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Mecanismos moleculares de la neuropatología asociada a
scrapie
Curso Terapia génica 08-09
Inmaculada Martín Burriel
Encefalopatías EspongiformesTransmisibles
• Especie humana:– Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob(ECJ)
– Kuru– Insomnio Familiar
Fatal (IFF)– Gerstmann-Straussler-
Scheinker (GSS)
• Especies animales:– Encefalopatía
Espongiforme Bovina (EEB)
– Encefalopatía Transmisible del Visón
– Caquexia Crónica de ciervos (CWD)
– Scrapie de ovino y caprino
Introducción
2
Características EETs
• Enfermedades neurodegenerativas fatales• Origen:
– Genético: ECJ, IFF, GSS– Esporádico: ECJ– Infeccioso o transmitido: Kuru, EEB, scrapie,
nvECJ
Introducción
Agente causal infeccioso
Proteína Proteasa-sensible Proteína Proteasa-resistente
PrP (Prion Protein)
Codificadas por el mismo gen
Misma secuencia aminoacídica
Diferente conformación
PrPC PrPSc
Introducción
3
Características histopatológicas comunes
Vacuolización.Acumulación de PrPSc
Espongiosis
Muerte neuronal
Introducción
Muerte neuronal
• Muerte Celular Programada (Liberski et al.,2004)
– Apoptosis (MCP-I)– Autofagia (MCP-II)– MCP tipo III
• Se ha observado apoptosis en distintos modelos de EETs in vivo* e in vitro**.
• ¿Mecanismos moleculares? ¿Relación con las lesiones histopatológicas?
• Fairbairn et al., (1994)*• Giese et al., (1995)*• Gray et al., (1999)*• Forloni et al., (1993)**• Brown et al., (1996)**• O’Donovan et al., (2001)**
Introducción
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Apoptosis
• Modificaciones morfológicas características
• No conlleva inflamación
• Requiere de la activación de genes específicos
Introducción
Cascadas moleculares de apoptosis
BAX
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Vía mitocondrial• In vitro:
– Activación por péptidos PrP– PrPC homología de
secuencia con Bcl-2– PrPC inhibe la apoptosis
inducida por Bax• In vivo:
– Bax Bcl-2 (Park et al. 2000)
– = Bax = Bcl-2 (Siso et al., 2002)
– Tg enfermedad priónicaBax-/- muerte neuronal (Chiesa et al., 2005)
– Bax-/- + EEB = muerte n. (Coulpier et al., 2006)
www.sgul.ac.uk
Introducción
¿Qué ocurre en scrapie?
• Prototipo de enfermedad priónica de origen infeccioso
• ¿Hay cambios en la regulación de Bax o Bcl-2?• ¿Están relacionados con las lesiones de EETs?• ¿Están implicados otros miembros de la familia
de Bcl-2?– Bcl-x(L): neuroprotector in vitro en enfermedades
priónicas (Sakudo et al., 2003)
Introducción
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Animales
• Ovino con scrapie (n=9)– Hembras– 3-5 años– Genotipo ARQ/ARQ– Rasa Aragonesa– Sintomatología clínica
• Ovino control (n=5)– Igual sexo, edad, genotipo y raza
Grupo de Investigación en enfermedades priónicas y lentivirusanimales
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
Médula oblongada
• Núcleo motor del hipogloso (H)• Núcleo del tracto solitario (S)• Núcleo del nervio trigémino
(V,NV)• Núcleo cuneatus medial (ACN)• Núcleo de la oliva (IO)• Núcleo parasimpático del
nervio vago (MX)• Formación reticular (RF)
RF
RNA laterFijación
+Inclusión
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
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Expresión génica• Marcadores apoptosis:
– Bax– Bcl-2
45605’-GCATTTGCGTGGACGAT-3’SYBRGREEN5’-ATGCCTCCTGCACCACCA-3’ACTB
