Post on 01-Jan-2015
PCR(Polymerase Chain Reaction)
“A partir de una copia de DNA única, el PCR permite obtener 100 mil millones de copias idénticas en una tarde. La técnica es sencilla. Sólo requiere un tubo, unos cuantos reactivos y una fuente de calor”.
Kary B. Mullis (Scientific American, 1993)
Kary B. Mullis
Premio Nobelde Química (1993)
1979 Cetus CorporationSíntesis de oligonucleótidos
1973 PhD UC BerkeleyDoctorado en Bioquímica
1983 Responsable laboratorio síntesis DNA (Cetus)Invención del PCR
Los años previos…
San Francisco - Mendocino (California, Abril 1983)
“No funcionará. Además, es tan simple,
que seguro que alguien, en algún sitio,
ya lo ha intentado.”
8 Septiembre 1983
La primerareacción de PCR.
PCR01
16 Diciembre 1983
El primer resultadoaparentemente positivo.
Marzo 1985: primera patente.
Junio 1984: Cetus crea el “grupo de PCR”.
Mayo 1987: primer artículo describiendo el método.
1985Kary Mullis recibe de Cetus una bonificación de:$10.000 (un 1 seguido de 4 ceros)
PCR en $$$
1991Hoffmann-La Roche paga por la patente:$300 millones (un 3 seguido de 8 ceros)
2005Total de royalties generados al cabo de 20 años:$2.000 millones (un 2 seguido de 9 ceros)
¿En qué consiste la técnica de PCR?
El PCR es una técnica para copiar DNA.
A diferencia del proceso de replicación, el PCR copia fragmentos específicos de DNA.
El PCR permite obtener millones de copias a partir de un fragmento de DNA.
¿Cuáles son las aplicaciones del
PCR?
Uno de los campos de aplicación habituales del PCR es la ciencia forense.
Mediante el PCR, una pequeña cantidad de DNA procedente de unas pocas células es suficiente para identificar a una persona.
Antes de la invención del PCR era muy difícil obtener suficiente DNA en la escena del crimen para una identificación positiva.
Otros campo de aplicación del PCR son el diagnóstico de enfermedades hereditarias,
Progeria o envejecimientoprematuro.
el establecimiento de relaciones genéticas entre individuos…
…y la investigación de restos paleontológicos.
¿Cómo puede obtener el PCR millones de copias de un fragmento específico de DNA en unas pocas horas?
La duplicación del DNA durante la mitosis requiere la intervención de una compleja maquinaria molecular.
Afortunadamente el PCR se sirve de un único enzima (DNA polimerasa) y de una fuente de energía (temperatura).
La reacción de PCR consta de 3 etapas.
Cada etapa requiere una temperatura particular a fin de que se lleve a cabo una reacción específica.
Desnaturalización(separación de las hebras del DNA)
“Annealing”(unión de los “primers” por complementariedad)
Los “primers” son fragmentos de DNA sintético de corta longitud (~ 20 nucleótidos).
Se diseñan de manera que sean complementarios a una secuencia conocida del fragmento a amplificar.
En una reacción de PCR se utilizan dos “primers” (uno en cada extremo del fragmento a amplificar).
↓
5’ →3’
→
Extensión(a cargo de la polimerasa)
Elevamos la temperatura a 72 °C para que la polimerasa pueda extender las cadenas de DNA.
↓
La polimerasa extiende las cadenas hasta que se alcanza el extremo del DNA o las condiciones de temperatura cambian.
En el segundo ciclo la polimerasa extiende las cadenas hasta el extremo en que se encuentra el segundo “primer”.
El ciclo se repite una y otra vez…
En cada ciclo se dobla el número de fragmentos copiados.
“Ingredientes” de la reacción PCR:
• DNA a amplificar• Primers• dNTPs• Solución salina con Mg2+• Polimerasa
Los “ingredientes” de la reacción deben ser capaces de soportar altas temperaturas.
(Thermophilus aquaticus es una bacteria que vive en medios a 50-80°C)
Taq polimerasa
Fuentes del parque de Yellowstone (EUA)
1985 2000
La reacción de PCR se lleva a cabo en un termociclador
¿Cómo puede identificarse un individuo a partir del análisis de una muestra biológica mediante la técnica de PCR?
Figure 8-47a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Los fragmentos amplificados migran en función de su tamaño en un gel de electroforesis.
En ocasiones los fragmentos entre los cuales se unen los “primers” varían de longitud entre individuos.
Estos fragmentos se denominan microsatélites. Se trata de secuencias cortas y repetidas de nucleótidos.
Para averiguar si una muestra pertenece a un individuo se amplifican fragmentos que contengan regiones de microsatélites.
Figure 8-47b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)