Post on 28-Dec-2015
DISCIPLINAS POST-GENÓMICAS
APLICADAS AL ESTUDIO DE
INTERACCIONES HOSPEDANTE –
PATÓGENO: ANALISIS INTEGRADO
TRANSCRIPTÓMICA Y METABOLÓMICA
PARTE II
Ruth Heinz
Instituto de Biotecnología
INTA Castelar
TRANSCRPTOMICA
MICROARREGLOS
Ventajas:
• tecnología madura, con años de análisis y validaciones
• Procesamiento y comparación simultánea de muchas
muestras en paralelo
• Han sido extensamente estudiados en interacciones H-P
Desventajas:
• Limitados a identificar transcriptos de genes conocidos
• Background puede ser alto por señales inespecíficas
• Señal saturada a altos niveles de expresión génica
TRANSCRIPTÓMICA POR RNA-seq
Se han generado ESTs de 18 especies de
hongos fitopatógeno y 2 Oomicetes,
Estas bases no son completas, no sirven para
análisis cuantitativos.
NGS de segunda y tercera generación estan
empezando a revertir esas falencias
principalmente en hongos.
Genoma de referencia:
• Se mapean las lecturas sobre el genoma de referencia, utilizando programas de detección de sitios de splicing.
• Se pierden sitios no canónicos comunes en plantas, hongos, oomicetes
Sin genoma de referencia
• Ensamblado “de novo”.
• Bioinformaticamente mas complejo que secuenciación Genómica “de novo” .
• Requiere normalización de colecciones ADNc antes de la secuenciación masiva
TRANSCRPTOMICA POR RNA-seq
EJEMPLOS DE TRANSCRIPTOMICA EN
FITOPATÓGENOS
P. syringae pathovar tomato strain DC3000,
• RNASeq por Illumina GA2
• 30 milliones de lecturas de 32 nucleotidos
• Comparación con genoma de referencia arrojaron algunas discrepancias
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)
• dRNA-seq (enriquecimiento en secuencias 5’) y 454 seq, permitió identificar sRNA implicados en el proceso de virulencia.
Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 5
EJEMPLOS DE TRANSCRIPTOMICA EN EL
ESTUDIO DE RELACIÓN H-P
Journal of Pathogens
Volume 2011, Article ID 716041, 11 pages
Ploplar Melampsora larici-populina: LCM – 454 pirosecuenciación
IDENTIFICACION DE FACTOR Avr Ve1 EN
Verticilliun dahliae POR RNA-SEQ
5110–5115 | PNAS | March 27, 2012 | vol. 109 |
no. 13
Estrategia de secuenciación genómica de
variantes y RNA seq por ILLUMINA para la
identificación del Factor de Avr Ve1 de
Verticillium dahliae que interactua con el gen R
Ve1 de tomate.
METABOLÓMICA
• Disciplina postgenómica que permite analizar cambios en metabolitos originados por cambios a nivel genético, transcriptómico o proteómico
• Permite evaluar el efecto de un transgene en el metabolismo primario y secundario
• Recientemente se ha difundido el uso de varias estrategias de análisis de metabolitos para el estudio de la respuesta de plantas a patógenos, plagas y estreses abióticos
VENTAJAS Y LIMITANTES DE LA METABOLOMICA
Ventajas
Dado que los metabolitos constituyen el producto final de la
expresión de los genes, el estudio cuali y cuantitativo de la
composición metabólica de un organismo permite identificar la
función de muchos genes.
Permite conocer el estado metabólico de un organismo
La metabolómica constituye la herramienta más informativa a
nivel funcional entre todas las tecnologías ‘omicas’
Limitantes
Incapacidad de estudiar el exhaustivamente todo el metabolismo
limitaciones técnicas, complejidad química del metabolismo, variabilidad de los organismos.
