Red iberoamericana deRed iberoamericana deinvestigación y desarrollo defármacos basados encompuestos metálicos.compuestos metálicos.

Programa CYTED red 209RT0380g

Coordinadora Dra. Dinorah Gambino

Desarrollo de fármacos de base Desarrollo de fármacos de base metálica: Técnicas biológicas demetálica: Técnicas biológicas demetálica: Técnicas biológicas de metálica: Técnicas biológicas de

evaluaciónevaluación

Susana B. Etcheverry

Facultad de Ciencias ExactasUniversidad Nacional de La Plata, Argentina

UNLP

Bioinorganic Chemistry: an interdisciplinary areaarea

Inorganic

Physicochemistry

Inorganic Chemistry Medicine

Organic Chemistry Pharmacology

Bioinorganic ChemistryChemistry

Biochemistry Environmental science

Biology PhysicsAgronomyV t i

science

Biology Physics Veterinary

Formación de complejos metálicosp jActivación/inhibición enzimática y obtención de efectos enzima-miméticosobtención de efectos enzima miméticosMejoramiento de la biodisponibilidadAumento de la estabilidad de la formaAumento de la estabilidad de la forma activa de una drogaDisminución de los efectos colateralesDisminución de los efectos colateralesDisminución de la resistencia hacia una drogadrogaCambio en los efectos farmacológicosObtención de compuestos activos por víaObtención de compuestos activos por vía oral

Usos de la Química Bioinorgánica en Medicina

1. Obtención de drogas para mejorar la homeostasis de los iones en el organismo.

2. Obtener drogas basadas en metales en las cuales elmetal es clave en el mecanismo de acción

Aplicaciones farmacocinéticas

Aplicaciones quimioterapeúticas

Aplicaciones al diagnóstico por imágenesAplicaciones al diagnóstico por imágenes

http://www.ugr.es/~bioinorg/index.html

http://www.ugr.es/~bioinorg/index.html

Selection and/or

Phase ISynthesis and characterizationS l ti t di t bilit

Experimental Scheme

-Selection and/orchemical modificationsof interesting biological

Solution studies: stability determinationsPhysicochemical characterization

ligands or substanceswith pharmacologicalactivity-

Phase IIBioactivityII1. In cell free systems

) ALPy-Bioactivity of free ions,free ligands and thecomplexes in cell

a) ALPb) SOD and catalasec) DNA cleavage-Nuclease activity.

.complexes in cellcultures.

Phase IIBioactivityy

II.2 Screening of bioactivity in cell cultures

Selection and/or chemical

PHASE IChemistry

modifications of interestingbiological ligands orsubstances withpharmacological activity

Phase II.1II.1 Bioactivity studies in Cell Free pharmacological activity-

-Bioactivity of free ions, freeligands and the complexesin cell cultures.

ySystems.

Phase IIBioactivity

II.2 Screening of bioactivity in cell cultures

Cellular proliferation

Selection and/or chemical Phase II

Phase I.ChemistryCOMPLETE EXPERIMENTAL DESIGN

-Selection and/or chemicalmodifications of interestingbiological ligands orsubstances withpharmacological activity-

Phase IIII.1 Bioactivity studies in Cell Free Systems

-Bioactivity of free ions, freeligands and the complexes incell cultures.

Phase II. BioactivityII.2 Screening of bioactivity in cell cultures

O t bl t lif +Cellular proliferation Tumoral cell prolif.-

Antimetastasic capacityOsteoblast prolif.+

Osteoblast differentiation+

Antimetastasic capacity -

Potential antitumoral compoundsCel prolif. +and glucose consumption +

Potential insulinmimetic compounds

ECM mineralization+

Bioactive compounds

Potential osteogenic

Phase III. Toxicity study

Phase IV.Mechanism of action study

Potential osteogenic compounds

In vivo studies

Selection and/or chemical

PHASE IChemistry

modifications of interestingbiological ligands orsubstances withpharmacological activity

Phase II.1II.1 Bioactivity studies in Cell Free pharmacological activity-

-Bioactivity of free ions, freeligands and the complexesin cell cultures.

ySystems.

