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22/09/2011
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Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Reacciones enzimáticas
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
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�aturaleza Industria química
Síntesis de compuestos orgánicos
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La naturaleza de las enzimas
1) La reacción química se lleva a cabo
bajo condiciones suaves
2) Acción específica de acuerdo a la
clase de enzima
3) Tasas de reacción muy rápidas
4) Numerosas enzimas para diferentes
objetivosEnzymes at work (www.novozymes.com)
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Clase Enzimas Industriales
1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa
oxidasas, lacasas
2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-
transferasas
3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas,
pectinasas, proteasas, pululanasas
4. Liasas Pectato-liasas, αααα-acetolactato
decarboxilasas
5. Isomerasas Glucosa isomerasa
6. Ligasas �o son usadas actualmente
Enzymes at work (www.novozymes.com)
Enzimas típicas usadas en procesos industriales
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Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos
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Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos
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Enzimas técnicas (Industrias: Detergentes, almidón, textil, curtidos, pulpa y
papel, y cosméticos
Enzimas en la industria alimentaria: láctea, cerveza, vinos y jugos, grasas y
aceites, y panificación.
Enzimas en alimentación animal
Mercado mundial de enzimas industriales($1,500,000 USD en el año 2000)
(McCoy, 2000)
65 %
10 %
25 %
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Puntos principales de la aplicación comercial de
un catalizador enzimático
• Velocidad de reacción
(actividad catalítica)
• Extensión de la reacción
(constante de equilibrio)
• Duración de la actividad
(estabilidad)
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Energía de activación
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Diseño de biorreactores
reactorroi VvSSF =− )(
ννννr = velocidad de reacción
F, S0
F, Si
donde:
Balance de materia
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Leyes fundamentales de la cinética
• Velocidad de la reacción
• Orden de la reacción
---- = v = k
---- = v = k CA CB
Orden uno
Orden cero
Orden dos
v0
[P]
t
[A]0
d[P]
dt
---- = v = k CAd[P]
dt
d[P]
dt
A P
A P
A + B P
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Consideraciones al definir el orden de una reacción
• No se puede decir que todas las
reacciones poseen un cierto orden
(Reacciones complejas)
• No se debe intentar deducir el orden de
una reacción de su ecuación
estequiométrica
(Depende del mecanismo de la reacción)
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Sitio activo y formación del complejo: enzima-sustrato
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Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato
Efecto de proximidad y efecto de orientación
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Modelo de ajuste inducido
Hexoquinasa
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ES
k 1
k -1
k cat
E
S
E
P
E + S
k 1
k -1
ES
k cat
E + P
Modelo llave-cerradura
E
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Los experimentos cinéticos revelan propiedades
enzimáticas
Cinética química
• Los experimentos examinan la cantidad de producto
(P) formado por unidad de tiempo (∆∆∆∆[P] / ∆∆∆∆t)
• Velocidad (v) – la tasa de una reacción
(varía con la concentración de reactante)
• Constante de la tasa (k) – indica la velocidad o
eficiencia de una reacción
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Cinética enzimática
• Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molécula de
