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8/13/2019 Tecnologa del ADN
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Curso: Biologa Celular y MolecularOscar Nolasco Crdenas MSc.
oscarnol@hotmail.comDiciembre 2013
Tecnologa del DNA
recombinante
mailto:oscarnol@hotmail.commailto:oscarnol@hotmail.com8/13/2019 Tecnologa del ADN
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Dos importantes enzimas en la generacin deDNA recombinate
Enzimas de restriccin:
Corta el DNA de un organismo en una secuenciaespecifica.
DNA Ligasas:
Une fragmentos de DNA produciendo DNA
recombinates.
DNA recombinante: Es el DNA compuesto porsegmentos de DNA de diferentes orgenes
Tecnologa del DNA recombinante
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5` G A A T T C 3`
Enzima de restriccin: EcoRI
3` C T T A A G 5`
Corte
5` G A A T TC 3`
3` C T T A A G 5`
ExtremoscohesivosDNA Ligasas
3` T T A A P
5` OH
+
3` T T A A P5`OH
3` C G P5` OH
3` T A C G P5` OH
A
C
B
Unin por
complementaridadde pares de bases
5` A A T T 3`
3` T T A A 5`
OH
P P
OH
+FragmentosB y C noapareados
5` A A T T 3`
3` T T A A 5`
DNAligasas
Mecanismo paracortar y unir DNA
Enzima derestriccin
Secuencia de reconocimientopalindrome
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ClonacinGenerar copias idnticas de un organismo,
clulas o secuencias de cidos nucleicos de un
organismoLa oveja Dolly Genes clonados
Involucra la intervencin humana.
Origina una nueva generacin
Tecnologa desarrollada para clonar genes
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Elementos necesarios para una clonacinde secuencias
Vector
segmento de DNA con propiedad de replicarse y serfuncional dentro de un organismo. Posee un
segmento de seleccin (antibitico) y otro de insercin
de un DNA forneo
Plasmidos, bacteriofagos,adenovirus, baculovirus,
El hospedero celular
organismo que sirve para albergar al vector y su
inserto.
E.coli, levadura, celulas humanas, celulas insecto
Secuencia a insertar INSERTO
segmento de DNA de inters que queremos reproduciry/o expresar. Ejm. un segmento de genoma, gen,
cDNA, etc.
VectorPlasmido
Fragmento deDNA para ser
clonado
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VectorPlasmido
+FragmentoDNA a serclonado
El vector escortado yligado alinserto
PlasmidoRecombinante
Transformacinde E.coli(CaCl2, electroporacin)
Cultivadas en placasconteniendo ampicilina
Las clulas queno tienen elplasmido
mueren enplacas conampicilina
Las clulastransformadas
son las quesobreviven
CromosomaBacteriano
El plasmidotiene una
replicacinindependiente
Multiplicacincelular
Amp R.
Amp R.
ORI
ORI
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Bacteriofagos Permite insertos de 20 30 kb
Lambda es el bacteriofago comnmente empleado
Presenta mayor eficiencia en transformar clulas en comparacin a los plasmidos
Cosmidos Permite la insercin de 40 Kb
Los cosmidos combinan los elementos esenciales de un plasmido y un bacteriofago
Bacterial Artificial Chromosomes BACs)
BACs permiten la insercin de 300 kbs. El factor F de E.coli es capaz de mantener fragmentos largos de DNA.
YACs permiten la insercin de 300-500 kbs.
YACs : un centromero de levadura con dos telomeros de levadura. Un origen dereplicacion bacteriano marcadores de seleccion.
