Post on 21-Apr-2015
MC JEANETT CHÁVEZ ONTIVEROS
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 1
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOAFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICASLICENCIATURA EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Culiacán, Sinaloa.
MC JEANETT CHAVEZ ONTIVEROS
Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Enterobacterias
Indol
Rojo de Metilo
Vogues Proskauer
Citrato como única fuente de carbono
Fermentación de hidratos de carbono
Descarboxilasa
Fenil-Alanina desaminasa
Citocromo-oxidasa
Reducción de nitratos
Ortonitrofenil galactósido
Indol
M di R tiCaldo de triptófano (1% Trp)
Es uno de los productos de la degradación metabólica del triptófano, el cual surge por la hidrólisis del mismo con la ayuda de la enzima
triptofanasa.
Medios y Reactivos.- Reactivo de Kovac (Soln. Acidificada de p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol isoamílico)
Reactivo de Ehrlich
Interpretación.-
Positiva: Color fucsia brillante en la interfase del reactivo.
Negativa: Un anillo amarillo
Control.-Control positivo: E. coli
Control negativo: Klebsiella pneumoniae
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Rojo de Metilo
Prueba cuantitativa de la producción de ácidos que requiere que los m.o produzcan ácidos fuertes (láctico, acético y fórmico) a partir de glucosa, por la vía de fermentación de ácidos mixtos
Principio.-
Medios y Reactivos.-
Caldo Rojo de Metilo-Voges-Proskauer (RM/VP)
Indicador Rojo de MetiloInterpretación.-
Positiva: Aparición de color rojo en la superficie del medio
vía de fermentación de ácidos mixtos.
Positiva: Aparición de color rojo en la superficie del medio
Negativa: Puede producir un color anaranjado
Controles.-
Control Positivo: E. coli
Control Negativo: Enterobacter aerogenes
Voges- Proskauer
Medios y Reactivos.-
Medio
Principio.-
El ácido pirúvico es un compuesto formado de la degradación de la glucosa
Medio.-
Caldo RM/VP
Reactivos.-
Alfa-naftol (5%)
Alcohol etílico absoluto
Hidróxido de potasio (40%)
Se degrada a acetoína (acetilmetilcarbinol)vía butanodiólica
Acetoína + O2 + KOH (40%) Diacetilo (rxna. Guanidina y/o arginina) alfa-naftol
(5% EtOH)
Interpretación.-
Positiva: Aparición de un color rojo 15 minutos o más después del agregado de los reactivos
Negativa: No aparece coloración roja, puede aparecer color cobre
Rojo
Prueba Positiva Prueba Negativa
CitratoCitrato• Prueba verifica:
• Uso de citrato como única fuente de C• Uso de citrato como única fuente de C• Uso de compuestos amoniacales como fuente de N
• Se cultivan en agar citrato de Simmons (Citrato de sodio y (NH3)3PO4; azul de bromocresol)bromocresol)
• Si es positiva habrá una alcalinización del medio.
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IMViCIMViC• (E.coli ++--) (Enterobacter --++)• (Salmonella -+-+ ) (Citrobacter -+-+)
Fermentación de Carbohidratos (Caldo Rojo de Fenol)
Hidratos de Carbono
Glucosa
Sacarosa
Lactosa
Rojo de Fenol
pH < 6.8 pH > 7.4
Amarillo Roja-Rosado
Interpretación.-
Amarillo
POSITIVO
Amarillo/ gas
NEGATIVO
No hay cambio en la No hay cambio en la coloración Rojo-rosado oscuro
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Fermentación de AzúcaresGlucosa
Organismo Resultado del test1) Control Negativo2) S. aureus Ácido3) P. vulgaris Ácido, gas4)P. aeruginosa Negativo5) E. coli Ácido, gas
Sacarosa
Organismo Resultado del test
1) Control Negativo
2) S. aureus Ácido
3) P. vulgaris Ácido, gas
4)P. aeruginosa Negativo
5) E. coli Negativo
Lactosa
Organismo Resultado del test
1) Control Negativo
2) S. aureus Ácido
3) P. vulgaris Negativo
4)P. aeruginosa Negativo
5) E. coli Ácido, gas
Medio universalmente Medio universalmente empleado para la empleado para la diferenciación de diferenciación de enterobacteriasenterobacterias, en base , en base enterobacteriasenterobacterias, en base , en base a la fermentación de a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido y a la producción de ácido sulfhídrico. sulfhídrico.
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Agar TSI (Triple Sugar Iron)
Diferentes pruebas sobre agar TSI
•• SiSi lala bacteriabacteria problemaproblema fermentafermenta lala glucosa,glucosa,acidificaráacidificará elel mediomedio haciendohaciendo virarvirar aa amarilloamarillo elelindicadorindicador enen elel fondofondo deldel tubo,tubo, mientrasmientras queque sisi nonoeses fermentadorafermentadora dede glucosa,glucosa, elel mediomedio permanecerápermanecerádede colorcolor rojorojo..
