Concepción, 16 de abril 2015

JM Sayagués

Técnicas para la detección de anomalías

cromosómicas. Aplicaciones de la técnica de

Hibridación in situ Fluorescente (HISF) en

hemopatías malignas

Alteraciones genéticas+

Factores ambientalesNeoplasia

Hemopatías malignas Alteración genética aislada(Alteración primaria)

Alteraciones genéticas asociadas ala transformación del clon inicial

(Alteraciones secundarias)Tumores sólidos

Introducción

• Estandarización de la técnica de Arrays Genómicos• Significado biológico y pronóstico de los cambios genómicosanalizados mediante arrays genómicos en los LEZM

MetodologíaHipótesis y Objetivos

Resultados y Discusión

Introducción

Célula neoplásica

Introducción

Citogenética convencional

Hibridación in-situ fluorescente

Hibridación Genómica Comparada

Micro-arrays

5-10 Mb

2.5-5 Kb

BASEsimple

Ultra-secuenciación

t(9;22)(q34;q11)

1960: Cromosoma PhiladelphiaLeucemia Mieloide Crónica

Limitaciones:-Sólo células en división- Selección clonal-Interpretación subjetiva- pequeño nº de células- sensibilidad

Citogenética Convencional

Nowell PC & Hungerford D A. A minute chromosome in humanchronic granulocytic leukemia. Science 142:1497. 1960

AT C G

CA

TG C

G

Células

Sonda

Hibridación in situ fluorescente

Identificación y localización desecuencias de ADN

1) Células en suspensión- Interfase: metanol/ácido acético (3/1 v/v)

- Metafase:Leucocitos estimulados (Fitohemaglutinina)Tratamiento con ColcemidTratamiento hipotónicoFijación

2) TejidosIncluidos en parafinaFrescosCongelados

Hibridación in situ fluorescente

Disgregación mecánica

1) TRATAMIENTO ENZIMÁTICO

Pepsina

Biotina Digoxigenina

Avidina oEstreptavidina Anti-digoxigenina

A C TG TA GT G C A T C A TG A G

A C TG TA GT G C A T C A TG A G

3) REVELADO/VISUALIZACIÓN

2) DESNATURALIZACIÓN E HIBRIDACIÓN

Sonda

Hibridación in situ fluorescente

- MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

. LÁMPARA:100 W, 200 horas

. OBJETIVO: 100X INMERSIÓN

. FILTROS: Simples, dobles y triples

-CONTABILIZAR SEÑALES

. 200 CÉLULAS

Hibridación in situ fluorescente

Sondas para FISH

Centroméricas LibreríasLocus

específicasTeloméricas

Tamaño y la localización de secuencias que identifican

Síndrome Down

NORMAL TRISOMIA

Anomalías cromosómicas•Numéricas: ganancias y pérdidas cromosómicas

•Estructurales: Deleciones, amplificaciones, inversionesy translocaciones

Tipos de alteraciones cromosómicas

DELECIONES

AMPLIFICACIONES

.

.......

.

.....

Alteraciones estructurales

INVERSIONES

Alteraciones estructurales

TRASLOCACIÓN

Traslocación equilibrada entre dos cromosomas

q

p

Fusión

Alteraciones estructurales

FISH: Limites de detección

La sensibilidad de la técnica depende del:

• Diseño y tamaño de la sonda• Muestra• % de células tumorales en la muestra• Patrón de normal – alterado• Número de células analizadas

En general se asume un cut-off del 4% (100 – 200 núcleos)

– Trisomía 18 en mucosa gástrico• 100 núcleos: 5,7% (0,9 + 3 x 1,16)• 500 núcleos: 3,7% (0,8 + 3 x 0.9)

– Trisomía 8 en LMC:• 200 núcleos: 3%• 500 núcleos: 1,8%

– Trisomía 12 en LLC:• 1,8 – 2.2 % (Seoul National University Institute)

Trisomías

FISH: Límites de detección

Cuneo et al. Haematológica, 1998; 83: 21-26Bunn et al. Blood, 2003; 101:1941-1949

FISH: Límites de detección

• En general se asume un cut-off del 10% (100 núcleos)

• Sin embargo, los intervalos calculados son inferiores:

– Monosomía 7: 5% en SMD

– Monosomía 6: 6.86% en Linfoma B

– Monosomía 13: 8,2% en mieloma (200 núcleos)

Monosomías

Imashuku et al. Haematological, 2003; 88:(11) ECR31Sietske et al. Blood, 2000; 96: 3569-3577

FISH: Límites de detección

Deleciones• Deleción P16:

