Post on 26-Apr-2020
Genómica Funcional en FarmacologíaGenómica Funcional en Farmacología
Genética MolecularCiencias BiológicasUniversidad de Jaén
Antonio Caruz ArcosDpto. Biología Experimental, Área de Genética
Universidad de Jaén
Dianas moleculares en descubrimiento de drogasDianas moleculares en descubrimiento de drogasDianas moleculares en descubrimiento de drogasCada tejido presenta un patrón específico
de expresión génicaLos niveles de expresión frecuentemente difieren en
situaciones patológicas
Genes estimulados Genes reprimidos
“ La identificación de la expresión diferencial es el paso cruci“ La identificación de la expresión diferencial es el paso crucial en al en la localización de importantes dianas moleculares para diseño dela localización de importantes dianas moleculares para diseño dedrogas”drogas”
Dianas moleculares en descubrimiento de drogasDianas moleculares en descubrimiento de drogas
De la función al genenzima/receptor
micropurificación ensayos funcionales
clonación gen
Del gen a la funcióngenotecas sustracción-específicas de tejido
microarrays identificación nuevas proteínas
knock-out ratónestructura proteína
diseño químico inhibidores
Principales etapas descubrimiento de fármacosPrincipales etapas descubrimiento de fármacos
•identificada nueva diana?• detectada la expresión génica?• gen clonado?• función biológica determinada?• relevancia terapéutica demostrada?
•ligandos naturales identificados?• producción proteína recombinante?• ensayos in vitro establecidos?• sistema de screening masivo?
•Diseño químico, química combinatoria• TERAPIA
Identificación dianas potencialesIdentificación dianas potenciales
Expresión diferencial I:Expresión diferencial I:con conocimiento previocon conocimiento previoMicroarrays de Microarrays de ADNADN
SAGESAGE
SSHSSH
DifferentialDifferential displaydisplay
Expresión Expresión diferencial II:diferencial II:sin conocimientosin conocimiento
previoprevio
Genotecas de Genotecas de ADNcADNcespecíficas de tejidoespecíficas de tejido
Tejido normal versus tejido patológico
OLigosOLigos
ADNcADNc
Validación de las dianas moleculares:Validación de las dianas moleculares:Identificación función génicaIdentificación función génica
Bloqueo función Bloqueo función génicagénica
KnockKnock--outsouts
siRNAsiRNA
IVET (in vivo IVET (in vivo expression technologyexpression technology))
STM (STM (signature tagged mutagenesissignature tagged mutagenesis))
Inmunohistoquímica
Doble híbrido/inmunoprecipitación
Phage display
Doble híbrido: identificación de parejas de interacciónDoble híbrido: identificación de parejas de interacción
Doble híbrido: mapas de interacción proteicaDoble híbrido: mapas de interacción proteica
Cada punto representa una proteína, las líneas indican interacciónentre ellas. Puntos rojos, proteínas esenciales (mutación letal)
InmunoprecipitaciónInmunoprecipitación: : Mapas de interacción proteicaMapas de interacción proteica
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PhagePhage displaydisplay
PhagePhagedisplaydisplay
CXCR4 -/-CXCR4 wt/wtSDF1 wt/wt SDF1 -/-
Cora
zón
Cora
zón
KnockKnock--outs: función génica y validación de dianasouts: función génica y validación de dianas
CXCR4 wt/wt CXCR4 -/-
E13,5
E15,5
Sist
ema
vasc
ular
Sist
ema
vasc
ular
RNA RNA interferenceinterference: nueva herramienta genómica: nueva herramienta genómica
1.1. RNAiRNAi: la introducción de ARN dc en una célula inhibe la : la introducción de ARN dc en una célula inhibe la expresión génica de forma específica de secuenciaexpresión génica de forma específica de secuencia
2.2. Fue primeramente descrito en C.Fue primeramente descrito en C.eleganselegans, , duplex duplex de de ARN de 20ARN de 20--30 30 pb pb producía el silenciamiento de los producía el silenciamiento de los genes homólogos.genes homólogos.
3.3. Sistemas similares han sido descritos en plantas y Sistemas similares han sido descritos en plantas y animales superiores.animales superiores.
4.4. Requiere: síntesis del ARN diana y su rotura específica Requiere: síntesis del ARN diana y su rotura específica que genera los ARN guías (19que genera los ARN guías (19--20 nucleótidos) con 2 20 nucleótidos) con 2 nucleótidos libres en el extremo 3´. Los nucleótidos libres en el extremo 3´. Los ARNi ARNi pueden pueden ser replicados por ser replicados por polimerasas polimerasas dependientes de ARN.dependientes de ARN.