Phase IIBioactivity

II.2 Screening of bioactivity in cell cultures

Cellular proliferation

CELLULAR PROLIFERTIONCELLULAR PROLIFERTION

Osteoblasts

) 110

120at

ion

(% b

asal

80

90

100MC3T3E1

Cel

l pro

lifer

a

50

60

70 UMR106

TreVO [M]0 20 40 60 80 100 120

40

Barrio DA, Williams PAM, Cortizo AM, Etcheverry SB. J Biol Inorg Chem. 8: 459-469, 2003.

MUERTE CELULARCELULAR

Importancia de la muerte celularImportancia de la muerte celular

La muerte celular juega un roli l l d ll dcrucial para el desarrollo de

plantas y animalesp y

En un humano adulto en buenEn un humano adulto en buenestado de salud, billones decéluulas mueren en médula ósea eintestino cada horaintestino cada hora.

Tipos de muerte celularp

La muerte celular puede ocurrir a t é d d dif ttravés de dos procesos diferentes:

Programados o accidentales

El í ú d lEl mías común de losmecanismos de muerteprogramada es la APOPTOSIS

y

el más común de los mecanismosaccidentales es la NECROSISaccidentales es la NECROSIS

NECROSIS

Necrosis (nuerte celularNecrosis (nuerte celular“accidental”) es un proceso

t ló i d lpatológico que ocurre cuando lascélulas son expuestas a seriospinsultos físicos o químicos

APOPTOSIS

Apoptosis: muerte celular “normalo programada”) es el procesoo programada ) es el procesofisiológico por el cual células nod d útildeseadas o que no son útiles soneliminadas durante el desarrollo yyotros procesos biológicosnormalesnormales

La apoptosis es una forma demuerte celular que estáregulada genéticamenteregulada genéticamente.La muerte celular programada es

t i t l d l d ll d lparte integral del desarrollo de los tejidos tanto de animales como de jplantas pluricelulares

Diferencias entre Necrosis y Apoptosis

Características morfológicas

Características bioquímicas

C í

Características bioquímicas

Características moleculares

Características morfológicasNecrosis

Pérdida de la integridad de la membrana celular

Comienza con hinchazón del

membrana celular

Comienza con hinchazón delcitoplasma y las mitocondriasFinaliza con lisis celular totalFinaliza con lisis celular totalDisintegración de organelasInvolucra células vecinas y macrófagosInvolucra células vecinas y macrófagos, generando una respuesta inflamatoria

Micrografía electrónica de una célula ótinecrótica

Muerte celular programadaMuerte celular programada

La muerte celular programada es parteLa muerte celular programada es parteintegral del desarrollo de los tejidostanto de plantas como de animalestanto de plantas como de animalespluricelulares

Nematode Caenorhabditis elegansg

Estudios genéticos queEstudios genéticos queidentificaron los primerosgenes de muerte celulargenes de muerte celularprogramada

Apoptosis“Burbujas” de la membrana celular“Burbujas” de la membrana celular,

pero sin pérdida de la integridad-Agregación de la cromatina en lamembrana nuclearmembrana nuclear-Finaliza con fragmentación celular enpequeños cuerpospequeños cuerpos-Formación de vesículas unidas amembrana (cuerpos apoptóticos)membrana (cuerpos apoptóticos)-Las mitocondrias se tornan permeablesdebido a la formación de porosdebido a la formación de porosinvolucrando a proteínas de la familia bcl-2

Células apoptóticas

Glóbulo blanco Glóbulo blanco en apoptosis

Nuclear

Membrane blebs

Nuclear

fragments

Apoptotic bodies

Etcheverry SB, Ferrer EG, Naso L, Rivadeneira J, Salinas V,Etcheverry SB, Ferrer EG, Naso L, Rivadeneira J, Salinas V, Williams PAM. J Biol Inorg Chem 13: 435-447, 2008

Células apoptóticas

Alteración del citoesqueleto

Rivadeneira J, Di Virgilio AL, Barrio DA, Muglia CI, Bruzzone L, Etcheverry SB. Med Chem 6: 9-23, 2010

Procesos apoptóticos

Desarrollo del i d tópie de ratón

Metamorfosis fibien anfibios

Desaeeollo de pie de ave

Cada día, en cualquiera denosotros, se produce el suicidiode alrededor de 10 mil millonesde alrededor de 10 mil millonesde células por apoptosis, siendo

t i l lesto necesario para el normaldesarrollo del organismog

Cuando una célula muere porapoptosis empaqueta suapoptosis, empaqueta sucontenido citoplasmático, loque evita que se produzca larespuesta inflamatoriarespuesta inflamatoriacaracterística de la muerte

id t l iaccidental o necrosis.