– 3.1% - 200 núcleos (Woo et al. J Korean Med Sct, 2005;20: 30-41)

• Deleción ATM:– 5% (Salido et al. Haematologica, 2003; 88: 11)– 6.5% (Goorrha et al. Genetic in Medicine, 2004; 6: 48-53)

• Deleción RB1:– 5.3% - 200 núcleos (Avet-Loiseau et al. Blood, 1999; 94: 2583-89)

• Deleción TP53:– 10% (Chang et al. Blood, 2005; 105: 358-60)– 8.6% (Ackermann et al. British J Haematol, 2003; 103; 1161-63)

FISH: Límites de detección

Translocaciones

• Sonda: S-BRC/ABL Dual Color• Patrón de normalidad: 2R2V• Patrón de translocación: 1R1V1F• Cut-off: 10%

• Sonda: D-BRC/ABL Dual Color• Patrón de normalidad: 2R2V• Patrón de translocación: 2F1F1R• Cut-off: 1%

• Sonda: Break-Apart• Patrón de normalidad: 2F• Patrón de translocación: 1F1V1R• Cut-off: 1.7%

Wen et al.J. Clinical Pathology 2007;46: 47-71

Varella-García et al.Genet Mol Biol 2003; 21: 1415-57

Van der Burget el tal.Leukemia, 2011; 13: 2107-12

BAC-

arra

y

ADN referenciaADN tumoralCantidades =

Pérdida

Sin cambios

Ganancia

Array-Hibridación Genómica Comparada

0.50

Inte

nsid

adfluo

resc

encia

NormalDeleción Amplificación

1

1.25

1.50

0.75

aCGH vs. FISH

No requiere células en divisiónAnaliza globalmente el genomaAlta especificidadProcedimiento semiautomatizadoElevado nivel de resolución

VENTAJAS

No detecta alteraciones recíprocas30% de células tumoralesHibridación de alta calidadPolimorfismos

LIMITACIONES

Array-Hibridación Genómica Comparada

¿Es útil el diagnósticocitogenético en el estudio de

leucemias y linfomas?

Clasificación OMS

Año 2000. Sociedad europea y americana de hemopatología

Clasificación de la Leucema Mieloblástica Aguda (LMA):

Criterios

Morfológicos

Genéticos

Inmunofenotípicos

Clínicos

Clasificación OMS de las Leucemias agudas mieloblásticasAño: 2000

Buen pronóstico

Mal pronóstico

Clasificación OMS: Leucemia mieloblástica agudaAño: 2008

- 90% se clasifican como LMA M2- 10% de las LMA de novo, jóvenes- Pronóstico favorable: Buena respuesta a la

QT (ARA-C a altas dosis de citarabina;arabinosido de citosina)

- Frecuente asociación con otras anomalíasgenéticas: del(9q22), –Y

Proteína de fusión RUNX1-RUNX1T1

LMA con t(8;21) (q22;q22) RUNX1-RUNX1T1

LMA con t(15;17) (q22;q12)

8 % de las LMA, fundamentalmente en jóvenes. Pronóstico favorable: buena respuesta a ATRA Morfológicamente: Blastos muy granulados Bastones de Auer (astillas) MPO +++

Hipergranular o LAP “típica” Hipogranular

bastones de Auer Nucleos bi-lobulados

q22

q12RARα

PML

t(15;17)(q22;q12)

PML-RARαProteína de fusión

LMA con t(15;17) (q22;q12)

Inv (16) y t (16;16) (p13;q22) CBFβ-MYH11

Incidencia: 12% de todas las LMA Morfológicamente:

• Diferenciación granulocítica y monocítica• Presencia de población EF anormal en MO• Ocasionalmente sin eosinofilia

90% se clasifican como LMA M4Eo

Pronóstico favorable:↑ tasas de RC y SLE con QT (ARA-C ↑ dosis)

Proteína de fusión (CBFβ-MYH11)

- 16p: Se han descrito 10 transcritosdiferentes, el más frecuente es eltipo A (88%)- Parece ↓ la cantidad de CBF activo ycompetir contra él, dando unaacumulación de multímeros CBFβ-MYH11/CBFα en el núcleo

Cr. 16q22: gen del factor-β (CBFβ)Cr. 16p13: cadena pesada de la miosina (MYH11)

CBFβ/MYH11

LMA con alteraciones de 11q23 (MLL)

• Incidencia: 5-6% de todas las LMA• Involucrado en proliferación, supervivencia y

diferenciación de célula madre hematopoyéticapluripotencial

• Reordenado en LMA de novo, LMA secundaria y LLA• Pronóstico adverso / controvertido• Más frecuente en:

