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Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011
7. Los antecedentes metodológicos de los Proyectos
Genoma. Historia del Proyecto Genoma Humano.
Fundamentos y Objetivos. Metodología básica: corte
de ADN, separación de fragmentos, clonación,
librerías genómicas, ensamblado de cóntigosy
secuenciación.Las dos estrategias para el análisis de
las secuencias: restricción a gran escala y
secuencias de genes expresados.
http://www2.uah.es/webgenetica/
Docencia Fac. Medicina Genética
Genómica = Conocimiento de organización = Mapas
Los mapas genéticos tienen muchas utilidades:
conocer los sistemas de organización de los genes,
desarrollar sistemas de detección mediante técnicas
moleculares,
hacer diagnósticos de la presencia o ausencia de
determinadas secuencias o genes.
Realizar diagnóstico molecular encuentra sus aplicaciones
en:
genética clínica,
genética forense,
diagnósticos de paternidad,
experimentos de transformación para terapia génica
Genética – N.Jouve 2
adulto
Fecundación: 22” + XX (2n = 46)
22” + XY(2n = 46)
♂ = Gametos: 22’ + X ó 22’ + Y (n = 23)
♀= Gametos: 22’ + X (n = 23)
♀ ♂
Soma
mitosis
Linea germinal
meiosis En la Meiosis se produce la
«recombinación» Cada gameto,
genéticamente diferente. La
combinación genética que surge
es diferente para cada gameto
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1900 (1865) El nacimiento de la Genética, (Mendel).
1944 (1869) El descubrimiento de que los genes,
tienen su base química en el ADN.
1953 El descubrimiento de la estructura de doble
hélice del ADN.
1960-65 El conocimiento del código genético
universal.
1970 El Dogma Central de la Biología Molecular
1975-90 La aparición de técnicas para aislar, clonar,
y secuenciar el ADN
Los antecedentes metodológicos de los
Proyectos Genoma
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Ser-Pro-Ile-Ser-Cys-Asp-Thr-STOP
Proteína
Las proteínas son el producto de los genes y forman
Parte de estructuras ó funcionan como enzimas…
1961-65 - El código genético universal
Núcleo
Citoplasma
AGTGGCTATTCGACGCTATGCATTAAGCACGTATCGCATCGTA ADN (Gen)
UCACCGAUAAGCUGCGAUACGUAAUUCGUGCAUAGCUAGCAU ARNm
1970 El Dogma Central de la Biología Molecular
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1978 – W. Arber, D.Nathans, y
H.O. Smith:
Endonucleasas de restricción
1980 - P. Berg, F. Sanger
y F. Gilbert:
Ingeniería Genética
1975-90 La aparición de técnicas para aislar,
clonar y secuenciar el ADN
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Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011
Premios Nobel de 1980 por el desarrollo de un método eficaz para la secuenciación del ADN
1975-90 La aparición de técnicas para aislar,
clonar y secuenciar el ADN
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MS2 (ARN) 3.568 b 3 1976
FX174 (ADNs) 5.386 b 9 1977
SV40 (ADNd) 5.224 pb 5 1978
Fago l (ADNd) 48.502 pb 61 1982
Fago T (ADNd) 35.400 pb 55 1983
Epstein-Barr (ADNd) 172.281 pb 68 1984
ADN mit. humano (ADNd) 16.569 pb 37 1981
Virus o ADN Tamaño genoma Nº genes Año
1975-90 La aparición de técnicas para aislar,
clonar y secuenciar el ADN
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Historia del proyecto genoma
humano
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Historia del Proyecto Genoma Humano
1984
Reunión científica en Alta (California): conveniencia de poner en
marcha un programa de gran envergadura y coste económico, para
facilitar la detección de mutaciones génicas causantes de
enfermedades.
1986
Reunión en la ciudad de Santa Fe (California): se hizo la primera
propuesta de un Proyecto Genoma Humano como requisito
indispensable para comprender el cáncer.
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“El orgullo nacional norteamericano está en juego: del mismo modo que en 1961 el Presidente Kennedy tomó la decisión de enviar un hombre a la luna, ahora la nación se ha comprometido a sí misma en un objetivo altamente visible e importante... Aunque el costo global de la secuenciación total del ADN humano será inferior en un orden de magnitud al de enviar al hombre a la luna, las repercusiones serán mucho más grandes”.
James Watson 1990
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1984-1988
Planteamiento y definición del Proyecto
1988-1990
Lanzamiento del proyecto en EE.UU
1990
Internacionalización del Proyecto;
establecimiento de una organización
denominada HUGO (Human Genome
Organization).
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Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011
•NHGRI National Human Genome Research Institute (USA)
*Baylor College of Medicine en Houston
*Washington University School of Medicine en St. Louis
*Whitehead Institute for Biomedical Res, Cambridge, MA
Whitehead Institute, Boston
•NIH The National Institutes of Health (USA)
•DOE The Department of Energy (USA)
*Joint Genome Institute in Walnut Creek, California
•Wellcome Trust *Sanger Centre, Hinxton (Inglaterra)
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CROM. 22
2 diciembre 1999
CROM. 21
8 mayo 2000
Eucromatina: 34.491 kb 34.000 kb
Secuenciado: 33.464 kb 35.202 kb
% terminado: 97 % 103.5 %
Nº de contigs: 12 6
“Working draft”
26 junio 2000
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1995 - Secuenciada la primera bacteria
Haemophilus influenzae -1740 genes (1.8 Mb
12 de Febrero de 2001, la publicación en Nature y Science
21 de abril de 2003
publicación en Science y Nature
(50 aniversario del descubrimiento de la doble hélice). Genética – N.Jouve 16
Fundamentos y objetivos
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Objetivos del Proyecto- 1988
Descifrar todo el mensaje del genoma humano
Desarrollar una tecnología eficiente para la secuenciación de todo el genoma
Identificar variaciones alélicas (SNPs = single nucleotide polymorphisms).