40605‘-GTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3‘VIC-AGGGACTTATGACCACTGTCCACGCC-TAMRA5‘-TCCATGACCACTTTGGCATCGT-3' GAPDH
3560º5’-GGGTCGGGAGAGCGTAATTT-3’5’-FAM-TCCAAGGAAGGCAGCAGGCGC-TAMRA-3’5’-GGGAATGACGGTTCGATTCC-3’18SRNA
4063º5’-CTTGAGCACCAGTTTGCTGG-3’FAM-AGTAACATGGAGCTGCAGAGGATGATCGC-TAMRA
5’-GTAACATGGAGCTGCAGAGG-3’Bax
40605’-TCCGAACTCAAAGAAGGCCA-3’FAM-ATGCGCCCCCAGTTCACCCC-TANRA5’-TGGTGGAGGAGCTCTTCAGG-3’Bcl-2
CyclesTaPr. ReverseSondaPr. ForwardGen
• Factor Normalización*:– ACTB– 18SRNA– GAPDH
*Vandesompele et al. (2002)
Media geométrica
• Diferencias entre grupos:– T Student
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
Determinación IHQ• Marcadores de apoptosis:
– Bax (1:300; rabbit polyclonal P-19; Santa Cruz)– Bcl-2 (1:200; rabbit polyclonal; Upstate)
• Lesiones EETs:– PrPSc: L42 (1:500; R-Biopharm, Germany) – HE (vacuolización, espongiosis)
• Apoptosis:– Apoptag ® Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit
(Chemicon International) – Caspasa-3 activa (1:40; mouse monoclonal Ab-4;
Calbiochem) Utilizada en la identificación de la apoptosis en Alzheimer (Stadelmann et al., 1999)
0-3
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
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Análisis estadístico• Análisis no paramétricos:
– Diferencias entre grupos• Test Mann-Whitney
– Efecto del área• Test ANOVA Kruskal-Wallis• Test Mann-Whitney
– Relación entre valores de inmunomarcaje de Bax y lesiones histopatológicas
• Correlación de Spearman
• Test Chi cuadrado:– Relación Bax/Vacuolización (H, MX)
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
Resultados: Expresión génica
Control
Scrqpie
Control
Scrqpie
Control
Scrqpie
Aumento de la expresión del factor pro-apoptótico BAX en ovino infectado de forma natural con scrapie.
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
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Resultados IHQ
Scrapie Control Scrapie
PrPSc H-E
Bax +
Bax -
- Sobre-expresión de Bax en neuronas de ovino con scrapie (Mann-Whitney U test p<0.001)- No hay un efecto significativo del área en la expresión de Bax- No se observan cambios en Bcl-2
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
Correlación Bax y PrPSc
• Correlación significativa entre Bax intraneuronal y depósito intraneuronal de PrPSc (rs=0.429; p<0.01 ) y en neuropilo (rs=0.297; p<0.05 )
• Efecto significativo de PrPSc en los valores de Bax (Kruskal-Wallis test p<0.01)
• Correlación entre Bax y las áreas de vacuolización (rs=0.362; p<0.05)
Bax y vacuolizaciónson procesos independientes
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
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Apoptosis
TUNEL
TUNEL:-Glías positivas en scrapie y control- No marcaje en neuronas
Caspasa-3
Caspasa-3Caspasa-3
CASPASA-3 ACTIVA:- Se observa en neuronas sin aspecto apoptótico tanto en scrapie como control- Glías apoptóticaspositivas en scrapie y control
No existen evidencias de apoptosis
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
Falta de evidencias de apoptosis
Poca densidadneuronal en la
médula oblongaday/o PrPSc
Bloqueo de apoptosis por vía
mitocondrial/ inducción otras
vías(Liberski et al., 2004)
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
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Animales
• Ovino con scrapie (n=13)– Hembras– 3-5 años– Genotipo ARQ/ARQ– Rasa Aragonesa– Sintomatología clínica