YAC plasmidoCromosoma de levadura
Yeast Artificial Chromosomes YACs)
Plasmidos Permite insertos menores de 10 kb
Existen una gran variedad de plasmidos y son la base del desarrollo de los otrossistemas de clonacin
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Multiple cloning site (Polylinker)
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Blue/White Seleccin
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Bibliotecas de DNA:
Colleccin de secuencias diferentes de DNA deun organismo cada cual ha sido clonada en unvector para su purificacin, almacenamiento y
analisisBibliotecas genomicas
Bibliotecas de expresin o de cDNA
Bibliotecas de DNA
(Hechas a partir de DNA
Genomico total o de cromosomas )
Usos secuenciamiento
anlisis de secuencias
(Hechas de cDNA- copia de mRNA)
Usos anlisis de protenas
Expresin de genes, los vectores para esta finalidad
tienen que tener un promotor fuerte de expresion
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1 pgina 3000 letras1 libro grande milpginas
3 millones letras
Genoma completo (23 pares decromosomas) alrededor de mil libros-3,200 millones de letras, 1 milln depginas.
1 cromosoma promedio, equivalentea 30 libros grandes (30,000 pginas,100 milllones de letras, 700 genes).
Demasiado grande
Necesidad de DNA recombinante:Banco genmico: Genoma compiladoen coleccin de 30,000 separatas de
30-50 pginas. Cada uno con espaciopara uno o pocos genes. Permiteanlisis detallado de cualquier lugardel genoma. Facilita identificacin degenes y marcadores.
Complejidad del genoma y banco genmico
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BAC plsmido secuencia
Clonacin de cromosoma en diferentes clones
a diferentes escalas segn su tamao
33,000 clones BAC por
juego haploide (entre 5-
7X veces el tamao
completo de DNA)
para cubrir 95-98%
genoma
Separatas pginas prrafos
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Digestin Parcial
EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR IEcoR I
Digestin Completa
Alta concentracin de la enzima
Digestion IncompletaBaja concentracin de la enzima
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EcoR I Digestion Parcial
Biblioteca Genomica
Celulas infectadas
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Miles de clones
BACs en placas
Petri
Trasladadas a placas de
microarreglos (microarrays)
4 arreglos de 384 (16X24) BACs
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Bibliotecas de expresinAislacin de mRNA
La mayora de mRNAs eucariotes son
poliadenilados en el 3
Oligo (dT) pueden enlazarse a poli(A) ypueden usarse para recuperar mRNA.
AAAAAAAAAAn5 cap
Porque expresar?
Cuando el producto de la secuencia clonada esuna protena.
La identificacin de un gen en una libreria obiblioteca requiere de su expresin.
Para sobreproducir una protena y purificarla.
Para estudios in vivo de la protena.
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Identificacin del producto proteicodel gen de interes
1. Actividad de la protena2. Western blotting empleando un
anticuerpo especifico
Screening por Expresin
Sintesis de cDNA :
Sintesis de la primera hebra:transcriptasa reversa
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Screening o buscado unaclona recombinante enuna biblioteca de cDNA
con un anticuerpo comosonda
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Algunas protenas recombinantes ensalud humana
Insulina Diabetis
Interfern Alfa Cancer
Interleukinas Cancer
Factores VIII, IX de coagulacin Activador tisular del plasmingeno
Hormona del crecimiento HGH Dwarfism Estatura corta
Vacunas (anticuerpos y antgenos) Herpes,Hepatitis B vacuna
Malaria
AIDS
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Animales transgnicos Animales que portan genes o secuencias de
DNAexgeno, introducidos por intervencinhumana (Ejm. ratones con insulina humana).
Procedimiento: microinyeccin de ovocitos (lentoe ineficaz para incorporar el DNA)
Son utilizados para generar Modelos animales:comportamiento de un gen in vivo
Son utilizados como animales bioreactores:Como produccin de leche con proteinasadicionales.
Posibilidad de uso en xenotransplantes Mas difcil que procariotes pero expresin mas
correcta: splicing, glicosilacin, pptido seal,etc.
