Post on 07-Feb-2018
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Tcnicas de Estudio de las clulas
Microscopia
Preparaciones permanentes:
Fijacin Deshidratacin Inclusin Corte
Fijacin: Acidos, solventes orgnicos como alcohol, aldehdos (Formaldehdo, glutaraldehdos)
Inclusin: Ceras o resinas (lquido a slido)Ej.: Parafina (xileno, benceno, tolueno)
Celoidina (etanol, eter)
Cortes: Micrtomo, vibrtomo, crostato.
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Colorantes utilizados para microscopia
Bsicos: Azul de metilenocidos: Eosinaneutros: Eosinato de azul de metileno.
Ej.: Hematoxilina: (-), revela ADN, ARN y protenas cidas
Para lpidos: OsO4, Sudn III
Otros mtodos de visualizacin
Asociacin con molculas grandes: Enzimas + sustrato adecuado anticuerpos marcados
Inmunofluorescencia
Difraccin de rayos X
Rayos X, son una forma de radiacin electromagntica, de una longitud de onda bastante pequea, de alrededor de 0.1nm (dimetro de un tomo de hidrogeno).
La posicin e intensidad de cada spot en el patrn de difraccin contiene informacin acerca de la localizacin de los tomos en el cristal, permitiendo deducir la estructura tridimensional de la molcula que conforma el cristal.
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Patrn de difraccin de una protena
Patrn de difraccin de la molcula de ADN
Como medir las condiciones internas de clulas vivas?
Microelectrodos:
Medicin de variables elctricas medicin de concentracin intracelular de iones inorgnicos
Microagujas:
Inyeccin de distintas sustancias
Micropipetas:
Diseccin Extraccin injertos
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Introduccin de sustancias
Microinyeccin Electroporacin Utilizacin de liposomas
Fraccionamiento celular
Ruptura celular
Shock osmtico Vibracin Ultrasonicacin Homogenizacin
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Fraccionamiento por centrifugacin
Centrifugacin diferencial
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Centrifugacin en gradiente
Estudio de protenas
Protenas poseen diferentes:Tamao Forma Carga Hidrofobicidad Afinidad por otras molculas
Separacin
Purificacin
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Cromatografas
Fase mvil: solvente
Fase inmvil: papelresina cargadasmatriz porosas inertes
Cromatografa en capa fina
Fase inmvil: Papel de cromatografaHoja de plsticovidrio con celulosa o silica.
Fase mvil: Agua Alcohol
Cromatografa en columnas
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Cromatografa de intercambio inico
Posee pequeas esferas cargadas negativa o positivamente
La separacin se produce segn carga
Cromatografa de filtracin en gel
Separacin segn tamao molecular
Matrices porosas de acuerdo al tamao
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Cromatografa de afinidad
Separacin de acuerdo a la afinidad de una molcula con otra.
La protena de inters puede ser retenida especficamente por la matriz
Electroforesis
Las protenas usualmente poseen carga neta positiva o negativa, dependiendo los aminocidos que contenga.
Cuando se aplica un campo elctrico a una solucin conteniendo molculas proteicas, las protenas migran a una razn dependiendo de su carga neta, y de su tamao y forma.
* A mayor carga y menor peso molecular, mayor movilidad electrofortica.
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Isoelectroenfoque
Cada protena tiene su punto isoelctrico; pH al cual tiene carga neta 0.
Una protena en su punto isoelctrico no migra en un campo elctrico.
* Gel con gradiente estable de pH La protena migra hasta el punto isoelctrico.
Electroforesis en gel
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Electroforesis en condiciones denaturantes (SDS-PAGE)
Las protenas se encuentran en una solucin que contiene un detergente con fuerte carga negativa (SDS).
Las molculas de detergente enmascaran la carga intrnseca de la protena y cuando se aplica voltaje migran hacia el electrodo positivo.
Electroforesis bidimensional
1.- Separacin en cuanto a carga (isoelectroenfoque).2.- Separacin en cuanto a peso molecular (con SDS).
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Tecnologa del ADN recombinante
* Largas molculas de ADN son cortadas en fragmentos por enzimas de restriccin
Nucleasas de restriccin (o enzimas de restriccin): Corta el ADN doble hebra en sitios especficos definidos por la secuencia nucleotdica local.
Extremos romos
Extremos cohesivos
El uso de enzimas de restriccin para realizar cortes especficos en el ADN, facilita el aislamiento y manipulacin de genes individuales.
Dos fragmentos de ADN cortados por la misma enzimas pueden unirse fcilmente (o con otra nucleasa que genere los mismos extremos cohesivos)
ADN recombinante
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Hibridacin utilizando sondas
- Localizacin de genes- Northern (RNA)- Southern (DNA)
Deteccin de DNA o RNA por hibridacin
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Clonar Genes
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Cultivos celulares
Fibroblastos Mioblastos
Lnea celulares
Cultivos primarios