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ASOCIACIÓN
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
SEMESTRE 2013-I
IV CICLO
GUIA DE PRÁCTICA
DE
MICROBIOLOGIA MÉDICA
ASOCIACIÓN
UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA
INDICE
Página
Recomendaciones generales 3
Microscopia: estudio y manejo del microscopio 4
Métodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales 7
Coloración diferencial de Gram 9
Coloración diferencial de Ziehl-Neelsen 11
Coloración especial: coloración de Leishman y Vago 12
Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales 14
Siembra bacteriana. Medios de aislamiento 17
Metabolismo bacteriano 19
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos (antibiograma) 27
Reacción antígeno – anticuerpo: Aglutinación 29
Fagocitosis 31
Reacción de Precipitación 32
Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA 33
Preparación de Antígenos bacterianos 35
Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus 38
Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Género Streptococcus 40
Aislamiento e Identificación de cocos Gram negativos: Genero Neisseria 42
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus 44
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: genero Listeria 46
Estudio microbiológico de la flora normal de la Secreción Bucofaríngea 48
Aislamiento e Identificación de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. 50
Aislamiento e identificación de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium 52
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona 54
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y 56
Serología
Aislamiento e Identificación de Enterobacterias: Coprocultivo 59
Estudio e Identificación de Vibrio cholerae 62
Estudio e Identificación del Genero Leptospira 64
Estudio e Identificación de Bartonella 66
Estudio e Identificación de Treponema – Prueba de VDRL ó RPR 67
Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo 68
Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes. 71
Estudio e Identificación de Hongos Ambientales 74
Estudio e Identificación de Hongos Dermatofitos 78
Estudio de Hongos Levaduriformes: Observación de cortes histopatológicos 81
Estudio de Hongos Dimórficos: Observación de cortes histopatológicos 83
ANEXOS: SEMINARIOS:
Genética Microbiana e Ingeniería Genética 86
Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunación 87
Antibióticos y quimioterápicos 88
Enfermedades de transmisión sexual. SIDA 89
Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla 90
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ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO
DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA
1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas llevando consigo la Guía de Prácticas,
mandil, plumón indeleble para escribir sobre vidrio y lápices de colores.
2. No se podrá ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prácticas, para evitar
contaminaciones
3. Durante las prácticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo sólo deberán colocar su guía de práctica y su libreta de apuntes.
5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodón, etc. al tacho de basura
6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de práctica para evitar que se
tiñan la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las láminas preparadas sobre hojas de papel blanco.
8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posición vertical para evitar que se derramen.
9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en frascos de boca ancha con
desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen deberán incubarse, teniendo en cuenta las siguientes
anotaciones:
Nombre o iniciales de los estudiantes
Nombre del germen, número de mesa, turno y fecha de la siembra
Las placas deberán ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias
Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas
Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37ºC
11. Al finalizar el trabajo:
Limpiar con algodón los objetivos del microscopio
Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no
queden láminas sobre la platina
Limpiar la mesa de trabajo
Comprobar que la llave de gas este cerrada
Lavarse prolijamente las manos con jabón.
12. El Protocolo de cada práctica será controlado por el profesor al final de la práctica.
El Profesor Responsable del Curso
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SIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA
PRÁCTICA N° 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I. OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio
compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del microscopio.
II. MATERIALES
Microscopios
Láminas portaobjetos
Laminillas cubreobjetos
Láminas coloreadas
Suero fisiológico
Pipeta Pasteur
Plumón indeleble
Papel lente
Tela de felpa(25 cm)
Fibra de pelo y lana
III. PARTES DEL MICROSCOPIO Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:
PARTE MECANICA
Tubo portalentes y cremallera
Tornillos macro y micrométrico
Revolver
Platina
Condensador
Brazo y Pie
Charnela
PARTE OPTICA
Ocular
Objetivos
Espejo
Lentes de condensador
Diafragma
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO
1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.
2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.
3. Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera
4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos
de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.
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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA
PRACTICA N° 2
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES
Y ESPECIALES.
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes
ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.
B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de
metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina
(ácido).
En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de metileno,
cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes
derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl -
Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los
microorganismos.
MATERIAL
Muestra con mezcla bacteriana
Láminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriológica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China
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Colorante Azul de lactofenol
Mechero de Bunsen
Varillas para coloración
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
Microscopio de luz con objetivo de inmersión
COLORACIÓN AZUL DE METILENO:
1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor
2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos
3. Lavar con agua y dejar secar
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso
COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:
1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos
2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana
3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo oscuro.
Como la capsula de la levadura Cryptococcus
COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:
1 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos
2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto
4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul – celeste
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfología de los microorganismos observados
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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorante es
llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de Ziehl
Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas la
mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
Muestra con mezcla de bacterias
Solución fisiológica al 0.85%
Láminas portaobjetos
Asa bacteriológica de Kolle en aro
Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:
Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)
Bicarbonato de sodio
Lugol (mordiente)
Alcohol- acetona (decolorante)
Fucsina básica (colorante de contraste)
Mechero de Bunsen
Varillas para coloración
Microscopio de luz con objetivo de inmersión
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
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PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación del
frotis.
2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener
una preparación en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama
débil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solución de
bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta que
no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prácticas.
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PRACTICA N° 3
COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado contenido de
lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol-
resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica fenicada) que es
soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la célula y en
esta forma resistir a la decoloración.
MATERIAL
Láminas con frotices de bacilo tuberculoso
Set de coloración Ziehl-Neelsen:
Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
Alcohol ácido (alcohol etílico con 3% de HCl)
Azul de metileno (colorante de contraste)
Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por
tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
6. Lavar con agua corriente
7. Secar y observar con lente de inmersión.
RESULTADO
Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol resistentes se
tiñen de color azul.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.
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PRACTICA N° 4
COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO
INTRODUCCION
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los
colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de microorganismos
presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN
Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de
microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES
Frotis de sangre con Bartonella
Solución de colorante Leishman
Agua destilada tamponada
Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.
2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
3. Lavar con agua de caño y dejar secar
4. Observar con objetivo de inmersión
5. Anotar los resultados en el protocolo.
COLORACIÓN DE VAGO
Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el
método de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.
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MATERIALES
Lámina portaobjetos
Palito mondadientes
Solución fisiológica al 0.85%
Set de coloración de Vago:
Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana
Asa de siembra en aro
Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
1. En una lamina colocar una gota de suero fisiológico al o.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa
fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos
5. Lavar con agua corriente
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
7. Lavar con agua corriente
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
RESULTADOS
Coloración Leishman: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro
Coloración de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte
de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.
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PRACTICA N° 5
MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES,
INTRODUCCION Para el aislamiento de bacterias de un material patológico, es necesario su cultivo en medios
especiales con una determinada concentración de iones de hidrógeno, sales, compuestos
nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Según su utilización pueden ser: simples,
enriquecidos, selectivos y diferenciales.
MATERIALES
Probetas de 100 ml.
Balones de 250 ml.
Tiras de Papel indicador de pH
Frasco con solución NaOH (N/10)
Frasco con solución HCl (N/10)
Pinzas rectas
Bagetas de vidrio
Goteros de vidrio
Trípodes con malla de Asbesto
Tubos de 16x150 mm
Tubos de 13x100 mm
Placas Petri
Frascos estériles
Agua destilada
Tubo con sangre citratada
Caldo nutritivo Agar simple o Agar nutritivo
Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g
Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g
Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g
Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g
Agua destilada 100 ml Agua destilada 100 ml
pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g
pH 7.0 - 7.4
Caldo peptonado
Peptona 2.0 g
Cloruro de sodio 1.0 g
5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.
6.0 gr. de Agar SS deshidratado.
6.5 gr. de Agar TSI.
2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons
2.1 gr. de Agar Urea.
1.7 gr. de Caldo MR VP
3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.
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PREPARACION
I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES
1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al
calor hasta su completa dilución. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es ácido
agregar gota a gota la solución de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solución de
HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121ºC por 15 Minutos.
Controlar la esterilidad incubando a 37ºC por 24 horas. Luego dejar en refrigeración hasta su
utilización.
2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego
agregar los demás ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH ó HCl.
Luego envasar y esterilizar a 121ºC por 15 Minutos y controlar la esterilidad por incubación a
37ºC por 24 horas. Dejar luego en refrigeración hasta su utilización.
II. MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar
enfriar hasta una temperatura de 45ºC y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada.
Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas
Petri estériles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en
refrigeración hasta su utilización. El color normal del medio debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de 80ºC
hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estériles y realizar control de
esterilidad y dejarlo después en refrigeración.
III. MEDIOS SELECTIVOS
3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su
completa disolución. Autoclavar a 121º C por 15 Minutos y repartir en placas estériles.
4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor
hasta su completa disolución. Repartir luego en placas estériles. No necesita autoclavar.
IV. MEDIOS DIFERENCIALES
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azúcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir
hasta su completa disolución. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en autoclave a 121º
C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final
tendrá un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendrá un color
verde.
3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolución y
autoclavar. Después adicionar 5 ml de Solución de Urea al 40% esterilizada por filtración;
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mezclar homogéneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendrá
un color amarillo.
4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de
13x100mm y autoclavar a 121º C por 15 Min.