•• SiSi lala bacteriabacteria problemaproblema fermentafermenta lactosalactosa y/oy/of áf á ffsacarosa,sacarosa, acidificaráacidificará elel mediomedio enen susu superficiesuperficie
volviéndolovolviéndolo dede colorcolor amarillo,amarillo, mientrasmientras queque sisi nono loloes,es, lala superficiesuperficie deldel mediomedio continuarácontinuará dede colorcolorrojorojo..
• Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo.
La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), perofermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa.
•• Si aparece rotura o desplazamiento del medio, Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas. significa que la bacteria es productora de gas.
Fermentación de azúcares (TSI)
Resultados (slant/butt)
Símbolo Interpretación
1)No cambio/ no cambio
NC/NC No Fermentación
2)Amarillo/amarillo con burbujas
A/A Fermentación de glucosa y lactosa y/o sacarosa, con producción de gas
3)? Rojo/amarillo con precipitado
negro
? NC/A ? Fermentadora de glucosa
4)Amarillo/amarillo i it d
? ?con precipitado
negro5)Rojo/Rojo ? No fermentación,
peptona catabolizada
1 2 3 4 5
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Ejemplo de la Fermentación de Carbohidratos en microorganismos
¿Qué azúcares fermentan Shigella s. y E. coli?
Fermentación de azúcares (Lactosa Agar Mac Conkey)
UREASA
C
O
NH22HN
Urea
22
C
O
NH22HN + 2HOH CO2 + H2O + 2NH3
Ureasa
Principio
(NH4)2CO3
Materiales y Reactivos
Caldo Urea de Stuart Agar Urea de Christensen
Extracto de levadura
0,1g Peptona 1g
Glucosa 1g
Fosfato monopotásico
9,1g
Fosfato disódico 9,5g
Urea 20g
Rojo de Fenol 0,01g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato monopotásico
2g
Urea 20g
Rojo de fenol 0,012g
Agar 15g
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Procedimiento1) Inoculación
2) Incubación
3) Interpretación de
35ºC / 18-24 hrs.
3) Interpretación de resultados
Interpretación de Resultados
Caldo Stuart
Positivo Coloración roja
NegativoNo existe cambio en
la coloración
Agar Christensen
Positivo
Hidrolizado lento.-
Hidrolizado rápido.- Color rojo en el medio
Color rojo solo en un principio solo en el pico de flauta, pero luego se torna en todo el tubo
Agar Christensen
Negativo
p
Hidrolizado lento.-
Hidrolizado rápido.-
Color rojo en el medio
Color amarillo original
Color amarillo original
Controles
Control Positivo Proteus
Control Negativo
Proteus
E. coli
Fenil- Alanina Desaminasa
Enterobacteriaceae
Proteus
Morganella
Providencia
Morganella
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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 8
Materiales y Reactivos
Agar Fenil Alanina
DL Fenilalanina 2g
Extracto de Levadura 3g
Cloruro de Sodio 5gAgar Fenil - Alanina
Fosfato de Sodio 1g
HCl concentrado 2,5 ml
Agar 12g
Cloruro Férrico 12g
Agua Destilada 100ml
ProcedimientoInoculación del pico de flauta
Incubación
Se agregan de 4 a 5 gotas de cloruro férrico
35ºC/18-24 hrs
Se gira el tubo
Interpretación
InterpretaciónPositiva
Negativa
Coloración verde
No hay cambio de Negativa ycoloración
Controles
Control positivo.- Especies de Proteus
Control negativo.- E. coli
Decarboxilasas
Lisina
Ornitina
Cadaverina
Putrescina
Arginina Citrulina
Medios y ReactivosPeptona 5g
Extracto de carne 5g
Púrpura de bromocesol 0,01g
Rojo de cresol 0,005g
Glucosa 0,5g
Piridoxal 0,005g
Agua destilada 1 l
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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 9
ProcedimientoInoculación de 2 tubos1)
Medio Moeller (control) Medio Moeller + Aminoácido
Se cubren con aceite mineral estéril
2)1 cm por encima de la
superficie
3) Incubación (35ºC/18-24hrs)
Interpretación
Positiva.- Indica un vire de color azul-púrpura
Negativa.- No existe cambio de coloracióng
Control
Aminoácido Control Positivo Control Negativo
Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Ornitina Enterobacter cloacae Especies de Klebsiella
Arginina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes
Figura 1. CADENA RESPIRATORIA (5 complejos).
Citocromo Oxidasa
CITOCROMO-OXIDASA
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SE ENCUENTRA EN:
o Microaerófilos
o Anaerobios Facultativos
La prueba de la oxidasa es importante para identificar microorganismos que carecen de
la enzima o son anaerobios obligados.
