Ingeniería metabólica

La mejora directa de la formación de un producto o las propiedades celulares a través de la modificación de una reacción bioquímica específica o la introducción de

una nueva mediante el uso de tecnología de DNA recombinante

¿Basta para aumentar la producción de un determinado producto sobreexpresar la enzima implicada en la producción del mismo? Es lo mismo producir insulina que etanol? ¿Cómo identifico los parámetros importantes que definen un estado fisiológico?

¿Cómo puedo utilizar esta información para determinar cómo estos procesos son regulados?

Identificación racional de los caminos más prometedores para lograr un determinado objetivo

Proponer caminos racionales para modificar estos parámetros en pos de obtener un objetivo específico.

¿Cómo analizo el impacto de esa modificación?

Biotecnología I

Modelo de la caja negra

Todas las reacciones celulares son agrupadas en una única reacción

para la producción total de biomasa

rs

rp

µ

FCE + aNH3 + bO2 yx/s biomasa + y CO2/s CO2 + w H2O

rs FCE + rNNH3 + rO2O2 rx biomasa + rCO2 CO2 + k H2O

Hay 2 maneras de analizar un cultivo

1

2 Ingeniería metabólica

Análisis de flujos metabólicos

¿Qué pasa dentro de la célula?

Análisis de las reacciones bioquímicas

El objetivo fundamental del análisis metabólico y los flujos es determinar qué factores y mecanismos son responsables del control de un determinado flujo metabólico. Sabiendo esto podremos diseñar un camino racional para modificar los caminos metabólicos en pos de un determinado objetivo.

Glu Glu Glu Ej: Producción de lisina por Corynebacterium glutamicum

wt Sobre-expresión de pyc Sobre-expresión de aspartato kinasa

(ask), aumenta prodyuccion de lisisna pero decrece drásticamente el crecimiento/fenotipo indeseado

Finalmente: sobreexpresión de piruvato carboxilasa y aspartato kinasa incrementa la productividad sin afectar marcadamente el crecimiento

Mediante AFM se determinó que el 90% de la lisina proviene de la ación de la piruvato carboxilasa (pyc)

Aumento en crec celular/fenotipo

indeseado

ask

Otros ejemplos… • Producción de 1,3-propanodiol por E. coli a partir de glucosa

• Ingeniería de S. cereviseae para la utilización de xilosa como fuente de energía para la producción de etanol

La α-D-xilopiranosa (D-xilosa, o azúcar de la madera) es una aldosa de cinco carbonos que es el principal componente monosacárido del xilano que se encuentra en la hemicelulosa de las paredes celulares de las plantas. de cinco carbonos (un monosacárido y pentosa). Desde el punto de vista biotecnológico, es útil conocer los mecanismos implicados en el metabolismo de la xilosa, ya que resulta económicamente deseable fermentar D-xilosa para producir etanol. Esto puede conseguirse ya sea utilizando levaduras que nativamente son capaces de fermentar la xilosa, tales como Scheffersomyces Pichia stipitis o haciendo uso de cepas de Saccharomyces cerevisiae conseguidas por medio de ingeniería metabólica . Pichia stipitis no resulta tan tolerante al etanol como la levadura que se utiliza tradicionalmente para producirlo a escala comercial que es la Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae por otra parte no es capaz de fermentar la D-xilosa para producir etanol. -Expresión de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa -Expresión de xilosa isomerasa -Ingeniería genética para permitir que la levadura utilice tanto glucosa como xilosa, sin represión x sustrato (represión por catabolito). – Expresión de transportador de celodextrina y una β-glucosidasa intracelular. También se ha tratado de hacer esto mismo en E. coli mediante la introducción de piruvato descarboxilasa y alcohol dehydrogenasa II de Zymomonas mobilis.

Estrategias generales • Expresión de genes constitutivos • Modificación de determinadas enzimas ya sea por sobreexpresión,

generación de mutantes de deleción, remoción de inhibición, entre

otras.

La elección de las modificaciones a realizar se centra en entender detalladamente los caminos responsables de convertir un determiando reactivo en producto así como los flujos asociados y los sistemas de regulación que intevienen.

IME (inverse metabolic engineering)

• Muchas veces se realizan mutanciones al azar y se busca el fenotipo deseado,

• Otro ejemplo, relacionado con el mejoramiento de la utilización de xilosa por S. cereviseae aplicando IME. Se pordujo una librería genómica de fragmentos de Pichia stipitis, se transformaron en S. cereviseae, y las cepas se testearon por su velocidad de cecimeinto en xilosa. Se secuenciaronaquellas cepas conmayor velocidad de crecimeinto y se lograron identificar dos genes xyl3 and psTal1 que fueron los responsables de esta mejora.

MUY COSTOSO

¿Cómo investigo los flujos y su regulación?