Interpretar las funciones: genómica funcional
Descifrar y analizar las secuencias de organismos modelo (levadura, nemátodo, Drosophila y ratón)
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Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011
Examinar las Implicaciones Eticas, Legales y Sociales, ELSI, de la Investigación genómica
Desarrollar herramientas de bioinformática y estrategias de computación para el uso de los datos de genes y secuencia
Entrenamiento de científicos para la investigación y análisis de genomas
Almacenar esta información en bases de datos
Transferir tecnologías relacionadas al sector privado
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Metodología básica
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Metodología básica: técnicas de localización y detección, corte de
ADN, separación de fragmentos, clonación, amplificación y
secuenciación
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Craig Venter Francis Collins
Dos estrategias para abordar el PGH
A la caza de genes específicos… Todo: genes y otras secuencias 22 EGG 2010-11 - N. Jouve
Consorcio Internacional, Director Francis
Colins.
6 pasos sucesivos:
1. Aislamiento del ADN genómico
2. Fragmentación
3. Clonación (mantenimiento de
fragmentos)
4. Conservación de todos los fragmentos
en “librerías genómicas”
5. Estudio del orden = cóntigos
6. Secuenciación de cada fragmento
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2. Fragmentación
3. Clonación
1000 kb
5. Mapa de cóntigos
1. Aislamiento ADN
4. Librería
genómica
6. Secuenciación
2. Fragmentación
3. Clonación
1000 kb
5. Mapa de cóntigos
1. Aislamiento ADN
4. Librería
genómica
6. Secuenciación6. Secuenciación
1
2
3 4
5
6 Genética – N.Jouve 24
5
Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011
Extremos
cohesivos
Extremos
cohesivos
Extremos
cohesivos
Extremos
romos
2. Fragmentación
Acción de las Endonucleasas Tipo II
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3. Clonación
Utilización de plásmidos (u otros vectores)
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ADN donante
Vector
Ligasa de ADN
3. Clonación
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Los vectores pueden ser
plásmidos naturales, u
otras formas modificados
genéticamente. Tienen
que tener capacidad de
replicación.
Tipos Tamaño inserto
•Plásmidos -15 kb
•Fagos 20 kb
•Cósmidos 40 kb
•BACs 100-300 kb
•YACs 1.000 kb
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4. Librerías genómicas
Cada fragmento del genoma se inserta en un vector
y cada vector se introduce en un cultivo bacteriano.
Cada cultivo conserva por replicación en las
bacterias
un fragmento distinto del genoma (clonación de
fragmentos de ADN).
Entre todos los cultivos deben completar de forma
fragmentada
El genoma completo. Su conservación constituye de
este modo una librería genómica.
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Solapamiento
Solapamiento
Solapamiento
5. Ensamblado de cóntigos
Supuestos 3 fragmentos A, B y C, se trata de encontrar su orden
Relativo, mediante la búsqueda de regiones solapantes en los
Extremos. Para ello se utilizan “marcadores moleculares”
La flecha señala un marcador (detalle de secuencia de ADN) común en B y C.
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Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011
6. Secuenciación automática
4 Reacciones de síntesis
de ADN que se interrumpen
en una base dada (A, C, G ó T)
seguido de la separación de
los productos de síntesis por
electroforesis Genética – N.Jouve 31
6. Secuenciación automática
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TERMINADORES (ddNTPs) MARCADOS FLUORESCENTEMENTE
-REACCIÓN EN UN SOLO TUBO
- UN SOLO CARRIL
- CUALQUIER PRIMER
- NO SE DETECTAN LAS PARADAS FALSAS (no se incorpora ddNTP)
6. Secuenciación automática
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TIPOS DE SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS
GELES DE
POLIACRILAMIDA CAPILARES
6. Secuenciación automática
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CUATRO FLUOROCROMOS QUE EMITEN
A DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA
CUATRO BASES DETECTADAS Y DISTINGUIDAS
EN UN SOLO CARRIL O INYECCIÓN CAPILAR
(5’-PRIMER; 3’-ddNTP)
6. Secuenciación automática
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6. Secuenciación automática
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Genética – Medicina – Nicolás Jouve Curso 2010-2011
Sanger Center 6. Secuenciación automática
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Celera Genomics, Director Craig Venter
pasos sucesivos
1. Obtención de copias en versión ADN, ADNc,
de ARN mensajeros de células especializadas.
2. Búsqueda en las librerías genómicas de los
clones de los ADN copias anteriores.
3. Secuenciación del ADN de dichos clones.
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ARN pol
ADN c
Transcriptasa
inversa
Aislamiento de
ARNm
ARN-m Proteína
Células
específicas
Clonación
Búsqueda de la secuencia del gen en Las librerías genómicas
1
2 3
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