NiñosLMA 2arias a tratamiento con inhibidores de la

topoisomerasa II• Morfología:

Diferenciación mielomonocítica o monocítica(M4-M5)

FABt(4;11) M4t(6;11) M4/M5t(9;11) M5at(10;11) M5at(11;19)/MLL-ELL M4t(11;19)/MLL-ENL M4/M5a

t(9;11) (p21;q23)

LA MÁS FRECUENTE

73 translocaciones y 54 genes

Grupo de riesgo Alteración genética Supervivencia5 años Recaída

Favorable t(8;21), t(15;17), inv(16) 70% 33%

IntermedioNormal, +8, +21, +22, del(7q), del(9q),Reordenamientos MLLOtras anomalías numéricas y/o estructurales

48% 50%

Desfavorable -5, -7, inv(3)/t(3;3), Cariotipos complejos (≥3alteraciones), t(6;9) 15% 78%

Estratificación pronóstica de las LMAs

Brunning RD, et al.: Acute myeloid leukaemia with recurrent genetic abnormalities. In: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, et al.,eds.: Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon, France: IARC Press, 2008. WorldHealth Organization Classification of Tumours, 3, pp 81-7. s

Las alteraciones citogenéticas definen el subtipo de LMAsy la estrategia terapéutica de los pacientes

LMA cariotipo normal: Estudio de mutaciones génicas

Mrozek et al, Blood. 2007;109:431-448Schlenk et al, N Engl J Med 2008;358:1909-1918

Mutaciones en CEBPA, Significado clínico:•Sólo en pacientes con cariotipo normal, sin FLT3-ITD ni mutaciones en NPM1.

Gen Incidencia ImpactoLMA-CN pronóstico

FLT3-ITD 45% AdversoNPM1 46-62% FavorableCEBPA 15-19% Favorable

Citogenética en SMD

Lee GR, et al. Wintrobe’s clinical haematology:Volume 1. 10th Ed. Baltimore: Williams &Wilkins, 1999:145-69.

Anemia Trombocitopenia Neutropenia

Multipotent stem cells

Lymphoid stem cellsMyeloid stem cells

Erytrocytes

Megakaryoblast Myeloblast

ThrombocytesB lymphocytedeveloping

in bone marrow

T lymphocytedevelopingin thymus

Erytroblast

Basophil Eosinophil Neutrophil Monocyte

Citopenias

Anomalías cromosómicas más frecuentes en SMD

FISH: no reemplaza cariotipo.

Indicación imprescindible: aldiagnóstico, escasas o nulasmetafases o cromosomas de pobrecalidad.

Tejido de elección: MO (SP siblastos 10-20%)

Núcleos a examinar por FISH:200

Sondas imprescindibles: 5p15;5q31; cen7; 7q31, cen8

Sondas opcionales: 20q;p53(17p13); cromosoma Y

Haase D et al. Blood 2005;106:232a

Riesgo favorable: del(5q), del(20q), -YRiesgo intermedio: +8, del(7q)Riesgo adverso: -5, -7, cariotipos complejos

SMD con del(5q): Lenalidomida

Fenaux et al. Blood 2011;118:3765–3776.

CORREGIR LAS CITOPENIASDisminuir o evitar las trasfusiones

Disminuir las infeccionesDisminuir las hemorragias

Mejorar Calidad de Vida Aumentar la Supervivencia

Lenalidomida en 5q-Las alteraciones citogenéticas en SMD definen el

pronóstico y tratamiento de los pacientes

Alteraciones cromosómicas en LLA-B

T. Szczepanski, et al. Lancet Oncology, 2010; 11:880-889

Alteraciones cromosómicas en LLA-B

T. Szczepanski, et al. Lancet Oncology, 2010; 11:880-889

Las alteraciones cromosómicas en LLA-B marcan el protocolo de tratamientoen función del pronostico citogenético de los pacientes.