• Ovino control (n=5)– Igual sexo, edad, genotipo y raza
Grupo de Investigación en enfermedades priónicas y lentivirusanimales
Regiones del SNC
RNAIHQ
Basal ganglia
HippocampusCortex
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Expresión de Bax
• Cálculo del Factor de Normalización*:– Media geométrica de los 3 o 4 genes más
estables en cada área (Objetivo 4) *Vandesompele et al. (2002)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
Medula Obl. Diencéfalo Cerebelo Corteza AF
ControlScrapie
**
Determinación tisular Bax
CerebeloHipocampo
Hipotálamo Médula oblongada
-++++++
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+/+++/++
+/++/+-/-+/++/++/++
++/+n.d.n.d.++/+++/+++/+SC90-248
+/+-/-+/++/+-/--/--/-+/+++/++++/++
++/++++/++/+-/-SC80-139
+/++/++/++/+-/--/--/-+/+-/-+/++++/++++/+++/++++/++SC70-138
+/+-/-+/+++/+
-/--/-+/+-/-++/+++/+++/+++++/+
++/++++/+SC60-122
++/+-/-+/++/+-/--/-+/+-/-+/+-/-++/++++/++
++/+++/+SC50-120
+++/+++/++/++/++/+
-/--/--/-+/+-/-++/+++/++
++/+++/+SC40-107
+++/++++/++++/+++
++/+
-/-+/++/+++/+
-/--/-+++/+++
+++/++
++/+++/+++SC30-86
++/+++/++/++/++/+
+/++/++/+++/+++/+++/++++/++++/++/+SC20-85
++/+++/++++/+++
++/+
+/+
+/++/+-/-++/+++/++
+++/+++
+++/++
++/++/++SC10-73
+/+-/-+/++/+-/--/--/--/-++/++++/++
++/+++/+++/++/+C40-442
+/+-/--/-+/+-/--/--/--/--/--/-+/+++/+n.d.n.d.C30-441
+/+-/--/-+/++/+
-/-+/++/+++/++/+++/+++/++/+-/-C20-439
+/++/++/+++/+
+/+
+/+++/+++/+++/++++/+++/+++/++
++/++++/++C10-438
PcOcFcCcCvWMGM
CoHHtTCortezaBgCerebeloPMoScAnimal
Marcaje intraneuronal
Gran variedad interindividual
Sobre-expresión de Bax IN
Correspondencia de Bax IN con las zonas donde se observa un mayor depósito de PrPSc pérdida acción neuroprotectora de PrPC
Causas de la muerte neuronal (Liberski et al.; 2004) :- Acción tóxica de PrPSc
- Muerte en zonas con poco depósito
- Pérdida de acción neuroprotectora de PrPC:
- Muerte en zonas con acumulación de PrPSc
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Apoptosis (caspasa-3)
No existen diferencias en scrapie y control
Gran variabilidad interindividual
Punteado fino en el citoplasma neuronal
Células de cerebelo con morfología apoptóticaNunca C. PurkinjesCerebelo Cerebelo
Cerebelo Médula espinal
Resultados similares en cerebelo de CJD (Puig y Ferrer, 2001)
Falta de evidencias de apoptosis
Poca densidadneuronal en la
médula oblongada/ PrPSc
Bloqueo de apoptosis por vía
mitocondrial/ inducción otras
vías
Lyahyai et al., 2006 (Acta Neuropathologica)
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Cascadas moleculares de apoptosis
BAXBCL2
BAK BAD
BCLXS
BCLXL
MCL1
AIF
APAF1
FASL/TNFα
FAS/TNFR1/TNFR2
TGF-β
PARP1
HSP70
HSP70
HSP90
HSP27
HSP70HSP90
HSP27
HSP70 HSP70
HSP90
HSP27
Expresión génica
40605‘-GTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3‘VIC-AGGGACTTATGACCACTGTCCACGCC-TAMRA
5‘-TCCATGACCACTTTGGCATCGT-3'Bak
45595‘-GGCTGTTAGCCAGTGCTTG-3'SYBRGREN5‘-CAGAGTTTGAGCCGAGTGAG-3' Bad
45605‘-TCAGGAACCAGCGGTTGAAG-3'SYBRGREEN5‘-TCAGAGCTTTGAACAGGACACG-3'Bcl-xS
45605‘-TCCCGGAAGAGTTCATTCAC-3'FAM-CGACCTGACGTCCCAGCTCCACA-TAMRA5‘-CAGGCGATGAGTTTGAACTG-3'Bcl-xL
40605‘-GAGTCACAATCCTGCCCCAG-3'FAM-TCGAGTGATGGTTCATGTTTTCAGTGACG-TAMRA
5’-GGCTTTCCAAGGCATGCTT-3´Mcl-1
40635’-CTTGAGCACCAGTTTGCTGG-3’FAM-AGTAACATGGAGCTGCAGAGGATGATCGC-TAMRA
5’-GTAACATGGAGCTGCAGAGG-3’Bax
40605’-TCCGAACTCAAAGAAGGCCA-3’FAM-ATGCGCCCCCAGTTCACCCC-TAMRA5’-TGGTGGAGGAGCTCTTCAGG-3’Bcl-2