5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa disolución
y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121º C por 15 min., y dejar enfriar los
tubos en plano inclinado.
PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.
B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
C. Materiales que usaron para la preparación.
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PRACTICA N° 6
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a las
24 horas y otras necesitan un período más prolongado para alcanzar su máximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos
y el resultado de la multiplicación bacteriana colonia, así como el procedimiento por el cual se pone
en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias
técnicas de siembra, siendo las más usadas : La siembra por estría, por dispersión-agotamiento,
por inoculación y por puntura.
Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:
FORMA : Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIÓN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.
TAMAÑO : Diámetro en milímetros.
CONSISTENCIA : Cremosa, membranosa y mucoide.
CROMOGENESIS : Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.
MATERIALES
Tubos con suero fisiológico estéril
Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo
Tubos de 16x150 con Agar nutritivo
Placas con Agar nutritivo
Placas con Agar Mac Conkey
Placas con Agar hipertónico de Chapman
Tubos con Agar Sabouraud
Tubos de 16x150 con medio hipertónico
de Chapman
Torundas estériles
Asas de siembra en aro y punta
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra bacteriana
sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.
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Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de
la superficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45º y
continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con ayuda
del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo
hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del tubo.
B) LECTURA:
Con la ayuda del profesor:
1. El alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de
cultivos sembrados.
2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.
PROTOCOLO
METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA
SIEMBRA
MEDIO DE CULTIVO
USADO
ESTRIA
DISPERSION
AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIÓN
CARACTERISTICA
DE LA COLONIA
OBSERVACION DE
COLONIAS
MEDIO DE CULTIVO
USADO
FORMA
ELEVACIÓN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAÑO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
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PRACTICA N° 7
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las características
de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la
caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel de género y
especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y
sirvan como marcadores de identificación.
En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de la
colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos e
indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos
específicos.
I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS
Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en un
medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptor final
de hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilización de hidratos de
carbono como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de ácidos
mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por el cambio
de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se
manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.
A) REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:
EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrógeno
(H2S).
El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10
respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH que es
el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en
este medio pueden ser fundamentalmente tres:
1. Fermentación de glucosa únicamente.
2. Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.
3. No fermentación de carbohidratos.
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Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se
detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba
del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de
hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
MATERIAL
Tubo con medio TSI en plano inclinado.
Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estríe la
superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37°C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se
encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada y la cantidad
de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la
utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo,
por no estar en contacto con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.
3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentación de la
glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos, por lo que
el tubo permanece amarillo.
4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización
oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)
1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )
2.
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica
valiosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético,
fórmico) a partir de glucosa.
Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos
frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada, como para
mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo),
superando el sistema amortiguador del pH del medio.
21
3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )
El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la
glucosa, es metabolizado por algunos microorganísmos produciendo el acetil- metil-
carbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol.
La prueba se basa en la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la acción del
KOH y Oxígeno atmosférico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción
catalítica del Alfa naftol y Creatinina.
MATERIALES
Cepa bacteriana MR positivo y negativo
Cepa bacteriana VP positivo y negativo
Reactivo Rojo de metilo
Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)
Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
PROCEDIMIENTO
1. Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y
negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37°C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre,
cuyo rango de viraje está entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se
manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.
2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2
ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es
importante añadir los reactivos en el orden específico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es
observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora los
cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS
PRODUCCION DEL INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido
triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoniaco(NH3). El indol
puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparición de un color rojo(en
forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que
contiene p- dimetilaminobenzaldehido.
22
MATERIALES
Cepa indol positivo y negativo.
Medio líquido peptonado y/o Medio SIM
Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino
benzaldehido).
Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.
PROCEDIMIENTO
La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos
segundos después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y
constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero
que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta
una prueba negativa.
III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO
Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia
Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de
los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente de carbono para su
metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee para determinar esta
característica no debe contener proteínas ni carbohidratos.
El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituye
uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.
PRINCIPIO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con
citrato con formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye
citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única
fuente de nitrógeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de
amonio, con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en
hidróxido de amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el azul de
bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
MATERIALES Cepa control citrato positivo y negativo.
Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnivca de estría en cada tubo la
cepa citarto positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18- 24 horas.
23
INTERPRETACION
Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio
inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV. HIDRÓLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)
Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa
que hidroliza la urea, según el siguiente esquema:
O
║
NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH ═ (NH4)2 CO3
Ureasa
El amoniaco reacciona en la solución para dar carbonato de amonio, produciéndose una
alcalinización y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
MATERIALES
Cepa patrón ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )
Medio Agar urea según Christensen
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el
fondo.
2. Incubar durante 18- 24 horas a 37°C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.
Prueba negativa: El medio permanece del color original
V. PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias.
El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo
de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente
reacción:
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa
negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).
24
MATERIALES Cepas Control: S. aureus, Streptococcus ó Enterococcus
Solución de Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%
Medio de cultivo: cualquier medio sólido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados
falsos positivos.
PRUEBA EN LÁMINA
a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de una colonia
bien aislada y transferir él inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
d) Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que
puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la
prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder
su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acústico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso
que ocurra inundar el área afectada con alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO
DEBE USARSE AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparición rápida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia
son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la
catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30’, éstas
no son catalasa positivas.
VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO – OXIDASA
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de
la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formación de
agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios
facultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios
estrictos.
En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o
tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados
comúnmente oxidasa).
MATERIAL
Cepa control: sembrada en Agar nutritivo
Reactivo de oxidasa
25
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se añaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los
discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIÓN
Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un
intenso color azul oscuro.
AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)
Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina
descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de la glucosa, la producción o no de gases
(CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).
Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. Se lee la reacción producida en la
superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH
del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad
al color purpura. Por contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo
del tubo es amarillo y la superficie alcalina
Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
a) Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo fermenta la
glucosa: superficie purpura/fondo amarillo.
b) Descarboxilación de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo (superficie
violeta/fondo amarillo).
c) Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.
d) Producción de gas: ruptura del medio.
e) Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.
VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias tóxicas
que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre,
produciendo la lisis de los eritrocitos, según el tipo de lisis que producen pueden clasificarse
en tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre
2. Incubar por 18 – 24 horas a 37° C
26
INTERPRETACIÓN
Hemólisis tipo Alfa: Es un tipo de hemólisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio
debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a
compuestos del tipo de la biliverdina
Hemólisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observándose una zona clara
alrededor de la colonia
VIII. PROTOCOLO
PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
MEDIO DE
CULTIVO
REACTIVO Y /O
INDICADOR
LECTURA
TSI
(Fermentación-
H2S)
VP
VOGES-
PROSKAUER
MR
ROJO DE
METILO
INDOL
CITRATO
CATALASA
UREASA
CITOCROMO
OXIDASA
LIA
(Agar Lisina
Hierro)
HEMOLISINA
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PRACTICA N° 8
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los
antibióticos y quimioterapeúticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:
Método de dilución
Método de Difusión en Agar
OBJETIVOS
1. Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los
antibióticos.
2. Interpretar los resultados del método utilizado.
3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo la concentración
inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe el crecimiento “in vitro”
bacteriano.
Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o en medio
agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24 horas, se
puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimiento macroscópico
bacteriano. Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Según Kirby- Bauer y col.)
Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o
quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la
muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel
filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24 horas, se observan las
zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en el
disco difiere para los distintos fármacos.
MATERIALES
Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya
Tubos con caldo nutritivo
Tubos con Agar semisólido
Tubos con cultivo bacteriano
Asas de siembra
28
Torundas estériles
Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi- disck).
Pinzas
Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.
4. Incubar a 37°C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano alrededor de
los discos, incluyendo el diámetro del disco.
b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si el
microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes antimicrobianos
utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede
responder a dosis altas del antibiótico.
La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su capacidad de
difusión en el Agar.
c) Anotar e interpretar los resultados.
Antimicrobiano Código Resistente Sensible Antimicrobiano Código Resistente Sensible
Gram negativo Gram positivo
Amikacina AK-MK ≤ 14 ≥17 Ac.nalidixico NA ≤ 21 ≥ 16
Amoxicilina + clavulanico
AM
≤ 13
≥ 18
Cefepima
FEP
≤ 14
≥ 18
Ampicilina AMP ≤ 13 ≥17 Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21
Cefalotina CFM ≤ 14 ≥18 Clindamicina CM-DA ≤ 14 ≥17
Cefotaxima CTX ≤ 14 ≥ 23 Cloranfeicol C ≤ 12 ≥18
Ceftazidima CAZ ≤ 14 ≥ 20 Eritromicina E ≤ 13 ≥18
Ceftriaxona CRO ≤ 13 ≥17 Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15
Cefuroxina RBA ≤ 14 ≥18 Nitrofurantoina FD ≤ 14 ≥17
Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21 Norfloxacin NOR ≤ 12 ≥17
Cloranfenicol C ≤ 12 ≥18 Oxacilina AO ≤ 10 ≥13
Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15 Penicilina P ≤ 19 ≥20
Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18 Rifampicina RIF ≤ 16 ≥ 20
Tetraciclina T ≤ 14 ≥19 Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18
Tobramicina NN ≤ 12 ≥15 Tetraciclina T ≤ 14 ≥19
Vancomicina V ≤ 9 ≥12
PROTOCOLO Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la práctica
desarrollada.