Análisis de flujos metabólicos C13-Análisis de flujos metabólicos Balance de flujos metabólicos y derivados

AFM

C13-AFM

FBA

Annu Rev Chem Biomol Eng. 2013;4:259-88

Lista de reviews importantes en el tópico ingeniería metabólica

Análisis de flujos metabólicos (AFM)

El flujo es el determinante fundamental de la fisiología celular y el parámetro más crítico que define un camino metabólico

Un camino metabólico se define como una secuencia de reacciones bioquímicas que conectan un determinado metabolito de entrada con un determinado metabolito de salida. El flujo es definido como la velocidad a la que los metabolitos de entrada son procesados para formar los metabolitos de salida.

A I

B

C

v1 v2 v3

E1 E2 E3

En est est: no hay acumulación metabolitos intermediarios –> v1= v2=v3

A I

B

C

J1

Cómo afecta una perturbación?

-cambiar la veloc de una reacción (inducción) -pulso sustrato

Ejemplo 1

A B C D E F G

H I J

K L M

D

J

E

G

M

2 NADH

NADH

Se asume estado pseudo-estacionario para los intermediarios D, E y NADH, luego son 3 restricciones en el sistema

1. ν1 - ν2 - ν3 = 0 = qD

2. ν3 - ν4 - ν5 = 0 = qE

3. ν2 - 2ν5 = 0 = qNADH

4. v1=qA 5. v5=qM

D

J

E

G

M

Tengo 3 ec y 5 incognitas. Con dos medidas experimentales (Ej qA y qM (extracelulares) puedo resolver el sistema

AFM

a)Esquema de los caminos metabólicos.

b)Medición de los flujos->se realiza a través de balances simples basados en la medición de componentes extracelulares y suposición de estado pseudo estacionario para componentes intracelulares.

c)Introducción de perturbaciones definidas (alterar actividad de

una enzima, adición de un pulso de sustrato, o cambiar la FCE en el biorreactor y determinar nuevamente los flujos luego de que se alcanza el est est.

Qué información puedo obtener a partir del análisis de flujos metabólicos (AFM)?

-Rendimientos máximos teóricos

Identificación de nodos o puntos de ramificación donde hay que hacer cambios de la regulación enzimática para favorecer el flujo de metabolitos por la ruta que tributa al producto de interés.

-Estudios del metabolismo celular en condiciones compatibles con un bioproceso para el desarrollo de estrategias adecuadas para el crecimiento del microorganismo y producción de metabolitos de interés biotecnológico -Utilización de AFM, llevados a cabo en condiciones estándar de cultivo, para identificar vías metabólicas cuya manipulación podría resultar ventajosa para la obtención de un fenotipo industrial.

Metabolismo celular Carbohidratos

Pool de hexosas fosfato

piruvato Productos metabólicos

CO2

O2 H2O

Precursores metabólicos

Building blocks

Macromoléculas

Glicolisis y ruta de pentosas fosfato CO2 ATP

NADH NADPH

Ciclo de Krebs NADH

Fosforilación oxidativa

NADH

NADPH ATP

Polimerización

Biosíntesis

Anabolismo Catabolismo

a)Esquema de los caminos metabólicos. Ejemplo sencillo

Un primer paso necesario para aplicar AFM es la construcción de un modelo metabólico

Reacciones anabólicas

C1= 1 y´x/ATP

σS + aNH3 + c1ATP 1 C-mol x + (σ-1)CO2 + h1 NADH v1

Ej: En la fabricación de 100 gr de levadura a partir de NH4+, glu, sales

NADH (mmol) NADPH(mmol) CO2 (mmol)

aa + 878.5 -541.1 +237.9

nucleótidos +64.2 -47.4 -21.9

lípidos +406.7 -342 +207.9

polisacáridos 0 0 0

Total +1349.4 -930.5 +423.9

+ producción - consumo

Será lo mismo el gasto a partir de otras FCE y otras FN? Y de otros µorg?

Suponemos NADH y NADPH intercambiables

Reacciones catabólicas

S CO2 + h2NADH + c2ATP Fosforilación a nivel de sustrato

NADH + ½ O2 H2O + (P/O) ATP Cadena de citocromos

ATP ADP Mantenimiento

v2

v3

v4

V4 = mATP

σS + aNH3 + c1ATP 1 C-mol x + (σ-1)CO2 + h1 NADH v1

S CO2 + h2NADH + c2ATP

NADH + ½ O2 H2O + (P/O) ATP

ATP ADP

v2

v3

v4

V1=µ

Modelo metabólico básico sin producción de producto

Si se produce un producto, por ejemplo, etanol:

σS + NH3 + C1 ATP ---------------> Biomasa + (σ-1) CO2 + h1 NADH S ----------------------> 2/3 EtOH + 1/3 CO2 + 1/3 ATP S ------------------> CO2 + h2 NADH + c2 ATP NADH + 1/2 O2 --------------------> H2O + (P/O) ATP ATP --------------------> ADP

v1 v2 v3

v4 v5

Cómo mejoro la producción de etanol?