CTaPr. ReverseSondaPr. ForwardGen
Análisis mediante RT-PCR en Tiempo RealT Student
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Expresión de genes de apoptosis y gliosisMATERIAL Y MÉTODOSPCR a Tiempo Real DISEÑO DE CEBADORES Y SONDAS
Gen Número de acceso Cebadores y sondas (5’→ 3’) pb Tª (ºC)
TNF-α X56756 F: CCCTTCCACCCCCTTGTTCR: GGCTCTTGATGGCAGAGAGGAT 277 60
TNFR1 U90937 F: CTCAGGACCCAGGCACTACAGR: CCCGCAAATGATGGAGTAGAG 134 59
TNFR2 NM_001040490 F: GATGGGTCCTGTCTTGGTGTGTR: CAAAACAACAAGGGCTCCAGAA 144 60
FAS AB011671 F: CTGGAGCAAGTTCCTGCCAAR: CTCCGTCGCGTTTGCAAT 105 60
FASL XM_584322F: GAAGAGGAGGGACCACAACACAR: CTTTGGCTGGTGGACTCTCTGAS: FAM-TGGTGGCCCTGGTTGGATTGGG-TAMRA
147 61
TGF-β1 X76916 F: GCACGTGGAGCTGTACCAGAAR: GCCACTGCCGCACAACTC 125 60
AIF AF529274 F: TGGAGGCACAGCTGCTTTTR: CGGCAGCTCAGGATCTTCA 94 59
APAF1 XM_617966 F: GCCAAGCAGGAGGTCGATAAR: GCAAGCATGGTAAACAGCATCT 117 60
PARP1 D90073 F: AGTGAAGGCCACGATTGAGAAR: TCAGACACGACACGGATGTTG 147 59
Cálculo Factor de Normalización• Cálculo del Factor Normalización
*Vandesompele et al. (2002)
Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path)
Tyrosine 3-monooxygenase/ tryptophan 5-monooxygenaseactivation protein, zeta polypeptideYWHAZ
Succinate dehydrogenase complex, subunit ASDHA
Ribosomal protein L32RPL-32
Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1HPRT1
18S ribosomal RNA18S rRNAGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseGAPD
Glucose-6-phosphate dehydrogenaseG6PDH
Beta actinACTB
NameSymbol
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Análisis GeNorm
GAPDHSDHASDHASDHA
rRNAHPRTHPRT RPL32
SDHARPL32RPL32rRNA
ACTBrRNArRNAG6PDH
YWHAZGAPDHACTBHPRT
HPRT YWHAZG6PDHYWHAZ
RPL32ACTBGAPDHGAPDH
G6PDH G6PDH YWHAZ ACTBMédula oblongadaCerebeloDiencéfaloCorteza Frontal
- Todos los HK mostraron valores de estabilidad M<1.5 (recomendado por Vandesompele et al. (2002))- GeNorm ordena los HK en función de su estabilidad
Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path)
Análisis GeNorm
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Corte
xCo
rtex_
healt
hyCo
rtex_
scra
pie
Cere
bellu
mCe
rebe
llum
_hea
lthy
Cere
bellu
m_s
crap
ieM
.obl
onga
taM
.obl
onga
ta_h
ealth
yM
.obl
onga
ta_s
crap
ie
Thal
lam
usTh
alla
mus
_hea
lthy
Thal
lam
us_s
crap
ie
Valo
res
de V
n/Vn
+1
V2/3 V3/4 V4/5 V5/6 V6/7 V7/8
V: variación entre dos FN secuenciales
V>0.15 es necesario añadir un nuevo HK
Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path)
18
Series de HK
rRNAHPRTHPRT RPL32
SDHARPL32RPL32rRNA
ACTBrRNArRNAG6PDH
YWHAZGAPDHACTBHPRT
HPRT YWHAZG6PDHYWHAZ
RPL32ACTBGAPDHGAPDHG6PDH / GAPDHG6PDH /SDHAYWHAZ /SDHAACTB/SDHA
Médula oblongadaCerebeloDiencéfaloCorteza Frontal
Media geométrica FN
Lyahyai et al., enviado (Exp Mol Path)
Medulla Oblongata
050
100
150
200
250BAD
BAKBAX *
BCL-2
BCL-XL
BCL-XS *
MCL-1 *AIF *
APAF1TNFa *TNFR1* TNFR2
* FAS
FASL
TGFB1
PARP1
HSP27
HSP72
HSP73HSP90
Diencephalon
Cerebellum
0
50
100
150
200
250
BADBAK
BAX
BCL-2 *
BCL-XL *
BCL-XS
MCL-1 *
AIF
APAF1 *TNFa
TNFR1TNFR2
FAS
FASL
TGFB1
PARP1
HSP27
HSP72
HSP73HSP90
Prefrontal cortex
0
50
100
150
200
250BAD
BAK *BAX
BCL-2 *
BCL-XL *
BCL-XS
MCL-1
AIF
APAF1TNFa
TNFR1TNFR2
* FAS
FASL
TGFB1
PARP1
* HSP27
HSP72
HSP73* HSP90
Perfiles de expresión génica de marcadores de apoptosis
0
50
100
150
200
250
BADBAK*
BAX*BCL2
BCL-XL
BCL-XS
MCL-1
AIF
APAF1TNFa
TNFR1TNFR2
*FAS
FASL
TGFB1
PARP1