Cambios bioquímicos y moleculares de la apoptosis

Clivage del ADN cromosómico en grandes fragmentosen grandes fragmentos Cambios en la membrana

l á i ( li ió dplasmática (externalización de fosfatidilserina))Pérdida del potencial demembrana mitocondrialmembrana mitocondrial

APOPTOSIS y NECROSISAPOPTOSIS y NECROSIS

Molinuelo MS, Barrio DA, Cortizo AM, Etcheverry SB. Cancer Chemother Pharmacol 53: 163-172, 2004.

Potencial de membranamitocondrial

Permite que ciertas siondas fluorescentescon alta afinidad por las mitocondriascon alta afinidad por las mitocondriasmetabólicamente activas sean capaces deretener esos colorantes mostrando altaretener esos colorantes mostrando altaintensidad de fluorescencia. Lasmitocondrias de células apoptóticasmitocondrias de células apoptóticasretienen menos esas sondas y disminuyela intensidad de fluorescenciala intensidad de fluorescencia,

REGULACION DE LA APOPTOSIS

APOPTOSISAPOPTOSIS

Vía extrínseca

Vía intrínseca

La vía apoptótica extrínseca activa receptores de membranaactiva receptores de membrana tales como:FasFasTNFPorinas

La vía intrínseca está mediada por eventos mitocondriales

ELMORE 2007 Toxicologic Pathology

Para ambas vías laPara ambas vías laapoptosis depende de unacascada proteolíticaintracelular que es mediadaintracelular que es mediadapor caspasas

CASPASASCASPASAS

Las caspasas son una familia deproteasas q e tiene cisteína enproteasas que tiene cisteína ensu sitio activo y clivan proteínasy pespecíficas en sitiosdeterminados que poseen ácidodeterminados que poseen ácidoaspártico

ACTIVACION DE CASPASAS

PROCASPASAS

Las caspasas se sintetizan enLas caspasas se sintetizan entodas las células comoprec rsores inacti as oprecursores inactivas oprocaspasas, las que seactivan por clivajeproteolíticoproteolítico

Activación de Caspasaprocaspasa por clivaje activa

Subunid.grande Subunid.

Peq.

Sitios declivaje ClivajeClivaje

C

Procaspasai ti

Caspasaactiva

Prodominiosinactiva

Cascada de las Una moléculade las caspasas

de caspasa iniciadora activa

Muchas moléculas de caspasas ejecutoras

Clivaje de prot. del citoesqueleto Prot. nucleares

Targets de caspasas ejecutoras ti dactivadas

Di ersas proteínas o estr ct ras cel laresDiversas proteínas o estructuras celularestales como:

Proteínas nucleares

DNA-depending enzyme o endonucleasa, queal activarse cliva el DNA nuclear

Componentes del citoesqueleto y de lasproteínas de adhesión que vincula a cadaproteínas de adhesión que vincula a cadacélula con sus vecinas

Caspasas humanasInvolucradas en la inflamación

Caspasa 1 (ICE), 4, 5

Involucradas en apoptosisInvolucradas en apoptosis

Caspasas iniciadoras (2 8 9 10) Caspasas iniciadoras (2,8,9,10)

Caspasas ejecutoras (3, 6, 7)

Inicio de la apotosis

En todas las células, la maquinaria de las qcaspassas está siempre lista para actuar. Sólo se requiere un disparador del q pproceso.Cómo se activa la primera procaspasa?p p pLas caspasas iniciadoras presentan un gran prodominio que contiene un gdominio reclutador de caspasas (CARD)

Ese dominio CARD les permiteEse dominio CARD les permiteunirse a proteínas adaptadoras yforma un complejo activo cuandoforma un complejo activo cuandola célula recibe un estímulo

tótiapoptótico.Una vez en el complejo, lascaspasas iniciadoras están muypróximas unas de otras y lo quep y qes suficiente para activarlas. Ellasse clivan unas a otras y el procesose clivan unas a otras y el procesose torna irreversible

INHIBIDORES DE LA VÍA EXTRÍNSECAINHIBIDORES DE LA VÍA EXTRÍNSECA

Muchas células producen proteínasinhibitorias que pueden actuarq pintracelularmente o extracelularmenetepara restringir la vía extrínsecap g

Receptores decoydecoy de superficie: tienenun dominio de unión al ligando pero notienen un dominio de muerte

Los decoy pueden unir el ligandoLos decoy pueden unir el ligandopero no pueden activar la muertecelular Por eso son inhibidorescelular. Por eso son inhibidorescompetitivos de muerte celular

Vía intrínseca de apoptosisVía intrínseca de apoptosis

Depende de las mitocondrias

Vía intrínsecaVía intrínseca

Las células activan la apoptosisdesde adentro de las células.