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PRACTICA N° 9
REACCION ANTIGENO – ANTICUERPO: AGLUTINACIÓN
La aglutinación es un fenómeno inmunológico producto de una reacción antígeno-anticuerpo en el
que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamaño grande. Estas partículas pueden ser
bacterias, eritrocitos, partículas de látex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural
o artificial por antígenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con
antisueros o antígenos específicos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables a simple
vista o con lentes de poco aumento.
AGLUTINACION BACTERIANA
Existen muchos métodos comúnmente empleados para demostrar la aglutinación bacteriana, uno de
los más simples es la aglutinación en lámina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del
antígeno con el suero del paciente en una lámina. Esta técnica ofrece un método de muestreo rápido
para análisis de rutina.
MATERIALES
Lámina para aglutinación ( láminas excavadas)
Antígeno bacteriano
Suero de paciente
Pipetas serológicas de 0.2 ml
Palitos mondadientes
PROCEDIMIENTO
1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lámina de
vidrio excavada.
2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos a cada gota de suero de un mismo paciente.
3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota.
4. Hacer rotar suavemente la lámina por espacio de 2 a 3 minutos.
RESULTADO
La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable que tienden a agruparse en
la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.
PROTOCOLO:
Realizar una aglutinación cualitativa y una cuantitativa
30
Aglutinación cuantitativa
REACTIVOS
TUBOS
1 2
3 4 5
ANTISUERO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
ANTIGENO
AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO
TITULO
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
RESULTADO:
Título del suero: ………………………………………………………….
Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en práctica
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PRACTICA N° 10
FAGOCITOSIS
La línea celular de defensa está íntimamente asociada con la línea humoral. La fagocitosis o el
englobamiento de partículas extrañas por ciertas células es un fenómeno no específico, pero se
incrementa cuando intervienen anticuerpos específicos o complementos. Entre las células
fagocíticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrófagos (monocitos libres). A estas
sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antígenos más susceptibles a la fagocitosis se
les llama OPSONINAS.
FAGOCITOSIS “IN VITRO”
Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difíciles de realizar, en comparación con otras pruebas
serológicas, pero en ciertos sistemas es la única a ser utilizada. El antígeno y la sangre total
(conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de
estas mezclan se colorean.
El índice fagocítico es el número promedio de partículas ingeridas por cada 100 Neutrófilos de la
sangre.
MATERIAL
Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o
Klebsiella
Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA
sódica al 1%
Una jeringa de 5 ml con aguja N° 20
Pipetas Pasteur con perilla de jebe
Láminas portaobjetos
Colorante Wright
Agua tamponada
Baño María a 37°C
Centrífuga
Gradilla
Microscopio con objetivo de inmersión
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO
1. Con la jeringa hipodérmica recolectar 5 ml de sangre venosa.
2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.
3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.
4. Llevar los tubos a Baño María por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.
5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.
6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glóbulos blancos de cada
tubo.
7. Realizar los frotices y colorear con Wright:
Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.
Añadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.
Después de 15 minutos, lavar con agua de caño.
Secar y observar con objetivo de inmersión.
RESULTADO
Se observará la presencia de gérmenes intracelulares que han sido fagocitados.
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PRACTICA N° 11
REACCION DE PRECIPITACION
INTRODUCCION
Es una reacción antígeno- anticuerpo, en el que el antígeno es de naturaleza soluble. Cuando se
mezcla un antígeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de
equivalencia y visibles por lo general macroscópicamente. Las reacciones de precipitación pueden
realizarse en un gel como el Agar.
INMUNODIFUSION SIMPLE
Llamada técnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentración de Inmunoglobulinas en el
suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja
gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antígeno, procediéndose
luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observándose la formación de un halo circular
de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración antigénica.
INMUNODIFUSION DOBLE
Llamada también método de Ouchterloni, es útil para comparar antígenos, detectar anticuerpos
precipitantes, anticuerpos antinucleares y antígenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar
semi-sólido en portaobjetos, en el cual se efectúan perforaciones, los cuales se llenan con los
elementos reaccionantes (antígeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubación a temperatura
ambiente, observamos la aparición de bandas de precipitación.
MATERIALES
Suero positivo
Antígeno
Láminas de vidrio con Agar noble al 1%
Placas Petri
Pipetas capilares
Láminas preparadas y coloreadas
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.
2. Depositar en los orificios periféricos los antígenos a estudiar.
3. Colocar las láminas en una cámara húmeda.
RESULTADO
Observar las bandas de precipitación que se forman:
Identidad total : Las bandas de precipitación se unen.
Identidad parcial : Se observa un espolón.
No identidad : Las bandas se cruzan.
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INMUNOELECTROFORESIS
Es útil para la separación de las proteínas en un campo eléctrico, permitiendo medir e identificar
componentes séricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.
Resulta de la combinación de la electroforesis con la inmunodifusión. En una primera fase los
antígenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su
movilidad en un campo eléctrico, luego de una corrida electroforética, se coloca el antisuero en una
especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las proteínas que han migrado. Luego
de incubar, se forman bandas de precipitación frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.
PRACTICA N° 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA
INTRODUCCION
En los últimos años se han desarrollado numerosos métodos para la detección de antígenos virales
como de anticuerpos específicos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).
Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinación o la
prueba de Fijación de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).
Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada
utilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromogénicos, las que producen una
reacción de color. Estas pruebas se conocen como “Análisis de Inmunoabsorbencia Ligada a
Enzimas” (enzime- linked immunosorbent assay) ó ELISA.
La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es
necesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran número de muestras
simultáneamente en forma rápida y automatizada.
PROCEDIMIENTO
Determinación de Anticuerpo en fase sólida
Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo ó perla, esto consiste en absorber la superficie de la
placa con el anticuerpo específico antiviral o anticuerpo de captura.
Luego se añade la muestra clínica, si esta contiene antígeno viral se unirá al anticuerpo de
captura
Esta unión se detectará mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas más
usadas son la peroxidasa, fosfatasa alcalina ó biotina- aviclina.
Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el
antígeno.
Añadir el sustrato de la enzima.
Observar la presencia de color.
LECTURA
El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colorímetro o un
espectrofotómetro.
A mayor cantidad de antígeno presente en la muestra, más intenso será el color observado.
34
ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA
(Ensayo Inmunoenzimático para la detección de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficiencia humana
HIV-1 grupo O y HIV-2)
SUSTRATO A
20 ul. Cromogénico
PLACAS CON
SUEROS
CONJUGADO
(Ag-Ac color celeste)
SOLUCION
GLICO-PROTEINA + OBTENIDOS + (Peroxidasa con Ig G + SUSTRATO B + DE
DEL VHI
DE PACIENTE
Antihumana) 5ul C/ pozo
Buffer Peróxido
PARADA
Hidrogeno 100 ul
CONTROL + INCUBAR INCUBAR
30 min a 30 min a
37° 37°
CONTROL +
Absorber
CONTROL -
LAVAR LAVAR
twin salino
twin salino
CONTROL - 1/10 1/10
(5 veces)
CONTROL -
PACIENTE
PACIENTE
SECAR SECAR
PACIENTE la placa la placa
(tomado de Wiener lab.)
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PRACTICA N° 13
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
INTRODUCCION
Antígeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce
la formación de anticuerpos o la aparición de fenómenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en
presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo específico, dando lugar a
fenómenos perceptibles.
Los Antígenos más comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos,
hematíes, suero, etc.
Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antígeno en dosis adecuadas y
generalmente progresivas con las siguientes finalidades.
1. Inducir en el hombre o en los animales, la formación de anticuerpos que los protejan contra
determinados procesos infecciosos. Este método conocido como vacunación confiere inmunidad
adquirida activa.
2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales serán empleados en:
a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, tétanos, etc.,
en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una
inmunidad adquirida pasiva.
B) La tipificación de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de
clasificación, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las
Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.
I. PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y FLAGELARES
A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.
A. MATERIAL
Cultivo bacteriano en medio sólido y en desarrollo confluente
Cultivo bacteriano en medio líquido (caldo nutritivo)
Pipetas graduadas estériles de 5 cc.
Suero fisiológico estéril, repartido en frascos de 100 cc.
Embudos y gasa, estériles para filtrar
Acido fénico concentrado en tubos de 13x100 ml.
Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.
Pipetas de Pasteur, estériles
Escala de MacFarland (tubo Nº 3)
Pipetas graduadas de 1 ml.
Tubos vacíos estériles de 16x150 ml.
36
Algodón y Alcohol yodado
Agar nutritivo en placas y tubos
B. PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiológico estéril a los cultivos
bacterianos presentados en medio sólido
2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar
3. Filtrar a través de gasa estéril
4. Separar la suspensión en cantidades iguales en dos tubos de 13x100
5. Para preparar el Antígeno somático "O", medir la cantidad de suspensión bacteriana
de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una
concentración de 0.5%.
Se puede así mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antígeno a la
ebullición durante dos horas, o tratándolo con alcohol absoluto.
