoni para el control del microorganismo, la cual puede ser
atribuida y/o asociada a los componentes químicos principales
obtenidos de las hojas de Stevia que contienen glucósidos de
esteviol de los cuales destacan con un 95% el esteviósido y el
rebaudiósido A, cuyas propiedades han demostrado ser
beneficioso para la salud sistémica como antioxidante,
quimioprotectora, antiinflamatoria, digestiva, vasodilatadora y
recientemente para la salud oral frente a diversos microorganismos
pues pasa por el cuerpo sin producir ningún tipo de efecto tóxico,
es decir, este producto sería seguro para su uso en embarazadas,
adultos y niños con restricciones de edad28, 33, 36, 49. Inclusive se
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puede pensar en un sinergismo entre estos glucósidos y sus
metabolitos secundarios para producir tal efecto, no obstante aún
no se han reportado trabajos donde se aíslen y estudien de
manera particular.
Por otro lado, los saborizantes, conservantes y preservantes
como lauril éter sulfato de sodio (tensioactivo o detergente),
sorbitol y glicerina (sustancias humectantes), además de alcohol
96° quienes acompañan su composición podrían ejercer un papel
coadyuvante en su efecto antibacteriano.
En términos generales los edulcorantes naturales están
ganando terreno debido a los múltiples beneficios que se les ha
observado; no obstante, con los antecedentes existentes, se
puede postular a este edulcorante como un potencial complemento
terapéutico en la atención odontológica, con su posible uso como
enjuague bucal en el control de la caries sobre Streptococcus
mutans como agente patógeno principal, bajo restricciones en la
edad y sobre todo en pacientes que presenten condiciones de
obesidad, diabetes e hipertensión.59
Este estudio ha evidenciado que el enjuague bucal a
diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia
rebaudiana es efectivo sobre este microorganismo a partir de la
concentración de 1,07 mg/mL y 2,14 mg/mL trabajado en etanol de
70° y 30° respectivamente (p 0.05).
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Al respecto, estos resultados se soportan con los estudios
realizados por Pérez Guevara S48, quién demostró el efecto
antibacteriano in vitro, del extracto etanólico de Stevia rebaudiana
sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, donde las
concentraciones mínimas inhibitorias del extracto fueron de 1,07
mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70° y 4,28 mg/mL en
extracto trabajado en etanol de 30°; y las concentraciones mínimas
bactericidas fueron de 10mg/mL en los enjuagues a base de
extracto trabajados en etanol de 70° y 42,8 mg/mL en etanol de
30°.
Vitery Sapuyes G. et al49. en 2010, demostraron la actividad
antibacteriana de la Stevia rebaudiana contra del Streptococcus
mutans y el Lactobacillus acidophilus, a través de un estudio in
vitro utilizando la técnica de difusión en Agar Mueller Hinton,
evidenciando efecto inhibitorio en su crecimiento.
Por otro lado, la concentración mínima bactericida del
enjuague bucal utilizado en este estudio, que mostró ser efectiva
sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, fue de 75 mg/mL en los
enjuagues a base de extracto trabajados en etanol de 70°, por lo
que se podría inferir que a mayor concentración del extracto
etanólico en el enjuague, mayor es su efecto bactericida; mientras
que fue estadísticamente nula en etanol de 30°.
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Estos resultados difieren con los encontrados por Gamboa
F45. et al. En Colombia en 2012, demostraron la actividad
antimicrobiana in vitro de 5 extractos: hexano, metanol, etanol,
acetato de etilo y cloroformo obtenidos a partir de hojas de Stevia
rebaudiana Bertoni sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 por
método de difusión en pozo, obtuvieron halos de inhibición de
10.0, 9.3, 9.0, 10.0, 12.0 en mm para 30 mg / ml, 120mg / ml, 120
mg / ml, 60 mg / ml y 60 mg / ml de cada extracto respectivamente.
Así mismo, Vitery Sapuyes G. et al49. en 2010. demostraron
la actividad antibacteriana de la Stevia rebaudiana contra del
Streptococcus mutans y el Lactobacillus acidophilus, a través de
un estudio in vitro, formándose halos de inhibición en promedio de
14,5 mm con el S. mutans y de 15,5 mm contra el L. acidophilus a
una concentración de 50 mg/ml soportado por la prueba
estadística.
En el presente estudio se realizó un control positivo
utilizando Clorheridina al 0.12 %, quién demostró su efectividad
como Gold Estándar en el control de la microflora oral y para tal
caso, sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, al no observarse
crecimiento del microorganismo y tener la capacidad de producir
halos de inhibición de 14.25 mm.