σS + aNH3 + c1ATP 1 C-mol x + (σ-1)CO2 + h1 NADH v1

S CO2 + h2NADH + c2ATP

NADH + ½ O2 H2O + (P/O) ATP

ATP ADP

v2

v3

v4

V1=µ

Balances con flujos específicos:

X: V1=µ

S: -σv1-v2 = Qs

ATP: -c1v1+c2v2+(P/O)v3-v4=0 NADH: h1v1+h2v2-v3=0 O2: -0,5v3=qO2 CO2: (σ-1)v1+v2=qCO2

Componentes intracelulares, no medibles, no se acumulan

a)Esquema de los caminos metabólicos.

b)Medición de los flujos->se realiza a través de balances simples basados en la medición de componentes extracelulares

Resolvemos el sistema de ecuaciones Compuestos medibles: µ, qO2, qCO2, qs

C2 por glucólisis+ciclo krebs

X glucolisis->2ATP xKrebs->2ATP

P/O= 1 mol ATP/atgO?

Para eucariotes: en teoría se sintetizan 3 moles de ATP por cada NADH oxidado, y 2 moles de ATP por cada FADH2 oxidado Para procariotes: en teoría se sintetizan 2 moles de ATP por cada NADH oxidado (Ahora, debido a un incompleto acoplamiento entre la oxidación y los procesos de fosforilación el P/O real es bastante menor que el teórico)

2/3

ϒs ϒx σ=1.095 Y´x/s=0.5 Cmolx/Cmols

Y´x/ATP=0.5 Cmol x/Cmol ATP

V4=mATP= mol ATP/Cmolx h

P/O , c1

Propios de cada microorganismo en cada medio de cultivo, supongamos que lo sabemos

Resolvemos el sistema de ecuaciones:

C2v2 + (P/O)v3 = mATP + c1µ h2v2 - v3 = -h1µ

Incógnitas? -> flujos

Resolvemos por método de sustitución, o por determinantes, etc

-qs = (σc2 + c1 + ϒx/2(P/O) µ + mATP c2 + ϒs/2 (P/O) C2+ϒS/2(P/O)

1/Y´X/S ms

Reemplazando: y´x/s= 0.55 Cmol x/Cmol S

Que pasa si agrego una sustancia que me elimina un ciclo de fosforilación? P/O baja, que pasa con Yx/ATP? Y con Yx/s? Si aumento ms? Si c1 aumentase?

1) G + PEP----------------------------> G6P + PIR 2) G6P <----------------------------------> F6P 3) F6P + ATP ------------------------> 2 T3P (DiOH aceton P + G3P ) 4) T3P <-----------------------------------> 3PG + ATP + NADH 5) 3PG <------------------------------------> PEP 6) PEP------------------------------------> PIR + ATP 7) PIR + CoA---------------------------> AcCoA + NADH + CO2 ( Ingreso a Krebs) 8) AcCoA +OAA ---------------------> ICT + CoA 9) ICT -------------------------------------> OGA + NADPH + CO2 10) OGA +CoA -------------------------> SucCoA + CO2 + NADH 11) SucCoA <-----------------------------> Suc + ATP + CoA 12) Suc <------------------------------------> MAL + FADH 13) MAL <------------------------------------> OAA + NADH 14) PEP + CO2 ------------------------> OAA 15) G6P ------------------------------------> RU5P + 2 NADPH + CO2 ( ingreso a PPP) 16) RU5P <---------------------------------> X5P 17) RU5P <---------------------------------> R5P 18) X5P + R5P <--------------------------> T3P + S7P 19) T3P + S7P <-------------------------->F6P + E4P 20) X5P + E4P <------------------------T3P + F6P 21) NADH + 1/2 O2 -------------------> H2O + (P/O) ATP 22) FADH + 1/2 O2 --------------------> H2O + 1/2 (P/O) ATP 23) ATP ------------------------------------> ADP (mantenimiento) Sintesis de Lisina 24) OGA + NH3 + NADPH ------------> GLM 25) OAA + GLM ---------------------------> ASP + OGA 26) ASP + PIR + 2 NADPH + SucCoA + GLM + ATP ------> Suc + OGA + Lisin + CoA + CO2

Modelo metabólico para la síntesis de lisina por Corinebacterium glutamicum

Es siempre así de sencillo?

Tenemos 26 flujos que determinar

Rutas metabólicas

Obtengo una serie de balances que indican la

velocidad con que se consumen sustratos, se

producen productos y se consumen/producen

intermediarios

Esto genera una serie de ecuaciones con n incógnitas (flujos).

Resolución por cuadrados mínimos.

Matriz estequiométrica X Matriz

V = Matriz Q

Sale de las rutas

metabólicas

Sale de datos experimentales

previamente reconciliados

Despejo Matriz V

A x V = Q

V= Q . AT =(A.AT)-1.AT.Q A AT

Ruta pentosas fosfatos