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Mtodos de transferencia de genes Microinyeccion directa Mediada por virus Embrionica stem cells Transferencia Nuclear
Sperm-mediated gene transfer Transferencia de genes mediante
cromosomas artificiales
Transgenesis in Mice
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Transgenesis in Mice
Microinjection
Transgenesis in Mice
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Transgenesis in Mice
Retroviral Vector
E b i i t ll
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Embrionicas stem cells
Derivada del embrion en estado de blastocito
Dividida in vitro indefinidamente sin diferenciacion
Pueden ser transfectados con transgenes o conremosion de genes (knockout)
T f i l
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Transferencia nuclear
Dolly 1997
Las clulas somticas pueden ser
transfectadas o geneticamente alteradasantes de la transferencia nuclear
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Biorreactores de protenas humanas
(No en bacterias porque no
realizan modificaciones
postranscripcionales nipostraduccionales)
Cabra transgnica con TPA humano
(tissue plasminogen activator) en leche
Transgnico con lactoferrina humana
Bi f tifi i
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GOLDEN RICE Arroz fuente de alimento para mayorparte de pases pobres de Asia y
frica Falta Vitam. A: Ceguera y
problemas corneales hasta 40%poblacin
Vitamina A se encuentra en cscaray partes verdes ; pero no en grano
Golden rice: arroz transgnico conVit A en granos, meta dosis diariade Vit A en un plato: conseguida
(150ug/100g arroz) Profesores Peter Beyer (U. Freiburg,
Alemania) e Ingo Portrykus (Inst Tec.Fed Suiza), con compaa Syngenta(patentado), donacin a pases endesarrollo.
Biofortificacin
G
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46 cromosomas: 22 pares autosomas + XX/XY
3.2 X 109pares de bases (bp) haploide
Menos de 25,000 genes traducidos a protenas (vs 120,000 a 70,000inicial). Drosophila 14,000, C. elegans 18,000
Humanos: ms de 300,000 protenas. Genes segmentados => Splicingalternativo: 1 gen varias protenas segn el tejido
Catlogo de genes humanos y sus secuencias para genes candidatos a
enfermedades. Inmensas cantidades de secuencias repetidas (40% del total), muchas
polimrficas. Ejm. Alu (cicatriz de transposones), microsatlites.
Desarrollo de databases genmicas y de expresin en otras especies,acceso libre Internet.
Logros Genmica => transcriptoma, protema, metaboloma. Evolucion entre organismos Modelos: bacterias, levaduras, Arabidopsis, drosophila, ratn. Correlacin de SNPs con los estados de salud y enfermedad Susceptibilidad y prediccin de enfermedades
Genoma Humano
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Mitocondrial:
1 cromosoma circular X 100s
16, 569 bp
37 genes: 13 prot, tRNAs
Enfermedades raras neurodegenerativas,
musculares y pticas Enfermedades degenerativas comunes:
diabetes, Alzheimer, cncer
Genoma Mitocondrial
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Identidad 99.9% => 0.1% variabilidad (3 millones de bases)
Variabilidad en casi todos los genes y regiones -5 millones de mutacionespuntuales polimrficas (SNPs) hasta ahora.
Miles de marcadores genticos en todas las regiones cromosmicas (facilitaestudio de mapeo de genes y diagnstico en familias y en poblaciones)
Algunos genes inactivos o ausentes en individuos normales: CCR5
Otros genes duplicados: CYP2D6 (40% de frmacos)
Inters por poblaciones no estudiadas previamente (ejm. Sudamericanas)
Variabilidad del GenomaHumano
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Identificacin de genes causales de enfermedades3, 500 - 5, 000 enfermedades hereditarias, estadosprevios asintomticos, intermedios, alternativos
Conocimiento de procesos normales y enfermedades.Reconsideracin conceptual de enfermedades raras,
comunes, propensiones Tests de diagnstico (comparacin de genes normalesvs afectados)
Anlisis del material gentico para factores de riesgo Prevencin (multifactoriales)
Conocimiento de protenas Protenas recombinantes Farmacoterapia molecular Farmacogentica
Terapia gnica
Aplicacin Prctica
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Diagnstico Molecular
Caracterizacin de mutaciones causales engenes o marcadores asociados aenfermedades.
Diagnstico en pacientes, prenatal(microvillosidades corinicas 8-11 sem,amniocentesis 12-18 sem), presintomtico,preimplantacional.
Sirve para determinar la enfermedad:pronstico, prevencin, tratamiento, terapia,consejo gentico en posibles portadores, etc.