6. Para preparar el Antígeno flagelar "H", inactivar las fracciones somáticas en el otro
tubo de suspensión bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentración
del 0.5%
7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108
gérmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de
suero fisiológico, gotas de cada uno de los antígenos concentrados hasta alcanzar una
turbidez similar al tubo Nº3 de la Escala de MacFarland.
Este es un Método turbidimétrico de cálculo bacteriano, que consiste en diluir el antígeno y
apreciar la turbidez obtenida comparándola con la de los tubos patrones de un nefelómetro o
determinándola con exactitud mediante un Espectrofotómetro.
El Nefelómetro más conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:
Preparar una solución de Cloruro de Bario al 1%
Otra de Ácido sulfúrico al 1%.
Colocar una serie de 10 tubos vacíos y estériles
Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO N°
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cl2Ba 1%
0.1 cc.
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
H2SO4 1%
9.9 cc.
9.8
9.7
9.6
9.5
9.4
9.3
9.2
9.1
9.0
Bacterias
por cc.
3.0 x
108
6.0 x
108
9.0 x
108
1.2 x
109
1.5 x
109
1.8 x
109
2.1 x
109
2.4 x
109
2.7
x
109
3.0
x
109
37
La unión de ambos reactivos químicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al
homogenizarse da una turbidez que es más intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario
empleado. A cada tubo corresponde una concentración de gérmenes determinada, de acuerdo a lo
señalado en el cuadro.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Sembrar cada uno de los antígenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con la
finalidad de controlar su esterilidad
Realizar la observación a las 18 ó 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.
Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la práctica.
D. INOCULACION
1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc.,
1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antígeno, con intervalo de 4 a 5 días.
2. Realizar la sangría después de 4 días de la última inyección.
E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIÓN (DEMOSTRACION)
38
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PRACTICA Nº 14
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STAPHYLOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,
agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados, y Grampositivos en los
cultivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como
patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forúnculos, abscesos,
intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S.
epidermidis y S. saprophyticus, sólo dos tienen importancia médica. Sólo la especie patógena S.
aureus produce una enzima llamada coagulasa.
MATERIALES
Placas Petri con Agar hipertónico de Chapman (MH) o Manitol salado
Placas Petri con Agar sangre (AS)
Tubos con Caldo plasma
Láminas portaobjetos
Set de colorantes para Gram
Asa de platino en aro
Reactivo Catalasa
PROCEDIMIENTO:
1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertónico de Chapman y Agar sangre,
por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a 37°C
2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las
características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman
(tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una colonia
de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37ºC (Prueba de la
coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y
como indicador de pH el rojo de fenol
7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina
39
RESULTADOS:
1. Características macroscópicas de la muestra:
2. Resultado de la coloración realizada
3. Resultado de la reacción de la Coagulasa, en caldo plasma observar que sólo S. aureus coagula
el plasma.
4. Resultado de la reacción de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparición de
burbujas en las tres especies.
5. Resultado en Agar hipertónico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de
S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.
6. Observar la presencia de hemólisis en las placas con Agar sangre
7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es sensible
y S. saprofiticus resistente.
PROTOCOLO:
Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamaño de la
colonia, forma que presenta, pigmento, hemólisis, y otras características que crea conveniente.
Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.
CEPAS
BACTERIANAS
TRABAJADAS
MH
o
Manitol
salado
AS
(Agar
sangre)
COAGULASA
CATALASA
GRAM
Característica
morfológica
40
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PRACTICA Nº 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
El género Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificación de Lancefield
en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis);
H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningún grupo). Con
la coloración de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son
patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del
cuerpo humano y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite diferenciar
algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glóbulos
rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero no lisados como sucede en la hemolisis
tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo
de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos
alfa hemolíticos se denominan S. viridans. La mayoría de Streptococcus pueden desarrollar en
presencia o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las
especies de Streptococcus.
MATERIAL
Cultivo de Streptococcus en medio de
caldo BHI
Placas con Agar sangre de carnero
Torunda estéril y bajalengua
Tubos con Thioglicolato
Tubos con caldo Inulina
Discos de Bacitracina
Discos de Optochin
Solución de Desoxicolato al 2%
Tubo con ClNa al 6.5%
Láminas portaobjetos
Set de colorantes de Gram- Kopeloff
Asas de Kolle, pinzas
Microscopio, aceite de inmersión.
PROCEDIMIENTO
1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce
turbidez o sedimento.
2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de dispersión y
agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lámina portaobjetos y
colorear por Gram.
41
3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el disco
de Optochin,
4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.
5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.
6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%
7. Realizar la prueba de la catalasa
8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas bacterias
de lisarse en presencia de sales biliares
LECTURA
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolíticos; S. viridans y S. pneumoniae
son alfa- hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la Bacitracina
y S pneumoniae es sensible a la Optochina
3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de
Agar sangre e incubar a 35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva se observa que las
colonias son lisadas (desaparecen)
4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.
5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el
efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% y
ácido tioglicolato que actúa como agente reductor disminuyendo aun más el potencial de oxido-
reducción del medio.
6. En la solución de ClNa al 6.5% , observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D)
7. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa
PROTOCOLO
Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada
IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS
ORGANISMO
SENSIBILIDAD
CAMP
Hidrólisis
De
Metabo
lismo
de la
Inulina
Desarro
llo en
NaCl
6.5%
Lisis por Bilis
Bacitra
cina
Opto
chin
Hipu
rato
Escu
lina
Desoxi
colato Sodio
- hemolíticos
GRUPO A
S. pyogenes
S
R
N
N
N
N
N
N
GRUPO B
S. agalactiae
R*
R
P
P
N
N
P*
N
GRUPO C, F, G
R
R
N
N
N
N
N
N
- hemolíticos
GRUPO Viridans
R*
R
N
N
N*
N
N
N
S. pneumoniae
R
S
N
N
N
P
N
P*
S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reacción variable
42
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PRACTICA Nº 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO
NEISSERIA
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares, con los
lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias especies, entre éstas N.
gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En
muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se tiñen adicionalmente con el colorante azul de
metileno, observándose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que
le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayoría de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una
tensión de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37°C y un pH de 7.2 a
7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros
microorganismos morfológicamente similares.
La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de carbono: Glucosa,
maltosa, sacarosa y lactosa.
El diagnóstico de gonorrea requiere una estrecha cooperación entre el médico y el laboratorio.
Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recolección correcta de la muestra.
b) Selección del recipiente apropiado para el transporte y rápido envío al laboratorio.
c) Selección del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificación de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES
Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria
Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria
Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
Reactivo de Citocromo- oxidasa
Reactivo de catalasa
Solución fisiológica al 0.85%
Láminas portaobjetos
Set de coloración de Gram
43
Colorante de Azul de metileno
Microscopio
Asas de siembra en aro y punta
Solución de alcohol yodado
Algodón y Xilol.
METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeñas, circulares de
bordes continuos, blanco- grisáceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a
N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeñas de borde entero, circulares,
translúcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el
cambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la
lámina control.
4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el azul de
metileno.
PROTOCOLO
MEDIO DE CULTIVO
MUESTRA
COLONIAS TAMAÑO GRAM AZUL DE
METILENO
AGAR THAYER MARTIN
AGAR CHOCOLATE
SECRECION
ENDOCERVICAL
PRUEBAS
BIOQUIMICAS
OXIDASA CATALASA
44
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PRACTICA Nº 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS:
GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El género Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que
pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. Algunas especies causan enfermedades en el
hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como
"carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y se
encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patógena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patológicos se presenta
como un bacilo rectilíneo, Gram positivo, grueso, inmóvil y capsulado. En los cultivos, las colonias
son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en
largas cadenas, sin cápsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.
MATERIALES
Placas Petri con Agar nutritivo
Placas Petri con Agar sangre
Tubos con Caldo nutritivo
Tubos con Agar semisólido
Tubos con gelatina
Láminas para frotices
Set de coloración de Gram
Set de coloración de Hiss para cápsula
Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas
Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4) Lavar con agua corriente y secar
5) Observar al microscopio con lente de inmersión
45
COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos
(adicionar colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5) Lavar y secar
6) Observar al microscopio con lente de inmersión
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especies patógenas
y ß- hemolíticas en las especies saprofitas.
En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido
En Gelatina: sólo las especies saprofitas producen hidrólisis.
EN LAS LAMINAS COLOREADAS
Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el
centro del bacilo.
Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color púrpura y la cápsula de color claro o incoloro.
Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
GENERO BACILLUS ESPECIE PATÓGENA
ESPECIE SAPROFITA
Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Agar semisólido
Hemolisis
Hidrólisis de la gelatina
Prueba de la Catalasa
Fermentación salicina
Movilidad
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PRACTICA Nº 18
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO
LISTERIA
INTRODUCCION
El género Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerófilos, no esporulados, móviles y
presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V ó
de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposición, en el suelo,
en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patógena es Listeria
monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los
ganglios linfáticos, produce síntomas neurológicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las heces, desarrolla
bien en medios de cultivo comunes.
MATERIAL
Tubos con Caldo nutritivo
Tubos con medios semisólidos (Motilidad)
Placas Petri con Agar sangre
Placas Petri con Agar nutritivo
Tubos de 13x100 con:
Agar urea de Christensen
Citrato de Simmons
Caldo rojo de fenol con glucosa
Caldo rojo de fenol con sacarosa
Caldo rojo de fenol con lactosa
Caldo rojo de fenol con manita
Caldo rojo de fenol con salicina
Caldo esculina
Caldo:
MR-
VP
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.