Leucemia linfática crónica

D13S25

Cr. 12

La del(13q) es la alteraciónmás frecuente en la LLC

Leucemia linfática crónica

Del(11)(q21)

ATM

P53

del(17p)

La pérdida de ATM se asocia con- Edad joven- Masas ganglionares- Mala respuesta a fludarabina- Mal pronóstico

(n=325)

Del(13q)

Meses

Del(11q)

+12

Del(17p)

36 72 108 144 180

20

40

60

80

100

00

Lancet Oncol. 2015 Feb;16(2):169-76. Döhner et al N Engl J Med 2000; 343: 1910

SUPERVIVENCIA Y CITOGENÉTICA

Leucemia linfática crónica

P<0.001

Las alteraciones citogenéticas en LLC definen el pronóstico de los pacientes

Mieloma múltiple

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20 21 22 X

Anomalías numéricas en el MMTrisomías

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131415 16 17 18 19 20 21 22 X Y

Monosomías

p

q

Anomalías estructurales en el MM

Todos los MM tienen alteraciones genéticas

Gutiérrez et al, Haematologica 2000 y Leukemia 2001

del(13q)

Evolución clonal en Mieloma múltiple

“Acquired genetic events collaborate withinitiating events to drive disease progression”

Morgan et al, Nature Reviews in Cancer 2011

(50%)(50%)

Mieloma múltiple

Alteraciones primarias

IGH Translocaciones (50%)• t(11;14) CCND1 (20%)• t(4;14) FGFR3 (15%)• t(6;14) CCND3 (4%)• t(14;16) MAF (4%)• t(14;20) MAFB

Hiperdiploidia (50%)• Trisomías de los cromosomas3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 21

Alteraciones secundariasDeleciones• Deleción 1p (20%) CDKN2C,• Deleción 6q (33%)• Deleción 8p (25%)• Deleción 13q (44%) RB1, DIS3• Deleción 11q (7%) BIRC2/BIRC3• Deleción 14q (38%) TRAF3• Deleción 16q (35%) WWOX• Deleción 17p (8%) TP53

Ganancias+1q (40%) CKS1B, ANP32E

Iniciación Progresión

Alteracionesinnatas

2p DNMT3a3p JPO27p ULK4

Morgan et al, Nature Reviews in Cancer 2011

Mieloma múltiple

t(4;14)(p16;q32) del(17p13.1) (P53)

t(4;14) (n=29)

No t(4;14) (n=231)

P<0.0001

Ove

rall

surv

ival

120100806040200

100

80

60

40

20

0

P53 normal (n=238)

Deleción P53 (n=22)

P<0.0001

100

80

60

40

20

0

806040200 100Gutierrez NC et al. Leukemia 2007, Walker et Blood 2010

Blood. 2015 Jan 9. pii: blood-2014-11-612069.

del(1p32) +1q21 (CKS1B)

Linfoma de células del manto

t(11;14)(q14;q32)

Paneles de utilidad para linfomas

2524232221

161514131211.2

11.2121314.114.32122232431

32

3334353637

2

ALK2625242322

21

1413

12

11.213.1

2122

242526.126.2

272829

13.3

23

3

BCL6

23222112

11.211.2121321.121.221.3

22

23

824

131211.211.2121321

222324

31

32

14IgH

11.2

15

141312

12

1314

2122

232425

11

CCND1API2 21

11.311.2

11.2

12

2223

18

BCL2MALT1

ALK split

BCL6 split

c-MYC/IgH fusion

BCL2/IgH fusion

MALT1/API2 fusion

CCND1/IgH fusion

2524232221

161514131211.2

11.2121314.114.32122232431

32

3334353637

2

ALK2524232221

161514131211.2

11.2121314.114.32122232431

32

3334353637

2

ALK2625242322

21

1413

12

11.213.1

2122

242526.126.2

272829

13.3

23

3

BCL6

2625242322

21

1413

12

11.213.1

2122

242526.126.2

272829

13.3

23

3

BCL6

23222112

11.211.2121321.121.221.3

22

23

824 MYC

131211.211.2121321

222324

31

32

14IgH

11.2

15

141312

12

1314

2122

232425

11

API2 21

11.311.2

11.2

12

2223

18

BCL2MALT1

ALK split

BCL6 split

c-MYC/IgH fusion

BCL2/IgH fusion

MALT1/API2 fusion

CCND1/IgH fusion

ALK split

BCL6 split

c-MYC/IgH fusion

BCL2/IgH fusion

MALT1/API2 fusion

CCND1/IgH fusion

Los reordenamientos cromosómicos contribuyenal diagnóstico diferencial de linfomas

Conclusiones

-La FISH es especialmente útil para la identificación deanomalías estructurales como la t(12;21), t(8;21), t(8;14),inv(16) y reordenamientos a nivel de 11q23, que pueden pasarinadvertidas cuando se emplea citogenética convencional.

-Las alteraciones citogenéticas contribuyen al diagnóstico(LMAs, LLA y LNH) pronóstico (LMAs, SMD, LLA, y MM) y a laestrategia terapéutica (LMA, SMD, LLA, LLC y MM) depacientes con leucemias y linfomas.

Gracias

Por

Vuestra Atención