substrato (la enzima esta saturada con el substrato)
• Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E],
y la reacción es pseudo-primer orden
• Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado
cuando el substrato específico se enlaza al sitio activo de la
enzima
E + S ES E + P
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Velocidad inicial (vo)
• La velocidad al inicio de una reacción catalizada
enzimáticamente es
vo (velocidad inicial)
• k1 y k-1 representan una rápida asociación
/disociación no covalente de substrato del sitio
activo de la enzima
• kcat = constante de la tasa para formación de
producto de ES
E + S ES E + P k1
kcat
k-1
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Curva de progreso para una reacción catalizada
enzimáticamente
• La velocidad inicial (vo) es la
pendiente de la porción lineal
inicial de la curva
• La tasa de la reacción se duplica
cuando se usa el doble de
enzima
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Leonor Michaelis
1875-1949
Maud Menten
1879-1960
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Consideraciones de equilibrio rápido(Ecuación de Henri-Michaelis-Menten)
E + Sk 1
k -1ES
k cat E + P
[ ] [ ] [ ]ESEE t +=
[ ]ESkv cat=
[ ][ ]
[ ] [ ]ESE
ESk
E
v cat
t +=
[ ][ ][ ]
[ ] [ ] [ ]EK
SES
ES
SEK
S
S =∴= ,
[ ]
[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]EK
SE
EK
Sk
E
v
S
S
cat
t +=
[ ][ ]SK
S
V
v
Smax +=
1. Reacciones involucradas
2. Balance de masa
3. Velocidad limitante
4. Dividir por [E]t
5. Expresión de equilibrio
6. Sustituir en términos de [E]
7. Donde Vmax = kcat
[E]t
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JBS HaldaneBriggs
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Consideraciones de estado estacionario(Ecuación de Briggs-Haldane)
E + S
k 1
k -1ES
k catE + P
[ ] [ ] [ ] ( ) [ ]ESkkSEkdt
ESdcat ⋅+−⋅= −11
[ ]0=
dt
ESd
[ ] [ ][ ] M
cat Kk
kk
ES
SE=
+=
⋅ −
1
1
[ ]ESkv cat=
[ ][ ]
[ ] [ ]ESE
ESk
E
v cat
t +=
[ ][ ]SK
S
V
v
M +=
max
1. Reacciones involucradas
2. Balance de masa
3. En estado estacionario
4. Constante de Michaelis
6. Dividir por [E]t
8. Donde Vmax = kcat [E]t
5. Velocidad limitante
[ ]
[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]EK
SE
EK
S
Ek
v
M
M
tcat +=
7. Sustituyendo [ES]
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νννν
[S]
Vmax
KM
Vmax
2
νννν = Vmax [S]
KM + [S]
Cinética de Michaelis-Menten
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La ecuación de Michaelis-Menten
• La Velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima está
saturada con el substrato (alta [S])
• A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden
cero con respecto a S)
• A bajas [S] la reacción es de primer orden con respecto a S
• La forma de una curva vo versus [S] es una hipérbola
rectangular, indicando saturación del sitio activo de la enzima
conforme [S] se incrementa
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Gráficas de velocidad inicial (vo) versus [S]
(a) Cada punto vo vs [S] se obtiene
de un experimento cinético
(b) La constante de Michaelis (KM)
iguala la concentración de
substrato necesario para
alcanzar ½ de la velocidad
máxima
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El significado de KM
• KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax
• KM ≅ k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociación
enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1
• Entre más bajo sea el valor de KM, más ajustado
será el enlace del substrato
• KM puede ser una medida de la afinidad de E for S
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KM y concentraciones de substrato fisiológicas
• Los valores de KM para las
enzimas son típicamente
arriba de [S], tal que las
tasas enzimáticas son
sensibles a pequeños
cambios en [S]
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• La constante catalítica (kcat) – constante de la tasa de orden uno
para la conversión de complejo ES a E + P