2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lámina y
laminilla.
47
3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los
diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.
LECTURA
FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.
LAMINAS EN FRESCO : Se observará la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40
aumentos.
EN CALDO NUTRITIVO: Se observará una turbidez tenue y homogénea.
EN AGAR SANGRE : Se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.
EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar
MOVILIDAD
+
GLUCOSA
+
MR
+
HEMOLISINA
+
SACAROSA
-
VP
+
CATALASA
+
LACTOSA
-
OXIDASA
-
MANITA
-
UREA
-
SALICINA
+
CITRATO
-
ESCULINA
+
48
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PRACTICA Nº 19
"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION
BUCOFARINGEA”
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma
continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen de la
edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinar la flora normal de
cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo, los lactantes
alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto gastrointestinal, en
los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos presentan un gran desarrollo de
levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,
Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias
anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gram
negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patógenas como Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus
influenzae.
MATERIALES
Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)
Agar nutritivo en placas
Agar sangre en placas
Agar chocolate en placas
Medio hipertónico de Chapman en placas
Agar Mac Conkey en placas
Agar Sabouraud en tubos
Torundas estériles (2 x tubo)
Baja lengua
Asa de Kolle en aro
Laminas portaobjetos
Set de colorante Gram
Varillas para coloración
49
PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.
3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37ºC
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los
medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioquímico correspondiente y pruebas de
patogenicidad si se requiere.
Caldo plasma en tubo
- Disco de Bacitracina
- Disco de Optochin
- Reactivo de Citocromo- oxidasa
- Reactivo de catalasa
PROTOCOLO
El alumno realizará un cuadro estadístico con los resultados obtenidos.
50
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PRACTICA Nº 20
AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL-
RESISTENTES
GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este género esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología bacilar,
poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan lentamente
en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.
Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en el aire, en
el agua y en la tierra.
Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis, que
puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar, renal y digestiva los
mas frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para establecer el diagnóstico
específico a través de la baciloscopia.
Mycobacterium leprae produce la lepra ó enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis,
Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia,
también, son patógenos.
MATERIALES
Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo
Láminas portaobjetos nuevas y desengrasadas
Láminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis
Láminas con extensión de otros tipos de Micobacterias
Set de colorante de Gram
Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.)
Cepas patrones sembradas en medio Lownstein Jensen + verde de malaquita
PROCEDIMIENTO
1. Observar los caracteres macroscópicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.
2. Tomar una partícula mucopurulenta del esputo y hacer una extensión homogénea sobre la
lámina portaobjetos nueva.
3. Fijar la preparación.
4. Realizar una coloración con Gram y otra con Ziehl- Neelsen
51
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, etc.
LECTURA
Observar como los gérmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloración de Ziehl- Neelsen
porque no son ácidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en
un fondo azul.
EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO
Enfocar con el objetivo de 100x la lámina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la
longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los
resultados, según el siguiente cuadro:
Negativo : No se observan bacilos en 100 campos.
Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.
Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.
Positivo (+++) : Más de 10 bacilos por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que esta en tratamiento y permite
detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la producción de pigmento, permitiendo clasificarlos en
grupos.
I. Cepas que desarrollan en 8 ó más días. Llamadas de desarrollo lento.
GRUPO I: Pigmentan por estímulo de la luz. Son fotocromógenas.
Ejemplo: M. kansasi , M. simiae
GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estímulo luminoso. Son escotocromógenas. Ejemplo: M.
scrofulaceum
GRUPO III: No pigmentan espontáneamente, ni por estímulo luminoso.
Son no cromógenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y
M. tuberculosis var. Bovina
II. Cepas que desarrollan en 7 días o menos.
GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la práctica correspondiente.
52
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PRACTICA Nº 21
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO
CORYNEBACTERIUM
INTRODUCCION
El género Corynebacterium comprende un grupo heterogéneo de bacterias en el cual se incluyen
especies comensales y patógenos a animales, plantas y bacterias de suelo.
Las características comunes del género son:
1) Bacilos pleomórficos Grampositivos, No forman esporas
2) Las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposición en
“letras chinas”,
3) Aerobios o anaerobios facultativos,
4) Catalasa positivos,
5) Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infección aguda, contagiosa y
febril, caracterizada por inflamación local y formación de una seudomembrana en la orofaringe,
además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina (toxina difterica). Es
propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vías respiratorias
superiores.
El género se divide en tres grupos:
Grupo I : Corinebacterias parásitas y patógenas para el hombre y animales;
Grupo II : Corinebacterias fitopatógenas, y;
Grupo III : Corinebacterias no patógenas.
Algunas de las especies más frecuentemente halladas en el laboratorio clínico son: C.diphtheriae,
C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y
C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier lesión
inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar
inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.
MATERIAL
Cepa de Corynebacterium diphtheriae en
caldo enriquecido
Placa con Agar sangre
Placa con Agar chocolate telurito de
potasio
Tubo de 13x100 con medio Pai en plano
inclinado
Set de colorante de Gram
Set de colorante de Albert
Tubos con Agar Urea Christensen en
plano inclinado
Caldo Rojo de fenol + Glucosa
Caldo Rojo de fenol + Maltosa
Asas de siembra
Láminas portaobjetos
Aceite de inmersión
Microscopio
53
PROCEDIMIENTO
1. Tomar el inóculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el método de
dispersión agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por
estrías. Incubar por 48 horas a 37°C.
2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el método de Albert.
4. Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo
Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
COLORACION DE ALBERT
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tiñen
de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol
etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X
LECTURA
En la coloración Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados
ensanchados en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o
dispuestos paralelamente, o en forma de “letras chinas”.
En la coloración Albert observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro
En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram
negativos) observar los tres tipos de bacilos diftéricos:
a) Tipo gravis: colonias grandes grisáceas.
b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras.
c) Tipo intermedius: colonias pequeñas, lisas o rugosas con centro negro.
En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con
bordes enteros, color crema o blanco grisáceas, sólo las colonias Tipo mitis producen beta
hemolisis.
BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae
Hemolisis: Beta (sólo el Tipo mitis) Gelatina : Negativo
Catalasa : Positivo Sacarosa : Negativo
Movilidad: Negativa Glucosa : Negativo
Urea* : Negativa Maltosa : Positivo
Nitrato : Positivo Lactosa : Negativo
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PRACTICA Nº 22
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:
GENERO PSEUDOMONAS
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con
flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes
para su desarrollo “In Vitro”.
Pseudomona aeruginosa es la especie más frecuentemente asociada con enfermedad humana,
principalmente quemaduras severas, pero también se aíslan de orina, sangre, lavados bronquiales,
esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con
riesgo de vida fatales.
La detección del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnóstica de P.
aeruginosa, la mayoría de los aislamientos producen también el pigmento fluoresceina y
desarrollan bien a 42°C.
MATERIAL
Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.
Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150
Agar nutritivo en Placa Petri
Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150
Agar semi-sólido en tubo de 13 x 100
Medio TSI
Reactivo de Oxidasa
Frasco con cloroformo
Set de colorantes Gram
Láminas portaobjetos
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el método de
Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas
conocidas.
3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.
55
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeños, Gram negativos.
CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de
color verdoso y un olor característico.
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.
MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este género no
fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos sólo por vía oxidativa en el medio
de oxidación- fermentación (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusión del pigmento en el
Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la
piocianina.
PROTOCOLO
CARACTERÍSTICAS
MICROORGANISMOS
Pseudomona aeruginosa
Crecimiento en Mac Conkey
Reacciones en TSI
Difusión de Pigmento en Agar nutritivo
Prueba de Citocromo- oxidasa
Solubilidad Cloroformo- piocianina
Crecimiento Agar nutritivo
Agar semisólido
56
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PRACTICA Nº 23
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO
BRUCELLA
HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles no formadores de esporas.
Son Gram negativos y necesitan una tinción prolongada con la fucsina básica de por lo menos 2
minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tinción convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta” es causada por las siguientes especies
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicación y desarrollo “in vitro” es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar
Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificación de especies se utiliza una serie bioquímica para observar la producción de H2S,
hidrólisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 % y
requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, líquido cefalorraquídeo, médula ósea o biopsias
de ganglios linfáticos e hígado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz- Castañeda. La
incubación debe hacerse en una atmósfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37°C. Las colonias aparecen
entre el 4 al 5 día, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 días antes de ser descartado
como negativo.
II: SEROLOGIA
Para el diagnóstico serológico se utilizan las técnicas de:
1. Aglutinación rápida en placa
2. Aglutinación lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinación del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA
57
MATERIAL
Tubo con cepa de Brucella
Frascos con medio de Ruiz- Castañeda
Muestra de sangre total de paciente
Agar fucsina en placa
Agar Thionina en placa
Suero positivo y suero control negativo
Antígeno estandarizado de Brucella
Láminas excavadas
Pipetas de 0.2 ml
Palito mondadientes
Láminas portaobjetos
Set de coloración de Gram
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castañeda, e
incubar por 4 a 5 días a 37°C. Se debe esperar hasta 30 días para descartar el cultivo.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el método de Gram,
siguiendo las recomendaciones señaladas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer círculo de la 2da. Línea de
la lámina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lámina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alícuota de suero añadir una gota de antígeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotación, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el
suero negativo y la dilución más alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lámina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos más.