Es respuesta a injuria, daño en elADN, falta de oxígeno, denutrientes o de señales denutrientes o de señales desupervivencia extracelulares

Vía intrínsecaVía intrínseca

Se activa por alteración de la membranaSe activa por alteración de la membranamitocondrial y liberación al citosol deproteínas u otros compuestosproteínas u otros compuestosmitocondriales, por ej el citocromo C, queactivan intrínsecamente la cascadaactivan intrínsecamente la cascadaproteolítica de caspasas

Vía intrínseca

Cuando el citocromo C se libera al citosolbi f ió l t tcambia su función completamente

Se une a una proteína adaptadora de unSe une a una proteína adaptadora de un activador de caspasas llamada Apaf1

Apaf1oligomeriza en un heptámero llamado apoptosomaapoptosoma

Los Apaf1 en el apoptosoma reclutan algunasLos Apaf1 en el apoptosoma reclutan algunasde las procaspasas iniciadoras (procaspasa9) que se activan por proximidad de unas con9), que se activan por proximidad de unas conotras en el apoptosoma

Vía intrínseca

Apaf 1

DominioCARD

Liberaciónde cit C

Activ de Apaf 1 por cit Chid óli i d dATP dADPe hidrólisis de dATP a dADP

Cit C en espeaciointermembrana

Mitocondria

Estímulosapoptóticos

Vía intrínsecaDominio CARD

Procaspasa 9

Ensamble de apoptosomas

catalizado por ADP

Reclutamientoy activ de

procaspasa 9

Apoptosoma

p p

Procaspasa 9 clivay activ caspasas ejecutorasy activ caspasas ejecutoras

Cascada de caspasa queCascada de caspasa quelleva a apoptosis

VIA INTRINSECA

VIA EXTRINSECA + VIA INTRINSECA

En algunas células, la víaEn algunas células, la víaextrínseca puede reclutar la víaintrínseca a fin de amplificar laintrínseca a fin de amplificar laseñal apoptótica para matar lasp p pcélulas.Esto se realiza mediante unEsto se realiza mediante unconjunto de proteínas de la familiaBcl2

Importancia de la regulación deImportancia de la regulación de la vía apoptótica intrínseca

La vía apoptótica intrínseca estáfinamente regulada a fin deasegurar que las células seasegurar que las células sematarán a sí mismas sólocuando sea absolutamentenecesarioecesa o

Proteínas Bcl2

Proteínas de la familia Bcl2regulan la vía intrínseca de laregulan la vía intrínseca de laapoptosis

REGULACION DE LA APOPTOSIS

Bcl-2 es el miembro fundador de lafamilia Bcl-2 de proteínas reguladorasfamilia Bcl-2 de proteínas reguladorasde la apoptosis.

Estas proteínas gobiernan el potencialde la membrana mitocondrial externa yde la membrana mitocondrial externa ysu permeabilidad (MOMP) y pueden serpro-apoptóticas (Bax BAD Bak y Bokpro-apoptóticas (Bax, BAD, Bak y Bokentre otras) o anti-apoptóticas(incluyendo Bcl-2 BCl-xL y Bcl-w entre(incluyendo Bcl-2, BCl-xL, y Bcl-w, entreun conjunto).

Algunas proteínas Bcl2 sonproapoptóticas y promueven laproapoptóticas y promueven lavía intrínseca induciendo laliberación de cit C al citosol,mientras otras Bcl2 sonmientras otras Bcl2 sonantiapoptóticas e inhiben esalib ióliberación

El balance entre estas dos clases deBcl2 determina si una célula vive oBcl2 determina si una célula vive omuere por la vía intrínseca de la

t iapoptosis

Bcl2 antiapoptótica

Familia de proteínas reguladoras Bcl2

Bcl2 antiapoptótica

Ej Bcl2, Bd-x

BH 123proapoptótica

Ej Bax, Bak

BH3-onlyproapotóticaproapotótica

Ej Badm Bim, Bid, Puma, Noxa

Cuando un estímulo apoptóticoCuando un estímulo apoptóticodispara la vía intrínseca, lasproteínas proapoptóticas BH123proteínas proapoptóticas BH123se activan y se agregan paraf li ó lformar oligómeros en lamembrana externa de lasmitocondrias y estimulan laliberación de cit C y otrasyproteínas mitocondriales.