La mayor actividad antibacteriana frente a Streptococcus
mutans ATCC 25175 se obtuvieron con los extractos en etanol de
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70°, éstos resultados están de acuerdo con los de Mohammadi-
Sichani, (2012). Entre los cuatro extractos de Stevia rebaudiana,
los extractos de acetona (28,7 ± 2,8) y etanol mostraron
significativamente (p <0,05) mayor actividad en comparación con el
extracto de metanol y el extracto acuoso frente a Streptococcus
mutans en cada concentración. Por ello, probablemente los
metabolitos activos de Stevia rebaudiana son más solubles y
actúan mejor como sustancia antibacteriana cuando están
disueltos en etanol.
Vitery Sapuyes G. et al49. En 2010. Demostraron que los
resultados de los extractos de Stevia Rebaudiana con metanol y
etanol comparados con los de la Vancomicina son
estadísticamente iguales, con un valor de p igual al 20% para el
extracto con metanol y el 79% para el extracto con etanol, lo que
indica que sus efectos son similares, mientras que de extractos de
Stevia con hexanol y acetato de etilo mostraron evidencias
significativas, comparados con los resultados obtenidos con la
Vancomicina, con valores de p inferiores al 5%, lo que indica que
la Vancomicina mostró mejores resultados en la inhibición del
crecimiento que estos dos extractos.
Los promedios obtenidos en el control positivo, donde se
usó Penicilina muestra que este antibiótico es efectivo contra
Streptoccocus mutans, sin embargo no es factible su uso clínico
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debido a los diversos efectos adversos como las reacciones de
hipersensibilidad, las superinfecciones, manchas intrínsecas en los
dientes y en especial por generar resistencia bacteriana; éstos
inconvenientes orientan la investigación hacia nuevos productos
que sean seguros para el huésped y específicos para la flora
patógena de la boca, agentes antimicrobianos que pueden cumplir
un papel importante en la prevención de la caries dental.23
Los resultados del estudio corroboran lo reportado acerca
de los fitoquímicos naturales, sobre que podrían ofrecer una
alternativa a los antibióticos y representan un prometedor enfoque
en la prevención y estrategias terapéuticas para la caries dental y
otras enfermedades de la boca23, 45.
En el Perú, la caries dental es un problema de salud pública,
siendo aún la atención odontológica de elevado costo y no
accesible a toda la población; teniendo en cuenta que la fitoterapia
es una alternativa viable para el tratamiento de diversas patologías
orales; este estudio pone en evidencia que Stevia rebaudiana,
podría ser usada para prevenir la caries dental por su capacidad
para controlar el crecimiento del patógeno de la caries, por sus
propiedades beneficiosas en la salud y su bajo costo para la
elaboración del producto que se haría más accesible .
En tal sentido, este estudio, demuestra que existe un
potencial efecto en el enjuague bucal a diferentes concentraciones
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a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el
crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175, no obstante,
las pruebas de susceptibilidad bacteriana son sólo el inicio de una
línea de investigación cuyo objetivo final será la administración de
este producto aplicado clínicamente con fines preventivos contra la
caries dental. Por lo tanto, es de crucial importancia identificar y
aislar los metabolitos activos que estarían cumpliendo con la
función antimicrobiana específica, y de esta manera atacar
directamente a los patógenos de la cavidad oral con mayor
efectividad.
Finalmente, acogemos la hipótesis propuesta, pues de
acuerdo a los resultados podemos afirmar que el enjuague bucal a
base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana a diferentes
concentraciones presenta efecto antibacteriano in vitro sobre
Streptococcus mutans ATCC 25175; por lo que podría ser usado
para el control de los patógenos de la caries en pacientes previo
estudios in vivo.
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V. CONCLUSIONES
El enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia
rebaudiana tiene efecto antibacteriano sobre Streptococcus
mutans ATCC 25175.
La concentración mínima inhibitoria (CMI) evaluada fue de
1,07mg/mL trabajado en etanol de 70° y de 2,14 mg/mL en
etanol de 30°.
La concentración mínima bactericida (CMB) evaluada fue de
75 mg/mL trabajado en etanol de 70° y nulo en los
enjuagues a base de extracto trabajado en etanol de 30°.
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VI. RECOMENDACIONES
Realizar estudios que identifiquen las sustancias activas por el
cual se produce el efecto antibacteriano de un enjuague bucal a
diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia
rebaudiana.