6. A los 8 minutos no más, observar la presencia de grumos (aglutinación) que indica una reacción
positiva antígeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
58
INTERPRETACION
SUERO ANTIGENO DILUCION / TITULO
0.08 + 0.03 25 ó +
0.04 + 0.03 50 ó ++
0.02 + 0.03 100 ó +++
0.01 + 0.03 200 ó ++++
0.005 + 0.03 400 ó +++++
DIFERENCIACION BIOQUIMICA
ESPECIES
DE
BRUCELLA
PRUEBAS DE DIFERENCIACION
Huésped
Preferido
Necesidad
CO2 (5%)
Producción
de H2S
Hidrólisis
de Urea
Crecimiento en
Fucsina
0.002 %
Thionina
0.002 %
B.abortus
Bovino
+
++
Débil
+
-
B.melitensis
Cabra, oveja
-
-
Débil
+
+
B.suis
Cerdos
-
+
Fuerte
-
+
B.canis
Perros
-
-
Fuerte
-
+
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PRACTICA Nº 24
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de
los cuales son patógenos para el
Hombre y causantes de enfermedades.
El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el
COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el
aislamiento del agente patógeno bacteriano.
La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en
determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite
causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el sistema urinario. La E. coli
enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo
enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la
E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones
oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e
infección y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y
causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B ó C.
El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la
Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y
fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta.
El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos
peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones
urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital.
60
MATERIALES
Muestra de heces.
Placas Petri con Agar Mac Conkey
Placas Petri con Agar SS
Placas con Agar Manitol
Tubos con Agar Sabouraud
Tubos con medio TSI, LIA
Tubos con caldo peptonado
Tubos con Citrato de Simmons
Tubos con caldo MR-VP
Frasco con Lugol
Reactivo para Citocromo-oxidasa
Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
Reactivo para Rojo de metilo
Láminas portaobjeto y cubreobjeto
Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)
Juego de colorantes para Gram
Material básico para laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de
sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de
solución salina.
b) Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey,
Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA,
Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la
Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en
las colonias que son SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las
características.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el
medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y
producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio
debido a la producción de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador
púrpura de bromocresol]
61
EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el
reactivo de Kovac tornándose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como
fuente de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul),
negativo (color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay
producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color
amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se le
añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo
(color amarillo).
PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la
colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso
contrario no habrá ningún cambio de color
COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.
CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay
movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos
DIFERENCIACION BIOQUÍMICA
Especies
TSI
(glucosa, sacarosa
lactosa,SH2 )
LIA
Lisina
Cp
Indol
Ct
Citrat
o
MR-VP
Oxidasa
Ac.
Sup
Ac.
Fon
Ga
s
SH2
Escherichia coli
+
+
+
-
V
+
-
+ -
-
Klebsiella
+
+
+
-
-
V
+
- +
-
Salmonella typhi
-
+
-
+
+
-
+
+ -
-
Shigella
-
+
-
-
-
V
-
- -
-
Proteus
-
+
-
V
-
-
V
+ -
-
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PRACTICA Nº 25
ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
géneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio comprende muchas especies siendo las
de importancia médica Vibrio cholerae, causante del cólera epidémico; V. parahaemolyticus,
causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutáneas,
celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas, tejidos
blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en
parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman
esporas, sin cápsula, aerobios y oxidasa positivo.
La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,
citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubo con Caldo peptonado
Tubo con MR-VP
Tubo con Citrato de Simmons
Desoxicolato de sodio al 0.5 %
Láminas portaobjetos
Set de coloración de Gram
Microscopios
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.
cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares,
de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos a partir de la
utilización de la sacarosa)
En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto
63
verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva)
2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la
sacarosa, no produce H2 S.
3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol
4. En el medio LIA observar si hay decarboxilación de la Lisina.
5. En el medio MR- VP detectar la producción del acetil-metil-carbinol
6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio
7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
8. Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de Desoxicolato
sobre una lamina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de V.
cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensión viscosa al retirar el asa “como una
cuerda larga” que se torna mas pegajosa después de 60 segundos mas.
9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioquímicos sembrados.
PROTOCOLO
MEDIOS
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
TSI
Acidez en superficie y profundidad
Acidez superficie y
profundidad
LIA
Positiva por descarboxilación de la
Lisina
Positiva
VP
10- 50% cepas es positivo
Negativo
MR
Negativo
Negativo
Indol
Positivo
Positivo
Citrato
Negativo
Negativo
Urea
Negativo
Negativo
Oxidasa
Positiva
Positivo
Catalasa
Positiva
Positiva
Prueba de la cuerda
Positiva
Negativo
RESULTADOS
1. Realizar esquemas de lo observado en la práctica
2. Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes.
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PRACTICA Nº 26
ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas,
muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µm y 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan a ganchos
semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
El género Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales;
comprende 6 especies patógenas Leptospira interrogans con 18 variantes serológicas, L. noguchi,
L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos
comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades
antigénicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de
restricción o la composición de su DNA.
La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los roedores
y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la orina el agente
etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisión puede ser
directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del agua o material
contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones de la piel y mucosas
incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales líquidos, semisólidos y sólidos enriquecidos con suero de conejo o
carnero al 8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en un periodo de incubación de 5- 10 días,
en condiciones de aerobiosis.
Para el diagnóstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:
1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clínicas (sangre, líquido cefalorraquídeo,
orina) en medios de cultivo o inoculación en hámster o cobayo.
2. Evidencia sexológica en sueros pareados con incremento cuádruple del título de diagnóstico
inicial de 1:100
65
MATERIAL
Cultivo de Leptospira en medio semisólido de Fletcher- modificado
Lamina control coloreada por el método de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de
Congo.
Microscopio.
LECTURA
En el medio semisólido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en
todo el tubo y la formación de un anillo a unos milímetros de la superficie del medio
En la coloración de Kiktenko las Leptospiras se tiñen de un color rosado- violeta en fondo
incoloro, presentándose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C ó S, generalmente con los
extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas.
En la observación al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un “collar
de perlas” son muy móviles, realizan movimientos de translación, rotación y al rededor de su
eje.
RESULTADOS
1. Características del cultivo observado.
2. Realiza esquema de la observación en las láminas coloreadas
66
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PRACTICA Nº 27
ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA
INTRODUCCIÓN
La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la
Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrión y se transmite a través de la picadura de un insecto
alado hematófago conocido como Lutzomya.
Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su
tamaño varía entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de diámetro, presenta flagelos unipolares
en número de 1 a 10. En los cultivos jóvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y en
cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta)
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por los
colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura óptima de 29°C en medios
enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifásico con sangre y plasma,
durante un periodo de incubación de 5- 10 días. Su crecimiento es lento por lo general semanas,
enturbia el medio con sedimento y a veces se observa películas o témpanos en la superficie de la
parte líquida del medio.
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemática de la enfermedad, de las lesiones
eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemática) usando el agar de fases,
medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar
pruebas serológicas (aglutinaciones, fijación de complemento, Elisa, etc.), ó por Infección de los
hematíes humanos por Bartonella (Danza de los hematíes) e Inhibición del movimiento de los
hematíes por acción de anticuerpos específicos antibartonella
MATERIAL
Frotices coloreados por Leishman, Wrigth ó Giemsa procedentes de cultivo.
Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases
Cortes histológicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIÓN
Observar al microscopio las láminas coloreadas y apreciar la morfología y tinción de Bartonella.
En las láminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada.
En los cultivos observar la turbidez del medio, la formación de sedimento y la formación de
películas o témpanos
Realizar esquemas de las observaciones realizadas.
67
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PRACTICA Nº 28
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE TREPONEMA – PRUEBA DE VDRL ó RPR
INTRODUCCIÓN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogéneo de microorganismos espirilares
móviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres géneros
de microorganismos patógenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sífilis, T.
pertenue, produce el pián, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la
fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina
infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y
5 a 15 m de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes de
anilina y es difícil su cultivo en medios artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (líquidos tisulares) pueden
observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas móviles
características.
2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
3. Pruebas serológicas para sífilis, estas pueden usar antígenos treponémicos o antígenos no
treponémicos (cardiolipina purificada del corazón de buey)
4. Prueba de Floculación (VDRL), el antígeno VDRL es una solución alcohólica que contiene
0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que
las partículas del antígeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en
enfermos se combina con la reagina de la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos
contra algunos antígenos).
MATERIALES
Suero problema
Antígeno VDRL
Laminas excavadas
Pipetasgraduadas
PROCEDIMIENTO
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (baño María a 56°C x 30’) sobre la lamina
excavada
Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formación de floculos cuando la
reacción es positiva.
RESULTADOS
N (No reactivo) ........................ Ausencia de floculos
RD (Reactivo débil) ........................ Floculos pequeños
R (Reactivo) ....................... Floculos medianos y grandes
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PRACTICA Nº 29
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO
INTRODUCCION
El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes patógenos
causantes de una infección urinaria.