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TECNOLOGIAS DE DIAGNOSTICO Tecnologas de diagnostico basadas en
cidos nucleicos (NAT)
Tecnologas de diagnostico NO basadasen NAT
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Tecnologas de diagnosticobasadas en cidos nucleicos
(NAT) PCR: Mtodos basados en amplificacin
FISH : Mtodos basados en hibridacin
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http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html
Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chainreaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
Kary Mul l is 1983
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Tcnica desarrollada por el Premio Nobel Kary Mullis
Basada en el descubrimiento de la actividad biolgica a altastemperaturas de las DNA polimerasas encontradas enbacterias termfilas.
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PCR - Aplicaciones
clonacin
secuenciacin
diagnstico Mutagnesis sitio-dirigida
Anlisis de mutaciones
Cuantificacin de diferencias en expresin gnica (RT-
PCR) Pruebas de paternidad
Anlisis forense
Control de calidad a nivel industrial
La tcnica de PCR es una herramienta esencial dentro de labiologa molecular:
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PCR: Mtodos basados enamplificacin
Pruebas de amplio rango genes altamenteconservados y polimrficos: GenesRibosomales
Pruebas mltiples que permiten ladeteccin paralela de especies
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De PCR clsico a PCR en tiempo realbasado en la deteccin de fluorescencia.
Mayor robustez del sistema, menos
laboriosa, menos contaminacin. Cuantificacin relativa y absoluta PCR en tiempo real son mas costosas y
los sistemas todava no alcanzan sudesarrollado para su masificacin.Presencia de inhibidores en la muestra
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Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp.Kathy A. Mangold,1,2 Rebecca U. Manson,2 Evelyn S. C. Koay,3,4 LindseyStephens,1
MaryAnn Regner,1 Richard B. Thomson, Jr.,1,2 Lance R. Peterson,1,2and Karen L. Kaul1,2*JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2005, p. 24352440 Vol. 43, No. 5
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Xpert MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular
diagnostic for
tuberculosis and rifampicin resistance. Stephen D Lawnand Mark P Nicol
o os asa os en
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o os asa os enhibridacin
PNA FISH Evolucin de una sonda de nucletidos a una
sonda de acido nucleico peptdico PNA es unoligomero sinttico que imita la estructura del DNA
o el RNA, la carga negativa del esqueleto azcarfosfato es remplazada por una molcula sin cargaN-(2 aminoetil) glicina al cual se une la basenitrogenada por un enlace metilen carbonil
Son menos susceptibles de inhibicin por
impurezas en diferentes muestras clnicas acomparacin de los mtodos basados enamplificacin
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Tecnologas de diagnostico NObasadas en NAT
Uso de anticuerpos Uso de bacteriofagos (MicroPhage)
Herramientas de proteomica:
matrix-assisted laser desorptionionizationtime-offlight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
SECUENCIAMIENTO DE ADN
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Dos Mtodos desarrollados a fines de los70s: Mtodo Qumico Maxam y Gilbert
Mtodo Enzimtico Sanger de anlisis postreaccin
Ambos basados en la obtencin de molculas conterminaciones en A, G, C y T; para separar estosfragmentos en geles de poliacrilamida denaturantes.
Determinar el ordenamiento de los nucletidosen un fragmento de ADN
SECUENCIAMIENTO DE ADN
Radioactividad
l d
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reemplazado a
partir de
1987
Dideoxinucleotidos
marcados
fluorescentemente
Diciembre 2000
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Diciembre 2000
Un consorcio internacional completa el secuenciamiento del genoma de laprimera plantaArabidopsis thalianade125 Mb.
Febrero 2001El consorcio HGP publica su borrador en Nature(15 Febrero), y Celera lopublica en Science(16 Febrero)
Nuevos mtodos de secuenciamiento
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Nuevos mtodos de secuenciamientoPirosecuenciamiento
Secuenciamiento Masivo permite
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Centrifuge Step
Load Enzyme
Beads
44 m
Load beads into
PicoTiterPlate
Secuenciamiento Masivo permiteobtener genomas en menor tiempo
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MICROARRAYS
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