TECNOLOGÍAS UTILIZADAS PARA ESTUDIOS
METABÓLICOS
Para obtener un perfil metabólico completo, es necesario el uso de
diferentes tecnologías:
• IR Espectroscopía Infrarroja
• FTIR Espectroscopía Infrarroja con Transformación de Fourier
• NMR Resonancia Magnética Nuclear
• EC Electroforesis Capilar
• TLC Cromatografía en capa delgada
• GC Cromatografía Gaseosa
• HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución
• Cromatografías acopladas a Espectrometría de Masa (CG-MS, LC-MS,
UPLC-MS)
• Cromatografías acopladas a Espectrometría en Tándem (LC/MS/MS, etc)
LA ELECCIÓN DE LA TÉCNICA CORRECTA ES UN COMPROMISO ENTRE
RAPIDEZ, SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD, DEPENDIENDO DEL
OBJETIVO DE ESTUDIO
METABOLÓMICA EN PLANTAS
• Metabolitos identificados en el reino vegetal: 100-
200.000 correspondientes a metabolismo primario y
secundario
• Técnicas que permiten realizar un “fingerprinting”:
detección masiva de metabolitos en una muestra sin
identificación
• Técnicas de análisis de perfiles: detección,
cuantificación e identificación de metabolitos
ESTRATEGIAS DE ANÁLISIS
METABOLÓMICO
GC-MS: separación por cromatografía (GC or LC) acoplada a espectrometría de
masa (MS). Compuestos termo estables y volátiles, polares y no polares
ESI-MS: infusión directa por electrospray - MS . Para fingerprinting. Requiere
validación posterior para identificación
NMR (menor sensibilidad que GC) , Fourier transform (FT)-IR spectroscopy
LC-MS: para metabolitos secundarios, de mayor tamaño
CRONOLOGÍA DE ESTUDIO DE METABOLÓMICA EN RELACIONES
HOSPEDANTE-PATÓGENO
(__)General MS profiling (gene function analysis/physiological analysis/development/ protocols); (__ ), plant–host studies; (__ ),
FT-IR fingerprinting; (__ ), NMR fingerprinting/profiling. Allwood et al.. Physiol. Plantarum 132: 117–135. 2008
Estudios de perfiles metabólicos GC-MS
Metabolismo primario: •Aminoacidos •Azúcares •Alcoholes •Acidos organicos •Acidos grasos Metabolismo secundario: alcaloides, fenilpropanos, terpenos,
Estudios de perfiles metabólicos por GC-MS
Agente
Metabolómica de la respuesta de girasol al patógeno Sclerotinia sclerotiorum
Antecedentes
Agente Causal:
• Sclerotinia sclerotiorum (necrotrófico)
Factores de patogenicidad:
• Ácido oxálico • Enzimas hidrolíticas (poligalacturonasas)
Síntomas de la enfermedad:
• Maceración de tejidos del capítulo • Formación de esclerocios
Análisis transcriptómico y metabolómico:
resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en girasol
Material Vegetal
Días post-inoculación
Estadio reproductivo
D0 D2 D4 D12
R5.2 R5.6 R5.8 R6
Extracción muestras de tejido objeto (incluyendo un estandar de masa y un
estandar de tiempo de corrida)
Derivatización
Inyección en GC-MS. se inyectaron 2 volúmenes (100 y 200 ml)
debido a la alta concentración de los
azucares.
Estudios de perfiles metabólicos
IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS
Cromatogramas iónicos totales obtenidos por la técnica de GC-MS de extractos de frutos de tomate (A), de flores de girasol (B) y de una mezcla estequiométrica de extractos de frutos de tomate y flores de girasol (C).
RUTAS METABÓLICAS INVOLUCRADAS EN LA RESPUESTA AL
S.CLEROTIORUM
Peluffo et al. 2010, Phytochemistry 71: 70-80
Se identificaron 63 metabolitos
en flores de girasol y se
cuantificaron 50 por GC-MS
Se identificaron metabolitos cuyo perfil
varia significativamente en respuesta
al patógeno en el genotipo R y S
Se identificaron metabolitos
que permiten discriminar los genotipos
por su respuesta al patógeno
•71 (70–80)
Análisis los niveles en cada genotipo a distintos DPI (ANOVA)
HA89 Susceptible
RHA801 Moderadamente resistente
Análisis los niveles en cada genotipo a distintos DPI (ANOVA)
Azúcares Polioles Int. Fosforilados
Ác. Grasos
Ácidos del TCA
Ácidos Orgánicos Aminoácidos
HA89 (S)
RHA801 (MR)
En el genotipo R:
Cambios significativos
en azucares (trealosa), azúcares
alcoholes (manitol, glicerol),
ácidos grasos(metabolitos TCA)
En el genotipo S:cambios
en niveles de aminoácidos
como prolina
Análisis del complemento metabólico en genotipos
resistentes y susceptibles
Análisis de agrupamiento Análisis correlación entre metabolitos
El complemento metabólico del genotipo R