Para la obtención de muestras debe considerarse:
La recolección debe ser con un mínimo de contaminación
Establecer el momento óptimo para la recolección, con el objeto de tener la mejor probabilidad
de recuperar microorganismos causales.
Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las técnicas de cultivo necesarias.
Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administración de antibióticos.
Normalmente la orina es estéril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de contaminación
por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo:
1. Si existe menos de 10,000 gérmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la muestra
negativa.
2. Cuando la orina tiene más de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infección urinaria.
3. Si el número de gérmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y será
necesario repetir el cultivo.
La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recolección para
lograr recuentos de colonias exactos, luego se deberá identificarlas y realizar el Antibiograma
correspondiente.
MATERIAL
Muestra de orina patológica
Sedimento de orina
Agar Mac Conkey, Medio hipertónico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en placas
Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C
Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C
Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea de
Christensen.
Tubos con 9.9 ml de Suero fisiológico 0.85%
Pipetas de 1 ml. estériles
Placas Petri, vacías estériles
69
Bocal con desinfectante
Microscopio
Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen
Serie de colorantes de Gram
Láminas portaobjetos y laminillas
PROCEDIMIENTO
PRIMER DIA:
A. Estudio de las características macroscópicas
Describir el aspecto de la orina:
Color (amarillo, oscuro, castaño o incoloro)
Señalar si la orina es clara o turbia.
B. Estudio de las características microscópicas
1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lámina y laminilla al microscopio
con objetivos de 10X y 40X
2. Realizar un frotis y colorear por el método de Gram y Ziehl- Neelsen
C. Siembra de la muestra de orina:
1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersión agotamiento en las
placas con Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud
2. Método de dilución: Preparar una dilución de la orina de la siguiente manera.
a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con
suero fisiológico 0.85% estéril. Mezclar bien.
b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacías
estériles.
c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar
nutritivo licuado, rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla
homogénea.
d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37°C por 18- 24 horas.
LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales
anormales, leucocitos, levaduras, parásitos, espermatozoides, células epiteliales, cilindros.
2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram
negativas, y por el método de Ziehl- Neelsen las bacterias ácido alcohol resistentes(en caso de
infección por Mycobacterium).
SEGUNDO DIA:
1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el
crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de
70
colonias resistente a altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia de
levaduras.
2. En la siembra por dilución, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el número de
colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.
3. Se deberá seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar
suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioquímica
respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de
Christensen. Incubar a 37°C por 18-24 horas.
Nota: El agente causal aislado e identificado deberá ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad
Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara
una suspensión en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentración Mínima Inhibitoria
(MIC) del antibiótico cuya finalidad es orientar en la terapéutica y la concentración del antibiótico
alcanzado en el suero o en foco de infección.
El método de disco-difusión estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el
laboratorio, para dicha determinación (MIC).
REPORTE FINAL
Diseñar el protocolo correspondiente, señalando:
1. La observación macroscópica y microscópica de la muestra clínica.
2. Las características del desarrollo bacteriano, y los principios bioquímicos en cada uno de los
medios selectivos empleados.
3. Los resultados del comportamiento bioquímico.
4. La determinación del agente patógeno causante de la infección urinaria.
5. Determinación cuantitativo número de UFC por ml.
Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)
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PRACTICA Nº 30
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES
LACTANTES.
OBSERVACION DE LÁMINAS COLOREADAS
INTRODUCCION
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los
animales, de las plantas y también de las bacterias (bacteriófagos).
En este capítulo analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano; debido
a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo intracelular obligado,
los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las
enfermedades producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.).
Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y
multiplicación deben necesariamente utilizar los sistemas de las célula que parasitan y por ello se
denominan parásitos intracelulares obligados.
En los últimos años, se han desarrollado métodos de diagnóstico rápido para la mayoría de las
infecciones virales así como drogas antivirales específicas para muchos virus.
Se emplean métodos directos para el diagnóstico de los virus, y dado que estos solo se replican en
el interior de las células vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de métodos especiales
en el laboratorio de virología, tales como:
a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayoría de los virus pueden multiplicarse en
cultivo de células apropiadas.
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amniótica, cavidad alantoidea y
saco vitelino).
c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hámsters, monos)
d) Serología o demostración de anticuerpos frente al virus.
e) Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones.
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigación médica y epidemiología y
constituye un método muy extendido para el diagnóstico de la infección.
Por lo tanto estas prácticas nos orientan a conocer los diversos métodos de aislamiento directo o
indirecto para demostrar los efectos citopáticos de los diferentes virus y sus formas como se deben
evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.
METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLÓGICO:
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A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS.
Muchos de los virus y rickettsias patógenas para el hombre y los animales pueden propagarse en las
células vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrión de huevos embrionados de
gallina. Estas técnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y desde entonces están
siendo ampliamente usadas.
Las vías de inoculación y la edad del embrión a usar dependen del agente viral que va a ser
inoculado.
MATERIALES
Huevos embrionados de 7-9 días.
Huevos embrionados de 10-12 días.
Jeringas de tuberculina con aguja N° 25 x ¼” y 22 x 2”.
Colorante Fucsina al 1% con agua destilada
Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada
Frascos con Alcohol yodado
Algodón
Ovoscopio
Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados
Equipo de disección (Pinzas, tijeras curvas, guantes)
INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA
a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 días.
b) Hacer un pequeño orificio con el punzón en la zona marcada de huevos embrionados.
c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente ¼” en ángulo de 45° e
inocular 0.2 ml. de colorante.
d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33-35°C por 2-4
días, luego cosechar y observar.
INOCULACION POR VIA AMNIOTICA
a) Marcar la cámara de aire y la posición del embrión de 10-12 días.
b) Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima del
embrión y hacer una perforación rectangular de 0.5 cm, con el punzón.
c) Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona no
vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.
d) Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arriba la membrana amniótica,
formando una pequeña “tienda” en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solución de Azul de
metileno o del inoculo problema.
e) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.
f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 33-35°C
por 2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)
INOCULACION DEL SACO VITELINO
a) Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del huevo
embrionado de 6-7 días.
b) Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire.
c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x½” inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la
73
aguja verticalmente a través de la cámara de aire, hasta 35 mm de profundidad.
d) Sellar la abertura
COSECHA DE LOS LIQUIDOS (SEGÚN LAS CAVIDADES INOCULADAS)
a) Comprobar que el embrión este vivo. Enfriar a 4°C los huevos embrionados por algunas horas
(2-3 horas antes) para prevenir sangrado de los embriones.
b) Cortar la cáscara que cubre la cámara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes.
c) Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localización del Azul
de metileno y/o Fucsina en las zonas de inoculación (Membrana alantoidea, amniótica,
corioalantoidea y saco vitelino).
d) Cosechar las membranas en estudio y extraer el liquido alantoideo, amniótico y realizar las
pruebas de diagnóstico correspondientes según la investigación solicitada
D. INOCULACIÓN EN RATONES LACTANTES:
Se utilizaran ratones lactantes y las vías de inoculación serán:
Intraperitoneal, Intracraneal, Subcutánea y Nasal.
E. OBSERVACIÓN DE LAMINAS COLOREADAS:
Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusión
(Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el núcleo o en el citoplasma y su
localización es específica de la enfermedad viral.
Se considera estos cuerpos de inclusión (efecto citopatico) como conglomerados de virus
asociados a productos de reacción de la célula infectada.
OBSERVACIÓN DE LÁMINAS:
1. Cultivo de células normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tiñe de rosado el
citoplasma.
2. Rabia: corte histológico de cerebro. Coloración HE. Observar inclusiones eosinofilas
intracitoplasmáticas denominadas corpúsculos de negri.
3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de células humanas (HEP-2), observar la degeneración
celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el
borde de la célula.
4. Herpes simple en cultivos de células: Observar las células gigantes polinucleadas, las
inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
5. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusión intranuclear basófila en “ojos
de lechuza” rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basófilo).
6. Adenovirus en cultivo de células HEP-2: Observar la agrupación de células en racimo y las
inclusiones basófilas intranucleares.
PROTOCOLO
Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.
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PRACTICA Nº 31
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS AMBIENTALES
INTRODUCCION
Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a
expensas de la materia inerte existente, la mayoría se encuentra como saprofito, otros pueden ser
causantes de inducir hipersensibilidad así como también ser responsables de infecciones. Entre los
hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus,
Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula
MATERIALES
Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium,
Rhodotorula y Helmintosporium.
Láminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
Microscopios
PROCEDIMIENTO
1. Estudie las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio aéreo, aspecto de la colonia, producción de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscópico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las características
microscópicas de cada uno de los hongos preparados en las láminas con azul de lactofenol.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego varía de acuerdo a la especie en: amarillo, verde azufrado,
marrón o negro.
Microscópicamente presenta hifas tabicadas que forman conidióforos no tabicados que se ensanchan
en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas y de donde
salen las conidias en cadena.
Penicillium
Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante.
Microscópicamente presenta hifas tabicadas con conidióforos ramificados en cuyo extremo se hallan
los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.
