Pruebas microbiológicas rápidas de los alimentos Dra. Keiko Shirai.

Pruebas microbiológicas rápidas de los alimentos

Dra. Keiko Shirai

• Métodos Tradicionales (cuenta en placa, NMP)– simple– económico– aceptado

• Métodos Rápidos– rápidos– sensibles

Técnicas de cultivo

• Los m.o. generalmente se encuentran como poblaciones mixtas y deben ser aisladas como cultivos puros.

• Un cultivo puro consiste de una población de células que provienen de una sola célula– Técnica de estría en placa

– Transferencia aséptica de un cultivo

Keiko Shirai:

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Técnica de estría en placa

• Un cultivo mixto es depositado en un área de una caja petri con agar, con un asa de siembra estéril se estría el agar varias veces. El asa de siembra puede ser esterilizada antes de estriar nuevamente el agar.

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• Cuando la técnica de estría en placa ha sido llevada acabo adecuadamente, las células bacterianas se multiplicarán y crecerán en distintas poblaciones o colonias.

• Las colonias formadas por diferentes bacterias tienen diversas formas, tamaño y pigmentación.

• Esas diferencias pueden ayudar en la obtención de cultivos puros

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Transferencia aséptica de un cultivo

• Este término es utilizado para describir el procedimiento de transferencia de m.o. de un medio de cultivo a otro, de tal forma que se elimine la contaminación por m.o. indeseables.

• Es importante trabajar rápido y mantener los tubos en un ángulo que impida la entrada de contaminantes con el aire

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Pueden ser utilizadaspara la obtención de cultivos puros

Vertido Superficie

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Tinción

– Simple• Consiste en el uso de un solo colorante que aumenta

el contraste del espécimen contra un fondo.

– Diferencial• Utilización de dos colorantes

– (el colorante primario tiñe la estructura y el secundario ayuda al contraste).

– Especial• Los colorantes tienen afinidad específica por

estructuras celularesKeiko Shirai:

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Reactivos Tiempo Reacciones FrotisCristal Violeta 1 minuto Colorante básico que se une a

enjuagar los grupos cargados negativamentecon agua de la pared celular, membrana, citoplasma.

Yodo-Yoduro 1 minuto Yodo fija el cristal violeta a los grupos enjuagar negativos

Alcohol-Acetona 10 a 15 Decolorar el cristal violeta y yodo de segundos las células. El color difunde de los enjuagar m.o. gram positivos más lentamente quecon agua negativos, por la composición química

y grosor de la pared celular de gram positivos

Safranina 1 minuto Colorante básico que se liga a los gruposenjuagar negativos en ambos tipos de células.

Unos cuantos grupos negativos están libres del cristal violeta en gram +, mientras que la mayoría de los grupos - están libres en bacterias gram -. En consecuencia gram+ permaneces violetas mientras que gram -, rojos o rosas

Células incoloras difíciles de ver

Gram+ y -se tiñen azules

Gram+ y - se mantienen azules

Gram + permanecen azules, gram - se decoloran y son difíciles de ver

Gram + las células permanecen violetas, mientrás gram - son teñidas a rosa o rojo.

Métodos rápidos

• Directos– Biofotometría– Conteo por microscopía electrónica – Marcaje por fluorescencia– Análisis de imágenes

• Indirectos – ATP por luminiscencia– Reducción de colorantes– Cromatografía de gases – Presencia de enzimas especificas– Componentes celulares ("fingerprinting")

Microscopía por fluorescencia

• Los microorganismos se concentración por filtración

• Se tiñen con un fluoroforo• Se detectan en el microscopio con lámpara de

mercurio para inducir la excitación del fluoroforo.• Se realiza análisis de imágenes• Es rápido (ca 2 horas)• Puede ser utilizado para identificación

Esporas germinadas

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Bioluminiscencia (ATP)

• El ATP microbiano se hace reaccionar con la luciferasa

• Se realiza un análisis luminométrico

• El método es rápido (de 30 min a 2 horas)

• Se puede determinar viabilidad.

La ATP-Bioluminiscencia está basada en una reacción que ocurre en forma natural en las luciérnagas(Photinus pyralis). La reacción bioluminiscente catalizada por la luciferasa utiliza la energía químicacontenida en la molécula de ATP para producir la descarboxilización oxidativa de la luciferina aoxiluciferina, dando como resultado la producción de LUZ.La cantidad de luz emitida es proporcional a los niveles de microorganismos y/o materia orgánicapresente.

Análisis de imágenes A. niger

GEOMETRIC MODELThe number of

segments is a function of the number of tips.NS = 2Nt – 111 = 2(6) – 1

Biomass is a function of the number of tips:

X = NS[d2Lav/4]

NS = 2t+1 - 1

t = 0; NS = 1

dNS/dt = ln(2)2t+1

S4S3 S10

HYPHAL GROWTH KINETICS

X = [2*2t-1][d2Lav/4]

dX/dt = 2ln(2)2t[d2Lav/4]

(1/X)dX/dt = 2ln(2)2t/[2*2t-1]

For 2t>>1; (1/X)dX/dt ln(2) µX = Xoeµt; Find

HYPHAL LENGTH vs TIME

6 8 10 12 14 16 18 20

Time (h)

Glucosa: (g/L)

dL/dt = UrL/(KL + L)

(empirical rate law)

FINDING BRANCHING TIME

dL/dt = UrL/(KL + L) (empirical law)

Ur = maximal rate of hyphal extension (cm/h)

KL = empirical constant of saturation (cm)

After integration, between L0 and LC, the branching time, , is estimated as follows,

= [1/ Ur][KLln(LC/ L0) +LC - L0] = hours

APPROXIMATE MODELS

• For LC << KL KLln(LC/ L0) +LC - L0 KLln(LC/ L0)

[1/ Ur][KLln(LC/ L0)]

Early branching mechanism (Larralde model)

For LC >> KL> L0 KLln(LC/ L0) +LC - L0 LC

[1/ Ur][LC]

Late branching mechanism (Trinci model)

MICROSCOPIC MODELS

Larralde-Corona et al., (1993); Lc << KL

µ = ln(2)UR/[KLln(Lav/d0)]

• Extracción de ADN, este se amplifica en PCR

• Nucleótidos específicos son concentrados y reaccionan con reactivos fluorescentes para cuantificar

• Resultados son obtenidos en 1 a 3 horas

• Sensible.

Cromatografía de gases

• Se determinan ácidos grasos.

• No es un método rápido

• No es sensible

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