Se aparta del control sin inocular a 2 y 4DPI,
mientras que para el genotipo S esto ocurre mas tardíamente
El genotipo R presenta una mayor concertación de cambios
metabólicos dentro de ciertas rutas metabólicas como el ciclo
de TCA, asociado a foto respiración. Los intermediarios
de TCA aumentan significativamente a los 2 y 4 DPI,
y luego disminuye, en forma concomitante con el aumento de
actividad catalasa en ese periodo
Asociación de los cambios metabólicos con el nivel de susceptibilidad/resistencia
Objetivo: Corroborar si alguno de los cambios detectados en las distintas vías metabólicas
tienen un correlato con las actividades de las enzimas asociadas a dichas vías
DPI 0 1 2 4 1 2 4
Sacarosa Sintasa (nmol UDP-glu . min -1 . mg proteina -1 )HA89 8,590,78 - - 9,340,56 - - 9,420,96
RHA801 7,300,66 - - 10,820,51 - - 9,481,17
Invertasa de Pared celular (µmol azúcares reductores . min-1
. gDW-1
)HA89 2,87010 - - 2,690,02 - - 2,780,06
RHA801 2,750,03 - - 2,350,10 - - 2,410,15
Invertasa citosólica (nmol azúcares reductores . min -1 . mg proteina -1 )HA89 0,510,01 - - 0,200,01 - - 0,280,02
RHA801 0,590,05 - - 0,430,13 - - 0,400,03
Invertasa vacuolar (nmol azúcares reductores . min -1 . mg proteina -1 )HA89 1,130,05 - - 0,500,02 - - 0,670,04
RHA801 1,460,09 - - 0,980,22 - - 1,040,07
Catalasa (Unidades . mg proteina -1 )HA89 3,930,39 5,360,83 4,720,62 4,371,14 3,180,71 5,461,03 4,250,55
RHA801 2,640,64 2,510,32 2,570,27 1,880,22 3,610,61 2,380,32 5,651,21
Fenilalanina ammonio-liase (nmol ácido cinamico . min-1
. µg proteina-1)HA89 1,660,04 0,580,09 1,200,18 0,690,09 0,240,07 0,910,05 0,270,02
RHA801 0,630,01 0,650,05 nd nd 0,340,08 0,110,02 nd
Inoculado con agua (mock ) Inoculado
Enzimas claves del
metabolismo primario del
carbono
Fotorrespiración
Metabolismo de los
fenilpropanoides
De las enzimas evaluadas, la actividad de la catalasa corroboró los cambios metabólicos
Fenilalanina amonio-liasa
ANÁLISIS DE PERFILES TRANSCRIPCIONALES POR QRT-PCR
Y HORMONALES POR LC-ESI-MS/MS
La expresión de genes candidatos con similitud a:
elemento de respuesta a etileno, WRKY7 y quitinasa
se induce en tiempos tempranos post infección en el
genotipo R.
Otros genes como PR5 se detectan en mayores
niveles hacia el 2 y 4 DPI tanto en plantas NI como I;
indicando en este caso que los niveles de este gen no
son inducibles sino pre existentes.
Peluffo 2010, Tesis doctoral
Línea: DPI
El nivel de ácido jasmónico es
superior en flores del genotipo
R respecto del S, en días
tempranos post infección
Los niveles de acido salicílico
fueron mayores en plantas S inoculadas a
partir de 2 DPI, mientras que el genotipo
R no presenta diferencias entre
I y NI y los niveles son muy
inferiores
RHA801 (MR) HA89 (S)
Análisis de perfiles
metabólicos
Construcción de clonotecas
diferenciales y análisis
transcripcionales de genes
candidatos
Análisis de perfiles
hormonales (SA y JA)
Mediante estos análisis se
encontraron diferencias en los
componentes metabólicos que
pudieron ser asociadas al
comportamiento contrastante de
las líneas frente a S.
sclerotiorum.
Fue posible correlacionar cambios en los perfiles
metabólicos con variaciones en los niveles de las fitohormonas
analizadas.
Se encontró una correlación
entre los niveles de estas
fitohormonas y la
susceptibilidad (SA) y
resistencia (JA).
Se identificaron 3 genes
que estarían implicados en
la respuesta de defensa de
la línea de girasol RHA801
(MR) frente a la inoculación
con S. sclerotiorum.
• Se valido la técnica de GC-MS para identificación y cuantificación de metabolitos en capítulos de girasol
• Se detectaron cambios significativos en metabolitos en estadios tempranos del proceso de infección en genotipos con respuesta contrastante al patógeno S. sclerotiorum
• El genotipo R presento cambios en niveles metabólicos significativos en los D 2y D4 post infección
• Los estudios concertados de metabolitos muestran patrones de regulación diferencial en genotipos R y S, presentando el genotipo R mayores interacciones intermódulo, lo que señalaría mayor concertación de determinadas rutas metabólicas
• Alcoholes (ononitol, glicerol, malitol), derivados de pared celular (xilosa, ramnosa, gluconato) carbohidratos como la trealosa.