MEDIOS Y REACTIVOS
• CLORHIDRATO DE TETRAMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE KOVAC)1% (REACTIVO DE KOVAC)
• CLORHIDRATO DE DIMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE GORDON Y MCLEOD)
REACCIÓN
Cit crd IncoloroCit crd IncoloroCit cox Azul (azul de indofenol)
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REACTIVO DE KOVAC
vs
REACTIVO DE GORDON Y REACTIVO DE GORDON Y McLEOD
Ventajas del reactivo de Kovac
• Estabilidad durante el almacenamiento
• Mas sensible para la detección de citocromo-oxidasa
M ó i• Menos tóxico
PROCEDIMIENTODirecta Indirecta
2 o 3 gotas de reactivo se agregan directamente en colonias bacterianas aisladas en un medio en placa.
Se agregan unas pocas gotas del reactivo a una tira de papel de filtro o se usan tiras o discos comerciales impregnados con reactivo p gdesecado.
INTERPRETACIÓN
10 s Las colonias que tienen actividad de citocromo-oxidasa desarrollan un color azul oscuro en el sitio de inoculación en 10 s.
10 – 60 s Debe evaluarse aún más porque probablemente no pertenezca a la familia Enterobacteriaceae.
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No deben usarse asas o alambres de o alambres de
inoculación de acero inoxidable o Nichrome
para esta prueba.
CONTROLESControl Positivo Pseudomonas
aeruginosa
Control Negativo Escherichia coli
Propósito
Reducción de Nitratos
Este examen detecta la habilidad de un organismo para reducir nitratos (NO3) a nitritos (NO2) o algunos otros compuestos
nitrogenados, tales como nitrógeno molecular (N2), usando la enzima nitrato reductasa.
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Reactivo A Ácido Sulfanílico 8g
ÁÁcido acético (5N), 30%
1L
Reactivo B α-naftalamina 8g
Ácido acético (5N), 30%
1L
CALDO DE NITRATO O AGAR NITRATO (PICO DE FLAUTA)
Extracto carne 3gExtracto carne 3g
peptona 5g
Nitrato de potasio (KNO3) 1g
Agar (sin nitritos) 12g
Agua destilada 1L
PROCEDIMIENTO
Inoculación
Incubación(a 35°C,
18 a 24 horas)
Agregar 1mL de cada uno
de los reactivos A y B
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El polvo de zinc se agrega a los tubos cuyo resultado parezca ser negativo (siga siendo claro).
CONTROLES
CONTROL POSITIVO
E. coli
CONTROL NEGATIVO
Acinetobacter calcoaceticus
Ortonitrofenil Galactósido
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β-Galactosidasa
Lactosa permeasa
CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS (criterio ONPG TEST)
Bacterias no fermentadoras de lactosa
Son incapaces de producir ácidos a partir de lactosa.
Bacterias no fermentadoras de Dan una prueba positiva de lactosa (carecen de permeasa,
pero si poseen β-galactosidasa)ONPG.
Fermentadores tardíos de lactosa Poseen una actividad permeasa Fermentadores tardíos de lactosa Poseen una actividad permeasa lenta.
Fermentadores normales Dan una prueba positiva de OMPG rápida.
PROCEDIMIENTOAsa de crecimiento
Bacteriano + 0.5 mL de solución fisiológica
Se agrega una gota de toluenogota de tolueno
Mezclar durante unos s
A l ióAgregar soluciónONPG amortiguadora
Baño de agua a 37°C
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Agar-hierro de Kligler MEDIO RICO EN
LACTOSA(KIA)
Agar-hierro-triple-azúcar (TSI)(TSI)
Fosfato de sodio buffer,1M, pH7
O-nitrofenil-β-galactósido (ONPG), 0.75 M
REACTIVOSSolución Fisiológica
Tolueno
INTERPRETACIÓN
5-10 min Algunos.
El color amarillo por lo común es evidente.
1 hora La mayoría.
24 horas Las reacciones no deben interpretarse p
como negativas hasta después de 24 horas
de incubación.
CONTROLES
CONTROL POSITIVO E. coli
CONTROL NEGATIVO Proteus
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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 17
http://www.uprm.edu/biology/cursos/micro/pruebas.htm
• http://html.rincondelvago.com/pruebas-bioquimicas.html
• http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.troybio.com/images/Product_Images_BBL/MCONKEY-ECOLI.gif&imgrefurl=http://www.troybio.com/images/Product_Images_BBL/BBL.htm&h=1648&w=1629&sz=745&tbnid=fOb6kWI8BPcJ:&tbnh=150&tbnw=148&hl=es&start=14&p=fOb6kWI8BPcJ:&tbnh=150&tbnw=148&hl=es&start=14&prev=/images%3Fq%3Dagar%2Bmac-conkey%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D