5.5. ARNi ARNi se une a un complejo formando el RNAse une a un complejo formando el RNA--induced induced Silencing complex Silencing complex (RISC) que destruye el ARN diana(RISC) que destruye el ARN diana
Mecanismo de interferencia del ARNMecanismo de interferencia del ARN
cDNA ANDcpromotorpromotor terminador
Introducción Introducción plásmido plásmido en la en la célulacélula
cadena + cadena -ARN ARN transcrito transcrito en la célulaen la célula
Formación espontáneaFormación espontáneade bucle de ARN de bucle de ARN bcbc
Digestión por Digestión por ARNasaIIIARNasaIII RISC
complejo de complejo de interferencia interferencia de ARNde ARN
RISCAAAAAAAAAAAAAA
ARNm dianaARNm diana
AAAAAAAAAAAAAAARNm destruidoARNm destruido
SignatureSignature--taggedtaggedmutagénesis:mutagénesis:
Construcción de una Construcción de una colección de bacterias colección de bacterias mutantes por inserción de mutantes por inserción de un un transposóntransposón
Selección negativa genes Selección negativa genes esenciales durante la esenciales durante la infección: tuberculosis, infección: tuberculosis, identificados genes identificados genes metabolismo metabolismo lipídicolipídico
In vivo In vivo expressionexpression technologytechnology::Genes expresadosGenes expresadosdurante la infección.durante la infección.Selección positivaSelección positiva
•• Clonación aleatoria de Clonación aleatoria de fragmentos fragmentos genómicosgenómicos delante delante del gen GFP sin promotordel gen GFP sin promotor
•• Transformación bacteriana Transformación bacteriana con la genoteca aleatoriacon la genoteca aleatoria
•• Tratamiento similar inicio Tratamiento similar inicio infeccióninfección
•• Selección bacterias Selección bacterias fluorescentesfluorescentes
•• Eliminación falsos positivosEliminación falsos positivos
•• IDENTIFICACIÓN GENES IDENTIFICACIÓN GENES INDUCIDOS DURANTE LA INDUCIDOS DURANTE LA INFECCIÓNINFECCIÓN
Descubrimiento de dianas: cathepsina K como modeloDescubrimiento de dianas: cathepsina K como modelo
ratones knock-out
hibridación in situinmunohistoquímica
estructura proteínagenómica funcional:
hibridación sustractiva
Búsqueda dianas contra Búsqueda dianas contra la osteoporosis:la osteoporosis:
osteoclastososteoclastos
Difícil elección dianas molecularesDifícil elección dianas moleculares
Visión tradicionalalta eficacia dependiente baja expresión diana
fracaso: PALA-aspártico transcarbamilasaéxito: estatinas-HMG CoA reductasa
La abundancia de cathepsina K no reduce laeficacia de los inhibidores en modelos animales
Genómica y fármacos antiviralesGenómica y fármacos antivirales
Estrategias tradicionalesDianas virales: específicas, menos tóxicas
Dianas potenciales limitadas (VIH, VHC, HPV <10 proteínas)Funciones virales dificilmente atacables
Estrategias alternativasIdentificación funciones celulares necesarias para la replicación viral y descartar aquellas imprescindibles para la función celular,
similares obstáculos de toxicidad
Estudios de infección viral con microarrays (I)Estudios de infección viral con microarrays (I)
Virus Experimento Array Células Umbral Cambios
expresión
Comentarios
HCMV gB, 2–24 h 8942 (est.)humano
Fibroblastos 2.3× 441 Genes est. porinterferón
HCMV Infección 40min, 8 hy 24 h
6600 Oligoshumano
Affymetrix
Fibroblastos 4.0× 258 Genes est. porinterferón
HSV-1 Adenovirusexpresando
ICP0
>7500humanoIncyte
Fibroblastoshumanospulmón
2.0× 13
HSV-1d106
InfecciónICP0+
ICP27-
>7500humanoIncyte
HEL 2.0× 427
HSV-1tratadocon UV
Infección 24 h
19 000 (est.)humano
HEL 2.0× 32 Genes est. porinterferón
HSV-1KM110
InfecciónMutación enVP16/ICP0
19 000 (est.)humano
HEL 2.0× 33 Genes est. porinterferón
KSHV TransfecciónLANA
~6000 (est.)humano
Linfoma deBurkitt
2.0× 15 Genes est. porinterferón
Estudios de infección viral con microarrays (II)Estudios de infección viral con microarrays (II)