Rol de BH123, proteína Bcl2 proapoptótica en relación a la activación de la vía intrínseca

P BH123 E tí lProt BH123inactiva

Estímulo apoptótico

Agregación de protBH123 activadas

Cit C

Otras prot del Espacio

intermembranaste e b a as

Vía intrínseca inactivaBcl2 activaBcl2 activa

BH123 inactiva

Cit C

Otras proteínasintermembrana

Activación de la vía intrínseca

Estímulo Bcl2 inactivaLiberación de prot intermebrana

apoptóticoBcl2 inactiva

Prot BH3-onlyAgregado de prot

BH123 activasyactivada

BH123 activas

Cit CCit C

Inhibidores de caspasas (IAPs)Inhibidores de caspasas (IAPs)

Descubiertos por primera vez encélulas de insectos infectadas porbaculovirus

La mayoría delas células delas células demamíferospuedenpuedensintetizar IAPS

Inhibidores de apoptosis (IAPs)E i d tí l tóti l IAP i hibEn ausencia de estímulos apoptóticos los IAPs inhiben la activación espontánea de las procaspasas

VÍA INTRÍNSICA INACTIVAPAnti IAP Cit C Procaspasas

ACTIVACIONESPONTANEAESPONTANEA

ProdominiosIAPs

Caspasabloqueada

Prot BH123 activas

ACTIV DE LA VIA INTRINSECA

ESTIMULOSAPOPTOTICOS

Apotosoma +caspasa 9 activada

Caspasaejecutora

APOPTOSIS

activada

Prot BH123 activadasAnti IAPs

IAP bloqueados

Rol de factores de supervivencia extracelulars en ajustar el número de células funcionales en el sistema nervioso

Célulasi

Neuronasapoptóticas

Cuerpo neuronal

nerviosas apoptóticas

neuronal

Muerte celular

Factores de Células blanco supervivencia

Apoptosis y p53Apoptosis y p53

El gen p53 o tp53, también llamado el"guardián del genoma" se encuentra en"guardián del genoma", se encuentra enel brazo corto del cromosoma 17(17p13) y codifica un factor de(17p13) y codifica un factor detranscripción nuclear

Resulta esencial para inducir la respuesta de la célula ante el daño alrespuesta de la célula ante el daño al ADN, deteniendo el ciclo celular en caso de mutación. El gen p53 es uncaso de mutación. El gen p53 es un gen supresor de tumor que desempeña un papel importante endesempeña un papel importante en apoptosis y control del ciclo celular.

Un p53 defectuoso podría permitirque las células anormales proliferenque las células anormales proliferendando por resultado cáncer(alrededor de un 50 % de todos los(alrededor de un 50 % de todos lostumores humanos contienenmutaciones en p53)mutaciones en p53).

La entrada en apoptosis es el últimomecanismo protector, si el daño en elADN es irreparable, para evitar laproliferación de las células quecontienen ADN anormal. p53 activa laexpresión de genes pro-apoptosis,como Bax o PUMA. Sin embargo, noestá claro cómo decide la célula si debereparar su ADN o entrar en apoptosis.

Aparentemente p53 presenta mayorafinidad por los promotores de los genesafinidad por los promotores de los genesde reparación del ADN que por lospromotores de los genes pro-apoptosis depromotores de los genes pro-apoptosis, demanera que primero se activa la reparacióndel ADN Pero si ésta no es efectiva y p53del ADN. Pero si ésta no es efectiva y p53continúa acumulándose, se activarían losgenes pro apoptosisgenes pro-apoptosis.

Nuestro agradecimiento a la Dra Dinorah Gambino por su gran esfuerzo en la coordinación de esta Red CYTED

y a la Dra Lena Ruiz Azuara y su grupo de trabajo por la organización de este curso de la Red CYTED en la UNAM

Gracias a todos por su atenciónGracias a todos por su atención