• kcat es más fácilmente medible cuando la enzima esta saturada con
S
• La relación kcat /KM , llamada también coeficiente de
especificidad, es una constante de segundo orden para
E + S E + P
a bajas concentraciones de [S]
Las constantes cinéticas indican la actividad
enzimática y la especificidad
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Significados de kcat y kcat/KM
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Ejemplos de constantes catalíticas
Enzyme kcat(s-1)
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Valores of kcat/KM
• kcat/KM puede aproximar la tasa de
encuentro de dos moléculas no cargadas
en solución (108 to 109 M-1s-1)
• kcat/KM es también una medida de la
especificidad de la enzima por diferentes
substratos (constante de especificidad)
• Aceleración de la tasa = kcat/KM
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Cálculo de KM y Vmax
La gráfica doble-
recíproca
Lineweaver-Burk es
una transformación
lineal de la gráfica de
Michaelis-Menten
(1/vo versus 1/[S])
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[ ]tf EkV 2max = [ ]tEkVb 1max −=
1
12
k
kkK
Sm−+
=2
12
−
−+=
k
kkK
pm
Donde:
Reacciones reversibles
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]PEESSEK
K
K
K
+←
→
←
→+
−− 2
2
1
1
[ ] [ ]
[ ] [ ]PS
P
b
S
f
neta
K
P
K
S
K
PV
K
SV
v
++
−
=1
maxmax
Glucosa Isomerasa
Consideración de estado estacionario
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[ ][ ] eq
eq
eq
Sb
PfK
S
P
KV
KV==
max
maxRelación de Haldane0=netav
En el equilibrio
Borges da Silva y col., 2006
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Inhibición por substrato(Consideración de equilibrio rápido)
E + S ESk cat
E + P
[ ] [ ] [ ]+[ΕS2]ESEE t+=
[ ]ESkv cat=
[ ][ ]
[ ] [ ]ESE
ESk
E
v cat
t +=
[ ][ ][ ]ES
SEKS= ,
[ ]
[ ][ ]
[ ] [ ]E
EK
Sk
E
v
[ ]EK
S
S
S
cat
t +=
[ ]SK
[ ]SV
v
Smax +=
1. Reacciones involucradas
2. Balance de masa
3. Velocidad limitante
4. Dividir por [E]t
5. Expresiones de equilibrio
6. Sustituir en términos de [E]
7. Donde Vmax = kcat [E]t
+S
ES2
KS
KI
+ [ES2]
[ ][ ][ ]ES2
SESK I
=
[ ]EK
S
S
+ [ ]2
[ ]2S+KI
KI
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Inhibición por substrato
0.0000
5.0000
10.0000
15.0000
20.0000
25.0000
0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06
[S] nM
V n
mol/l*m
in
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05
1/[S]
1/v
[ ] [ ]SKVVSV
K
v I
M
maxmaxmax
1111++=
-1/KM
1/Vmax
KM/Vmax
1/V
1/[S]
[ ] iM KKS =max
[ ]
[ ] [ ]i
MK
SSK
SVv
2
max
++
=
[ ] maxmax
111
VSV
K
v
M +=
KI se calcula de:
[S]max
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Los inhibidores de enzimas son importantes por varias
razones
Inhibición enzimática
1) Pueden ser usados para obtener información acerca de la forma del sitio
activo de la enzima y los residuos de amino ácidos en el sitio activo
2) Pueden ser usados para obtener información acerca del mecanismo químico
3) Pueden ser usados para obtener información acerca de la regulación o control
de una vía metabólica
4) Pueden ser muy importantes en el diseño de medicamentos
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Sistemas de inhibición simple
• Inhibición competitiva
• inhibición no competitiva
• Inhibición acompetitiva
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ES
KS k p
E
S
E
P
EI
I
KiE + S
KS
ES
k p
E + P
+
I
Ki
EI
Modelo de inhibición competitiva
[ ][ ] [ ]SK
IK
S
V
v
i
S
max +
+
=
1
Consideración de equilibrio rápido
E
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1/[S]
1/v0
-1/KM
1/Vmax
Incremento de
[I]
Inhibición competitiva
[I]-KI
Pend.
KM aumenta
Vmax no cambia
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Ki
I
S
E+PES
Ki
KS
KS
E
ESIEI
Modelo de inhibición no competitiva
E + S ES E+PKS
EI + S ESI
KS
+
IKi Ki
+
I[ ]
[ ][ ]SK
S
K
I
V
v
S
i
max +=
+1
Consideración de equilibrio rápido
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1/[S]
1/v0
-1/KM
Inhibición no competitiva
Incremento de
[I]
1/Vmax
[I]-KI
Inter.