HSP27
HSP72
*HSP73HSP90
-1
0
1
2
3
4
5
6
Priondeposition
Gliosis Spongiosis Neuronalvacuolization
0
1
2
3
4
5
6
Priondeposition
Giosis Spongiosis Neuronalvacuolization
- Inducción de las vías mitocondrial y extrínseca- Cambios de expresión relacionados con gliosis- Efecto neuroprotector de Mcl-1 y Hsp70- Inducción de vías independiente de caspasas (AIF)
-10123456
Priondeposition
Giosis Spongiosis Neuronalvacuolization -1
0123456
Priondeposition
Giosis Spongiosis Neuronalvacuolization
- Inducción de distintos mecanismos de la vía mitocondrial- Efecto neuroprotector de Mcl-1- Facilitar la deposición temprana del prión (Hsp27, Hsp90)
ControlScrapie
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Conclusiones vía Mitocondrial
• En scrapie natural ovino se induce la expresión de Bax.
• La correlación de Bax con PrPSc indica que la inducción de Bax puede ser consecuencia de la pérdida de actividad neuroprotectora de PrPC
• El incremento de Bax no lleva asociada la detección de apoptosis no tiene un papel relevante en la inducción de apoptosis en scrapie ovino
Serrano, Lyahyai et al. (en revisión) Vet Res
Conclusiones vía mitocondrial
• La represión de Bcl-2 y Bcl-xL y el aumento de Bak y Bcl-xs pueden estar asociados a la neuropatología de scrapie
• Podría existir apoptosis independiente de caspasas
• Se observan mecanismos neuro-protectores (Mcl-1) que podrían ralentizar la apoptosis
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9. El incremento de expresión de los factores TNF-α y TNFR2 en médula oblonga de ovino con scrapie natural se correlaciona con el alto grado de gliosisobservado en esta zona.
10. En los tejidos altamente lesionados, médula oblonga y diencéfalo, los factores involucrados en las vías de apoptosis mitocondrial (AIF) y extrínseca (TNF-α, TNFR2 y FAS) pueden participar en la pérdida neuronal descrita en estas áreas.
11. En el diencéfalo el abundante depósito de PrPSc induce la síntesis de miembros de la familia HSP70 que podrían actuar como factores neuroprotectores frente a la inducción de apoptosis por vía mitocondrial y extrínseca. En áreas menos afectadas como la corteza anterior frontal la reducción de HSP90 y HSP27 podría contribuir a la acumulación de proteína prión en estadios tempranos de scrapie.
12. El incremento de la expresión de Hsp90 en las células de Purkinje en animales con scrapie podría tener un efecto neuroprotector frente al estrés inducido por la proteína prión en cerebelo.
CONCLUSIONES VÍA EXTRÍNSECA y HSP
Serrano, Lyahyai et al. (en revisión) Vet Res
Trabajo futuro
• Confirmar la localización tisular de los miembros de Bcl-2 que han mostrado cambios significativos
• Determinación de factores que participan en las vías de apoptosis independiente de caspasas
• Aparición de estrés oxidativo en fases preclínicas (Yun et al., 2006): ¿La apoptosis también ocurre en estadíos tempranos asintomáticos?Análisis de ovino preclínico
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Equipo de Trabajo• Investigadores del Laboratorio de Genética
Bioquímica de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza– Dr. Jaber Lyahyai Lamarti– Dra. Carmen Serrano Calvo– Dra. Rosario Osta Pinzolas– Dra. Pilar Zaragoza Fernández
• Investigadores del Grupo de investigación en enfermedades priónicas y lentivirus– Dra. Rosa Bolea Bailo– Dra. Eva Monleón– Dr. Juan J. Badiola Díez