Fusarium Colonias de micelio aéreo algodonoso de color rosado ó violeta en la superficie.
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Microscópicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidióforos, macroconidias septadas y
alargadas, fusiformes.
Rhizopus
Colonias de micelio aéreo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisáceo.
Microscópicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos
esporangioforos que terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se
encuentran las esporas.
Cephalosporium
Colonias de micelio aéreo de color blanco- rosado o blanco- amarillento.
Microscópicamente presentan hifas septadas, conidióforos cortos que dan origen a conidias hialinas
agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, después se torna de color negro en el centro, con la periferia elevada
de color gris.
Microscópicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales sobre
conidióforos cortos y nudosos
Rhodotorula
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos
carotenoides. Microscópicamente se observa células ovoides o redondeadas con o sin yema.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica.
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PRACTICA Nº 32
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS
INTRODUCCION
Los dermatofitos son organismos queratinófilos que invaden las estructuras queratinizadas del
cuerpo como la piel, pelo y uñas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los
invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones más
comunes en los humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del género Trichophyton, Microsporum y
Epidermophyton, así como también Malassezia furfur que es causante de la Tiña versicolor o
Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce nódulos en el tallo piloso
de los cabellos, barba y bigote.
Por su hábitat pueden clasificarse en: Zoofílicos (Microsporum canis), Geofílicos (Microsporum
gypseum), y Antropofílicos (Epidermophyton).
MATERIALES
Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum y E.
floccosum.
Lámina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
Láminas preparadas de M. furfur en hidróxido de potasio al 20%.
Láminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.
Material básico de laboratorio(xilol, algodón, alcohol)
Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia , producción de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las características microscópicas de cada uno de los hongos preparados
en láminas.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.
Trichophyton rubrum
Colonias de micelio aéreo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un pigmento
de color púrpura.
Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias sésiles piriformes, a veces puede
observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
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Trichophyton mentagrophytes
Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un pigmento
amarillo- pardusco.
Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esféricas agrupadas, pueden
presentar hifas en espiral y macroconidias.
Trichophyton tonsurans
Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con
pigmentación amarillo- castaño al reverso.
Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en raquetas
septadas, pueden observarse macroconidios.
Microsporum gypseum
Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela.
Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en número de
4-6, rara vez se observan microconidias.
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con
pequeñas excrecencias en la superficie, pueden también observarse microconidias y clamidosporas.
Epidermophyton floccosum
Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques
transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.
Malassezia furfur (Pityrosporum)
Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas
agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnóstico se da por el
examen directo de la muestra
Piedraia hortai
Los nódulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro que
envuelven completamente el tallo piloso.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica
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PRACTICA Nº 33
ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION:
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las
cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutáneos.
Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras
especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crónicas en la piel o mucosas, aparato
genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar
infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutáneas; en el hombre la infección primaria es casi
siempre pulmonar.
MATERIALES
Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.
Láminas de Candida albicans en Agar harina de maíz.
Láminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.
Cortes histológicos con C. albicans y Cr. neoformans.
Material básico de laboratorio (xilol, algodón, alcohol)
Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y
consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las características que presentan cada especie de los hongos en el Agar
harina de maíz, tinta china y en los cortes histológicos.
CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES
Candida albicans
Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.
En el Agar- almidón- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que
tipifican a Candida albicans.
En los cortes histopatológicos observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las
lesiones rodeadas de una zona de histiocitos.
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto
mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
En las láminas con tinta china se aprecia la cápsula como un halo brillante entre el borde de la
levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china.
En los cortes histopatológicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las
lesiones, las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltración celular.
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PRACTICA Nº 34
ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION
Los hongos dimórficos, son hongos causantes de infecciones mucocutáneas y/o sistémicas en el
hombre y algunos animales.
Paracoccidioides brasiliensis
En su fase inicial esporógena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su
fase de levadura en tejidos infectados.
Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infección crónica, granulomatosa de la piel,
mucosa, ganglios y vísceras. Es más frecuente entre los trabajadores rurales.
Histoplasma capsulatum
En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporógena, que se desarrolla principalmente
sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza), excremento de
murciélagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado.
Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma
benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.
Sporothrix schenckii Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos
animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales
contaminados con el hongo. La infección esta localizada preferentemente en los ganglios linfáticos
MATERIALES
Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.
Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol
Cortes histológicos infectados por estos hongos.
PROCEDIMIENTO 1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia.
2. Observar las características microscópicas de cada uno de los hongos.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS
Paracoccidioides brasiliensis En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histológicos, se presentan como células
esféricas u ovaladas de 10 a 80 micras de diámetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscópicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con
microconidias esféricas o piriformes.
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En Agar Infusión cerebro corazón (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro.
Microscópicamente se observan células esféricas.
Histoplasma capsulatum
En frotices o cortes histológicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas en
los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeñas, redondas u ovaladas de 1-3 micras
de diámetro.
En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscópicamente
se observan hifas tabicadas con escasa producción de microconidias y gran cantidad de
macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa “Clamidospora tuberculada”.
En el medio BHI desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso rugoso, color marrón claro.
Microscópicamente, se observan como células ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeñas, blanquecinas presentando
posteriormente un aspecto húmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema a
negro.
Microscópicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidióforos en cuyo extremo se
encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan células en gemación
ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.
PROTOCOLO
Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.
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SEMINARIO-I
GENETICA MICROBIANA E INGENIERIA GENÉTICA
(Organización de los genes. Transferencia del DNA. Mutación. Expresión génica e
Ingeniería genética)
TEMA 1 : ORGANIZACIÓN DE LOS GENES (ADN PROCARIOTICO)
TEMA 2 : TRANSFERENCIA E INTERCAMBIO DE LA INFORMACIÓN
GENETICA BACTERIANA.
TEMA 3 : MUTACIÓN Y SUS CONSECUENCIAS
TEMA 4 : EXPRESIÓN GÉNICA E INGENIERIA GENÉTICA Y SUS
APLICACIONES EN LA MEDICINA.
OBSERVACIONES A TENER EN CUENTA:
PRESENTACIÓN EN POWER- POINT Y TRÍPTICO
EXPOSICIÓN: CADA TEMA 10-15 MINUTOS
LUGAR: AULA DE CLASES TEÓRICAS
HORA: EN HORAS DE PRÁCTICAS
PASO AL FINAL DE LA EXPOSICIÓN
Profesor Responsable del Curso
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ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA
SEMINARIO – II
VACUNAS ANTIMICROBIANAS. PROGRAMA DE VACUNACIÓN
(Tipos de vacunas. Requisitos de una buena vacuna)
TEMA 1: TIPOS DE VACUNAS Y CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS DE LA
VACUNACIÓN.
TEMA 2: OBJETIVOS DE LA VACUNACIÓN Y REQUISITOS DE UNA BUENA
VACUNA.
TEMA 3: PRACTICAS DE VACUNACIÓN ACTUAL Y MEDIDAS DE CONTROL
TEMA 4: CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS DE LA VACUNACIÓN
TEMA 5: PROGRAMAS DE VACUNACIÓN
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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA
SEMINARIO - III
ANTIBIÓTICOS Y QUIMIOTERÁPICOS
(Mecanismos básicos de actividad y resistencia a los antibióticos)
TEMA 1: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS
1.1: Inhibidores de la Síntesis de la pared celular
1.2: Inhibidores de la Síntesis de proteínas
1.3: Inhibidores de la Síntesis de ácidos nucleicos
1.4. Inhibidores de la función de la membrana citoplasmática
TEMA 2: RESISTENCIA A LOS AGENTES ANTIBACTERIANOS
2.1: Genética de la resistencia
2.2: Mecanismos de resistencia
TEMA 3: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS Y ANTITUBERCULOSTÁTICOS
3.1. Mecanismos básicos de actividad
3.2. Mecanismos de resistencia
TEMA 4: CLASES DE AGENTES ANTIVIRALES
4.1: Mecanismos básicos de actividad
4.2: Mecanismos de resistencia
TEMA 5: CLASES DE AGENTES ANTIMICÓTICOS
5.1: Mecanismos básicos de actividad
5.2: Mecanismos de resistencia
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ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA
SEMINARIO - IV
ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL:
(ETS) Y SIDA
1. SÍFILIS CONGÉNITA. FASES DE LA ENFERMEDAD. DIAGNÓSTICO
SEROLÓGICO.
2. PAPILOMAVIRUS
3. VIRUS DE LA HEPATITIS B
4. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH):
A) ETIOPATOGENIA DEL SIDA Y ESTRUCTURA DEL VIH
B) ASPECTOS GENERALES DEL CURSO DE LA INFECCIÓN POR VIH
C) EPIDEMIOLOGÍA. TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN
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SEMINARIO - V
ARBOVIRUS. DENGUE Y FIEBRE AMARILLA
TEMA 1: FIEBRE AMARILLA
a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA
b) MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA
TEMA 2: FIEBRE AMARILLA
a) DIAGNÓSTICO E INMUNOLOGÍA
b) PREVENCIÓN Y CONTROL
TEMA 3: DENGUE
a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA
b) MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA
TEMA 4: DENGUE
a) DIAGNÓSTICO E INMUNOLOGÍA
b) PREVENCIÓN Y CONTROL
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