Realizar estudios que determinen el mecanismo de acción por el
cual el enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia
rebaudiana ejerce un efecto antibacteriano sobre Streptococcus
mutans ATCC 25175.
Realizar estudios donde se enfrente el enjuague bucal a
diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia
rebaudiana con cepas de Streptococcus mutans aisladas de
pacientes.
Realizar estudios in vitro y estudios clínicos in vivo para
determinar la biocompatibilidad del enjuague bucal a base de
extracto etanólico de Stevia rebaudiana.
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Farmacia y Alimentos. Universidad Habana de Cuba 2002. Revista
Habanera de Ciencias Médicas, Vol. 1, 101-105.
55. De los Ángeles, M; Veloz, T. Eficacia in-vitro de un colutorio
elaborado con aceite esencial de la hoja de Ishpingo ocotea quixos
(Lam.) Kostern. ex O.C. Schmidt y clavo de olor Syzygium
aromaticum (L.) Merr. & L.M. Perry. La Granja 13(1): 31-41. 2011.
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador.
56. Koneman E. W. et al. Diagnóstico microbiológico. Texto y Atlas en
color. 6a Edición. 2008.
57. Duraffourd C, D'Hervicourt, LLapraz J. Cuaderno de Fitoterapia
Clínica. Barcelona: Masson, 1987
58. Pretel S. Efecto antibacteriano del extracto butanólico de Mauria
heterophylla (gian) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.
Estudio in vitro. [Tesis para optar el Grado de Maestro] Universidad
Nacional de Trujillo. Perú. 2011
59. Contreras S. Anticariogenic properties and effects on periodontal
structures of Stevia rebaudiana Bertoni. Narrative review. Journal of
Oral Research. Private practice. Chile. 2013. [Fecha de acceso 22
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ANEXOS
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TABLA RESUMEN
“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a
diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de
Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”.
Enjuague bucal a
base Extracto
etanólico de Stevia
rebaudiana
CMI (mg/mL)
CMB (mg/mL)
OH 70°
1,07
75
OH 30°
2,14
-
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REPRESENTACIÓN FOTOGRÁFICA DEL PROCEDIMIENTO
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ANEXO 01
Tabla 1. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 1,07%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 1,07 % 80 ml
Tabla 2. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 5 %.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25%
5 % 80 ml
Tabla 3. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de
Stevia rebaudiana Bertoni al 10%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 10 % 80 ml
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Tabla 4. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 25%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 25 % 80 ml
Tabla 5. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 50%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 50 % 80 ml
Tabla 6. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 75%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 75 % 80 ml
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Tabla 7. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 2,14%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 2,14 % 80 ml
Tabla 8. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 4,23%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 4,23 % 80 ml
Tabla 9. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de
Stevia rebaudiana Bertoni al 10,7%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 10,7 % 80 ml
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Tabla 10. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 21,4%
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 21,4 % 80 ml
Tabla 11. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 32,1%.
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 32,1% 80 ml
Tabla 12. Fórmula del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni al 42,8%
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Extracto etanólico de Stevia Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 42,8 % 80 ml
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Tabla 13. Fórmula del enjuague bucal sin extracto etanólico de Stevia
rebaudiana Bertoni (control negativo)
Sustancia Porcentaje
Emal 70 (Lauril éter sulfato de sodio) Glicerina Sorbitol Alcohol 96º Agua destilada c.s.p
3,75% 18,38% 5,63% 6,25% 80 ml
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ANEXO 02
“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico
de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”
1.- Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI), usando extracto etanólico OH 70°.
Concentración de
enjuague bucal
(mg/ml)
Repeticion
UFC
Control A
Control B
1.07%
5%
10%
25%
50%
75%
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
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ANEXO 03
“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico
de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”
1.- Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI), usando extracto etanólico OH 30°.
Concentración de
enjuague bucal
(mg/ml)
Repeticion
UFC
Control A
Control B
2.14%
4.28%
10.7%
21.4%
32.1%
42.8%
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
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ANEXO 04
“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”
1.- Determinación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ATCC 25175 frente al enjuague bucal a diferentes concentraciones (CMB), usando extracto etanólico OH 70°.
Concentración de
enjuague bucal
(mg/ml)
Repeticion
Diámetro de halo de Inhibición (mm)
Clorhexidina al
0.12 %
(Perio·Aid®
DENTAID)
1.07%
5%
10%
25%
50%
75%
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
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ANEXO 05
“Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico
de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175”
1.- Determinación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ATCC 25175frente al enjuague bucal a diferentes
concentraciones (CMB), usando extracto etanólico OH 30°.