• Los metabolitos relacionados con la producción de polifenoles (cafeato y clorogenato), presentan mayores cambios en el genotipo S .
• Metabolitos asociados con removilización de N (aumento de prolina) se han detectado en el genotipo S
RESUMEN RESULTADOS CAMBIOS METABÓLICOS CLAVES
ASOCIADOS A LA INTERACCIÓN GIRASOL –SCLEROTINIA
Resistente PI594754 (Rpp1)
Susceptible BRS 184
INFECCIÓN
I
I
NI
NI
V2 o V3 MUESTRAS (6 replicas por muestra)
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección
0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección
Ensayo experimental desarrollado en EMBRAPA Londrina
6 h PI 12 hpi 94 hpi 6 réplicas biológicas
Estudios de perfiles metabólicos por la técnica GC/MS en un sistema de interacción con hongo biótrofo (soja- Phakopsora pachyrhizi )
Determinación del complemento metabólico en hojas de soja en las líneas
BRS 184 (S) PI594754 (R) inoculadas con roya
ANOVA para los niveles en cada
genotipo, tiempos PI y estados
de inoculación (I y MI)
99 metabolitos cuantificables
Análisis de
coordenadas
principales (PCA)
175 metabolitos
Análisis de
correlaciones
y de redes
Resistente PI594754
Susceptible BRS 184
I
NI
• Identificar cambios metabólicos asociados a la respuesta al patógeno
• Identificar rutas metabólicas involucradas en el proceso de resistencia/susceptibilidad
• Contribuir a la identificación de genes candidatos
102 metabolitos cuantificables e identificados
Genotipo R y S
21
Tiempo: 6, 12 y 96 h PI
Tratamiento (I vs NI)
21
1 4
14
3 Shikimato
Análisis de varianza (ANOVA) de perfiles metabólicos diferenciales
Aspartato Glucosa Eritrose Histidina Treitol
0
7 metabolitos interacciones tratamiento 7 metabolitos interacción tiempo*línea 31 metabolitos no mostraron diferencias para ningún factor o interacción
Glutámico Nonadecano Xilulosa
Hexadecane Myo-inositol-2-phosphate
Erytrose Nonadecane Treitol
Análisis de Componentes Principales
Efecto genotipo
R S
Correlaciones línea resistente
(PI594754)
Control: 65 correlaciones significativas Inoculado: 83 correlaciones significativas
Control: 57 correlaciones significativas Inoculado: 47 correlaciones significativas
Correlaciones línea susceptible (BRS 184)
Citrate
Aconitate
Isocitrate
2-oxoglutarate
Succinyl-
CoA
Succinate
Fumarate
Malate
Oxalacetate
Acetil- CoA
Glucose
G6P
F6P
3PGA
PEP
Pyruvate
Glutamat
e
Arginine
Glutamin
e
Pyroglutamate
Ornithine
Prolin
e
ɣ-aminobutyrate
Hydroxyproline
Palmitate
Stearate
Saccharat
e
Shikimate
Quinate
Tryptopha
n
Phenylalanine
Tyrosine Tyramine
Caffeate
Benzoate
Chlorogenate
Glycerate Glycerol Glycerol-
P
Fructose
Mannitol
Sorbos
e
Mannose L-Ascorbate
Dehydroascorbat
e
Galactarate
Threonat
e
Sucros
e
Meiezitose Raffinose
Gluconolacton
e Trehalose
Galactose
Glucose 1-
P Maltose
Ribose
Psicose
Myo-Inositol-1P
Maltitol
Myo-Inositol Ononitol
Xylogluca
n Rhamnogalacturan
Xylose
Fucose
Arabinose
Gluconate
Galacturonic
Glycine Serine
Alani
ne
Valine
Leucine
Aspartate
Homoserine
Threonin
e
Isoleucin
e
Asparagine
Lysine
Glutaric Acid
ß-Alanine
Glycolate
Glyoxylate
Ctrl1 Ctrl2 Ctrl3
WS1 WS2 WS3
-4 0
4
D-Galactono-1,4-lactone
Galactinol
Talose
Urea
Methionine
Pyrroline-2-carboxylate
Malonate
TCA cycle
Nicotinate
Uracil
Nicotiamine
Cystine Cysteine
Histidine
Rhamnose
Lactate
Threitol
Lactulose
2-Coumarate
Cambios metabólicos en plantas asociados a respuestas de
defensa inducidas
Parker et al., (2009)The Plant Journal 59, 723–737
MUCHAS GRACIAS