TEMA:

TECNOLOGIA DEL ADN

RECOMBINANTE

Blga. Felicita Karina Camargo Paredes

ADN RECOMBINANTE

• Un ADN recombinante esta formado por la unión de moléculas heterólogas.

• Hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos de ADN que no se encuentra juntas de manera natural. Es decir se produce por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.

ADN RECOMBINANTE

Esta tecnología se utiliza en la investigación básica y en el desarrollo y producción de vacunas, de proteínas terapéuticas, y de plantas y animales modificados genéticamente.

PROTEINA TERAPEUTICA

Dolly», es la consecuencia de los experimentos efectuados sobre clonación que, en definitiva, trataban de conseguir la producción de animales transgénicos capaces de segregar proteínas en la leche o en la sangre con fines terapéuticos .

COMPONENTES

1. ENZIMAS DE RESTRICCION

• Es la piedra angular de la tecnología del ADN Recombinante, se denomina Endonucleasas de restricción.

• Estas enzimas se aíslan de bacterias, su nombre se debe a que limitan o previenen las infecciones víricas, degradando el acido nucleico invasor.

• Las enzimas de restricción reconoce una secuencia especifica de nucleótidos (sitio de restricción) de una molécula de ADN de doble cadena, y corta por una secuencia palindrómica.

ACCION DE LA ENZIMA DE RESTRICCION

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción.

Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

ACCION DE LA ENZIMA DE RESTRICCION

Secuencia palindrómica

Las enzimas de restricción pueden ser:

• La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli

• La enzima Hin dII proviene de Hemophilus influenzae

• Las endonucleasas de restricción de los tipos I y III no son útiles para la clonación de genes porque cortan el ADN por puntos distintos al de reconocimiento es decir da corte aleatorio.

• Las enzimas tipo II se usan ampliamente puesto que hacen cortes en sitios específicos.

• Otras enzimas de restricción de tipo II, como SmaI, corta el ADN formando fragmentos romos, estos, primero deben modificarse mediante la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal, para adicionar “colas” de nucleótidos.

2. VECTORES

Son moléculas de ADN transportadoras. Gracias a un vector, un segmento de ADN puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse.

Los vectores pueden ser: Plásmidos, Bacteriófagos y Cósmidos.

CONDICIONES PARA SER UTILIZADO COMO VECTOR:•Tamaño pequeño de 3 kb.•Carecer del gen mob. La movilidad in vivo de un plásmido

requiere del gen mob y del sitio nic.•Exprese marcadores fenotípicos o de selección.•Secuencias de DNA que pueden ser sustituidas por DNA exógeno. •Llevar sitios de policlonaje (polilinker).

PLASMIDOS• Es una molécula de ADN circular,

extracromosómica, que a menudo lleva información genética.

• Se autorreplican.

• Se encuentran en bacterias y levaduras.

• Algunos codifica resistencia a antibióticos,

a metales, producen toxinas, entre otros.

• Reciben en promedio insertos de 5 kb.

Paso 1

Paso 2

Paso 3

PLASMIDO

BACTERIOFAGO (FAGO)

Es un virus que afecta a una bacteria.

BACTERIOFAGOS O FAGOS

• Entre ellos el fago Lambda .

• DNA de doble cadena, lineal.

• Tamaño de 48.5 kb.

• Recibe tamaños de insertos de 18 a

25 kb.

• Poseen sitios de reconocimiento

donde se inserta el DNA exógeno.

• El empaquetamiento se realiza in

vitro.

Fago + DNA foráneo

CÓSMIDO

• Es un vector diseñado para permitir la clonación de segmentos largos de ADN foráneo. Los cósmidos son híbridos formados por sitios del fago lambda (bactereofagos ) insertados en plásmidos.• Plasmidio + secuencia cos del Fago = COSMIDO• Tamaño de 5 kb.• Creados para clonar fragmentos largos de DNA.• Recibe tamaño de insertos entre 40 y 45 kb.

CÓSMIDO

3. FRAGMENTO DE ADN O ADN FORANEO

• Es el ADN que se va a clonar, es decir aislar, amplificar, secuenciar y expresar.

4. ADN LIGASA

Es la enzima que sella el hueco uniendo covalentemente las dos cadenas.

5. CÉLULA HUÉSPED

Es una bacteria, como Escherichia coli. Se utilizan como huésped ya que están bien caracterizadas genéticamente y pueden aceptar un amplio espectro de vectores (plásmidos, fagos y cósmidos)

PROCEDIMIENTO DE CLONACIÓN DE ADN EN E. COLI

1. Aislar el ADN que se va a clonar y tratarlo con una enzima de restricción para crear fragmentos que acaben en secuencias específicas.

2. Ligar los fragmentos obtenidos a moléculas de plásmidos que han sido cortados con la misma enzima de restricción, obteniéndose un vector recombinante.

3. Transferir el vector recombinante a células huésped bacterianas

4. Hacer crecer la célula huésped en una placa de cultivo donde formara colonias.

Las células de cada una de las colonias provienen de una célula inicial, por lo tanto todas las células de la colonia y los plásmidos que contienen, son genéticamente idénticas, a esto se les denomina clones.

TAREATRADUCIR EL SIGUIENTE DIAGRAMA

DIAGRAMA DE CROMOSOMAS HUMANOS

MUCHAS GRACIAS...