Virus Experimento Array Células Umbral Cambios
expresión
Comentarios
HIV-1 Infección2 y 3 días
1506 (est.)humano
CEM CD4 Tcélulas
1.5× 20 Tráfico intracelularFactores
transcripciónPolio Infección
3 días7000
humanoHeLa 1.7× 18 ++
12 --ARNs asociados a
polisomasHPV31 Transfección
genoma viral7075 (est.)UniGEMIncyte
Queratinocitoshumanos
2.3× 153 STAT1 repr.Genes est. por
interferónCVB3 Infección
ratóndías 3 y 9
7000 (est.)rata
Miocardiocitos 1.8× 619 Varias rutasintracelulares
MDV Infección48 h y 96 h
1126 (est.)pollo
Fibroblastospollo
2.0× 21, 22, 13 Genes est. porinterferón
HCV Transfección
region NSdías 5 y 10
6416 oligos
humanoAffymetrix
HepG2 2.0× 9 (día 5) 15
(día 10)
Varios genes
Influenza Infección24 h
15 000humano
HeLa 1.5×>750
4h = 618h=329
Citocinas (IL-6)Ubiquitina
Influenza Virusinactivados
24 h
15 000humano
HeLa 1.5×>750
4h = 848h = 13
MetalotioneinaCiclo celularUbiquitina
Patrones de respuesta celular frente Patrones de respuesta celular frente infección viralinfección viral
CMV: bloquea las células en G1 con incremento de cdk-2-ciclin E replicación inhibida por
antagonistas ruta p38-MAPK
HSV-I depende de cdk
Herpesvirus: CMV y HSVHerpesvirus: CMV y HSV--II
Adenovirus aviarAdenovirus aviar
dependiente de heat shock protein 40
inducción apoptosis células infectadas al inhibir NFκκκκB
Herpesvirus del Herpesvirus del sarcoma de Kaposisarcoma de Kaposi
Genómica y lucha antibacterianaGenómica y lucha antibacteriana
Mycoplasma genitalium
Neisseria meningitidis
Pseudomonas aeruginosa
Rickettsia prowazekii
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Treponema pallidum
Vibrio cholerae
Borrelia burgdorferi
Campylobacter jejuni
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis
Escherichia coli
Helicobacter pylori
Mycobacterium leprae
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma pneumoniae
Genomas de patógenos bacterianos secuenciados
TIGR Microbial Database
Identificación de factores de virulenciaIdentificación de factores de virulenciaalineamiento de secuencias,alineamiento de secuencias,
búsqueda de repeticiones en tandembúsqueda de repeticiones en tandemgenes corregulados con factores genes corregulados con factores
virulencia conocidos: mapeo operonesvirulencia conocidos: mapeo operones
Patrones de expresión:Patrones de expresión:identificación genes candidatos identificación genes candidatos
intervención terapéuticaintervención terapéutica
Farmacogenómica bacteriana
Patogénesis bacteriana:Respuesta hospedador
Patrones de expresión génicaen diagnóstico
Genómica y búsqueda de vacunasGenómica y búsqueda de vacunasCandidatos: proteínas de membrana o Candidatos: proteínas de membrana o
factores de virulenciafactores de virulencia
Identificación de proteínas con segmentos transmembrana(programa PHD), secuencias líder de secreción, aa aromáticos en
el extremo C-terminal o firma específica en N-terminal
Proteínas producidas en sistemas de expresión deE.coli mediante proceso robotizado
Antígenos innoculados en modelos experimentalesy evaluación nivel de inmunización frente a infección
natural
Genómica y búsqueda de vacunasGenómica y búsqueda de vacunas
Neisseria meningitidis
Fracaso desarrollo vacuna universal:polisacárido capsular con baja inmunogenicidad
proteínas superficie testadas con altísisma variabilidad genética
Estrategia genómica:identificación 600 potenciales proteínas de membranaexpresión in vitro de 350 e inmunización de ratones
actividad bactericida de 25 sueros de ratones: correlación protección humanos
algunas de las proteínas están altísimamente conservadas en todas las cepas
tiempo
activida
d
genómica genómica estructuralestructural
genómica genómica funcionalfuncional
diseño diseño químicoquímico
investiginvestigclínica: clínica: terapiaterapia
BIÓLOGOSQUÍMICOS
FARMACÉUTICOS MÉDICOS
Enfoque multidisciplinar: sucesión ecológicaEnfoque multidisciplinar: sucesión ecológica