Concentración de
enjuague bucal
(mg/ml)
Repeticion
Diámetro de halo de Inhibición (mm)
Clorhexidina al
0.12 %
(Perio·Aid®
DENTAID)
2.14%
4.28%
10.7%
21.4%
32.1%
42.8%
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
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ANEXO Nº 06
EVALUACIÓN DE LA TESIS
El Jurado deberá: Consignar las observaciones y objeciones pertinentes relacionados a los siguientes ítems. Anotar el calificativo final. Firmar los tres miembros del Jurado.
TESIS:……………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
1. DE LAS GENERALIDADES:
El Título ……………………………………………………………………….
….………………………………………………………………………………
Tipo de Investigación:………………………………………………………..
………………………………………………………………………………….
2. DELPLAN DE INVESTIGACIÓN:
Antecedentes:……………………………………………………………
Justificación:..................................................................................
Problema:……………………………………………………………….
Objetivos:………………………………………………………………..
Hipótesis:………………………………………………………………..
Diseño de Contrastación:………………………………………………
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Tamaño Muestral…………………………………………………………
Análisis Estadístico: ……………………………………………………
3. RESULTADOS:………………………………………………………………
………………………
4. DISCUSIÓN:…………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
……………………………………………….
5. CONCLUSIONES:……………………………………………………………
6. REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS:………………………………………..
7. RESUMEN:……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………..
8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:………………………………….
9. ORIGINALIDAD:……………………………………………………………
10. SUSTENTACIÓN
10.1 Formalidad:………………………………………………………
10.2 Exposici6n:…………………………………………………………
10.3Conocimiento del Tema: …………………………………..
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CALIFICACIÓN:
(Promedio de las 03 notas del Jurado)
JURADO: Nombre Código
Docente
Firma
Presidente: Dr.……………………............. ……………………
……………………
Grado Académico: ……………………………………………………
Secretario: Dr.…………………………….. ….……………….
…………………..
Grado Académico: ……………………………………………………
Miembro: Dr.………………………………… ….……………….
…………………………
Grado Académico: …………………………………………………
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ANEXO Nº 07
RESPUESTAS DE TESISTAS A OBSERVACIONES DEL JURADO
El Tesista deberá responder en forma concreta de las observaciones del jurado a manuscrito en el espacio correspondiente: Fundamentando su discrepancia. Si está de acuerdo con la observación también registrarla. Firmar.
TESIS:
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………
1.- DE LAS GENERALIDADES:
El Titulo
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Tipo de Investigación
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
2.- DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN:
Antecedentes:
…………………………………………………………………………………………
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Justificación:
………………………………………………………………………………………….
Problema:
…………………………………………………………………………………………
Objetivos:
………………………………………………………………………………………….
Diseño de Contrastación: …………………………………………………………
Tamaño Muestral:
………………………………………………………………………………
Análisis Estadístico: …………………………………………………………………
3.- RESULTADOS:
……………………………………………………………………………………
4.- DISCUSIÓN:
…………………………………………………………………………………….
5.- CONCLUSIONES:
………………………………………………………………………………….......
..................................................................................
6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ………………………………………….
7.- RESUMEN:………………………………………………………………………
…………………...
8.- RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:…………………………………....
9.- ORIGINALIDAD:
………………………………………………………………………………….
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11. SUSTENTACIÓN:………………………………………………………
10.1 Formalidad:
………………………………………………………………
10.2 Exposición:
………………………………………………………………
10.3 Conocimiento:
…………..……………………………………………………………
………………………........
Nombre
Firma
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CONSTANCIA DE ASESORAMIENTO
El que suscribe Dra. Teresa Etelvina Ríos Caro, profesora de la Facultad de
Estomatología, de la Universidad Nacional de Trujillo, hace constar que es
ASESORA del proyecto de Investigación titulado: ―Efecto antibacteriano in
vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto
etanólico de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans ATCC 25175‖,
perteneciente a la alumna: BECERRA QUIROZ, Layla Marinés, del sexto año
identificada con DNI. Nº 70495331, Matrícula. Nº 012100110.
Trujillo, 11 de Enero del 2016
_______________________________________
C.D. Esp.Dra Teresa Etelvina Ríos Caro
Cod. UNT 4118
ASESORA
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