KM no cambia
Vmax disminuye
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Modelo de inhibición acompetitiva
E + S
Ki
E + P
E S ES
ESI
+
I+
KS
ES E + P
ESI
Ki
KS
kcat
kcat
[ ]
[ ]
[ ][ ]S
K
I
K
S
K
I
V
v
i
m
i
max +
+
=
+ 11
Consideración de equilibrio rápido
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1/[S]
1/v0
Incremento de
[I]
-1/KM
1/Vmax
Inhibición acompetitiva
[I]-KI
Inter.
KM disminuye
Vmax disminuye
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Equilibrio rápido en sistemas bi y tri-reactantes
1. La aproximación de equilibrio rápido es útil y válida
para los sistemas de enlace aleatorio
2. La mayoría de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones
ordenadas se prefiere la aproximación de estado estacionario
E + A + B EAB E + P
B = Sustrato
A = Cosustrato, coenzima o coactivador
�otas:
donde:
E = Enzima
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[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ]BABA
BA
max
KK
BA
K
B
K
A
KK
BA
V
v
⋅⋅
+++
⋅⋅
=
α
α
1
Sistemas bi-reactantes aleatorios
E + B EB
+
A+
A
EA + B EAB E + P
KB
KA
αααα KB
αααα KA
kp
Consideración de equilibrio rápido
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Sistemas bi-reactantes ordenados
[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]BAA
BA
max
KK
BA
K
A
KK
BA
V
v
⋅++
⋅
=1
E + A EA + B EAB E + P
Consideración de equilibrio rápido
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Sistemas tri-reactantes aleatorios
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]CBACBCABACBA
CBA
max
KKK
CBA
KK
CB
KK
CA
KK
BA
K
C
K
B
K
A
KKK
CBA
V
v
⋅⋅⋅⋅⋅
+⋅⋅
+⋅⋅
+⋅⋅
++++
⋅⋅⋅⋅⋅
=
γβααβγ
γβα
1
Consideración de equilibrio rápido
EABEABC
EAEAC
EB
EEC
E + P + Q + R
+ C
KC
+ C
ββββ KC
+ C
αααα ββββ KC
EBC+ C
αααα KC
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Sistemas tri-reactantes ordenados
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]CBABAA
CBA
max
KKK
CBA
KK
BA
K
A
KKK
CBA
V
v
⋅⋅+
⋅++
⋅⋅
=1
(EABC EPQR)kp
KA KB KC
E EA EAB
KP KQ KR
EQR ER E
Consideración de equilibrio rápido
Sistema Ter Ter ordenado
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Multisitios de enlace de sustrato
Sitios de enlace no cooperativos
[ ] [ ]
[ ] n
S
n
SS
max
K
S
K
S
K
S
V
v
+
+
=
−
1
1
1
[ ][ ]SK
S
V
v
Smax +=
Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n moléculas de enzina de un
sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una
molécula de n sitios de enlace
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[S]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
v
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Enzimas alostéricas
Comparación de curvas de velocidad.
(a) Respuesta hiperbólica, (b) respuesta sigmoidal
(a)
(b)
Enzima alostérica
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Enzimas alostéricas
Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)
E + S ES E + P
+
S
+
S
SE + S SES SE + P
ES + P
P + E
KS
αααα KS
KS
kp
kpkp
αααα KS
Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlace
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[ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ]423
4
32
3
2
2
423
4
32
3
2
2
4641
33
SSSS
SSSS
max
cKba
S
bKa
S
aK
S
K
S
cKba
S
bKa
S
aK
S
K
S
V
v
++++
+++
=
Consideración de equilibrio rápido
Vmax = 4 kp [E]tdonde:
Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace
Enzimas alostéricas
Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)
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Enzimas alostéricas
[ ][ ]nn
max SK
S
V
v
+=
'
Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato
es muy marcada
Ecuación simplificada para enzimas alostéricas
(Ecuación de Hill)
n = número de sitios de enlace de sustrato por molécula de enzima
K’ = Constante que involucra los factores de interacción y a la constante
de disociación intínseca
Donde: