Post on 29-Jun-2020
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II
ANÁLISIS GENÉTICO Y BIOQUÍMICO DEL CATABOLISMO DEL COLESTEROL EN Mycobacterium smegmatis mc²155
TESIS DOCTORAL
IRIA UHÍA CASTRO Madrid, 2010
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II
ANÁLISIS GENÉTICO Y BIOQUÍMICO DEL CATABOLISMO DEL COLESTEROL EN Mycobacterium smegmatis mc²155
TESIS DOCTORAL
IRIA UHÍA CASTRO
DIRECTORES:
Dra. BEATRIZ GALÁN SICILIA Dr. JOSÉ LUIS GARCÍA LÓPEZ
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
Madrid, 2010
La miro a V. en los ojos, y mis ojos le dicen que soy un pobre
buscador en el mundo, que no comprendo nada de mi destino ni
del de los demás, que he vivido, y pecado, y creado, y que un
día me iré sin haber comprendido nada, en la oscuridad que nos
ha parido a todos.
J. J.
En la Ciencia la única verdad sagrada, es que no hay verdades
sagradas.
Carl Sagan
A mis padres
AGRADECIMIENTOS
Por si cabe alguna duda, sabed que no se podría entender el trabajo acumulado en estas páginas sin este apartado. Una tesis no son sólo las miles de horas pasadas en el laboratorio intentando que salga ese experimento que no te deja dormir, una tesis es también todo el lado humano que está detrás y que te permite dar lo mejor de ti cada día con ilusión a pesar de los tropiezos. Una tesis es todas las experiencias, buenas y malas, dentro y fuera del laboratorio, acumuladas en estos años, más allá de las pipetas, las electroforesis y los microarrays. No se puede entender lo uno sin lo otro. Por todo eso me es obligatorio dedicar unas líneas a todos los que conformaron el escenario en el que se desarrolló este trabajo, y a todos los que estuvieron entre bastidores. Desde el director hasta el último apuntador, todos son importantes y sin ellos hubiera sido imposible que la obra hubiese empezado y terminado. Es tarea difícil agradecer tantas cosas a tantos en tan poco espacio. Se intentará. Todo sea dicho, os merecéis mucho más.
En primer lugar quiero agradecerle al Doctor José Luis García el haberme “engañado” para realizar la tesis doctoral. Ha sido un camino duro, pero ha merecido la pena. Gracias por tus brillantes ideas, por enseñarme a buscar las mías propias, por intentar que diese lo mejor de mi en todo momento, por saber contagiar esa pasión tan grande que tienes por la ciencia y por aparecer (afortunadamente) como por arte de magia cuando tu presencia es imprescindible y ya empezamos a temer que quizás estés en Vladivostock u otro lugar de nombre más impronunciable si cabe.
Gracias a la Doctora Beatriz Galán (Bea), mi primera compañera de batalla en el mundo nuevo de las micobacerias; empezamos solas ante el peligro rodeadas de Pseudomonas, Escherichia y Azoarcus, ¡pero al final hemos conseguido hacernos un hueco respetable!. Gracias por tus sabios consejos, por enseñarme a ser práctica cuando tiendo al enrevesamiento, por animarme en los momentos de pesimismo científico, por tu actitud siempre positiva y ante todo por ser, además de una gran codirectora de tesis, una estupenda compañera de laboratorio más.
Gracias a todos los miembros de plantilla del grupo de Biotecnología Medioambiental y del grupo de Genética Bacteriana. Creo que uno de los secretos para que un laboratorio funcione a la perfección es que haya entendimiento, cooperatividad y respeto entre los “jefes”; esto siempre influye positivamente en los que estamos más abajo y hace que el ambiente de trabajo sea inmejorable. Felicidades, porque lo habéis conseguido. Gracias al doctor Eduardo Díaz, que nunca deja un cabo suelto, al doctor Manuel Carmona, nuestro experto en evolución, a la doctora Auxiliadora Prieto, maestra de los plásticos, al doctor Rubén López, el patriarca, al doctor Ernesto García, el sentenciador, al doctor Pedro García, eres auténtico, no cambies nunca.
A mis compañeros del día a día: en general gracias a todos porque no creo que hubiese mejores personajes con los que compartir alegrías y penas científicas. Sois los mejores.
En primer lugar me gustaría recordar a Patricia, Cris F y Pepa; prácticamente nos cruzamos, yo entrando de novata y vosotras
saliendo hacia vuestra recién estrenada etapa de post doc. Espero que todo os vaya estupendamente. Gracias a los neumos, tan dispuestos a ayudar en temas científicos como a hacer vídeos al más puro estilo Dogma o a darlo todo
con unos abanicos al ritmo de Locomía: Miri, Elisa, José Yuste, Marta, Beatriz, Miriam, Violeta, Susana, Elo. Gracias María del Mar por esas habitaciones rurales compartidas y por tener siempre en la cara esa sonrisa encantadora que ilumina. Gracias Dani, (el más actor de todos los científicos, el más científico de todos los actores) por descubrirme el mundo de la improvisación teatral; aquí tienes una seguidora incondicional. Gracias María por tantas noches imborrables, por el estupendo viaje a Donosti, por todas las historias con un toootal (especialmente aquella de Koldo Matilla), ¡y felicidades por la peque en camino! Ana, Anitaaaaa!!! Muchas gracias por esa alegría y vitalidad que desprendes por cada poro de tu piel y que consigues contagiarnos; gracias por ser la primera en ir a visitarme al 344 cuando aún era territorio recién conquistado y nadie se atrevía a entrar, gracias por tantas y tantas charlas, algunas de camino a casa al borde de la congelación, pero no importa: siempre es un placer hablar contigo. Vales mucho, convéncete de ello.
Seguiré por los que me quedan más cerquita, los biodegradadores, y en primer lugar por el primer laboratorio en el que hice escala
recién llegada al grupo: el 342. Gracias Irene por ser tan maja y eficiente y ser un apoyo femenino en aquella primera etapa rodeada de testosterona. Gracias Niño; a ti te tocó ejercer de primer papá pato de una Iria totalmente novata; gracias por tu paciencia, por estar siempre dispuesto ayudar, por no quejarte por robarte espacio de poyata y mesa de ordenador, por intentar siempre hacerme reír y conseguirlo, esos primeros meses y los siguientes dos años. Gracias Gonn, el equilibrio perfecto hecho persona, gracias por ponerme bien el cuello de la bata, por estar siempre ahí para lo que haga falta, científico o no, por tomarte la confianza de vacilarme sin ningún pudor, por nonononono, por los conciertos, por tantas y tantas risas. A mis extremeños favoritos: Blas, Blasete, Bleis: gracias por las conversaciones en la campana y fuera de ella, por sorprenderme siempre con nuevas e insospechadas preguntas sobre lo humano y lo divino, por recomendarme buenas series, por tu cruzada pro-cañas los jueves, por tus ji ji ji, por ser tan maligno pero
a la vez tan pedazo de pan, por enseñarme tantos consejillos prácticos en el labo y por supuesto por el cloruro de calcio. Ánimo con el postdoc. ¿Para cuándo una quedada rubenil en Las Vegas? Juan: ha sido un privilegio tenerte sentado detrás gran parte de esta tesis. Gracias por tu paciencia infinita todas las veces (que no fueron pocas) que te asalté con dudas, desde cuánto tiempo se dejaba una ligación hasta cómo se hacía un modelo 3D de proteínas. Y sobre todo por los dibujos de colorines sin los que mi mente cuadriculada todavía no entendería la recombinación homóloga. Te debo más pulpos de los que puedas comer en esta vida. Gracias por los momentos grunge (voy a obviar los momentos Sínkope) y gracias sobre todo, ante todo y a pesar de todo por ser un grandísimo amigo. Aunque intentes esconderte detrás de un gruñón a mí no me engañas: eres de las mejores personas que he conocido.
Gracias al laboratorio de las niñas, el 343, adonde hacía escapadas cuando ya notaba que me estaba masculinizando en demasía.
Gracias Tere por ser el mejor ejemplo a seguir y por luchar contra el caos que nos caracteriza a los biodegradadores; gracias Laura, compañera del metal, por tu mente clara (contado por ti cualquier protocolo parece fácil) y por tu ironía y sarcasmo de los que soy fan número uno, gracias también por salvarme la vida (del ordenador) en un momento de crisis vírica de cuyo nombre no quiero acordarme…Gracias Isa Manso, por esa gracia cordobesa y por no perder tu dulzura e inocencia a pesar que tener que lidiar con los caballeros del 342 durante años. Gracias Merche, mi compañera en la conquista de nuevos territorios, por recordarme que lo más importante en la vida es precisamente eso: vivir y disfrutar de cada momento como si fuera el último; por los cotilleos compartidos y por esa naturalidad tan genial que te caracteriza.
A los que llegaron después de mí: Javier, gracias por tu bondad intrínseca e inseparable de tu persona, porque no importa lo
apurado que estés, siempre tienes un momento para preguntar ¿qué tal te va? o para ayudar en lo que sea; gracias también por aquel sirtaki sueco y por los momentos Tom Jones a última hora de la tarde. Te deseo toda la suerte del mundo. Gracias Isabel por intentar y lograr el milagro de organizar a los rubenes en tantas ocasiones; después de mi momento de coreógrafa sé lo difícil que es. Gracias junto a Javier por ser los mejores guías posibles en el viaje a León. Gracias Vir por ser un encanto de persona siempre dispuesta a escuchar y a dar cariño, por tus despistes con los que me siento tan identificada, por tus momentos de soprano y por las noches en las que lo dimos todo. Gracias Nina por tu vitalidad incombustible, por las tardes de garrapato y póker y por ser una rubena por derecho propio desde el primer día. Gracias Andrés por tus visitas al 344 que siempre acaban con risas, por las “servesitas en el sésped”, por la sincronización en las coreografías y por ser tan buena gente. Gracias Ana V. por ser la torrejonera más buenaza por dentro y por fuera y por saber mantenernos a raya, que ya sabes que si no nos subimos a la chepa…Espero que Esther ya te haya enseñado a preparar el colesterol. Gracias Esther, mi primera discípula en el complicado mundo de las micobacterias y el colesterol, por no desesperarte conmigo ante mi inexperiencia como profesora; espero haber conseguido transmitirte el legado; gracias por ser tan lista y aprender tan rápido, es genial tener a alguien hombro con hombro trabajando en lo mismo, y gracias por los experimentos de última hora. Millones de gracias Valle, porque sin ti seguiríamos sin creernos la existencia de la colestenona, y esta tesis hubiese sido muy triste; gracias por currarte el método de LC/MS y por ese buen rollo tan genial que te rodea siempre. Gracias José Ramos, el sucesor de Merche en el puesto (¡e outro galego por fin!) por las risas máximas, por predicar ese entusiasmo total por la ciencia y por los ánimos cuando a una lo único que le apetecía era tirar la toalla. ¡A ver si coincidimos en más congresos, calamidad! Por último gracias a aquellos que pasasteis más fugazmente por el laboratorio y a los que merece la pena recordar: Valeria (creo que ni tú ni yo olvidaremos nunca el Shingo mama); Dani (mi primer patito) y Julia (¡que parece que te has quedado con ganas de más y vuelves!).
Fuera ya del grupo, pero aun por los pasillos del CIB, tengo que agradecer a Luque sus visitas al 344 para saquear sin miramientos el cajón de las fuentes de carbono, no sin antes conseguir que perdiésemos completamente el hilo de lo que estábamos haciendo a base de charla. A pesar de ello tus historietas siempre son bien recibidas, creo que ya soy adicta. Gracias a los compañeros microbiólogos con los que compartí experiencias y risas en congresos: Juan, Eli, Fátima…Gracias en general a los becarios del CIB por esas terapias de grupo en el Lekumberri, fiestas y casas rurales que hacen que seamos la envidia de los demás centros; en especial gracias a los organizadores profesionales de eventos del CIB, Carlos y R.. Gracias Marta Fierro por ese cocido en Redilluera que nos salvó de la congelación. Gracias a toda la gente de los distintos servicios del CIB que me han ayudado durante estos años: Proteómica, Secuenciación, Servicio Técnico, Gerencia…Gracias Ana por las conversaciones mopa en mano.
Más allá del CIB me gustaría agradecerle al doctor Julián Perera y a su grupo (Oliver, María, Laura, Vicky, Julio) las “reuniones del colesterol”, que ayudan siempre a ver tu trabajo desde otra perspectiva, a resolver dudas y a plantear nuevas. Ha sido muy bueno poder contar con un apoyo tan cerca.
Muchísimas gracias al doctor Carlos Martín y a todo su grupo, en especial al doctor José Antonio Aínsa, por acogerme tan bien en Zaragoza y enseñarme prácticamente todo lo que sé sobre micobacterias, por cederme la cepa Mycobacterium smegmatis mc2155 con la que he trabajado en esta tesis y por su disposición desinteresada para ayudar a lo largo de todos estos años.
Gracias al doctor Neil G. Stoker y a la doctora Sharon L. Kendall por el excelente trato recibido durante mi estancia en su laboratorio y por los conocimientos transmitidos. Gracias también a los demás miembros del grupo: Annemmieke, Ricardo y Dunni, siempre dispuestos a ayudarme.
A todos los que me han acompañado a lo largo de estos años en este Madrid (donde también queda un agujero para mí): Isora, Bea, gracias por ese primer año compartido que tuvo mucho de telenovelesco pero también de experiencias compartidas y compañerismo predoctoral entre tres recién llegadas a Madrid y al mundo de la investigación. Iso, creo que aún sigues siendo mi pareja más estable. Bea, gracias por sentarte a mi lado aquel primer día que llegaste tarde. Gracias a las dos sobre todo por haber conseguido superar las piedras que nos encontramos por el camino y seguir ahí. Gracias Andrés, compartimos piso unos pocos meses, pero te quedaste para siempre con nosotras. Gracias por tu cariño, las cotufas, los marujeos, aquel estupendo viaje a Canarias post-DEA…¡Ánimo en la recta final! Gracias Aniña y Sergio, por hacer que me entendéis cuando os hablo de frustraciones científicas, por hacer tan llevadera la convivencia, por las charlas (en persona y vía Facebook) y por los buenos ratos vividos dentro y fuera del hogar. Gracias a Diana por esas cañitas inocentes que acababan en un metro a las 6 de la mañana, ¿cuándo vienes de visita con tu bólido?; gracias a Borja, que sin saberlo también me ha ayudado, gracias a Javi, al que le ha tocado aguantarme en esta recta final.
A los que compartieron conmigo esos años cruciales en los que decidimos nuestro futuro: gracias a las demás Despojos (Isora, Ro, Carol, Bea, Elena, Sara) por seguir haciendo realidad cada año el milagro de reunirnos, por las visitas a Madrid durante estos años, por supuesto por los años de alegrías y penas en la facultad y porque el milagro se siga repitiendo por muuuchos años. Gracias Mar (Mel!), nunca olvidaré esos años de estudios, siestas, gárgolas, Estela, confesiones, Teruel, Trujillo crest, Nessun dorma y risas; Sandriña, la supercampeona que puede con todo, ¡nos dejas a todos quedar mal! Gracias por tu enorme cariño que no sé como te cabe en ese cuerpecito y por todos los momentos sala rosa compartidos aquí con la anterior y con tantas otras personas y personajes que pasaron por Cadarso.
Gracias Sara por ¿23 años ya? (madre mía) de amistad ininterrumpida; qué te voy a decir a ti, sé que te tengo para lo que haga falta y no dudes que tú me tienes a mí también. Gracias Leti por las escapaditas a Madrid, y por tener siempre una sonrisa y una palabra de ánimo preparadas; gracias a los del “insti”, porque da igual cuánto haga que no nos vemos, cuando quedamos es como si hubiésemos hablado el día anterior, gracias por todos estos años y por tantos momentos inolvidables compartidos: Ana, Carmen, Antía, Héctor, Juan. No importa dónde acabemos cada uno, siempre nos quedará Vigo.
Gracias Edith y Carlos, por animarme a pedir la Beca de Introducción a la Investigación sin la que todo esto no hubiese sido posible; gracias también por el apoyo y los ánimos que me habéis dado a lo largo de estos años, ayuda mucho que crean en ti en los momentos en que una ya no sabe ni en qué creer. Gracias al sector “Villa” (Alfredo, Marisa, Quiqui, Marcos, Alicia, Celia, Víctor…) por ofrecerme gustosamente en repetidas ocasiones vuestro cuerpo para inyectaros bacterias comedoras de lorzas, por preguntarme siempre qué tal me va con mi tesis (e incluso intentar entender de qué va) o simplemente y ante todo por estar ahí para lo que haga falta, que es lo que realmente define a una familia, más que la sangre o los genes compartidos.
Gracias Papá y Mamá por quererme tanto, apoyarme siempre y animarme a que siga mis sueños, aunque eso signifique que esté lejos, que ya sé que preferiríais que estuviese más a mano…Gracias por estar tan orgullosos de mí aunque no merezca ni la mitad de tanto orgullo, gracias por aceptarme como soy y por tener la culpa en gran medida de que sea como soy; sin duda sois las dos personas más importantes de toda esta lista y de todo este libro.
Ha sido un placer.
Índice
ÍNDICE
ABREVIATURAS I. INTRODUCCIÓN 1. El colesterol y los compuestos esteroideos 1.1 Esteroides y esteroles
1.2 El colesterol y moléculas derivadas en animales
1.3 Impacto ambiental del colesterol y de las moléculas derivadas del
colesterol
2. Rutas microbianas de degradación de compuestos esteroideos 2.1 Degradación aeróbica de esteroides
2.1.1 Degradación aeróbica del colesterol
2.1.2 Enzimas responsables de la transformación de colesterol en 4-
colesten-3-ona
2.1.2.1 Enzimas con actividad colesterol oxidasa
2.1.2.2 Enzimas con actividad 3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa
2.2 Degradación anaeróbica de esteroides
3. Regulación de las rutas de degradación de compuestos esteroideos 4. Mecanismos de transporte del colesterol 5. Degradación aeróbica del colesterol y compuestos esteroideos en el
género Mycobacterium
II. OBJETIVOS III. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cepas bacterianas, plasmidos y oligonucleótidos utilizados 2. Medios y condiciones de cultivo 2.1 Escherichia coli
2.2 Mycobacterium smegmatis
3. Transformación de las células
3.1 Transformación de Escherichia coli
3.2 Transformación de Mycobacterium smegmatis
3.2.1 Preparación de células electrocompetentes
3.2.2 Electroporación
vii
1334
9101214
202022232525
27
33
37394545454848484849
i
Índice
ii
4. Técnicas de DNA
4.1 Electroforesis de DNA en geles de agarosa
4.2 Extracción de DNA cromosómico de micobacterias
4.3 Aislamiento de DNA plasmídico
4.4 Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente
(PCR)
4.5 Secuenciación de DNA
4.6 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc2155
mediante mutagénesis insercional
4.7 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc2155
mediante deleción por recombinación homóloga
5. Técnicas de proteínas 5.1 Obtención de los extractos proteicos
5.1.1 Extractos de Escherichia coli
5.1.2 Extractos de Mycobacterium smegmatis
5.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
5.3 Purificación de la proteína KstR
5.4 Ensayos enzimáticos
5.4.1 Ensayos in vitro de actividad productora de 4-colesten-3-ona para
análisis mediante TLC y LC/MS
5.4.2 Ensayos in vivo de actividad productora de 4-colesten-3-ona para
análisis mediante TLC y LC/MS
6. Ensayos de unión DNA-Proteína 6.1 Marcaje de sondas con 32P
6.2 Ensayos de retardo en gel
6.3 Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I (footprinting)
7. Técnicas de RNA 7.1 Extracción de RNA de micobacterias
7.2 Retrotranscripción seguida de reacción de PCR (RT-PCR semicuantititiva)
7.3 Retrotranscripción para PCR en tiempo real
7.4 PCR en tiempo real (q-PCR)
7.5 Análisis genómico de M. smegmatis bajo diferentes condiciones de
cultivo mediante microarrays de RNA
49505051
5151
52
5558585858595960
60
62636363646565666667
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Índice
iii
7.5.1 Síntesis y marcaje del cDNA
7.5.2 Hibridación de los microarrays
7.6 Técnica de primer extension o extensión con cebador
8. Cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) 9. Cromatografía en capa fina (TLC) 10. Análisis de los datos de secuencia IV. RESULTADOS 1. Potencial catabólico de compuestos esteroideos y caracterización
genética in silico y mediante RT-PCR de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis mc2155 1.1 Crecimiento de M. smegmatis mc2155 en distintos esteroides
1.2 Identificación y caracterización in silico de genes de M. smegmatis y M.
tuberculosis implicados en el metabolismo del colesterol
1.3 Validación de los genes identificados in silico mediante análisis de su
expresión por RT-PCR
1.4 Búsqueda de un indicador genético de degradación de esteroides en
bacterias
2. Estudio de enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4 colesten-3-ona
2.1 Análisis in silico de genes que codifican actividad colesterol oxidasa o
deshidrogenasa
2.1.1 MSMEG_1604
2.1.2 MSMEG_5228
2.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol de los
genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228
2.3 Clonación y expresión heteróloga de los genes MSMEG_1604 y
MSMEG_5228
2.3.1 Clonación de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228
2.3.2 Expresión heteróloga de MSMEG_1604
2.3.3 Expresión heteróloga de MSMEG_5228
2.4 Ensayos enzimáticos mediante TLC con colesterol marcado con 14C
2.4.1 Experimentos in vitro con ChoDMS y 3-β HSDMS. Cinética enzimática
2.4.2 Detección de la actividad de ChoDMS in vivo
686970727474
77
7979
82
89
95
97
9898
103
108
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Índice
iv
2.5 Ensayo de ChoDMS y 3-β HSDMS mediante LC/MS
2.6 Ensayo de afinidad de ChoDMS por el colesterol
2.7 Mutagénesis de MSMEG_1604 y MSMEG_5228
2.7.1 Ensayos de crecimiento en colesterol de los distintos mutantes
2.7.2 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos
mutantes mediante TLC
2.7.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos
mutantes mediante LC/MS
2.8 Búsqueda de nuevas enzimas con actividad colesterol
oxidasa/deshidrogenasa: SDRMS
2.8.1 Análisis in silico de genes ortólogos a acmA
2.8.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol
del gen MSMEG_5233
2.8.3 Clonación y expresión heteróloga del gen MSMEG_5233
2.8.4 Cinética enzimática de SDRMS mediante TLC con colesterol marcado
con 14C
2.8.5 Ensayos mediante LC/MS de SDRMS
2.8.6 Mutagénesis del gen MSMEG_5233
2.8.6.1 Ensayos de crecimiento con el mutante M.
smegmatis::MSMEG_5233
2.8.6.2 Análisis de la composición del sobrenadante de cultivo en
colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233
mediante TLC
2.8.6.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol del
mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 mediante LC/MS
3. Análisis genómico mediante microarrays de la ruta de degradación del colesterol
3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays del genoma de M.
smegmatis mc2155
3.2 Validación de los resultados de expresión obtenidos con los microarrays
mediante RTq-PCR
4. Estudio mediante mutagénesis insercional de diversos genes implicados en el metabolismo del colesterol
4.1 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_6036
117119121121
123
124
127128
132133
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144
145
170
172
173
Índice
v
4.2 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1366
4.3 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_5995
4.4 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_0217
4.5 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1543
4.6 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_3519
5. Introducción al estudio de la regulación transcripcional del catabolismo del colesterol por las proteínas represoras KstR y KstR2
5.1 Ensayos de crecimiento con los mutantes de los reguladores KstR y KstR2
5.2 Introducción al estudio del represor transcripcional KstR
5.2.1 Caracterización del promotor P5228
5.2.1.1 Identificación del sitio de inicio de la transcripción del promotor
P5228
5.2.2 Regulación del promotor P5228 por KstR
5.2.2.1 Clonación, hiperexpresión y purificación de la proteína KstRMsm
5.2.2.2 Unión de KstR a la región intergénica 5228
5.2.2.3 Determinación de las regiones operadoras de KstR en la
región promotora de MSMEG_5228
5.3 Estudio de la regulación mediada por KstR2 mediante la técnica de
microarrays
5.3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays de M.
smegmatisΔkstR2
V. DISCUSIÓN 1. Estudio del potencial catabólico de degradación de esteroides de M.
smegmatis mc2155 2. Análisis de las enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4-
colesten-3-ona en M. smegmatis mc2155 3. Análisis global de los genes inducidos diferencialmente en colesterol en
M. smegmatis mc2155 4. Estudio de los reguladores transcripcionales KstR y KstR2 VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA
175177180181182
183184185186
187189190192
194
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204
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227
231
vi
Abreviaturas
ABREVIATURAS A: Adenina
AD: 4-androstadien-3,17-diona
ADD: 1,4-androstadien-3,17-diona
Apr: Resistencia a ampicilina
APCI+: Ionización química a presión atmosférica
at: Atmósfera
ATP: Adenosina trifosfato
Bq: Bequerelio
BSA: Seroalbúmina bovina
C: Citosina
ºC: Grado centígrado
cDNA: DNA complementario
Ci: Curio
CO: Colesterol oxidasa
CoA: Coenzima A
C-terminal: Carboxilo terminal
Cy3: Cianina 3
Cy5: Cianina 5
Cy3-dCTP: Desoxicitosina trifosfato marcado con cianina 3
Cy5-dCTP: Desoxicitosina trifosfato marcado con cianina 5
Da: Dalton
dATP: Desoxiadenina trifosfato
dCTP: Desoxicitosina trifosfato
DEPC: Dietilpirocarbonato
dGTP: Desoxiguanina trifosfato
3,4-DHSA: 3,4-dihidroxi-9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-trien-9,17-diona
DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Ácido desoxirribonucleico
DNasa: Desoxirribonucleasa
DNP: 2,4-Dinitrofenol
vii
Abreviaturas
dNTP: Desoxinucleótido trifosfato
DO600: Densidad óptica medida a 600 nanómetros
DOHNAA: Ácido 9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-oico
4,9-DSHA: Ácido 4,5,9,10-diseco-3-hidroxi-5,9,17-trioxoandrosta-1(10), 2-dien-4-
oico
DTT: Ditiotreitol
http: Desoxitimidina trifosfato
ε: Coeficiente de extinción molar
EDTA: Ácido etilendiaminotetracético
FAD: Dinucleótido de flavina y adenina oxidado
FDR: False Discovery Rate
G: Guanina
g: gramo
g: Unidades de fuerza G
Gmr: Resistencia a gentamicina
GTP: Guanosina trifosfato
h: Hora
HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinetanosulfónico
3-HAS: 3-hidroxi-9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-trien-9,17-diona
HTH: Dominio hélice-giro-hélice
IPTG: Isopropil-β-D-tiogalatopiranósido
Kb: 1000 pares de bases
kDa: 1000 dalton
Kmr: Resistencia a kanamicina
kV: Kilovoltio
L: Litro
LB: Medio de cultivo Luria-Bertani
LC/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
μCi: 10−6 curios
μF: 10−6 faradios
μg: 10−6 gramos
μl: 10−6 litros
viii
Abreviaturas
μM: Micromolar M: Molar
MCS: Sitio de clonación múltiple
mg: miligramo
min: Minuto
ml: Mililitro
mM: Milimolar
MOPS: Ácido 3-(N-morfolin) propanosulfónico
mRNA: RNA mensajero
MS/MS: Espectrometría de masas tándem
m/z: Relación masa/carga
NAD: Nicotinamina-adenina-dinucleótido oxidado
NADH: Nicotinamina-adenina-dinucleótido reducido NADP: Fosfato de nicotinamina-adenina-dinucleótido oxidado
NADPH: Fosfato de Nicotinamina-adenina-dinucleótido reducido
ng: Nanogramo
nM: Nanomolar
nm: Nanómetro
N-terminal: Amino terminal
Ω: Ohmio
ORF: Marco abierto de lectura
P: p-valor
PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida
pb: Pares de bases
PCR: Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente
PDB: Protein Data Bank
PIPES: Sal disódica del ácido piperazina-N, N-bis2 etano sulfónico
pmol: Picomol
PMSF: fenil metanosulfonilfluoruro
p/v: relación peso/volumen
RBS: Sitio de unión al ribosoma
RNA: Ácido ribonucleico
ix
Abreviaturas
RNasa: Ribonucleasa
rpm: Revoluciones por minuto
RT-PCR: Reacción de retrotranscripción acoplada a PCR
RTq-PCR: Reacción de retrotranscripción acoplada a PCR en tiempo real
s: Segundo
SD: Secuencia Shine-Dalgarno de unión al ribosoma
SDR: Superfamilia de las deshidrogenasas/reductasas de cadena corta SDS: Dodecilsulfato sódico
SSC: Tampón citrato sódico salino T: Timina
TAE: Tampón Tris-Acetato-EDTA
TBE: Tampón Tris-Borato-EDTA
TE: Tampón Tris-EDTA
TLC: Cromatografía en capa fina
Tris: Trihidroximetilaminometano
tRNA: RNA de transferencia U: Unidad de actividad enzimática
V: Voltio
v/v: Relación volumen/volumen
X-gal: 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
ABREVIATURAS PARA AMINOÁCIDOS: Ala (A): Alanina Gly (G): Glicina Pro (P): Prolina
Arg (R): Arginina His (H): Histidina Ser (S): Serina
Asn (N): Asparragina Ile (I): Isoleucina Thr (T): Treonina
Asp (D): Aspártico Leu (L): Leucina Trp (W): Triptófano
Cys (C): Cisteína Lys (K): Lisina Tyr (Y): Tirosina
Gln (Q): Glutamina Met (M): Metionina Val (V): Valina
Glu (E): Glutámico Phe (F): Fenilalanina
x
Introducción
I. INTRODUCCIÓN
1
Introducción
2
Introducción
I. INTRODUCCIÓN
1. El colesterol y los compuestos esteroideos 1.1 Esteroides y esteroles
Los esteroides son compuestos de gran importancia en biología, medicina y
química que se encuentran ampliamente distribuidos en el medio ambiente. Su
estructura contiene un esqueleto de ciclopentanoperhidrofenantreno o un
esqueleto derivado de éste por rotura de uno o más enlaces o contracción o
expansión de los anillos (Fig. 1 A). Este esqueleto consiste en cuatro anillos
fusionados, tres de seis carbonos y uno de cinco carbonos, que se nombran con
las letras A-D. Este núcleo esteroideo es prácticamente plano y relativamente
rígido de tal manera que los anillos fusionados no permiten la rotación en los
enlaces C-C. Normalmente aparecen grupos metilo en las posiciones C-10 y C-13
y en la posición C-17 puede aparecer una cadena lateral tipo alquilo (JCBN, 1989).
Los esteroles son compuestos esteroideos que poseen un grupo hidroxilo en
la posición C-3 y que conservan la mayor parte del esqueleto del colestano,
formado por el núcleo esteroideo y una cadena lateral de 8 átomos de carbono en
el carbono 17 (Fig. 1 B). En la cadena lateral suelen presentar más átomos de
carbono (JCBN, 1989). Entre los esteroles de origen natural destacan los
fitosteroles en plantas, el ergosterol en hongos y levaduras, y el colesterol en
células animales. Todos ellos desempeñan una importante función como agentes
estabilizantes de las membranas celulares de los organismos en los que se
encuentran y como precursores de una gran variedad de productos con
actividades biológicas específicas.
El colesterol (3-hidroxi-5,6-colesteno) (Fig. 2) es un esterol de 27 átomos de
carbono en el que el grupo hidroxilo adopta una configuración β. Este alcohol
policíclico ha sido una de las moléculas biológicas más estudiadas, ya que es un
componente esencial de todos los tejidos animales (Bloch, 1965). El colesterol es
3
Introducción
una de las moléculas más comunes en la naturaleza, donde se encuentra
formando parte de las membranas celulares de las células animales, aunque
también se encuentra en algunos organismos procariotas, como se comentará
más adelante.
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A B
C D1
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A B
C D1
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A B
Figura 1. Estructura química del ciclopentanoperhidrofenantreno (A) y del colestano (B). La nomenclatura de los átomos de carbono y de los anillos está indicada en la figura.
1.2 El colesterol y moléculas derivadas en animales
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HO
A B
C D
Figura 2. Fórmula química del colesterol. La nomenclatura de los átomos de carbono y de los
anillos está indicada en la figura.
4
Introducción
Aunque es una molécula esencial para muchos animales, incluido el ser
humano, los mamíferos no requieren el colesterol en la dieta, ya que todas las
células pueden sintetizarlo a partir de precursores simples. Aunque la estructura
de los esteroles sugiere una ruta biosintética complicada, en los organismos
eucariotas se sintetizan a partir de subunidades simples de isopreno. La síntesis
de colesterol en animales tiene lugar en cuatro etapas, mostradas resumidamente
en la figura 3. Esta síntesis es particularmente activa en el hígado, corteza renal,
piel, intestino y en la aorta (Bloch, 1965). Dado que la cantidad total de colesterol
(absorbido más sintetizado) sobrepasa la cantidad requerida por el organismo
para atender al normal funcionamiento celular, parte de ese colesterol debe ser
eliminado. Debido a que los mamíferos carecen de las enzimas necesarias para
degradar el núcleo del colesterol, este se excreta tal cual, con pequeñas
modificaciones estructurales o bien transformado en otros compuestos esteroideos
(ácidos biliares u hormonas esteroideas) (Björkhem y Eggertsen, 2001).
5
Introducción
-OOC-CH2-C-CH2-OHCH3
OH
1
Mevalonato
Acetil-CoA
3 CH3-COS-CoA
CH
HO
2
CH3
C-CH2-CH2-O-P-O-P-O-
O
-O
O
-O
Escualeno Colesterol
2
3
4
Isopreno activado
Figura 3. Resumen de la ruta biosintética del colesterol en animales. 1) Condensación de tres
unidades de acetato para formar un intermediario de seis átomos de carbono, el mevalonato. Tres
moléculas de acetil-CoA se condensan para formar el compuesto ß-hidroxi-ß-metilglutaril-CoA
(HMG-CoA). La enzima HMG-CoA reductasa cataliza la reducción de HMG-CoA a mevalonato. 2)
Conversión del mevalonato a unidades activadas de isopreno; 3) polimerización de seis unidades
de isopreno para formar el escualeno, estructura lineal de 30 carbonos; y 4) ciclación del escualeno
para formar los cuatro anillos del núcleo esteroideo, con una serie de cambios más (oxidaciones,
eliminación o migración de grupos metilo) hasta la formación del colesterol (Nelson y Cox, 2004).
Como ya se ha comentado anteriormente, el colesterol tiene una gran
importancia metabólica, ya que es el precursor inmediato de un gran número de
sustancias tales como vitaminas, hormonas esteroideas y ácidos biliares (Fig. 4)
6
Introducción
(Björkhem y Eggertsen, 2001; Miller, 1988). Todas las hormonas esteroideas
derivan del colesterol (Fig. 4). En la corteza de la glándula adrenal se sintetizan
dos clases de hormonas esteroideas: los mineralocorticoides, que controlan la
reabsorción de iones inorgánicos (Na+, Cl-, y HCO3-) por el riñón, y los
glucocorticoides, que afectan al metabolismo de proteínas y carbohidratos
(participan en la regulación de la gluconeogénesis, por ejemplo), reducen la
respuesta inmune, la inflamación y las respuestas alérgicas. Las hormonas
sexuales se producen en las gónadas masculinas y femeninas y en la placenta.
Entre ellas se encuentran la progesterona, que regula el ciclo reproductivo
femenino, y los andrógenos (como la testosterona) y estrógenos (como el
estradiol), que influyen en el desarrollo de los caracteres sexuales secundarios
masculinos y femeninos, respectivamente. La síntesis de estas hormonas requiere
la eliminación de algunos o todos los carbonos de la cadena lateral situada en el
carbono 17 del anillo D del colesterol. Esta eliminación de la cadena lateral tiene
lugar en la mitocondria de los tejidos esteroidogénicos, e incluye la hidroxilación
de dos carbonos adyacentes en la cadena lateral (carbonos 20 y 22) seguida de la
rotura de la unión entre ellos. La formación de las diversas hormonas también
envuelve la introducción de átomos de oxígeno. Todas las reacciones de
hidroxilación y oxigenación están catalizadas por enzimas oxidasas de función
mixta que utilizan NADPH, O2 y el citocromo P-450 mitocondrial. Los ácidos y
sales biliares (Fig. 4) son derivados hidrofílicos del colesterol que tienen un papel
importante en la digestión, donde participan en la emulsión de las grasas de la
dieta. Por último, la vitamina D también deriva de la molécula de colesterol. La
vitamina D3 (Fig. 4), también llamada colecalciferol, se forma normalmente en la
piel a partir del 7-deshidrocolesterol en una reacción fotoquímica catalizada por el
componente ultravioleta de la luz solar. Posteriormente es convertida por enzimas
en el hígado y los riñones a 1,25-dihidroxicolecalciferol, la hormona activa, que
regula la absorción de calcio en el intestino y los niveles de calcio en riñones y
hueso (Nelson y Cox, 2004).
7
Introducción
HO
Cortisol (glucocorticoide)
OH
HO
HO
O
O
O
O
O
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
HOO OH
O
Colesterol
Pregnenolona
Progesterona
Aldosterona (mineralocorticoide)
Testosterona (andrógeno)
Estradiol (estrógeno)
NH
HO OH
OH
O
SO3-
HORMONAS ESTEROIDEAS ÁCIDOS BILIARES VITAMINA D3 (colecalciferol)
HO
Figura 4. Estructura química de algunas de las moléculas derivadas del colesterol.
El colesterol es un compuesto popularmente conocido por los nocivos efectos
que causa su excesiva concentración en nuestro organismo y por las numerosas
estrategias que se han desarrollado para la prevención de dichos efectos a través
de la promoción y divulgación de las dietas bajas en colesterol (Denke, 1995).
Cuando la suma del colesterol sintetizado e ingerido en la dieta excede la cantidad
8
Introducción
requerida para la síntesis de membranas, sales biliares y esteroides, pueden
desarrollarse acumulaciones patológicas del mismo en los vasos sanguíneos
(placas arterioscleróticas) que resultan en su obstrucción (arteriosclerosis). El fallo
cardíaco debido a la obstrucción de arterias coronarias es una de las principales
causas de muerte en la sociedad industrializada. Por otro lado, muchos de los
derivados del colesterol o de los compuestos con él relacionados poseen un gran
valor como intermediarios en la síntesis de esteroles y esteroides de interés
farmacológico, por lo que durante décadas la industria químico-farmacéutica les
ha prestado gran atención (Demain, 1992; Sedlaczek y Smith, 1988).
1.3 Impacto ambiental del colesterol y de las moléculas derivadas del colesterol
Entre los miles de nuevos compuestos contaminantes vertidos al medio
ambiente como consecuencia de la actividad humana, se observa, cada vez con
más frecuencia, la aparición en diferentes ecosistemas de numerosas moléculas
que poseen estructura esteroídica o que son derivados directos de compuestos
que poseen dicha estructura. Muchos de esos compuestos poseen potentes
actividades metabólicas que afectan a un gran número de procesos celulares
(algunos de ellos tan esenciales como la proliferación celular, control de ciclo
celular, mecanismos básicos de reconocimiento intercelular, etc.) por lo que su
presencia y/o acumulación en determinados nichos ecológicos puede causar
efectos muy perjudiciales sobre la salud humana y alterar los ciclos biológicos de
las especies que forman parte de esos ecosistemas.
La contaminación procede en parte como resultado de diversas actividades
industriales, pero también de los efluentes municipales, que son hoy en día una de
las mayores fuentes de emisión de estos residuos, ya que esos vertidos no sólo
aportan hidrocarburos, pesticidas, surfactantes y distintos metales, sino que
también aportan esteroles y esteroides de origen natural y sintético. En este
sentido, recientemente los productos farmacéuticos y los denominados productos
para el cuidado personal (PPCPs) han sido clasificados como una clase
emergente de contaminantes de especial relevancia para los medios acuáticos
9
Introducción
(Gagné et al., 2006). Entre estos productos se encuentran muchos compuestos de
naturaleza esteroídica de origen farmacéutico. Así por ejemplo el anticonceptivo
sintético oral 17α-etinilestradiol es considerado responsable, junto con los
estrógenos 17β-estradiol y estrona de causar la producción de vitelogenina
(feminización) en peces macho (Daughton y Ternes, 1999). Este fenómeno de
feminización fue observado por vez primera en lagunas de tratamiento de aguas
residuales a mediados de los años 80 (Routledge et al., 1998). Además, hay que
señalar que el colesterol es el principal componente de la lanolina, y este y otros
esteroles relacionados son contaminantes naturales bastante resistentes al
tratamiento anaeróbico que se lleva a cabo sobre los efluentes procedentes del
lavado industrial de la lana (Poole y Cord-Ruwisch, 2004). Estos efluentes
derivados del lavado de la lana están expresamente reconocidos como altamente
contaminantes por la legislación española nacional y autonómica que regula el
impacto ambiental de los residuos industriales. La cantidad de estrógenos
procedentes de fuentes animales es de menor importancia que la procedente de
aguas residuales, pero los residuos de estiércol contribuyen de manera importante
a su entrada en el medio ambiente (Hanselman et al., 2003; Raman et al., 2004).
El estiércol procedente de ganado y aves de corral también es considerado una
fuente de testosterona ambiental (Lee et al., 2003).
2. Rutas microbianas de degradación de compuestos esteroideos
Aunque se trata de moléculas naturales muy abundantes en la biosfera, el
colesterol y sus derivados son relativamente resistentes a la degradación
microbiana. El hecho de que el colesterol sea una molécula recalcitrante es
atribuido al bajo número de grupos funcionales (un único doble enlace C-C y un
sólo grupo hidroxilo), a su baja solubilidad en agua (3 x 10-8 M) y a la complejidad
de su conformación espacial. Su hidrofobicidad y baja volatilidad hacen que sean
compuestos en los que su absorción a fases sólidas es significativa en cuanto a su
presencia en el medio natural. Así por ejemplo, estudios acerca de la absorción
del estradiol en sedimentos fluviales predicen que menos del 1% del esteroide
10
Introducción
presente puede ser movilizado por sedimentos resuspendidos (Holthaus et al.,
2002). Por su alto índice de persistencia, el colesterol y algunos de sus derivados
primarios, como el coprostanol, son ubicuos y se utilizan como biomarcadores de
referencia en algunos análisis de contaminación medioambiental (Veiga et al.,
2005).
Centrándonos en la degradación bacteriana del colesterol, hay que señalar
que, por su importancia, este compuesto no ha pasado desapercibido y así la
búsqueda de microorganismos capaces de degradar colesterol se inició hace más
de 70 años. Ya a principios del siglo XX se observó que varias especies de
Mycobacterium podían utilizar el colesterol como única fuente de carbono y
energía (Söhngen, 1913). Años más tarde se comprobó que microorganismos
pertenecientes al género Proactinomyces eran capaces de degradar parcialmente
el colesterol añadido al medio de cultivo y que algunos de ellos, en particular P.
erytrhopolis, posteriormente renombrado como Rhodococcus erythropolis,
acumulaba ciertos compuestos estructuralmente relacionados con el colesterol, lo
que ponía de manifiesto su capacidad para transformar esta molécula y su uso
potencial para obtener nuevos derivados esteroídicos (Turfitt, 1944; Turfitt, 1948).
Además se comprobó que ciertas especies de Azotobacter podían transformar el
colesterol en 4-colesten-3-ona o en 7-deshidrocolesterol y que muchas de ellas
hidrolizaban la cadena lateral generando metilheptanona que se acumulaba en el
medio de cultivo (Horvath y Kramli, 1947). Whitmarsh demostró que ciertas
especies de Nocardia aisladas del suelo eran capaces de hidrolizar la cadena
lateral del colesterol transformando esta molécula en diferentes derivados
esteroídicos, muchos de los cuales tenían características parecidas a ciertas
hormonas sexuales (Whitmarsh, 1964). Otros autores pusieron de manifiesto que
distintas bacterias pertenecientes a los géneros Nocardia, Arthrobacter, Bacillus,
Brevibacterium, Corynebacterium, Streptomyces, Microbacterium, Serratia,
Achromobacter, Pseudomonas o Protaminobacter, entre otras, eran capaces de
degradar total o parcialmente el colesterol y otros esteroles (Arima et al., 1969;
Brown y Peterson, 1966; Chipley et al., 1975; Ferreira y Tracey, 1984; Martin,
1977; Nagasawa et al., 1969; Tak, 1942), si bien hay que decir que muchas de
estas cepas hoy en día se clasifican de diferente manera. A este respecto hay que
11
Introducción
señalar que Owen y colaboradores describieron en 1983 una cepa de
Pseudomonas con capacidad para mineralizar el colesterol, Pseudomonas sp.
NCIB 10590, la única bacteria Gram-negativa con capacidad de utilizar el
colesterol como única fuente de carbono y energía en aerobiosis descrita por el
momento (Owen et al., 1983). Desgraciadamente, la capacidad de esta cepa para
degradar colesterol no ha podido ser reproducida en nuestro laboratorio, ya que el
único cultivo que actualmente se conserva de la misma en la colección inglesa
NCIB no es capaz de crecer en estas fuentes de carbono (comunicación
personal), por lo que su operatividad actual está cuestionada.
Hay que señalar que existe un conocimiento limitado de las bases genéticas
y bioquímicas de las rutas catabólicas de estos compuestos, si bien es evidente
que un conocimiento detallado de las mismas podría permitir un uso más racional
de estos procesos y aportar a la industria farmacéutica enzimas con nuevas
propiedades susceptibles de ser producidas, modificadas y mejoradas por técnicas
de ingeniería de proteínas. Por otro lado, la aplicación de elementos y sistemas
biológicos a la resolución racional del problema de la eliminación de esteroles
contaminantes, también requiere un profundo conocimiento de su metabolismo a
nivel genético y bioquímico. La definición y caracterización de las rutas
metabólicas de estos compuestos permitiría emplear los procedimientos de
ingeniería metabólica para la modificación, el control y la ampliación de las
capacidades degradativas de diversas cepas bacterianas, para su utilización como
agentes biológicos descontaminantes. Tampoco se puede olvidar que el colesterol
desempeña un papel importante en la dieta y que existe mucho interés por reducir
la cantidad de colesterol en los alimentos. La posibilidad de modificar y ensamblar
estas rutas en organismos probióticos capaces de reducir el nivel de colesterol en
los alimentos de la dieta y/o en el intestino puede ser un objetivo técnicamente
posible a medio plazo.
2.1 Degradación aeróbica de esteroides
En la actualidad, el catabolismo aeróbico de esteroides en bacterias Gram-
negativas se ha estudiado en profundidad en Comamonas testosteroni TA441
12
Introducción
(anteriormente denominada Pseudomonas testosteroni), una cepa que además de
testosterona es capaz de utilizar también los ácidos biliares como fuente de
carbono y energía, pero no el colesterol. Se ha estudiado exhaustivamente la ruta
de degradación de la testosterona en esta bacteria, y muchas de las etapas de la
misma se han caracterizado a nivel genético y bioquímico (Horinouchi et al., 2001;
Horinouchi et al., 2003a; Horinouchi et al., 2003b; Horinouchi et al., 2004a;
Horinouchi et al., 2004b; Horinouchi et al., 2005). Así, la mayoría de los genes de
la ruta de degradación de la testosterona, denominados genes tes, ya han sido
caracterizados, si bien aún existen algunas lagunas de conocimiento sobre su
funcionalidad. En esta bacteria se han caracterizado muy bien algunas enzimas
(así como sus respectivos genes) que intervienen en la metabolización de
esteroides. Entre ellas cabe destacar la 3α-hidroxisteroide
deshidrogenasa/carbonilreductasa (3α-HSD/CR codificada por el gen hsdA), que
cataliza la oxidorreducción en posición 3 de una gran variedad de esteroides C19-27
(Hwang et al., 2005); la 3-oxo-Δ5-Δ4-esteroide isomerasa (KSI), que transforma la
5-androsten-3,17-diona en 4-androsten-3,17-diona (4-AD) (Kuliopulos et al., 1987);
y las Δ4-deshidrogenasas (Δ4-DHs, 3-oxo-Δ4(5α)-esteroide y 3-oxo-Δ4(5β)-
esteroide deshidrogenasas), que catalizan la conversión del 1-androstene-3,17-
diona (1-AD) (anillos A:B trans o cis, respectivamente) en ADD (Florin et al., 1996).
Dentro de grupo de las bacterias Gram-positivas, el género Rhodococcus
tiene un gran potencial catabólico (Larkin et al., 2005; van der Geize y Dijkhuizen,
2004). En él se han descrito algunas cepas capaces de degradar colesterol y
recientemente se ha avanzado en el estudio de algunas enzimas implicadas en el
metabolismo de esteroides, tales como la colesterol oxidasa, la 3-cetoesteroide
Δ1-deshidrogenasa o la 3-cetoesteroide 9α-hidroxilasa (Ivshina et al., 2005; Knol et
al., 2008; Morii et al., 1998; Navas et al., 2001; van der Geize et al., 2000; van der
Geize et al., 2002b; van der Geize et al., 2008). El reciente análisis completo del
genoma de Rhodococcus jostii cepa RHA1 (McLeod et al., 2006) ha revelado la
existencia de un conjunto de genes que podrían estar implicados en el
catabolismo del colesterol (van der Geize et al., 2007), algunos de los cuales han
sido definidos funcionalmente.
13
Introducción
Recientemente también se han desarrollado diversos trabajos sobre el
metabolismo del colesterol y su regulación en micobacterias, dirigidos gran parte
de ellos a investigar el papel que esta molécula desempeña en la patogenicidad
de la especie Mycobacterium tuberculosis; de ello se hablará específicamente en
el apartado 4.
2.1.1 Degradación aeróbica del colesterol
Aunque el catabolismo bacteriano del colesterol no se ha dilucidado
completamente en ninguna de las bacterias capaces de metabolizarlo, y por lo
tanto no se conoce su ruta de degradación completa, a partir de la combinación de
diferentes estudios bioquímicos realizados con varias cepas degradadoras de
esteroles (Kieslich, 1985; Martin, 1977; Owen et al., 1983; Schoemer y Martin,
1980; Sedlaczek y Smith, 1988; Szentirmai, 1990) se ha postulado una ruta para la
degradación aeróbica del mismo como se muestra en la figura 5. A continuación
se detallarán las diferentes etapas de esta ruta en tres apartados:
a) Transformación del colesterol en 4-colesten-3-ona. En esta ruta aeróbica
parece que el primer paso es la oxidación de colesterol a 4-colesten-3-ona a
través de dos reacciones secuenciales: la oxidación de colesterol a 5-colesten-3-
ona (Figura 5, (2)) seguida de su isomerización a 4-colesten-3-ona (Figura 5, (3)). La enzima que aporta esta primera actividad en el sistema degradativo es en
algunos microorganismos una colesterol oxidasa, mientras que en otros se trata
de una 3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa. En ambos casos se trata
de enzimas bifuncionales que incluyen actividad 3β-hidroxiesteroide oxidasa o
deshidrogenasa y actividad Δ5-3-cetoesteroide isomerasa. Dado que una parte de
esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio de este paso enzimático, se
detallarán las características de estas enzimas más adelante en el texto.
b) Eliminación de la cadena lateral del colesterol. Parece que, concomitante o
posteriormente al primer proceso oxidativo, la cadena alifática del colesterol se
elimina mediante varios procesos de oxidación, similares a una β-oxidación, aun
no bien precisados a nivel genético y bioquímico (van der Geize et al., 2007).
Estudios muy recientes han señalado a la proteína codificada por el gen ro04679
14
Introducción
de Rhodococcus jostii RHA1 (Rosłoniec et al., 2009), que codifica el citocromo
P450 125 (Cyp125) y tiene como ortóloga en M. tuberculosis a la proteína
codificada por el gen Rv3545c (Capyk et al., 2009a; Capyk et al., 2009b), como la
enzima responsable del primer paso de hidroxilación de la cadena lateral.
c) Rutas central y baja de degradación del colesterol. Una vez que la cadena
alifática se ha oxidado, el metabolismo del colesterol parece seguir para la
mayoría de bacterias aeróbicas una ruta catabólica común para esteroides de 19
átomos de carbono. Brevemente, 3-cetoesteroide- Δ1-deshidrogenasas de baja
especificidad, como KsdD en M. smegmatis (Brzostek et al., 2005), KstD en
Rhodococcus erythropolis (van der Geize et al., 2000; van der Geize et al., 2001;
van der Geize et al., 2002a) o TesH en Comamonas testosteroni (Horinouchi et al.,
2003b) transforman el compuesto 4-androstadien-3,17-diona (AD) (Figura 5, (9A)) en 1,4-androstadien-3,17-diona (ADD) (Figura 5, (9B)), que puede considerarse el
metabolito central de las distintas etapas degradativas, así como metabolito
central de la degradación de distintos esteroides, como la testosterona.
Posteriormente tiene lugar una 9α-hidroxilación catalizada por KstH en M.
smegmatis (Andor et al., 2006) y KshAB en R. erythropolis (van der Geize et al.,
2001; van der Geize et al., 2002b; van der Geize et al., 2008) y en M. tuberculosis
(Capyk et al., 2009a), seguida de la transformación no enzimática de la 9α-hidroxi-
1,4-androstadien-3,17-diona (Figura 5, (10B)) en 3-hidroxi-9,10-secoandrosta-
1,3,5(10)-trien-9,17-diona (3-HSA) (Figura 5, (11)). La hidroxilación subsecuente
de 3-HSA por enzimas como la oxigenasa de dos componentes TesA1A2 en C.
testosteroni (Horinouchi et al., 2004a) conduce a la obtención de la 3,4-dihidroxi-
9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-trien-9,17-diona (3,4-DHSA) (Figura 5, (12)), un
derivado catecólico cuyo anillo A se abre por una extradiol dioxigenasa de tipo
meta (TesB en C. testosteroni (Horinouchi et al., 2001); HsaC en R. jostii RHA1
(van der Geize et al., 2007) y en M. tuberculosis (Yam et al., 2009)) originando el
ácido 4,5,9,10-diseco-3-hidroxi-5,9,17-trioxoandrosta-1(10), 2-dien-4-oico (4,9-
DSHA) (Figura 5, (13)). Este compuesto es hidrolizado por TesD en C. testosteroni
(Horinouchi et al., 2003a), y HsaD en M. tuberculosis (Lack et al., 2008; Lack et al.,
2009) o R. jostii RHA1 (van der Geize et al., 2007) originando los ácidos 2-hidroxi-
2,4-hexadienoico (Figura 5, (14)) y 9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-
15
Introducción
oico (DOHNAA) (Figura 5, (15)). Los siguientes pasos, en los que muy
probablemente participan los genes catabólicos tesE, tesF, y tesG en C.
testosteroni (Horinouchi et al., 2005) conducirían a metabolitos que entrarían ya en
rutas generales de degradación (Kieslich, 1985). Sin embargo, las enzimas que
intervienen en esta ruta baja están aún por confirmar. Parece que el ácido 2-
hidroxi-2,4-hexadienoico se metaboliza a ácido 4-hidroxi-2-oxo-hexanoico (este
paso estaría catalizado por TesE) (Figura 5, (16)) que finalmente se rompería en
ácido pirúvico y propionaldehído (probablemente por la acción de TesG), que se
transformaría en propionil-CoA por acción de TesF. Por otra parte, se ha
propuesto que el DOHNAA se degradaría a ácido succínico. Se asume que el
primer paso en la degradación de este compuesto podría ser la eliminación de su
fracción propionil para producir ácido 9,17-dioxo-1,2,3,4,5,6,10,19-
octanorandrostan-7-oico (Figura 5, (17)) a través de una β-oxidación típica
(Kieslich, 1985).
16
Introducción
HO O O
COLESTEROL (1) 5-COLESTEN-3-ONA (2) 4-COLESTEN-3-ONA (3)
COL. OXIDASA COL. OXIDASA
COL. DESHIDROGENASA COL. DESHIDROGENASA
O
CH2OH
O
26-HIDROXI-1,4-COLESTADIEN-3-ONA (5B)
COOH
O
ÁCIDO 1,4-COLESTADIEN-3-ONA-26-OICO (6B)
COOH
O
ÁCIDO 1,4-COLADIEN-3-ONA-24-OICO (7B)
COOH
O
ÁCIDO1,4-PREGNADIEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8B)
1,4-COLESTADIEN-3-ONA (4)
CH2OH
O
26-HIDROXI-4-COLESTEN-3-ONA (5A)
COOH
O
ÁCIDO 4-COLESTEN-3-ONA-26-OICO (6A)
COOH
O
ÁCIDO 4-COLEN-3-ONA-24OICO (7A)
COOH
O
ÁCIDO 4-PREGNEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8A)
¿HIDROXILA- CIÓN MEDIADA POR CITO- CROMO P450?
DESHIDROGENACIÓN
DESHIDROGENACIÓN
DESHIDROGENACIÓN
DESHIDROGENACIÓN
DESHIDROGENACIÓN
OXIDACIÓN
OXIDACIÓN
OXIDACIÓN
OXIDACIÓN
OXIDACIÓN
OXIDACIÓN
17
Introducción
COOH
O
ÁCIDO 4-PREGNEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8A)
COOH
O
ÁCIDO 1,4-PREGNADIEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8B)
O O
O
4-ANDROSTEN-3,17 DIONA (AD) (9A)
O
OOH
9 ALFA-HIDROXI-4-ANDROSTEN-3,17DIONA (10A)
KstH
KsdD/KstD/Tes H
O
1,4-ANDROSTADIEN-3,17-DIONA (ADD) (9B)
OXIDACIÓN OXIDACIÓN
DESHIDROGENACIÓN
O
OOH
9 ALFA-HIDROXI-1,4-ANDROSTADIEN-3,17-DIONA (10B)
KsdD/KstD/Tes H
KshAB/KstH
¿APERTURA ESPONTÁNEA?
O
O
HO
3-HSA (11)
O
HO
O
OH
3,4-DHSA (12)
Tes A1A2
HsaC/Tes BHOOC
O
HOOC
O
O O
O
HOOC
O
OOH
OH
HsaD/Tes D
4,9-DSHA(13) O
O
HOOC
ÁCIDO 2-HIDROXI-2,4-HEXADIENOICO(14)
DOHNAA (15)
18
Introducción
O
OOHOH
HOOC OH
O
O
HOOC
ÁCIDO 2-HIDROXI-2,4-HEXADIENOICO (14)
DOHNAA (15)
Tes E
O COOH
ÁCIDO 4-HIDROXI-2-OXOHEXANOICO (16)ÁCIDO PIRÚVICO
O
PROPANAL
¿Tes G?
¿Tes F?O
PROPIONIL-CoACOOH
O
O
O
O
O
COOH
COOH
COOHOH
COOH
O
O
OHO
HO
SUCCINATO
ÁCIDO 9,17-DIOXO-1,2,3,4,5,6,10,19-OCTANORANDROSTAN-7-OICO (17)
Figura 5. Ruta postulada de degradación microbiana aeróbica del colesterol. Se indican las
distintas nomenclaturas de las enzimas implicadas en los pasos caracterizados. Es posible que la
4-colesten-3-ona (3) o alguno de los sucesivos metabolitos producto de la degradación de la
cadena lateral hasta (e incluida) la AD (9A) sufran una reacción de deshidrogenación que
introduzca un doble enlace en la posición 1, dando lugar al compuesto colesta-1,4-dien-3-ona (4) en el caso de la 4-colesten-3-ona, o a los correspondientes 1,2-deshidro derivados de las demás
19
Introducción
moléculas (nombrados con la letra B). Estos compuestos se han rodeado con línea discontinua en
la figura. Seguirían un proceso degradativo de la cadena lateral idéntico al que sufre la 4-colesten-
3-ona hasta el intermediario común 9α-hidroxi-1,4-androstadien-3,17-diona (10B).
2.1.2 Enzimas responsables de la transformación del colesterol en 4-colesten-3-ona
Como ya se ha comentado anteriormente, el primer paso en la degradación
aeróbica del colesterol es la oxidación de colesterol a 4-colesten-3-ona a través de
dos reacciones secuenciales: la oxidación de colesterol a 5-colesten-3-ona (Figura
5, (2)) seguida de su isomerización a 4-colesten-3-ona (Figura 5, (3)). Hasta la
fecha existen dos tipos de enzimas descritas que son capaces de realizar esta
reacción: las colesterol oxidasas y las 3-β hidroxiesteroide
deshidrogenasas/isomerasas. En ambos casos se trata de enzimas bifuncionales
que incluyen actividad 3β-hidroxiesteroide oxidasa o deshidrogenasa y actividad
Δ5-3-cetoesteroide isomerasa.
2.1.2.1 Enzimas con actividad colesterol oxidasa Las colesterol oxidasas (EC 1.1.3.6) (en lo sucesivo abreviadas como CO)
son enzimas flavin adenin dinucleótido (FAD)-dependientes bien caracterizadas y
de las que se conoce su estructura tridimensional. Se distinguen dos clases de
CO; la clase I está formada por aquellas CO en las que el FAD no está
covalentemente unido a la proteína, y la clase II por aquellas CO en las que el
FAD está unido covalentemente a un residuo de histidina. La actividad catalítica
de estas dos clases de CO es la misma, pero no comparten homología de
secuencia y pertenecen a diferentes familias (Aparicio y Martin, 2008). La clase I
pertenece a la familia de las GMC (glucosa/metanol/colina) oxidorreductasas, y se
han identificado enzimas de esta clase principalmente en actinomicetos (Doukyu,
2009). De esta clase se conocen las estructuras cristalinas de la CO de
Streptomyces sp. SA-COO (Lario et al., 2003; Yue et al., 1999) y de
20
Introducción
Brevibacterium sterolicum (Li et al., 1993; Vrielink et al., 1991). La clase II
pertenece a la familia de las VAO (vainillil/alcohol oxidasas). Se han identificado
enzimas de esta clase en B. sterolicum, R. erythropolis y bacterias Gram-
negativas (Doukyu, 2009). Además se ha determinado la estructura de una CO de
clase II de B. sterolicum (Coulombe et al., 2001). Las CO en la mayoría de los
casos requieren oxígeno molecular para formar 4-colesten-3-ona y peróxido de
hidrógeno (Smith y Brooks, 1974). Sin embargo, algunas CO de Burkholderia
cepacia ST-200, Pseudomonas spp., y Chromobacterium sp. DS-1 oxidan el
colesterol mayoritariamente a 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona y peróxido de
hidrógeno, y no a 4-colesten-3-ona (Doukyu y Aono, 1999; Doukyu et al., 2008).
Este intermediario no se ha asociado hasta el momento a ninguna ruta de
degradación completa de colesterol; de hecho, la cepa Burkholderia cepacia ST-
200 (antes denominada Pseudomonas sp. ST-200) es incapaz de crecer en
colesterol o 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona, lo que sugiere que el colesterol no es
el sustrato natural de esta enzima (Doukyu y Aono, 1999) o que la transformación
tiene otro fin distinto al de obtención de energía.
Hay que señalar que las CO mejor caracterizadas hasta la fecha, e. g., ChoA
y ChoM de Streptomyces sp SA-COO, ChoB de Bacillus sterolicum, ChoE de
Rhodoccocus equi y ChoD de M. tuberculosis (todas de clase I) son extracelulares
y parecen actuar más como factores de virulencia que como parte de un sistema
catabólico (Brzostek et al., 2007; Navas et al., 2001). De hecho, algunos estudios
(Av-Gay y Sobouti, 2000) postulaban que las micobacterias de crecimiento lento,
es decir, las patógenas como M. tuberculosis, M. bovis y M. leprae, poseían CO de
naturaleza extracelular, que aclaraban del medio el colesterol, y podían modificarlo
o almacenarlo, pero este no era utilizado como fuente de carbono, en
contraposición con las micobacterias de crecimiento rápido, como M. smegmatis,
que poseerían CO intracelulares y que sí utilizan el colesterol como fuente de
carbono y energía. De confirmarse esta hipótesis, se podría efectivamente
relacionar a las CO extracelulares micobacterianas con la patogenicidad y a las
intracelulares con el catabolismo del colesterol. Sin embargo, en estudios más
recientes se ha comprobado que el patógeno M. tuberculosis sí puede utilizar el
colesterol como fuente de carbono y energía (Brzostek et al., 2009; Pandey y
21
Introducción
Sassetti, 2008), con lo cual se especula que las CO extracelulares podrían formar
parte de la ruta catabólica del colesterol. Otra posible interpretación es que las CO
extracelulares se utilicen efectivamente en patogénesis y que otra enzima sea la
responsable de transformar el colesterol intracelularmente en 4-colesten-3-ona
para su metabolismo completo, como parece ser el caso en M. tuberculosis, donde
una hidroxiesteroide deshidrogenasa, además de ChoD, cataliza esta
transformación, e intracelularmente (Yang et al., 2007).
2.1.2.2 Enzimas con actividad 3-β hidroxiesteroide
deshidrogenasa/isomerasa
Las 3-β-hidroxi-Δ5-esteroide deshidrogenasas son una familia de enzimas
que catalizan la conversión de 3-β-hidroxi-5-eno-esteroides a 3-oxo-4-eno-
esteroides a través de una reacción de oxidación y una isomerización, utilizando
NAD+ o NADP+ como cofactores. El análisis de las bases de datos genéticas ha
puesto de manifiesto la existencia de una superfamilia de proteínas que además
de las esteroide deshidrogenasas bacterianas incluye a las 3-β-hidroxiesteroide
deshidrogenasas de mamíferos, las dihidroflavonol reductasas de plantas, las
UDP-galactosa-4-epimerasas bacterianas y las 3-β-hidroxiesteroide
deshidrogenasas víricas (Baker y Blasco, 1992). Las 3-β-hidroxiesteroide
deshidrogenasas bacterianas están filogenéticamente menos relacionadas con las
deshidrogenasas de mamíferos que las víricas. Sin embargo, su función podría ser
similar, esto es, la síntesis de hormonas esteroideas o de flavonoles bacterianos
(Yang et al., 2007). A esta familia pertenecen por ejemplo la enzima colesterol
deshidrogenasa NAD(P)-dependiente [NAD(P)-CDH] responsable del paso de
colesterol a 4-colesten-3-ona en el género Nocardia (Horinouchi et al., 1991) y la
3-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa Rv1106c de M. tuberculosis (Yang et al.,
2007), implicada, además de en la transformación de colesterol a 4-colesten-3-
ona, en la oxidación e isomerización de la dehidroepiandrosterona y la
pregnenolona. El hecho de que la colesterol deshidrogenasa de Nocardia se active
a nivel transcripcional por la adición de colesterol al medio de cultivo (Horinouchi
et al., 1991) y de que la interrupción del gen Rv1106c reduzca la oxidación de
22
Introducción
colesterol en M. tuberculosis por lo menos 90 veces (Yang et al., 2007) sugiere
una implicación directa de estas enzimas en el catabolismo del colesterol en los
organismos donde están presentes.
2. 2 Degradación anaeróbica de esteroides
Las transformaciones de esteroides más estudiadas que suceden en
ambientes anóxicos tienen lugar durante la circulación enterohepática en
mamíferos y son producidas por bacterias intestinales anaeróbicas. Se ha
constatado la rotura de enlaces alquilaril éter, deshidroxilaciones y oxidaciones o
reducciones en el carbono 17, pero no se ha descrito la rotura del núcleo
esteroideo por estas bacterias para la obtención de energía (Groh et al., 1993). Un
ejemplo de estos microorganismos es Bacteroides sp. cepa D8, primera bacteria
encontrada en el colon humano capaz de convertir colesterol, 4-colesten-3-ona y
coprostanona a coprostanol (Gerard et al., 2007). En 1988 se demostró por vez
primera la existencia de bacterias capaces de crecer en colesterol bajo
condiciones desnitrificantes (Taylor et al., 1981). Recientemente se han descrito
bacterias desnitrificantes capaces de oxidar colesterol y otros esteroides
completamente. Ejemplos de estos microorganismos son Denitratisoma
oestradiolicum, capaz de degradar 17β-estradiol utilizando el nitrato como aceptor
de electrones (Fahrbach et al., 2006); Steroidobacter denitrificans, degradadora de
estradiol, estrona, testosterona y AD (Fahrbach et al., 2008) o las cepas 72Chol
(Harder y Probian, 1997) y Sterolibacterium denitrificans (Tarlera y Denner, 2003),
capaces de oxidar completamente el colesterol.
Aunque algunas de estas bacterias han sido caracterizadas
exhaustivamente, todavía no existe mucha información sobre las rutas de
degradación o las enzimas implicadas en las mismas. Los estudios más
avanzados hasta el momento se han realizado con S. denitrificans, en el que se
han propuesto los pasos iniciales de la ruta de degradación de colesterol anóxica
(Chiang et al., 2007). Según estos estudios, el primer paso de la ruta hasta el
metabolito 4-colesten-3-ona estaría catalizado por la enzima AcmA, una
deshidrogenasa/reductasa de cadena corta NAD(P) dependiente (Chiang et al.,
23
Introducción
2008b). El segundo paso de la ruta estaría catalizado por una 4-colesten-3-ona-Δ¹-
deshidrogenasa denominada AcmB (Chiang et al., 2008a; Chiang et al., 2008b).
Este paso implicaría la producción de 25-hidroxi-4-colesten-3-ona mediante la
hidroxilación del carbono terciario de la cadena lateral, paso que difiere de los
descritos hasta ahora para las rutas aeróbicas y que presuntamente estaría
catalizado por una enzima de la familia de las molibdeno-hidroxilasas, que utilizan
agua como fuente del átomo de oxígeno incorporado al sustrato (Chiang et al.,
2007). Alternativamente, estos intermediarios pueden originarse como las
correspondientes 1,2-deshidro estructuras, colesta-1,4-dien-3-ona y 25-
hidroxicolesta-1,4-dien-3-ona. Los pasos iniciales del catabolismo anóxico del
colesterol propuestos para S. denitrificans se muestran en la figura 6.
Figura 6. Pasos iniciales propuestos para el metabolismo anóxico del colesterol en Sterolibacterium
denitrificans (Chiang et al, 2008b).
HO O O
O
OH
O
OH
O
AcmA AcmA
AcmB
H2OAcmB
H2O
COLESTEROL 5-COLESTEN-3-ONA 4-COLESTEN-3-ONA
25-HIDROXI-4-COLESTEN-3-ONA
25-HIDROXI-1,4COLESTADIEN-3-ONA
1,4-COLESTADIEN-3-ONA
24
Introducción
3. Regulación de las rutas de degradación de compuestos esteroideos
Existen todavía muy pocos estudios sobre la regulación de los genes
implicados en la degradación microbiana de compuestos esteroideos. Como en el
caso de los genes catabólicos, los estudios más avanzados en regulación se han
llevado a cabo en la bacteria C. testosteroni. En este microorganismo se ha
descrito que la expresión del gen hsdA está regulada por dos genes denominados
repA y repB (Xiong et al., 2001; Xiong et al., 2003). RepA actúa como un represor
transcripcional uniéndose a dos secuencias operadoras situadas en la región 5’ de
hsdA, mientras que RepB actúa como un represor traduccional uniéndose al
mRNA de hsdA. En ambos casos se produce la desrepresión del sistema cuando
existe testosterona en el medio, que se une a las proteínas represoras evitando su
unión al DNA o mRNA. Otro regulador, denominado TeiR, y perteneciente a la
familia LuxR, regula la expresión de varios genes implicados en la degradación de
la testosterona (Linares et al., 2008; Pruneda-Paz et al., 2004). Esta proteína se
ha estudiado en mayor detalle muy recientemente y se ha demostrado que es una
kinasa que presenta tres dominios funcionales (anclaje, unión a esteroide,
regulador). Se localiza anclada en la membrana, responde a diferentes esteroides
y está implicada en quimiotaxis (Göhler et al., 2008). La regulación de la ruta de
degradación del colesterol en el género Mycobacterium se ha comenzado a
estudiar recientemente, lo que se comentará en el apartado 5.
4. Mecanismos de transporte del colesterol
Los mecanismos de transporte de colesterol y otros esteroides en bacterias
todavía no se conocen en detalle. Los estudios más avanzados en este sentido se
están llevando a cabo en las actinobacterias. El análisis de las bases de datos de
secuencias génicas indica que diversas actinobacterias, incluyendo miembros de
los géneros Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus y Streptomyces y tanto de
especies patógenas como de saprófitas, contienen loci mce (Casali y Riley, 2007;
25
Introducción
McLeod et al., 2006). Las proteínas Mce (de mammalian cell entry) presentes en
actinobacterias son componentes de sistemas de transporte ABC (ATP-binding
cassette) complejos, que incluyen más de 8 proteínas distintas (Casali y Riley,
2007). En M. tuberculosis hay hasta 4 loci (mce 1-4). Los genes mce de M.
tuberculosis se han asociado con patogénesis, aunque su función todavía no está
totalmente clarificada. Parece que, por ejemplo, el gen mce1A está implicado en
facilitar la fagocitosis de las bacterias por macrófagos (Arruda et al., 1993). Los
dos primeros genes de estos loci (llamados yrbE) codifican proteínas
transmembrana con similitud con los componentes permeasa de transportadores
ABC. El rasgo distintivo de este tipo de transportadores es una ATPasa con
características conservadas. Todas las actinobacterias con loci mce contienen
genes que codifican ATPasas de la familia Mkl, normalmente no próximos a los
loci mce (Casali y Riley, 2007). En M. tuberculosis esta ATPasa está codificada
por un gen denominado mceG. Recientemente, se ha comprobado que el locus
mce4 de R. jostii RHA1 se induce durante el crecimiento en colesterol (van der
Geize et al., 2007). En M. smegmatis se ha demostrado que el operón mce4 está
regulado por la proteína KstR, regulador de la familia TetR que actúa como
represor transcripcional de genes relacionados con el metabolismo del colesterol
(Kendall et al., 2007). Estos hallazgos implicaban que este locus podía estar
relacionado con el transporte de colesterol, hecho que se ha visto confirmado en
R. jostii RHA1, donde se ha comprobado que distintos mutantes en el locus mce4
son incapaces tanto de captar como de crecer en colesterol (Mohn et al., 2008).
Esta incapacidad de crecimiento se presenta así mismo en presencia de
moléculas con estructura similar como el β-sitosterol, el 5α-colestanol y la 5α-
colestanona, que poseen una cadena lateral en el carbono 17 de 8 o más átomos
de carbono, mientras que estos mutantes siguen creciendo en AD, ácido cólico y
progesterona, moléculas con cadenas laterales más cortas y más polares (Mohn
et al., 2008). En M. tuberculosis, mutantes en el gen yrbE4A así como en la
ATPasa mceG tienen un escaso crecimiento en colesterol, aunque este se ve
recuperado a tiempos largos, lo que sugiere que podría existir otro sistema de
transporte secundario (Pandey y Sassetti, 2008). Así mismo, los mutantes en
estos genes presentan una virulencia disminuida en modelos animales (Pandey y
26
Introducción
Sassetti, 2008). El hecho de que este locus esté presente en micobacterias
saprófitas indica que su función no se limita a la virulencia (Mohn et al., 2008), lo
que se explica fácilmente teniendo en cuenta que en la naturaleza los esteroides
son sustratos valiosos y abundantes; el locus mce4 habría adquirido
posteriormente su papel en patogénesis.
5. Degradación aeróbica del colesterol y compuestos esteroideos en el género Mycobacterium
El género Mycobacterium es el único de la familia Mycobacteriaceae, del
orden Actinomycetales. Las micobacterias son bacterias aerobias con forma de
bacilos rectos o ligeramente curvados y miden 0,2-0,6 µm de ancho por 1,0-10 µm
de largo. Poseen un contenido en G+C muy elevado (62-70%). Son bacterias
típicamente ácido-alcohol resistentes aunque suelen considerarse Gram-positivas.
Todas las especies de Mycobacterium comparten una característica pared celular,
más gruesa que la de muchas otras bacterias, hidrofóbica y rica en ácidos
micólicos y lípidos. Esta pared celular proporciona una contribución sustancial a la
resistencia de este género de bacterias. El género incluye patógenos que causan
graves enfermedades en los mamíferos, como M. tuberculosis, M. bovis o M.
leprae, y también saprófitos de vida libre, no patógenos u oportunistas, como M.
smegmatis, M. aurum, M. phlei o M. fortuitum.
27
Introducción
Figura 7. Mycobacterium smegmatis mc2155.
Aunque ya se sabía desde hacía mucho tiempo que estas bacterias
degradaban colesterol, sólo muy recientemente se han realizado estudios
moleculares sobre la degradación aeróbica del colesterol con cepas de
Mycobacterium. Como ya se ha comentado anteriormente, no hace mucho se
postuló que los Mycobacterium de crecimiento rápido, por lo general no
patógenos, eran capaces de crecer en colesterol como única fuente de carbono y
energía, en tanto que los de crecimiento lento, que incluyen a los Mycobacterium
patógenos, podían acumular y modificar el colesterol pero no utilizarlo como fuente
de carbono y energía (Av-Gay y Sobouti, 2000). Esta teoría ha sido recientemente
refutada al comprobarse que M. tuberculosis sí puede crecer en colesterol
(Brzostek et al., 2009; Pandey y Sassetti, 2008).
Gracias a que el genoma de M. smegmatis se ha secuenciado recientemente,
se describieron por primera vez dos genes, ksdD1 y ksdD2, que podrían estar
implicados en la ruta de degradación del colesterol (paso de AD a ADD) y que
codifican dos posibles 3-cetoesteroide-Δ1-deshidrogenasas (Brzostek et al., 2005).
Poco tiempo después, se describió un gen que codifica una enzima KstH (Andor et
al., 2006), y que podría estar implicado en el paso de ADD a 9α-hidroxi-1,4-
androstadien-3,17-diona. Sin duda el avance más importante en el conocimiento
global de los genes implicados en la degradación del colesterol a nivel genético en
este microorganismo se logró como consecuencia del descubrimiento del
28
Introducción
regulador transcripcional KstR (Kendall et al., 2007). Previamente, se había
observado que en M. tuberculosis se inducía un gen durante infección en
macrófagos y que era esencial para la infección en ratones: Rv3574, que codifica
un regulador represor tipo TetR (Kendall et al., 2004). El gen ortólogo en M.
smegmatis, MSMEG_6042, fue delecionado y se comprobó que esto conllevaba la
inducción de un elevado número de genes (83) relacionados con el metabolismo
lipídico y más concretamente, como se verá a lo largo de esta tesis doctoral, con
el metabolismo del colesterol. En cuanto a su mecanismo de acción, se identificó
un motivo conservado en su propio promotor (TnnAACnnGTTnnA), así como en
las secuencias intergénicas de los genes a los que reprime, al que se postula que
la proteína se une como un dímero (Kendall et al., 2007). La desrepresión podría
producirse mediante la unión de KstR a la molécula de colesterol; de hecho se ha
encontrado un sitio de unión para esta molécula en un modelo de KstR
(comunicación personal). Más recientemente se ha encontrado otro regulador,
denominado KstR2, también un represor tipo TetR, que regula la expresión de 15
genes adicionales relacionados con el metabolismo de colesterol (Kendall et al.,
2010). De estos dos reguladores se hablará más extensamente en el apartado 5
de resultados.
Profundizando en el papel del colesterol en la patogénesis causada por estas
bacterias, hay que señalar que desde hace tiempo se ha relacionado la entrada de
diversas bacterias patógenas en células del sistema inmune y su mantenimiento
dentro de las mismas con dominios de la membrana plasmática de estas células
ricos en colesterol. Este es el caso por ejemplo de M. tuberculosis o M. bovis
Calmette-Guérin en macrófagos; este proceso, que requiere de dominios ricos en
colesterol en la membrana del macrófago, a los que las micobacterias se unen
específicamente a través del colesterol, supone que las micobacterias que
penetran en el interior del macrófago queden ‘secuestradas’ en fagosomas
recubiertos de TACO (proteína de cubierta que contiene triptófano y aspartato)
que previene la fusión lisosomal y asegura la supervivencia intracelular del
patógeno (Gatfield y Pieters, 2000). Estos dominios ricos en colesterol también
son necesarios para la entrada de M. kansasii (Peyron et al., 2000) o Bordetella
pertussis (Lamberti et al., 2008) en neutrófilos. Se especula que la unión
29
Introducción
específica de las micobacterias al colesterol podría deberse al alto contenido en
glicolípidos de su pared celular (Gatfield y Pieters, 2000). Por otra parte, se ha
visto que el operón mce4 de M. tuberculosis, que está en general presente en los
Actinomycetales (Casali y Riley, 2007) y que codifica un sistema de importación de
colesterol, es esencial para la supervivencia del patógeno durante los tiempos
prolongados de infección (Joshi et al., 2006; Sassetti y Rubin, 2003). Este
hallazgo hizo que se investigase y que finalmente se verificase la capacidad del
patógeno de crecer en colesterol como única fuente de carbono y energía. Se
postula que esta capacidad para degradar el colesterol la hereda de sus ancestros
saprofíticos, y que puede permitir a la bacteria aprovechar este esteroide para
conseguir carbono y energía en un compartimento intracelular que de hecho causa
la inanición de otros patógenos potenciales (Pandey y Sassetti, 2008). Además se
ha comprobado que los mutantes de M. tuberculosis en el gen choD presentan
una patogenicidad atenuada (Brzostek et al., 2009).
Por otro lado, hay que destacar que desde hace tiempo se sabe que el
colesterol puede sintetizarse también en bacterias (Hayami et al., 1979; Weeks y
Francesconi, 1978). No hace mucho se ha descrito que M. smegmatis es capaz de
sintetizar de novo este compuesto y que M. tuberculosis y M. leprae poseen genes
homólogos a los genes responsables de la biosíntesis del colesterol en levaduras
(Lamb et al., 1998). Más aún, en M. tuberculosis se ha caracterizado una actividad
esterol 14α-demetilasa (CYP51) (Podust et al., 2001) correspondiente a un
citocromo P-450 homólogo al que está implicado en la biosíntesis de esteroles en
hongos y que se ha estudiado exhaustivamente, ya que podría constituir una
excelente diana para desarrollar fármacos antifúngicos. La coexistencia en
Mycobacterium de una ruta biosintética y otra degradativa para el colesterol,
resulta muy interesante a la vez que plantea interrogantes.
Tras todo lo anteriormente expuesto, parecía interesante caracterizar desde
el punto de vista genético y bioquímico la ruta de degradación aeróbica del
colesterol utilizando como sistema modelo de estudio la bacteria M. smegmatis
mc2155 (Snapper et al., 1990) (figura 7) ; se trata de una bacteria de crecimiento
rápido en medios ricos y medios sintéticos simples, que se ha desarrollado y
30
Introducción
utilizado internacionalmente como cepa tipo por su alta eficacia de transformación
para el estudio de las micobacterias. Su velocidad de crecimiento en colesterol, en
donde alcanza densidades ópticas a 600 nm próximas a 2 y donde llega a fase
estacionaria aproximadamente en 48 h, la convierten en un buen candidato para el
estudio de esta ruta de degradación. Su genoma completo ha sido además
secuenciando recientemente. El interés surge principalmente desde un punto de
vista medioambiental, pero teniendo también en cuenta que por tratarse de una
especie muy próxima a M. tuberculosis, los resultados que se obtuviesen podrían
extrapolarse fácilmente a este patógeno. Esta extrapolación resultaría muy
interesante dada la relación del colesterol con los mecanismos de patogenicidad
en M. tuberculosis.
Al inicio de esta tesis doctoral, la ruta de degradación del colesterol en este
organismo era prácticamente desconocida, aunque actualmente se han
caracterizado algunos de los pasos implicados, gracias en gran medida al
descubrimiento de la existencia de un gran catabolón de esteroides en
actinomicetos (Kendall et al., 2007; van der Geize et al., 2007) .
31
32
Objetivos
II. OBJETIVOS
33
Objetivos
34
Objetivos
II. OBJETIVOS
Como se ha comentado en la Introducción, al comienzo de esta tesis doctoral
se desconocían la mayor parte de los genes implicados en el catabolismo del
colesterol en Mycobacterium smegmatis mc2155, así como sus posibles
mecanismos de regulación.
Dado el interés que planteaba el conocimiento de esta ruta metabólica, tanto
desde un punto de vista medioambiental como por el posible papel del
metabolismo del colesterol como un mecanismo de patogenicidad en especies
próximas a M. smegmatis, en esta tesis se han abordado los siguientes objetivos:
1. Identificación in silico de los genes de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis. Utilizando los bancos de datos de secuencias y la
información acumulada sobre el catabolismo del colesterol en distintos
microorganismos se planteó el análisis del genoma de M. smegmatis para
identificar in silico aquellos genes que pudieran estar implicados en dicho
catabolismo.
2. Caracterización de genes de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis. Mediante este objetivo, una vez realizado el estudio in silico, se
confirmaría la verdadera implicación en el metabolismo del colesterol de los genes
hallados utilizando las técnicas de RT-PCR, microarrays y la construcción de
mutantes de inserción por recombinación homóloga sobre M. smegmatis. La
técnica de microarrays permitiría así mismo la caracterización de nuevos genes
implicados en esta ruta de degradación.
3. Identificación y caracterización de la proteína responsable de la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona. Con este objetivo se
pretende identificar la enzima o enzimas implicadas en la primera etapa esta ruta
catabólica. Los genes que codifican estas enzimas se clonarían y se expresarían
en Escherichia coli para caracterizarlas bioquímicamente.
35
Objetivos
4. Estudio de la regulación del catabolismo del colesterol. Mediante este
objetivo se pretende identificar y caracterizar los reguladores implicados en la
degradación del colesterol. Los genes que codifican estos reguladores se
clonarían y expresarían para estudiar su actividad in vitro e in vivo.
36
Materiales y Métodos
III. MATERIALES Y MÉTODOS
37
Materiales y Métodos
38
Materiales y Métodos
III. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos utilizados
Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo se describen en la Tabla 1.
Los plásmidos empleados para la clonación, mutación y expresión génica se
muestran en la Tabla 2. Los oligonucleótidos sintéticos utilizados en este trabajo
para la amplificación de productos por PCR se presentan en la Tabla 3. Los
oligonucleótidos sintéticos empleados en los ensayos de RT-PCR de genes
posiblemente pertenecientes a agrupaciones génicas de degradación del
colesterol se muestran en la Tabla 4. Los oligonucleótidos sintéticos utilizados en
RTq-PCR se muestran en la Tabla 5. Todos los oligonucleótidos utilizados en este
trabajo se adquirieron en Sigma-Genosys.
Tabla 1. Cepas bacterianas ESTIRPE
CEPA
GENOTIPO/FENOTIPO RELEVANTE
REFERENCIA
E. coli
DH5α
F-, endA1, hsdR17 (rk
-mk+), supE44, thi-1, recA1, gyrA,
relA1, Δ(argF-lac)U169, deoRΦ80dlac, Δ (lacZ)M15
(Hanahan, 1983)
E. coli
DH10B
F-, mcrA, Δ (mrr hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, λ-, rpsL, endA1, nupG
Life Technologies
E. coli
BL21 (DE3)
F-, ompTgal[cdm] [lon] hsdSB con DE3 B
(Studier y Moffatt, 1986)
M. smegmatis
mc²155
ept-1 , mutante de mc²6 eficiente para electroporación
(Snapper et al., 1990)
M. smegmatis
::MSMEG_0217
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_0217 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_1366
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_1366 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_1543
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_1543 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_1604
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_1604 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_3519
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_3519 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_5228
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5228 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
39
Materiales y Métodos
M. smegmatis
::MSMEG_5233
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5233 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_5995
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5996 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_6036
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_6036 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
ΔMSMEG_5228
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5228 delecionado mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228
Doble mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5228 delecionado y el gen MSMEG_1604 interrumpido mediante recombinación homóloga
Este trabajo
M. smegmatis
ΔkstR
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_6042 delecionado
(Kendall et al., 2007)
M. smegmatis
ΔkstR2
Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_6009 delecionado
(Kendall et al., 2010)
M. smegmatis
ΔkstR/ΔkstR2
Doble mutante de mc²155 con los genes MSMEG_6042 y MSMEG_6009 delecionados
(Kendall et al., 2010)
Tabla 2. Plásmidos
PLÁSMIDO DESCRIPCIÓN REFERENCIA
pUC19
Vector de clonación, Apr oriColE1, lacZα
(Sambrook y Russell, 2001)
pGEM-T easy
Vector de clonación de productos de PCR, Apr, oriColE1, lacZα
Promega
pET-29a(+)
Vector de clonación e hiperexpresión, Kmr, oriColE1
Novagen
pJQ200X
Vector de clonación suicida para micobacterias para la construcción de mutantes por recombinación homóloga. Gmr
(Jackson et al., 2001)
pSUM36
Vector de clonación, oriE, oriM, Kmr
(Aínsa et al., 1996)
pUC5228DR
Vector pUC19 que contiene los fragmentos up-5228 y down-5228. Apr
Este trabajo
pGEM1604
Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_1604. Apr
Este trabajo
pGEM5228
Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_5228. Apr
Este trabajo
pGEM5233
Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_5233. Apr
Este trabajo
pGEM6042
Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_6042. Apr
Este trabajo
40
Materiales y Métodos
pET1604
Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_1604. Kmr
Este trabajo
pET5228
Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_5228. Kmr
Este trabajo
pET5233
Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_5233. Kmr
Este trabajo
pET6042
Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_6042 . Kmr
Este trabajo
pJQ0217
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_0217. Gmr
Este trabajo
pJQ1366
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1366. Gmr
Este trabajo
pJQ1543
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1543. Gmr
Este trabajo
pJQ1604
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1604. Gmr
Este trabajo
pJQ1604int
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1604. Gmr. Utilizado para la construcción de un mutante doble.
Este trabajo
pJQ3519
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_3519. Gmr
Este trabajo
pJQ5228
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_5228. Gmr
Este trabajo
pJQ5228DR
Vector pJQ200X que contiene los fragmentos up-5228 y down-5228. Gmr
Este trabajo
pJQ5233
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_5233. Gmr
Este trabajo
pJQ5995
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_5995. Gmr
Este trabajo
pJQ6036
Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_6036. Gmr
Este trabajo
pUJ9
Vector que contiene el gen lacZ sin promotor. Apr
(de Lorenzo et al., 1990)
pUJ9-5228 Derivado de pUJ9 que contiene la fusión P5228 :: lacZ Este trabajo
41
Materiales y Métodos
Tabla 3. Oligonucleótidos generales. Las secuencias marcadas en negrita en varios de ellos se
corresponden con dianas de restricción creadas.
OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA 5’-3’ UTILIDAD
CO5 GGAACTCATATGAAGCCTGACTACGACGTC Amplificación de MSMEG_1604. NdeI
CO3 CAGAATTCCTACCCCGCCGACGACAC Amplificación de MSMEG_1604. EcoRI
5228-F CATATGGCTGACTCCACCACCGAC Amplificación de MSMEG_5228. NdeI
5228-R AAGCTTCGTGCTGCCCTGAACTAG Amplificación de MSMEG_5228. HindIII
5233 pET F GGAATTCCATATGTCCGACGCCTTGGTCAC Amplificación de MSMEG_5233. NdeI
5233 pET R CCGGATCCATCGCGACGCGTTGACTCA Amplificación de MSMEG_5233. BamHI
pET6042 F CATGCATATGGCCGGAAACTCACAGC Amplificación de MSMEG_6042. NdeI
pET6042 R CATGCTCGAGGATCTTAGGTTGCTCCTCGG Amplificación de MSMEG_6042. XhoI
MSMEG_1604 F int CTAGTCTAGAGGACACGTTCGTGCAGACG
Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1604. XbaI
MSMEG_1604 R int CTAGGAGCTCCGTTTGGTGTAGGTGGTGATC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1604. SacI
MSMEG_5228 UP F CTAGGAATTCGGGCCCCGACGAGATCCACCGCGCC
Amplificación de un fragmento upstream de MSMEG_5228. EcoRI-ApaI
MSMEG_5228 UP R CTAGTCTAGAGATATCCCAGCAGTTCGGTGACCAG
Amplificación de un fragmento upstream de MSMEG_5228. XbaI-EcoRV
MSMEG_5228 DOWN F
CTCACTGCAGGATATCAGATGGAGGCGCAGGCCCG
Amplificación de un fragmento downstream de MSMEG_5228. PstI-EcoRV
MSMEG_5228 DOWN R
CTAGAAGCTTGGGCCCGGAACCGAACTGCTGAACTC
Amplificación de un fragmento downstream de MSMEG_5228. HindIII-ApaI
MSMEG_6036 Rec F GCTCTAGACAAGGTCCTCGGCATGGTC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_6036. XbaI
MSMEG_6036 Rec R ATAAGAATGCGGCCGCCGGTGTCTTCATGTAGAACG
Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_6036. NotI
MSMEG_5233 F int CTAGTCTAGACCAACCGCAAATCAGCAACC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5233. XbaI
MSMEG_5233 R int CTAGACTAGTGATGAGCAGCACCTCGTGG Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5233. SpeI
MSMEG_1366 F int CATCGTCGACCCAAGGAGCTCTACGAGATC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1366. SalI
MSMEG_1366 R int CATGCTCGAGGAGGGTGTGCAGGATCTCG
Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1366. XhoI
42
Materiales y Métodos
MSMEG_5995 F int CTAGACTAGTGTGCTGCTCAACATGGACG Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5995. SpeI
MSMEG_5995 R int CTAGTCTAGAGAGTTCGACGTCCTCCAGC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5995. XbaI
MSMEG_0217 F int CATGCTCGAGCGACTACCACATCACCACGG
Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_0217. XhoI
MSMEG_0217 R int CATGCTGCAGGGTCAGGATCAACGCCTCTTC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_0217. PstI
MSMEG_1543 F int CATGCTGCAGATGGAGGAGAACCTCGAATCC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1543. PstI
MSMEG_1543 R int GATGGTCGACTCATGGTCTCGGTGTCCAGC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1543. SalI
MSMEG_3519 F int CATGTCTAGACACTCAACTCCCTCGTGCC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_3519. XbaI
MSMEG_3519 R int GTAGGGGCCCCGACACCATGTACTGCAGCG Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_3519. ApaI
pJQ200X dir xylE TTGATGTTACCCGAGAGCTTG Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X
pJQ200X dir xylE int GGTCCAAGCCTTCAGATAGAC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X
pJQ200X inv xylE GAGTTAGCTCACTCATTAGGC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X
pJQ200X inv xylE int TCACTCACGGCAAGACCATC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X
F24 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pUC19 o pGEM-T-Easy
R24 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pUC19 o pGEM-T Easy
63f CAGGCCTAACACATGCAAGT Empleado para amplificar el gen 16S rDNA
1387r GGGCGGAGTGTACAAGGC Empleado para amplificar el gen 16S rDNA
5228 FP F TCAGCGCGTCGAGCAGGC Empleado para amplificar la sonda MSMEG_5228 FP
5228 FP R GCAGTTCGGTGACCAGGTTG Empleado para amplificar la sonda MSMEG_5228 FP
Lac57 CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG
Determinación del sitio +1 del promotor P5228
5228pUJ9 F CTGAGAATTCTTGGATGATTCGCTGCAGC Amplificación de P5228 y posterior clonaje en pUJ9. EcoRI
5228pUJ9 R CTGAGGATCCATGCCCGCAGCATAACTG Amplificación de P5228 y posterior clonaje en pUJ9. BamHI
43
Materiales y Métodos
Tabla 4. Oligonucleótidos empleados en RT-PCR semicuantitativa. Las secuencias en negrita
se corresponden con dianas de restricción creadas.
GEN SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO F(directo) SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO R(reverso) MSMEG_5935 CGAAACTTCTGCGCAATGCC CCAGTCCGATACGCAGTGC
MSMEG_5936 ATGAAGAAGATGTCCGCACG GAAGAACGTCCGGTACAGG MSMEG_5937 ACGCGTCGACAACTACGGCTTCTCCAAGAC CCGCTCGAGTCATCAAAAAGCCCACGGTC
MSMEG_5938 ACGCGTCGACATCTTCTGCAGATCCTGCG CCGCTCGAGTGTCCGTCGCTGCTTGTAC
MSMEG_5939 AAAACTGCAGTACGAGGAAGCGGGCATTC CCGCTCGAGCTCGTGGTCTTGGTGAACTC
MSMEG_5940 AAACTGCAGAACTGGCAGATCAAGCTGTG CCACTCGAGTTGAGCCGCACACCGAAAC
MSMEG_5941 AAAACTGCAGAGGTCTCGAACCGCCGTAC CCGCTCGAGGACGAGGTTCTTGCCGCTG
MSMEG_5943 AAAACTGCAGAGCTTCCACATGACCGAGC CCGCTCGAGAAGATGGACCGCTTGGTGG MSMEG_5994 TCAACGGAACCAAAATCGGTG CAGTGCGAGTTGGTTGACC
MSMEG_5995 GGGCCCATGTCGTCGTTCGAGCTGATC GGGCTCGAGTCTGCGCGAACGCGATCATG
MSMEG_5996 AAAACTGCAGGACATCGACATGCCCAACC CCGCTCGAGTGTGGTGTCACGCAGACCC
MSMEG_5997 TTCTCGGGAGATCACCTGC CTAACGTGTGATGAACGGAC
MSMEG_5998 CAGACGTTCCTGTTCAAGAC GCTTCTCGCTCCTGGTCTG
MSMEG_5999 AAAACTGCAGCGCCAACGGCTCCAACGTC CCGCTCGAGAACTCGTGTTGATGATGCGC MSMEG_6000 AAAACTGCAGTGCCGTACGAGTTCCACAGC CCGCTCGAGCCTGGTTCTGCATGACCGC
MSMEG_6001 AAAACTGCAGGACGCCAAATTCGGTCTGC CCGCTCGAGTGTCCTTGGTGGCGATGTC
MSMEG_6002 GCTCTAGAACGTGCGCAGCTTCTGGG ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGAACAGGTCGTCGAAG
MSMEG_6003 CTAGTCTAGAAACCAGATCGATCGCTACGG CCGCTCGAGGGTAGATGTTGACGAACCGG
MSMEG_6004 CTAGTCTAGAACGCTCGACGAACTCAAGAC GGGCTCGAGGGACGGAATGACCACCACG
MSMEG_6005 CCGCTCGAGTATCACCTACCGCAGATCTTC ACGCGTCGACCTCCGAAAGATACTGCGAC MSMEG_6006 TGCAGTTGCTCGTCATCGC TGAGCTGCACGAGCATGAC
MSMEG_6007 AAAACTGCAGAAAGCTTTCTGACGGTGCTG CCGCTCGAGACCGTGAACAGACCGAACG
MSMEG_6008 CTAGTCTAGAAAGGAACTCGGATTCAGCAC GGAGCTCGGATCTCGTTGTCGAAGTGCC
MSMEG_6009 TCTCTCGGGCAGCCTGTAC ACATCTTGCGCTGCTCTTTTG
MSMEG_6010 GGTTACTGACGTGCGTTTCG ATACGGCACCAGTGCTGAG
MSMEG_6011 ACGTGGTGATCTCCGACTAC ACTCCTCGTCTGTCATGTCG MSMEG_6012 GCTCTAGAGACAAGGTCAACCACTTCGG CGAGCTCGCTGATTCCCCGTCGCTCC
MSMEG_6013 CGAGCTCGAAACGACGGCACCTGGGAC GCTCTAGATGATGCACAGGTAGCGGTC
MSMEG_6014 AACAGCTCGACCGTGTGTTG GAAGAAGATCTCGCCGAAC
MSMEG_6015 CGAGAAGTTCGACGGCATC CGGATTCGTGGCTTGCTCC
MSMEG_6016 CCGCTCGAGCACGCAGTGGGACACTTTCAC AAAACTGCAGTTGAGCGCCTGGAAGCTGC
MSMEG_6017 CTAGTCTAGATTCCTGGCGTGTTTCGACG GGAGCTCCAGTTCCTCGGGTGCGATCAC MSMEG_6033 CCTTCAGAACTGGTACAACG CCAGATTGGTGACGTTCTGC
MSMEG_6034 ATGGACGACCGGCGTCACGG TCAATTATCAGCTTCAGGG
MSMEG_6035 AAAACTGCAGCACGAGAACCAGCAGCACG CCGCTCGAGGGGTTTGGTCTTCGGCACC
MSMEG_6036 GCTCTAGATTCAAGGAGGGCACCTCGG ATAAGAATGCGGCCGCTCCTTGGTCAGCACGAC
MSMEG_6037 AAAACTGCAGAACGCTACAGCGCCAAG CCGCTCGAGGGTTCGACGTTGAACTTCGC
MSMEG_6038 GCTCTAGAACAACTGGCACCTCGCGC ATAAGAATGCGGCCGCCGTCGTCGATCGTGTACTC MSMEG_6039 GCTCTAGA
AGGACCTCGACACCGACTTC ATAAGAATGCGGCCGCAGCCAGTGCACCACGGTC
MSMEG_6040 AACCACGACAACGTGCTGTC TCAGCTGAACTTGGTCTGGG
44
Materiales y Métodos
Tabla 5. Oligonucleótidos empleados en RTq-PCR. Las secuencias en negrita se corresponden
con dianas de restricción creadas.
GEN SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO F (directo) SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO R (reverso) MSMEG_0217 CGACTACCACATCACCACGG TGACGTTCTTGCCGACCTTG MSMEG_1366 GTTCCTGAAGTCGCTGATCG GATCTCGTAGAGCTCCTTGG MSMEG_1604 TGCTGTTCAAGATGCGCGAC CCATCGCGTTGGAGCCCTTG
MSMEG_5906 TTCTGACCATCAACAGCGTCG CGATCGAGAAGTGCAGTTCAC MSMEG_5228 CGTACACCGAGCGTTTCAAC GGATCGAGCACGTCAGCATG MSMEG_5233 CTGCAGACCGTCGACGTG CTAGACTAGTGATGAGCAGCACCTCGTGG MSMEG_5895 GGTGTGGTGGCCAAGATGC GCACCAGGTCGATGTACTGC MSMEG_5920 TGGGTTTGCAACTCGGATATTG GGTGAACACGGTGTCGAAAC MSMEG_5925 CGACAACGTCACCGACATGG CGTTGTGCAGGTACTGGCTG MSMEG_6009 AGCAGATGGTCGAAGAGGTC CGTCAGCTTCTCCAGCGG MSMEG_6012 GCTCTAGAGACAAGGTCAACCACTTCGG CGAGCTCGCTGATTCCCCGTCGCTCC
MSMEG_6036 GCTCTAGATTCAAGGAGGGCACCTCGG ATAAGAATGCGGCCGCTCCTTGGTCAGCACGAC
MSMEG_6039 GCTCTAGAAGGACCTCGACACCGACTTC ATAAGAATGCGGCCGCAGCCAGTGCACCACGGTC
MSMEG_6041 TCGTCGACGGACGTGCTTC CGTCGAGCAGCAGCACATC
2. Medios y condiciones de cultivo 2.1. Escherichia coli
Todas las soluciones y medios de cultivo utilizados en este trabajo se
esterilizaron por calor húmedo en un autoclave a 121 ºC y 1 at de presión, o
mediante filtración utilizando filtros estériles Millipore de 0,2 micras de diámetro.
El medio complejo utilizado para cultivar las células de E. coli es el medio
Luria-Bertani (LB) (Sambrook y Russell, 2001). Los cultivos en medio sólido se
realizaron con medio LB al que se adicionó Bacto Agar (Pronadisa) al 1,5% (p/v).
Cuando fue necesario, se añadió 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
(X-Gal) 0,08 mM, así como isopropil-1-tio-β-galactopiranósido (IPTG) de 1,00 a
0,01 mM.
2.2. Mycobacterium smegmatis
Para el cultivo de micobacterias se utilizan los medios complejos Bacto
Middlebrook 7H10 Agar (Difco) y LB con 1,5% de agar como medios sólidos, y
45
Materiales y Métodos
Middlebrook 7H9 Broth (Difco) y LB como medios líquidos. Al medio Bacto
Middlebrook 7H9 Broth y 7H10 Agar se le añade Middlebrook ADC Enrichment
(Difco) (fórmula aproximada por litro de agua: NaCl (8,5 g), albúmina bovina
(Fracción V) (50 g), dextrosa (20 g), catalasa (0,03 g)) (1/5 del volumen final).
El medio 457 es un medio basal (pH 6,9) cuya composición se detalla a
continuación: KH2PO4 (1,52 g), Na2HPO4 (2,44 g), (NH4)2SO4 (0,5 g),
MgSO4·7H2O (0, 2 g), CaCl2·2H2O (0,05 g), H2O destilada csp 1 L. A este medio
se adicionó glicerol 0,6 M o 18 mM o colesterol 1,8 mM como fuente de carbono
para su utilización como medio mínimo.
Para los cultivos en medio líquido con colesterol se utilizó medio mínimo 457
al que se adicionó colesterol acomplejado con β-ciclodextrina metilada al azar,
hasta conseguir una concentración final de colesterol 1,8 mM, que se corresponde
con una concentración final de ciclodextrina 18 mM. El protocolo de síntesis de
estos complejos se detalla más adelante.
A todos los cultivos en medio líquido de micobacterias se le adiciona siempre
Tween 80 al 0,05% para evitar la agregación de las células.
Síntesis de complejos colesterol-metil-β-ciclodextrina
Este protocolo se ha llevado a cabo para conseguir un medio en el que el
colesterol se disuelva perfectamente, ya que así está repartido homogéneamente
y además no produce turbidez, lo que permite que se pueda medir
espectrofotométricamente el crecimiento de los cultivos en medio líquido. Esta
disolución se lleva a cabo mediante la formación de complejos de colesterol con
metil-β-ciclodextrina (TRMB-T Randomly Methylated BCD, CTD Inc.) Para ello se
ha seguido un protocolo de disolución de esteroides en ciclodextrinas descrito
previamente (Klein et al., 1995). Brevemente, una solución de 30 mg de colesterol
en 400 µl de isopropanol-cloroformo (2:1 v/v) se añade en pequeñas alícuotas a 1
g de β-ciclodextrina metilada al azar disuelta en 11 ml de PBS y en agitación en un
baño de agua a 80 ºC. La solución final contiene colesterol 6,8 mM y ciclodextrina
70 mM (≈9% ciclodextrina), y es la base que se añadirá al medio mínimo para
cultivos con colesterol en medio líquido o en placa. Habitualmente se preparan las
46
Materiales y Métodos
placas de cultivo con colesterol 1,8 mM (0,08% colesterol), con 1,5% de agar y
medio mínimo 457. Los cultivos líquidos también contienen colesterol 1,8 mM, que
se corresponde con una concentración final de ciclodextrina de 18 mM. Este
protocolo también se llevó a cabo para disolver los otros esteroides utilizados en
este trabajo, ajustando en cada caso la cantidad de esteroide utilizada según las
necesidades. En el caso del ergosterol, la cantidad de ciclodextrina necesaria para
su completa disolución fue mayor, por lo que la concentración final de ciclodextrina
en los medios de crecimiento fue de 35 mM. Como se puede apreciar en la figura
8, la ciclodextrina apenas puede ser utilizada por M. smegmatis como fuente de
carbono y energía. Los cultivos en medio líquido con ciclodextrina como única
fuente de carbono a las concentraciones utilizadas llegan a una DO600 máxima de
0,3. Así, cuando la ciclodextrina se encuentra acomplejada con un esteroide, se
puede discernir perfectamente el crecimiento debido al esteroide solubilizado.
A B Figura 8. M. smegmatis mc2155 sembrado en A. Placa con ciclodextrina 18 mM. B. Placa con colesterol 1,8 mM-ciclodextrina 18 mM.
Las células de E. coli y M. smegmatis se cultivaron a 37 ºC. Los cultivos en
medio líquido se llevaron a cabo en un agitador orbital a 300 rpm. El crecimiento
en medio líquido fue seguido por turbidimetría a 600 nm (DO600) empleando un
espectrofotómetro UVmini-1240 (SHIMADZU).
Los antibióticos se prepararon en soluciones acuosas 1000x, a excepción de
la ampicilina, que se preparó 250x. Las soluciones preparadas se esterilizaron por
filtración y se conservaron a –20 ºC. Los antibióticos se utilizaron a las
47
Materiales y Métodos
concentraciones finales que se indican a continuación. Para E. coli: ampicilina
(Ap, 100 μg/ml), kanamicina (Km, 50 μg/ml), higromicina (Hyg, 150 μg/ml),
gentamicina (Gm, 10 μg/ml). Para M. smegmatis: kanamicina (Km, 20 μg/ml),
higromicina (Hyg, 50 μg/ml) y gentamicina (Gm, 5 μg/ml).
Durante periodos inferiores a un mes las cepas se conservaron a 4 ºC en
placas de LB, 7H10 o medio mínimo. Para la conservación a largo plazo, las
bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 20%
(v/v) para E. coli y al 50% (v/v) para M. smegmatis y se mantuvieron a -80 ºC.
3. Transformación de las células 3.1 Transformación de Escherichia coli
Las células de E. coli fueron modificadas genéticamente por transformación
tras hacerlas competentes mediante el método de RbCl y choque térmico
(Sambrook y Rusell, 2001).
3.2 Transformación de Mycobacterium smegmatis
3.2.1 Preparación de células electrocompetentes
La preparación de células electrocompetentes de M. smegmatis se llevó a
cabo según un protocolo descrito previamente (Parish y Stoker, 1998).
Básicamente, se siembra una colonia de la cepa de micobacteria
correspondiente en 10 ml de medio 7H9-ADC conteniendo Tween 80 0,05% y se
incuba a 37 ºC hasta alcanzar la fase estacionaria (aproximadamente 30 horas en
M. smegmatis). Con 2 ml de este cultivo se inoculan 200 ml de medio 7H9-ADC
conteniendo Tween 0,05% y se incuba en agitación (80 rpm) a 37 ºC hasta una
DO600 de 0,8-1 (18 h de cultivo aproximadamente). A continuación el cultivo se
incuba 1,5 h en hielo y se centrifuga repartido en 4 tubos Falcon de 50 ml a 3000 g
a 4 ºC 10 min. Una vez decantado el sobrenadante, se resuspenden las células en
48
Materiales y Métodos
200 ml de glicerol 10% (enfriado en hielo, y con Tween 0,05%). Tanto en este
paso como en las etapas posteriores se resuspenden las células volteando el
recipiente, nunca con vórtex, ni pipeteando. Seguidamente se centrifuga la
suspensión a 3000 g a 4 ºC 10 min. Posteriormente se retira el sobrenadante y se
resuspenden las células en 100 ml de glicerol 10% frío. Seguidamente se
centrifugan las células a 3000 g 10 min a 4 ºC y se añaden 25 ml de glicerol 10%
frío. Las células se resuspenden volteando y se dejan reposar para sedimentar los
agregados que no se resuspenden. Posteriormente se toma la suspensión sin los
agregados con una pipeta estéril. La suspensión se lleva a un tubo Falcon limpio
enfriado en hielo y se centrifuga a 3000 g 10 min a 4 ºC. Finalmente se retira el
sobrenadante y se resuspenden las células en 1,5 ml de glicerol 10% frío, que se
reparten en alícuotas de 200 µl y se guardan a −80 ºC hasta su uso.
3.2.2 Electroporación
A una alícuota de las células competentes se añade el DNA con el que se va
a transformar. Esta mezcla se pasa a una cubeta de electroporación (Cell
Projects), la mezcla se incuba 10 min en hielo y se electropora en un
electroporador Gene Pulser (Biorad) a 2,5 Kv, 25 µF y 1000 Ω. Se incuba la
cubeta en hielo otros 10 min. Posteriormente se añade 1 ml de medio 7H9-Tween-
ADC a la cubeta y el líquido se pasa a un tubo Falcon de 15 ml. Las células se
incuban 4 h a 37 ºC en agitación (80 rpm) antes de sembrarlas en medio sólido
con los antibióticos necesarios.
4. Técnicas de DNA
Las enzimas de restricción se obtuvieron de Amersham, Takara y New
England Biolabs. La enzima T4 DNA ligasa fue proporcionada por USB
(Amersham), la DNA polimerasa I y la Pfu polimerasa fueron suministradas por
Biotools B. M. Labs. Todas las enzimas se emplearon atendiendo a las
49
Materiales y Métodos
especificaciones de las diferentes casas comerciales. Los fragmentos de DNA se
purificaron empleando geles de agarosa, mediante el kit GeneClean (BIO 101) o el
High Pure PCR Product Purication Kit (Roche).
4.1 Electroforesis de DNA en geles de agarosa
Se utilizaron geles de agarosa al 0,7% o al 1,5% en tampón TAE (Tris-HCl 40
mM, ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM pH 8,1), utilizando el mismo tampón como
electrolito. A las muestras se les añadió ¼ de su volumen de una solución
compuesta por Ficoll 400 al 30% (p/v), azul de bromofenol al 0,2% (p/v),
xilencianol al 0,2% (p/v) y EDTA 40 mM pH 8,0. La electroforesis se realizó a 100
V durante 15-20 min y, una vez finalizada, los geles se tiñeron con bromuro de
etidio (5 µg/ml) y los fragmentos de DNA se visibilizaron con radiación ultravioleta
en un transiluminador. Como marcadores de tamaño se utilizaron el DNA del fago
λ digerido con la enzima de restricción BstEII (Amersham), y la forma replicativa
del fago ΦX174 digerida con HaeIII (New England Biolabs).
4.2 Extracción de DNA cromosómico de micobacterias
Para realizar la extracción de DNA se recogen las células de una placa, se
resuspenden en 400 µl de Tris-EDTA (TE) y se incuban a 80 ºC durante 20 min.
Se dejan enfriar a temperatura ambiente y se añaden 50 µl de lisozima (10 mg/ml),
se mezcla con vórtex y se deja 1-12 h a 37 ºC. A continuación se añaden 75 µl de
SDS al 10% conteniendo proteinasa K (10 mg/ml), se mezcla con vórtex y se
incuba 10 min a 65 ºC. Posteriormente se añaden 100 µl de NaCl 5 M y 100 µl de
CTAB/NaCl precalentados a 65 ºC y se incuba 10 min a 65 ºC. Seguidamente se
añaden 750 µl de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se mezcla con vórtex y se
centrifuga 5 min a 14000 g. La solución acuosa se toma con pipeta, se transfiere a
un tubo eppendorf y se añade un volumen equivalente de
fenol/cloroformo/isoamílico (25:24:1), se mezcla con vórtex y se centrifuga 5 min a
14000 g. La solución acuosa se toma con pipeta y se transfiere a un eppendorf
50
Materiales y Métodos
donde el DNA se precipita con 0,6 volúmenes de isopropanol y se mantiene 30
min a 20 ºC. Finalmente el DNA se centrifuga 15 min a 14000 g a 4 ºC, se lava con
etanol al 70%, se centrifuga 2 min a 14000 g y se seca al aire o en speed-vac el
precipitado que posteriormente se resuspende en 40-100 µl de TE.
4.3 Aislamiento de DNA plasmídico La extracción de DNA plasmídico de células E. coli se llevó a cabo empleando
el sistema High Pure Plasmid Purification Kit (Roche), de acuerdo con las
especificaciones del fabricante.
4.4 Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente (PCR)
La amplificación del DNA se realizó en un equipo Mastercycler Gradient de
Eppendorf y las enzimas que se emplearon fueron la DNA polimerasa I y la Pfu
polimerasa, ambas proporcionadas por Biotools B. M. Labs. Las mezclas de
reacción contenían MgCl2 1,5 mM y dNTPs 0,25 mM. Los productos amplificados
se purificaron con el sistema High Pure PCR Product Purification Kit (Roche).
4.5 Secuenciación de DNA
La secuenciación de DNA se llevó a cabo en el Servicio de Secuenciación
Automática de DNA (SSAD) del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
(SECUGEN, SL) utilizando un secuenciador automático modelo ABI Prism 3730
(Applied Biosystems). Para la reacción de secuenciación se utilizó el “Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” de Applied Biosystems, y la
DNA polimerasa AmpliTaq FS, de acuerdo con las recomendaciones del
proveedor. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo mediante la técnica
de PCR con un termociclador “Gene Amp PCR System 2400” de Perkin-Elmer. En el caso concreto de los experimentos de extensión por cebador (primer
51
Materiales y Métodos
extension), la secuenciación del DNA patrón se llevó a cabo según el método de
terminación de la polimerización por dideoxinucleótidos (Sanger et al., 1977)
utilizando el Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (USB), y [α-32P]dATP
(14,8 × 1012 Bq/mmol, 3,7 × 105 Bq/μl) (Amersham Biosciences) como
deoxinucleósido trifosfato marcado radiactivamente, siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
4.6 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc²155 mediante mutagénesis insercional
Para la construcción de distintos mutantes de M. smegmatis se procedió a la
interrupción insercional de los genes por recombinación homóloga simple. Para
ello, se amplificaron fragmentos internos de al menos 600 pb de cada uno de los
genes, y se clonaron en uno de los polilinkers de pJQ200x (Jackson et al., 2001),
plásmido que no replica en Mycobacterium pero sí en E. coli (Figura 9).
MCS
MCS
MCS
MCS
Figura 9. Vector pJQ200x. Este vector incluye un gen de resistencia a gentamicina (Gm), el gen
de contraselección sacB, que permite distinguir aquellas colonias en las que el vector se ha
insertado en el cromosoma (y por tanto son sensibles a sacarosa) y el gen xylE, que permite
confirmar, mediante la adición de catecol a una colonia, si la construcción se insertó en el
cromosoma (se producirá una coloración amarilla intensa). Las flechas amarillas indican la
situación de los dos sitios de clonación múltiple (MCS) presentes en este vector.
52
Materiales y Métodos
Con las construcciones resultantes se transformó la cepa E. coli DH10B y se
seleccionaron clones en que se comprobó que dichas construcciones eran
correctas. De estos clones se extrajo DNA plasmídico para la electroporación de
M. smegmatis. Las bacterias recombinantes presentaban una interrupción génica
por inserción, mediante recombinación homóloga entre el gen nativo cromosómico
y el correspondiente fragmento interno clonado en el vector suicida, de los
respectivos derivados del plásmido suicida pJQ200x (figura 10), y fueron
seleccionadas en un primer paso en placas de 7H10 con gentamicina (5 μg/ml).
En un segundo paso, las colonias resistentes se crecieron en placas de 7H10 con
sacarosa 10% para selección negativa, ya que el plásmido pJQ200x incluye el gen
sacB (levansucrasa de Bacillus subtilis), cuya expresión es letal para la bacteria
cuando crece en sacarosa. Finalmente, a aquellas colonias sensibles a sacarosa
se adicionaron 10-15 µL de catecol. La aparición de coloración amarilla en las
mismas indica que portan el gen xylE que incluye el plásmido suicida. Los
mutantes así obtenidos fueron analizados por PCR, empleando un oligonucleótido
específico del vector pJQ200x (Tabla 3) y un oligonucleótido externo al fragmento
clonado, para confirmar la interrupción de los respectivos genes truncados.
También se analizó la ausencia de una copia del gen no mutado mediante
amplificación por PCR con un oligonucleótido de la región 5’ y otro de la región 3’
del gen mutado en cada caso.
53
Materiales y Métodos
Figura 10. Mecanismo de mutagénesis insercional en M. smegmatis utilizando el vector
pJQ200x. El fragmento interno amplificado del gen a mutar (en este ejemplo MSMEG_1604,
MSMEG_5228 y MSMEG_5233) se inserta en pJQ200x utilizando sitios de restricción presentes en
los MCS. Como resultado se obtiene un derivado del plásmido pJQ200x portando un fragmento
interno del gen (pJQ1604, pJQ5228 y pJQ5233 en este ejemplo). Este plásmido se electropora en
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA SIMPLE (GmR, SacS)
M. smegmatis::MSMEG_1604
PstI XhoI
pJQ1604 (~7357pb)
PstI
XhoI
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA SIMPLE (GmR, SacS)
M. smegmatis::MSMEG_5228
SalI BamHI
pJQ5228 (~7407 pb)
BamHI
SalI
ELECTROPORACIÓN (M. smegmatis mc²155)
SpeI XbaI RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
SIMPLE (GmR, SacS) M. smegmatis::MSMEG_5233
SpeI XbaI
pJQ5233 (~7043 pb)
Inserción en pJQ200x
XhoI PstI MSMEG_1604
Amplificación mediante PCR de un fragmento interno del gen
sacB
Gmxyl E
ori
pJQ200X ( ~ 6407 pb)
MSMEG_5228 MSMEG_5233
BamHI SalI XbaI SpeI
54
Materiales y Métodos
M. smegmatis y tiene lugar la recombinación homóloga del mismo con el gen correspondiente en el
cromosoma, dando lugar a un mutante por interrupción del gen mediante inserción del plásmido
suicida.
4.7 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc²155 mediante deleción por recombinación homóloga
Para la construcción de mutantes de M. smegmatis mediante deleción (M.
smegmatisΔMSMEG_5228 en este trabajo, figura 11) se clonaron primero en un
mismo vector pUC19 dos fragmentos de DNA de unos 600 pb cada uno, uno en
posición 5’ al gen a mutar (fragmento up-5228), utilizando los oligonucleótidos
MSMEG_5228 UP F/UP R (Tabla 3) y otro en posición 3’ al gen a mutar
(fragmento down-5228), utilizando los oligonucleótidos MSMEG_5228 DOWN
F/DOWN R (Tabla 3). Con la construcción resultante se transformó la cepa E. coli
DH10B y tras extraer DNA plasmídico se digirió la región conteniendo los
fragmentos up y down con la enzima de restricción ApaI y se insertó en el sitio
ApaI de pJQ200x. La nueva construcción se seleccionó tras transformar
nuevamente E. coli DH10B y se electroporó con ella M. smegmatis mc²155. Los
transformantes por electroporación se sembraron en placas de medio 7H10 con
gentamicina. Las colonias obtenidas con gentamicina se replicaron en placas de
7H10 con sacarosa 10%. Se seleccionaron colonias que fuesen resistentes a
gentamicina, sensibles a sacarosa y que portasen el gen xylE (lo que se comprobó
como se detalla en el apartado anterior). Estas colonias han sufrido una
recombinación simple, todo el vector está integrado en el cromosoma. Para forzar
una segunda recombinación, tras crecer una colonia en 10 ml de medio 7H9 con
gentamicina hasta una DO600 aproximada de 0,8-0,9, se sembraron 20 μL de una
dilución ½ del cultivo en una placa de 7H10 y otros 20 µl en una placa de 7H10
con sacarosa 10%. En la placa con sacarosa se deben obtener alrededor de 103 a
104 colonias menos, lo que indica que ha tenido lugar la recombinación doble. Las
colonias crecidas en presencia de sacarosa se replicaron en placas de 7H10 con
gentamicina o sacarosa 10%. Aquellas sensibles a gentamicina, que no portan el
55
Materiales y Métodos
gen xylE y resistentes a sacarosa eran mutantes por recombinación doble. Los
mutantes así obtenidos fueron analizados por PCR, empleando tres parejas
distintas de cebadores que dan lugar a amplicones de diferente tamaño según se
trate de una cepa mutada o no mutada: 1. un oligonucleótido situado a 566 pb del
inicio del gen MSMEG_5228 (MSMEG_5228 UP F) con un oligonucleótido reverso
situado al final del gen (5228-R); 2. Un nucleótido situado al inicio del gen (5228-F)
con un oligonucleótido situado a 604 pb del final del gen (MSMEG_5228 Down R);
3. se analizó la ausencia de una copia del gen no mutada mediante amplificación
por PCR con un oligonucleótido situado en el inicio del gen (5228-F) y otro reverso
situado al final del gen (5228-R). La secuencia de estos oligonucleótidos se
muestra en la Tabla 3.
Figura 11. Construcción del mutante mediante deleción M. smegmatisΔMSMEG_5228. Los
detalles de la construcción se indican en el texto.
pUC19 (2686 pb)
MCS lacZ
bla (ApR)
rep (pMB1)
pUC5228DR
EcoR I-ApaI
XbaIPstI
ApaI- HindIII
Inserción de los fragmentos up-5228 y down-5228 en pUC19
Digestión con ApaI e inserción del fragmento up-down en pJQ200x
Electroporación en M. smegmatismc²155
88 29
MSMEG_5226 MSMEG_5229 MSMEG_5230 MSMEG_5227
Amplificación mediante PCR de los fragmentos up-5228 y down-5228
88 29
MSMEG_5226 MSMEG_5229 MSMEG_5230 MSMEG_5228 MSMEG_5227
EcoRI- Pst ApaI- Xba
Zona up-5228 (654 pb)
Zona down-5228 (633 pb)
pJQ5228DR ApaI
ApaI
ΔMSMEG_5228 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DOBLE
M. smegmatisΔMSMEG_5228 (GmS, SacR)
56
Materiales y Métodos
La construcción del doble mutante M. smegmatis::MSMEG_1604-
ΔMSMEG_5228 se llevó a cabo a partir del mutante M. smegmatis
ΔMSMEG_5228. Se hicieron células competentes de esta cepa y se transformaron
con el plásmido pJQ1604int, que incluye un fragmento interno del gen
MSMEG_1604 y que al sufrir recombinación homóloga simple produjo un mutante
en el gen MSMEG_1604 mediante interrupción por el plásmido suicida (Fig. 12).
Así, el mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 presenta el
gen MSMEG_5228 delecionado y el gen MSMEG_1604 interrumpido por
pJQ200x.
sacB
Gm xyl E
ori
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA SIMPLE (GmR, SacS)M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228
SacI XbaI
ELECTROPORACIÓN (M. smegmatis ΔMSMEG_5228)
INSERCIÓN
XbaI SacI
MSMEG_1604 pJQ200X
pJQ1604int
XbaISacI
SacI XbaI
Figura 12. Construcción del mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228. Se
amplificó un fragmento interno de MSMEG_1604 y se clonó en el sitio SacI-XbaI de pJQ200x
dando lugar al plásmido pJQ1604int. Con esta construcción se electroporó el mutante por deleción
M. smegmatis ΔMSMEG_5228. Tras la recombinación homóloga simple que tiene lugar en
MSMEG_1604 se obtiene el mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228.
57
Materiales y Métodos
5. Técnicas de proteínas
5.1 Obtención de los extractos proteicos
5.1.1 Extractos de Escherichia coli
La obtención de extractos crudos se llevó a cabo con las cepas de E. coli que
expresaban distintas proteínas de M. smegmatis en vectores de expresión. Para
ello se cultivaron las células a 37 ºC en 1 L de medio LB y se añadió la
concentración de IPTG requerida (50 µM) cuando los cultivos alcanzaron una
DO600 de 0,5-0,6. La inducción con IPTG se mantuvo durante 3 h a temperatura
ambiente (20 ºC) en agitación. Los cultivos se resuspendieron en 5 ml del tampón
adecuado tras centrifugar 30 min a 8000 g y 4 ºC, lavar con solución salina y
centrifugar de nuevo y se lisaron empleando la prensa de French (Aminco Corp.)
operada a una presión de 20000 psi. La suspensión obtenida se centrifugó a 4 ºC
a 16000 g durante 30 min, recogiéndose el sobrenadante (extracto crudo). La
determinación de la concentración de proteína se realizó empleando el método de
Bradford (Bradford, 1976), usando albúmina de suero bovino (BSA) como patrón.
5.1.2 Extractos de Mycobacterium smegmatis
Para obtener extractos de las micobacterias se utilizó un sonicador Branson
150. Un volumen de los cultivos correspondientes se centrifugó, se lavó 2-3 veces
con solución salina (NaCl 0,9% en H2O destilada) y se resuspendió en 500 µl del
tampón adecuado en tubos eppendorf de 2 ml. Las muestras se sonicaron
enfriadas en hielo aplicando 5-8 pulsos de 1 min a intensidad 9 del equipo. Entre
pulsos se incubaron los tubos 5 min en hielo. Después se centrifugaron a 4 ºC a
14000 g y se separó la fracción celular soluble de la insoluble.
Alternativamente, puede obtenerse el extracto proteico de las micobacterias
sometiéndolas a lisis en Fast-Prep (ver apartado 7.1 de Materiales y Métodos)
58
Materiales y Métodos
aumentando el número de ciclos hasta 6 y utilizando como medio de suspensión
celular el tampón adecuado en cada caso.
La determinación de la concentración de proteína en ambos casos se realizó
empleando el método de Bradford.
5.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en condiciones
desnaturalizantes en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS), en geles de
poliacrilammida (PAGE), a una concentración del 10% o del 12,5% según la
técnica descrita previamente (Laemmli, 1970). Las muestras se hirvieron durante
10 min en presencia del tampón de ruptura (Tris-HCl 250 mM a pH 6,8; SDS 2%;
β-mercaptoetanol 5%; glicerol 10% y azul de bromofenol 0,05%). Las
electroforesis se realizaron a temperatura ambiente, empleando un electrolito de
composición: Tris-HCl 25 mM pH 8,0, glicina 192 mM y SDS 0,1%. Las proteínas
fueron teñidas con Coomasie Brilliant Blue R250, según se describe previamente
(Swank y Munkres, 1971).
Las proteínas empleadas como marcadores de tamaño molecular (miosina,
200 kDa; β-galactosidasa, 116,2 kDa; fosforilasa B, 97,4 kDa; BSA, 66,2 kDa;
ovoalbúmina, 45,0 kDa; anhidrasa carbónica, 31,0 kDa; inhibidor de tripsina, 21,5
kDa; lisozima, 14,4 kDa; aprotinina, 6,5 kDa) fueron proporcionadas por Bio-Rad
(marcadores Broad-Range).
5.3 Purificación de la proteína KstR
El gen que codifica la proteína KstR, kstRMsm, (MSMEG_6042) se amplificó
por PCR y se subclonó en el vector de hiperexpresión pET-29a (+), fusionando en
su extremo 3’ 6 tripletes en fase que codifican un tag de 6His, resultando en el
plásmido pET6042. La cepa E. coli BL21 (DE3) transformada con el plásmido
pET6042, se creció en 50 ml de LB a 37 ºC hasta una DO600 de 0,6, momento en
que se indujo la expresión de KstR-His con IPTG 200 μM, y se mantuvo el cultivo
otras 3 h a 37 ºC. Tras centrifugar 30 min a 8000 g y 4 ºC, lavar con solución
59
Materiales y Métodos
salina y centrifugar de nuevo, los cultivos se resuspendieron en 5 ml del tampón
KST (HEPES 20 mM pH 8, KCl 150 mM, ß-mercaptoetanol 2 mM, glicerol 10%,
MgCl2 10 mM, PMSF 0,1 mM e imidazol 10 mM) y se lisaron empleando la prensa
de French (Aminco Corp.) operada a una presión de 20000 psi. A continuación, la
suspensión obtenida se centrifugó durante 30 min a 4 ºC a 16000 g y se purificó a
través de columnas de níquel-nitrilotriacetato en gel de sílice (columnas Ni-NTA
Spin, del kit Ni-NTA Spin, Qiagen). La columna se equilibró con 600 μl de tampón
KST sin imidazol (centrifugando durante 2 min a 300 g a 4 ºC), y seguidamente se
pasó el extracto proteico de 600 en 600 μl, quedando retenida en la columna la
proteína KstR-His. Seguidamente se lavó la columna con 3 volúmenes de tampón
KST con una concentración de imidazol 50 mM, y mediante interacción de afinidad
se procedió a la elución de la proteína unida a ésta con tampón KST con imidazol
1 M. La pureza de las muestras recogidas se analizó mediante SDS-PAGE. Las
fracciones recogidas se concentraron y se eliminó el imidazol de las mismas
utilizando las columnas VIVASPIN 500 (Sartorius); primero se pasó toda la
muestra a concentrar por la columna según las especificaciones del fabricante, y
posteriormente se realizaron 3 lavados con el mismo tampón KST sin imidazol,
obteniendo un volumen final de muestra de 50-75 μl. La concentración de proteína
pura KstR-His se calculó utilizando un Nanodrop 1000 (Nanodrop Technologies) o
espectrofotómetro UVmini-1240 (SHIMADZU). La proteína purificada se conservó
en tampón KST sin imidazol a 4 ºC por períodos no superiores a una semana.
5.4 Ensayos enzimáticos
5.4.1 Ensayos in vitro de actividad productora de 4-colesten-3-ona para análisis mediante TLC y LC/MS
Los extractos proteicos de E. coli BL21 (DE3) expresando los plásmidos
pET1604, pET5228 o pET5233 se ensayaron en un volumen final de 1 a 4 ml que
contenían 8 mg/ml de extracto proteico en el tampón adecuado (fosfato potásico
0,1 M pH 7,5 para extractos expresando el producto de MSMEG_1604 e
60
Materiales y Métodos
hidrocloruro de trietanolamina 0,1 M pH 8,5 para extractos expresando el producto
de MSMEG_5228 o MSMEG_5233). Una solución de colesterol 0,5% disuelto en
Triton X-100 al 10% se añadió a las soluciones de ensayo hasta una
concentración final de colesterol 0,44 mM. A los extractos proteicos que contenían
pET5228 y pET5233, se añadió NAD 1,35 mM. Cuando los ensayos se realizaron
para un análisis posterior mediante cromatografía en capa fina (TLC), se
añadieron 120.000 dpm de [4C-14C]colesterol por ml. Como control positivo se
llevaron también a cabo ensayos con colesterol oxidasa de Pseudomonas
fluorescens (Sigma). Se añadieron 2 µl de una solución de enzima de
concentración 5 mg/ml por ml de ensayo en tampón fosfato potásico 0,1 M pH 7,5.
Los ensayos se llevaron a cabo a 30 ºC en tubos de vidrio con agitación
continua.
En el caso de las muestras para TLC, se retiraron alícuotas de 900 µl a
distintos tiempos de reacción y tras precipitar las proteínas con ácido
tricloroacético al 4% se centrifugaron, se recuperaron los sobrenadantes y se
neutralizaron con NaOH 10 N. Posteriormente se extrajeron 2 veces con un
volumen equivalente de acetato de etilo. A continuación las dos extracciones se
concentraron bajo vacío. Los residuos así concentrados se analizaron
posteriormente mediante TLC como se describe en el apartado 9 de esta sección.
En el caso de las muestras para LC/MS, se retiraron alícuotas de 900 µl a
distintos tiempos de reacción y se extrajeron 2 veces con un volumen equivalente
de cloroformo. Como patrón interno se añadió a las alícuotas, antes de su
extracción, 50 μl de una solución de pregnenolona 20 mg/ml en cloroformo. A
continuación las dos extracciones se concentraron bajo vacío. Los residuos así
concentrados se analizaron posteriormente mediante LC/MS como se describe en
el apartado 8 de esta sección.
61
Materiales y Métodos
5.4.2 Ensayos in vivo de actividad productora de 4-colesten-3-ona para análisis mediante TLC y LC/MS
Diferentes cepas de M. smegmatis (mc2155, ::MSMEG_1604,
ΔMSMEG_5228, ::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228, ::MSMEG_5233) se cultivaron
en 15 ml (para un posterior análisis mediante TLC) o 25 ml (para un posterior
análisis mediante HPLC) de medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-
ciclodextrina. Cuando los ensayos se realizaron para un análisis posterior
mediante cromatografía en capa fina (TLC), se añadieron 3 x 106 dpm de [4C-14C]
colesterol a los 15 ml. Los cultivos se crecieron a 37 ºC durante 24 h (para un
posterior análisis mediante TLC) o 72 h (para un posterior análisis mediante
LC/MS).
En el caso de las muestras para TLC, se recogieron alícuotas de 2 ml a las
24 h de cultivo y se centrifugaron durante 15 min a 14000 g. Los sobrenadantes se
filtraron con filtros de acetato de celulosa 0.20 μm (Iwaki) y se extrajeron 2 veces
con un volumen equivalente de acetato de etilo. Los dos extractos de acetato de
etilo se concentraron bajo vacío. Los residuos así concentrados se analizaron
posteriormente mediante TLC como se describe en el apartado 9 de esta sección.
En el caso de las muestras para LC/MS, se recogieron alícuotas de 2 ml a las
0, 24, 48 y 72 h de cultivo. Posteriormente se extrajeron 2 veces con un volumen
equivalente de cloroformo añadiendo antes de la extracción 50 μl de una solución
de pregnenolona 20 mg/ml en cloroformo. Los dos extractos de cloroformo se
concentraron bajo vacío. Los residuos así concentrados se analizaron
posteriormente mediante LC/MS como se describe en el apartado 8 de esta
sección.
62
Materiales y Métodos
6. Ensayos de unión DNA-proteína
6.1 Marcaje de sondas con 32P
Mediante este método se marcó el oligonucleótido 5228 FP F. Para la
reacción de marcaje se emplearon 2,5 µl del oligonucleótido (2 µM), 1,25 µl de
tampón kinasa 10x (Biolabs), 3 µl de [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) (Amersham
Pharmacia Biotech) y 10 U de T4 polinucleótido kinasa 10 U/µl (Biolabs) en un
volumen total de 10 µl. La mezcla de reacción se incubó 30 min a 37 ºC. Al
término de la incubación se comprobó el nivel de incorporación del nucleótido
radiactivo al oligonucleótido mediante una cromatografía en capa fina (TLC). Para
ello se depositaron 0,5 µl de la sonda marcada sobre una membrana de sílica gel
60 (Merck) utilizando HCl 1 N como fase móvil. A continuación se realizó una
autorradiografía empleando una película Hyperfilm™ MP (Amersham Pharmacia
Biotech). Una vez marcado el oligonucleótido de interés se obtuvo mediante PCR
el fragmento 5228 FP (196 pb) utilizando como molde 100 ng de DNA de M.
smegmatis y los oligonucleótidos 5228 FP F y 5228 FP R (tabla 3 de
oligonucleótidos). En este caso la reacción de PCR difiere de la descrita en el
apartado 4.4 de esta sección. Se añadieron 10 µl del oligonucleótido marcado (5
pmoles), 7,5 µl del oligonucleótido frío a 1 µM (7,5 pmoles), 4 µl de dNTPs a 2,5
mM (0,2 mM final), 5 µl de tampón Taq polimerasa 10x, 1 µl de Taq polimerasa, 1
µl de DNA molde (100 ng/µl), en un volumen final de 50 µl. A continuación el
producto amplificado se purificó con el sistema High Pure PCR Product Purification
Kit (Roche) y se eluyó en un volumen final de 100 µl.
6.2 Ensayos de retardo en gel
Las mezclas de reacción contenían: tampón KST (HEPES 20 mM pH 8,0, KCl
150 mM, ß-mercaptoetanol 2 mM, glicerol 10%, MgCl2 10 mM, PMSF 0,1 mM),
0,1 nM de sonda de DNA (marcada mediante el método descrito en el apartado
anterior), BSA 50 μg/ml y la proteína purificada en este trabajo KstR-His (o
63
Materiales y Métodos
extracto proteico de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET6042) expresando KstR-His)
en un volumen final de 20 μl. Cuando se ensayó la unión DNA-proteína en
presencia de ligando, se añadió colesterol (0,25, 0,5, 1, 2 o 4 mM disuelto en
Triton X-100 al 10%) en un volumen final de 9 µl. Después de incubar las
diferentes mezclas de reacción durante 10 min a 25 ºC, las muestras se analizaron
por electroforesis en gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 5%. Los geles se
corrieron en cubetas de electroforesis “Miniprotean II” (Bio-Rad) a 125 V en
tampón TBE (Tris-borato 45 mM pH 8,3 y EDTA 1 mM) a temperatura ambiente.
Los geles se secaron al vacío sobre papel Whatman 3MM y se expusieron en
películas Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech).
6.3 Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I (footprinting)
Para los experimentos de footprinting con DNasa I se amplificó por PCR el
fragmento 5228 FP utilizando 5228 FP R (Tabla 3) como oligonucleótido frío y
5228 FP F (Tabla 3) como oligonucleótido marcado (procedimiento descrito en el
apartado 6.1 de esta sección) para marcar el extremo 5’ de dicho fragmento. Esta
sonda nos permitió realizar experimentos de footprinting con la región promotora
5228. Una vez purificada la sonda se formaron los complejos proteína-DNA
durante 20 min a 25 °C en 15 µl de tampón KST (HEPES 20 mM pH 8, KCl 150
mM, ß-mercaptoetanol 2 mM, glicerol 10%, MgCl2 10 mM, PMSF 0,1 mM) que
contenía: 1nM de la sonda 5228 FP, BSA 500 μg/ml, y distintas diluciones de la
proteína KstR-His purificada o de un extracto proteico de la cepa E. coli BL21
(DE3) (pET6042) expresando KstR-His. Transcurrida la incubación se añadieron 3
µl de solución DNasa I (1µg/ml (Amersham Biosciences)) en Tris-HCl 10 mM pH
7,0, MgCl2 10 mM, CaCl2 10 mM y KCl 125 mM y se incubó a 37 ºC durante 20 s.
La reacción se paró al añadir 180 µl de la solución DNasa STOP (acetato sódico
0,4 M, EDTA 2,5 mM, tRNA 50 µg/ml y 5 µg/ml de DNA de esperma de salmón) y
0,3 µl/ml de glicogen. Las muestras se trataron con fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico y posteriormente fueron precipitadas y lavadas con etanol absoluto y
etanol 70%, respectivamente. Las muestras se secaron, se resuspendieron en
tampón de carga (formamida al 98%, EDTA 10 mM pH 8,0 y cantidades traza de
64
Materiales y Métodos
azul de bromofenol y azul de xilencianol) y se desnaturalizaron por incubación a
95 ºC durante varios min. Posteriormente se analizaron en un gel de poliacrilamida
desnaturalizante al 6% (v/v)-urea 8 M. Los geles se secaron al vacío sobre papel
Whatman 3MM y se expusieron en películas Hyperfilm™ MP (Amersham
Pharmacia Biotech). La secuenciación del fragmento 5228 FP se llevó a cabo
mediante el método A+G (Maxam y Gilbert, 1977).
7. Técnicas de RNA
7.1 Extracción de RNA de micobacterias
El RNA para el análisis genómico de expresión diferencial en colesterol de M.
smegmatis mc²155 mediante microarrays, retrotranscripción-PCR y PCR en
tiempo real se extrajo de cultivos de la cepa cultivada en medio mínimo 457 que
contenía colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina, glicerol 18 mM en β-ciclodextrina o
glicerol 0,6 M. El RNA que se utilizó para el análisis genómico de expresión
diferencial del mutante en el regulador transcripcional KstR2 mediante microarrays
se extrajo de cultivos de la cepa salvaje y mutante en medio 7H9 conteniendo
ADC. En ambos casos 15 ml de cultivo en fase logarítmica (DO600 0,5-0,6) se
añadieron a 35 ml de solución de tiocianato de guanidinio (tiocianato de guanidinio
5 M, sarkosyl 0,5%, citrato sódico 25 mM) para interrumpir la transcripción. El
cultivo se centrifugó 20 min a 4000 g a temperatura ambiente y las células se
resuspendieron en 200 µl de agua. Este volumen se transfirió a tubos del Kit
Precellys VK01 (Bertin Technologies) y se añadieron 700 µl de solución RLT
(Qiagen). Las bacterias se lisaron utilizando un MiniBeadBeaterTM (Biospec) o un
Fast-Prep FP129 (Savant) durante 40 segundos a intensidad 6.5 y los extractos
solubles se recuperaron mediante centrifugación durante 5 min a 13000 g a 4 ºC.
Este procedimiento se realizó por duplicado para cada cultivo, usando un total de
30 ml de cada uno. En este punto, los extractos solubles de los duplicados se
recogieron en un mismo tubo y el RNA se purificó utilizando el Rneasy kit (Qiagen)
según las especificaciones del fabricante. El RNA para análisis mediante
microarrays se trató adicionalmente con Dnasa (Qiagen). Finalmente, las muestras
65
Materiales y Métodos
se eluyeron en 30 µl de agua. La cantidad de RNA extraído se midió utilizando un
NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies).
7.2 Retrotranscripción seguida de reacción de PCR (RT-PCR semicuantitativa)
El RNA utilizado para PCR semicuantitativa se trató con el kit Dnase and
Removal treatment (Ambion) según las especificaciones del fabricante. La
obtención del cDNA se llevó a cabo en un volumen de 20 µl de reacción que
contenían 300 ng de RNA purificado, DTT 10 mM, dNTPs 0,5 mM, 200 unidades
de SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen) y 5 mM de hexámeros al
azar como cebadores (pd(N)6 random hexamer 5´phosphate (Amersham
Biosciences)). En primer lugar el RNA y los hexámeros la azar se calentaron a 65
ºC durante 5 min para la hibridación y tras enfriar en hielo se añadieron los
restantes componentes de la reacción y esta se incubó a 42 ºC durante 2 h
seguido de 15 min a 70 ºC. Se emplearon 1,5 µl del cDNA así obtenido como
molde para la PCR posterior. El cDNA se amplificó utilizando los oligonucleótidos
requeridos en cada caso a concentración final 0,5 μM y 1 U de la DNA polimerasa
I de Biotools. En cada una de las reacciones de PCR se incluyó un control con 1,5
µl de la reacción de RT en la que no se empleó la transcriptasa reversa. Con este
control no se debe obtener ninguna banda de amplificación, lo que indicaría que
las preparaciones de RNA no contienen DNA contaminante. El volumen total de
reacción de PCR fue de 50 µl. El número de ciclos de amplificación fue en todos
los casos de entre 27 y 30.
7.3 Retrotranscripción para PCR en tiempo real
El RNA utilizado para PCR en tiempo real se trató de la misma manera que el
RNA utilizado para PCR semicuantitativa (apartado 7.2) pero la retrotranscripción
se llevó a cabo con 1 µg de RNA purificado, y una vez obtenido el cDNA, se
añadieron 7 µl de NaOH 1 M y 7 µl de EDTA 0,5 M, y se incubó 15 min a 65 ºC
para hidrolizar el RNA tras la reacción de retrotranscripción. Para neutralizar se
66
Materiales y Métodos
añadieron 17 µl de HEPES 1 M pH 7,5. El cDNA obtenido fue purificado mediante
el kit Geneclean Turbo (MP Biomedicals) y su concentración se estimó utilizando
un NanoDrop 1000 (Nanodrop Technologies).
7.4 PCR en tiempo real (q-PCR)
Para analizar los niveles de transcripción de diferentes genes se realizaron
experimentos de PCR en tiempo real en un iQ5 Multicolor Real-Time PCR
Detection System (Bio-Rad). Se amplificaron fragmentos de alrededor de 100 pb
de cada uno de los genes de interés. Se utilizaron muestras por triplicado a las
distintas cantidades de 5, 0,5 y 0,05 ng de cDNA total, 0,2 mM final de cada
cebador y 12,5 µl de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en 25
µl de volumen. Las parejas de cebadores utilizadas se muestran en la tabla 5. Las
muestras fueron desnaturalizadas a 95 ºC 30 s; la temperatura de fusión fue 60 ºC
30 s y para la elongación y la adquisición de señal se mantuvieron a 72 ºC 30 s.
Se realizaron 40 ciclos. Para la cuantificación relativa de los valores de
fluorescencia se utilizaron diluciones seriadas de DNA genómico de M. smegmatis
mc²155 (entre 4x10-4 y 40 ng). Los datos que se muestran son la media de los
obtenidos al analizar la expresión de los genes en tres cultivos independientes con
tres concentraciones diferentes de cDNA (5, 0,5 y 0,05 ng) y por triplicado. La
obtención y el análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el iQ5 Optical System
Software (Versión 2.0) (Bio-Rad).
7.5 Análisis genómico de M. smegmatis bajo diferentes condiciones de cultivo mediante microarrays de RNA
Los microarrays para el análisis de la expresión diferencial del genoma de M.
smegmatis mc²155 fueron facilitados por el Pathogen Functional Genomics
Resource Center de TIGR (http://pfgrc.tigr.org/). Éstos (Mycobacterium smegmatis
versión 4) consisten en 7736 oligonucleótidos diferentes de 70 pb, que
representan el genoma completo de M. smegmatis, impresos en una superficie de
67
Materiales y Métodos
aminosilano. Cada oligonucleótido está impreso 3 veces. Como control negativo
se incluyen 480 oligonucleótidos de 70 pb de Arabidopsis thaliana en cada
microarray.
Para los microarrays para el análisis de expresión diferencial en colesterol, el
cDNA procedente de cultivos crecidos en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina se
hibridó competitivamente frente al cDNA correspondiente procedente de cultivos
crecidos en glicerol 18 mM en β-ciclodextrina. En los microarrays para el análisis
de expresión diferencial del mutante en el regulador KstR2, el cDNA procedente
de cultivos de este mutante se hibridó competitivamente frente al cDNA de la cepa
salvaje.
En ambos casos el experimento incluyó réplicas técnicas mediante marcaje
reverso (dye-swap). Esta técnica consiste en hibridar dos microarrays con las
mismas muestras biológicas, pero marcadas cada una de ellas con un fluorocromo
distinto en cada uno de ellos (si la muestra A está marcada con el fluorocromo Cy5
y la B con el fluorocromo Cy3 en un microarray, en su réplica técnica se marcará A
con Cy3 y B con Cy5). Mediante esta técnica se elimina el sesgo que se puede
producir por diferencias en la de eficiencia de marcaje de las muestras
dependiente de los fluorocromos.
7.5.1 Síntesis y marcaje del cDNA
Se marcaron 5 µg de RNA de M. smegmatis cultivado en colesterol/ glicerol
(o 5 µg de RNA de M. smegmatis con KstR2 delecionado/cepa salvaje) con el
fluorocromo Cy3-dCTP o Cy5-dCTP (GE Healthcare). En cada caso, 3 µg de
oligonucleótidos al azar (InvitrogenTM Life Technologies) se hibridaron al RNA
mediante una incubación a 95 ºC durante 5 min, seguida de enfriamiento en hielo.
La reacción de marcaje contenía dATP, dGTP y dTTP a una concentración 0,5
mM, dCTP 0,2 mM, DTT 10 mM, 60 µmoles de Cy3-dCTP (o Cy5-dCTP) y 500
unidades de Superscript II (InvitrogenTM Life Technologies) en 25 µl de volumen
final. Las muestras se incubaron en oscuridad a 25 ºC durante 10 minutos y
seguidamente a 42 ºC durante 90 minutos.
68
Materiales y Métodos
Los microarrays se sumergieron en solución de prehibridación (SSC 3,5X,
SDS 0,1%, BSA 10 mg/ml) a 55 ºC durante 20 minutos. Posteriormente se lavaron
en 400 ml de agua durante 1 min y después en 400 ml de propanol durante 1 min.
Finalmente se secaron mediante centrifugación en tubos Falcon de 50 ml a 1500 g
durante 5 minutos y se guardaron en cajas oscuras sin polvo hasta su hibridación
(< 1 h).
7.5.2 Hibridación de los microarrays
Las muestras de cDNA marcadas con Cy3/Cy5 procedentes de cultivos
crecidos en colesterol 1,8 mM se combinaron con las correspondientes muestras
marcadas de cDNA procedentes de cultivos crecidos en glicerol 18 mM (o las
muestras procedentes de cultivos del mutante en KstR2 se combinaron con las
correspondientes muestras procedentes del cultivo de la cepa salvaje) y se
purificaron utilizando el kit MinElute PCR Purification (Qiagen). Las muestras se
eluyeron en 25 µl de agua y la eficiencia del marcaje se midió utilizando un
NanoDrop 1000 (Nanodrop Technologies). 22,5 µl de cada muestra se mezclaron
con 67,5 µl de solución de hibridación (formamida 30%, solución Denhardt 3,75X,
SSC 6X, pirofosfato sódico 0,75 mM, Tris pH 7,4 37,5 mM, SDS 0,075%) y se
desnaturalizaron incubando 2 min a 95 ºC antes de añadirse al microarray. Las
hibridaciones tuvieron lugar en cada microarray bajo tres cubreobjetos LifterSlips
22x22 mm (VWR International) en cámaras de hibridación humidificadas
(Corning) sumergidas en un baño de agua a 55 ºC en oscuridad durante 16-20 h.
Los microarrays se sacaron entonces de las cámaras de hibridación y se lavaron
cuidadosamente en la solución de lavado A (SSC 1X, SDS 0,05%) a 55 ºC para
quitar los cubreobjetos. Después se lavaron secuencialmente en 400 ml de
solución A 2 min a 55 ºC seguido de 2 lavados en 400 ml de solución B (SSC
0,06X) a temperatura ambiente 2 min cada uno. Se secaron mediante
centrifugación en tubos Falcon de 50 ml a 1500 g durante 5 min a temperatura
ambiente y se escanearon utilizando un escáner Affimetrix 428 Array Scanner. Los
archivos de imagen se cuantificaron utilizando el programa TIGR Spotfinder 3.1.1
(Saeed et al., 2003). Para cada condición, el RNA se extrajo de tres cultivos
69
Materiales y Métodos
independientes, y se utilizaron dos microarrays por experimento (réplicas técnicas
mediante marcaje reverso). Los datos se promediaron y normalizaron utilizando el
algoritmo no paramétrico RANK product (Breitling et al., 2004), disponible como el
paquete "RankProd" en Bioconductor (http://www.bioconductor.org) (Hong et al.,
2006). Este método detecta genes que se expresan diferencialmente en un
número de experimentos replicados independientemente de su intensidad
numérica. Los resultados son proporcionados en forma de P-valores definidos
como la probabilidad de que un gen dado se catalogue en la posición observada
por azar. Los genes que estaban inducidos más de 3 veces en colesterol frente a
glicerol y con un valor de P<0,1 fueron seleccionados para posteriores análisis.
Tras la normalización, se disponía de tres valores de P y de número de veces
de inducción para cada marco abierto de lectura (ORF). El valor central de los tres,
que como cabía esperar eran similares, se seleccionó para incluirse en las tablas
que se presentan en este trabajo. La inducción de 12 de los genes fue validada
mediante PCR a tiempo real.
7.6 Técnica de primer extension o extensión con cebador
La técnica de primer extension permitió determinar el sitio de iniciación de la
transcripción de la región promotora P5228. Para ello, se cultivaron células de E.
coli DH10B (pUJ9-5228) a 37 ºC en 25 ml de medio LB. Cuando las células
alcanzaron una DO600 de 0,6, se recogieron 6 ml que se centrifugaron, lavaron y
resuspendieron para proceder a la extracción de su RNA utilizando el Rneasy kit
(Qiagen) según las especificaciones del fabricante. Una vez extraído el RNA, se
procedió al análisis del sitio de inicio de la transcripción mediante la técnica de
extensión por cebador. La extensión se realiza mediante un cebador que hibrida
con el mRNA en una posición más o menos cercana del supuesto sitio de
iniciación de la transcripción. Para la identificación de la posición +1 del promotor
P5228 se empleó el oligonucleótido Lac57 (Tabla 3), que hibrida entre los
nucleótidos 39 y 62 en posición 3’ respecto al residuo de adenina del codón de
inicio de la traducción del gen lacZ.
70
Materiales y Métodos
El oligonucleótido Lac57 fue marcado empleando 7 μl del oligonucleótido
(2,15 μM), 2 μl de tampón T4 polinucleótido kinasa 10x (Biolabs), 10 μl de [γ-
32P]ATP (3.000 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia Biotech) y 10 U de T4
polinucleótido kinasa (Biolabs) en un volumen total de 20 μl. Esta mezcla se
incubó a 37 ºC durante 30 min y la reacción se paró añadiendo 0,5 μl de SDS 10%
(p/v) y 0,5 μl de EDTA 0,5 M pH 8,0. La mezcla de reacción se calentó a 65 ºC
durante 10 min y a continuación se añadió tampón TE hasta un volumen final de
100 μl. Finalmente el oligonucleótido marcado fue purificado mediante la utilización
de una columna de Sephadex G-25 previamente equilibrada en tampón TE.
Se tomaron 15 μg de RNA purificado, el oligonucleótido marcado en el paso
anterior (5 x 105 cpm), 10 μl de tampón acetato sódico 3 M pH 5,2 y agua destilada
hasta completar un volumen final de 100 μl. La mezcla resultante fue precipitada y
lavada con etanol absoluto y etanol 70%, respectivamente. Tras secar la muestra
a temperatura ambiente, el precipitado resultante se resuspendió en 30 μl de
tampón de hibridación (PIPES 40 mM pH 6,6, formamida 1 mM, EDTA 1 mM pH 8,
NaCl 0,4 M) y se calentó a 85 ºC durante 10 min. La muestra se incubó durante
toda la noche a 58 ºC. Después de ese tiempo, se añadieron otros 40 μl de
tampón de hibridación y la mezcla resultante fue precipitada con etanol absoluto y
lavada con etanol 70% secándose posteriormente a temperatura ambiente.
El precipitado se resuspendió en 10 μl de una mezcla de reacción compuesta
por 2 μl de tampón 5x de transcriptasa reversa AMV (Promega), 3,6 μl de dNTPs
2,5 mM, 3 U de transcriptasa reversa AMV (Promega) y agua destilada hasta 10
μl. Esta mezcla se incubó 1 h a 42 ºC y después de ese tiempo se detuvo la
reacción añadiendo 2 μl de NaOH 2 N. La muestra se mantuvo a temperatura
ambiente durante una noche y después fue precipitada añadiendo 1,5 μl de
acetato sódico 3 M y 30 μl de etanol absoluto. Finalmente se lavó con etanol 70%
y se secó obteniéndose un sedimento que fue resuspendido en 4 μl de solución
STOP (formamida 0,5% (v/v), EDTA 20 mM; azul de bromofenol 0,05% (p/v) y
xilencianol 0,05% (p/v)). El resultado de la reacción fue analizado por
electroforesis en gel de poliacrilamida 6%-urea 8 M (Sambrook y Russell, 2001),
detectándose los productos de la reacción por autorradiografía en películas
HyperfilmTM-MP (Amersham Pharmacia Biotech) utilizando pantallas
71
Materiales y Métodos
amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). La secuenciación del plásmido
pUJ9-5228 se realizó utilizando el oligonucleótido Lac57, como se describe en el
apartado 4.5 de esta sección.
8. Cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LC/MS)
La cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC/MS) se
utilizó para analizar la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona en
extractos proteicos o en cultivos de diversas cepas de M. smegmatis en colesterol.
El equipo empleado consistió en un equipo de cromatografía líquida (Surveyor
Plus LC) equipada con inyector automático acoplado a una trampa iónica (LXQ)
equipada con una fuente de ionización química a presión atmosférica (APCI), todo
de Thermo Electron (San Jose, CA, EE. UU.). Los datos se procesaron con el
software Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, EE.UU.).
La separación cromatográfica se realizó en una columna Tracer Excel 120
ODSB C18, (150 mm × 4.6 mm de diámetro interno , 5 μm de tamaño de partícula)
(Teknokroma, Barcelona, Spain). La fase móvil estuvo constituida por
acetonitrilo/agua (90/10, v/v) y acetonitrilo/isopropanol (85/15, v/v) como fases A y
B respectivamente. El flujo empleado fue de 1mL/minuto y el gradiente lineal
utilizado fue el siguiente: 100% A durante 5 min, incrementado a 100% B en 35
min. Tras mantener 100% B durante 7 min se reestablecieron las condiciones
iniciales, reequilibrándose la columna en las mismas durante 8 min. Durante este
gradiente, el eluyente pasó al espectrómetro de masas desde el minuto 2 hasta el
45.
La optimización de los parámetros en el espectrómetro de masas se realizó a
partir de soluciones madre de patrones de colesterol (Sigma) y 4-colesten-3-ona
(Fluka) en ciclodextrina a una concentración inicial de 6,8 mM y 7 mM
respectivamente, inyectados en la trampa iónica mediante infusión directa con una
velocidad de flujo de 5 µL/min. Así, el valor de los distintos parámetros que
permiten una mayor sensibilidad de detección son los siguientes: temperatura del
capilar 275 ºC, temperatura de vaporización 425 ºC, voltaje del capilar 39 V,
voltaje de descarga de la corona 6.00 kV, corriente de la fuente 6.00 µA y 15 eV
72
Materiales y Métodos
para la energía de disociación por colisión. Como gas auxiliar y nebulizador se
utilizó nitrógeno de alta pureza.
El análisis cuantitativo se realizó por el método del patrón interno, a partir de
diluciones de la solución madre de colesterol y 4-colesten-3-ona en agua
destilada, en concentraciones comprendidas entre 34 µM y 1,52 mM para el
colesterol y 0,875 hasta 70 µM para la 4-colesten-3-ona, adicionadas con 50 µL de
5-pregnen-3β-ol-20-ona (patrón interno) en una concentración de 20 mg/mL. La
extracción de analitos se llevó a cabo de la misma manera que en las muestras a
analizar, tal y como se describe en los apartados 5.4.3 y 5.4.4 de esta sección.
Los residuos concentrados de las muestras se resuspendieron en 400 µL de
acetonitrilo (Scharlau) de los que se inyectaron 25 µL para su análisis
cromatográfico.
Las rectas de calibración obtenidas fueron y = 880,751 x + 128999 para el
colesterol y y = 8207,230 x + 22278,6 para la 4-colesten-3-ona, donde x es la
concentración inyectada e y las áreas. Los coeficientes de determinación fueron
de 0,9984 y 0,9999 respectivamente.
La cuantificación se llevó a cabo mediante la fragmentación de los iones
padre del colesterol y la 4-colesten-3-ona (m/z 369.4 and m/z 385.4,
respectivamente) y recogiendo todos los iones fragmentos en full scan, trabajando
en MS2 o MS/MS. El precursor de colesterol, a m/z 369.4, es debido a la
deshidratación de la molécula de colesterol.
La identificación de colesterol y 4-colesten-3-ona en las muestras analizadas
(extractos proteicos o cultivos de diversas cepas de M. smegmatis) se llevó a cabo
por las fragmentaciones específicas de ambos compuestos, obtenidas a partir de
sus standards. En el análisis de las muestras, además de las fragmentaciones de
los iones característicos de colesterol y 4-colesten-3-ona, se recogieron todos los
iones producidos (full scan) en modo positivo desde m/z 100 a m/z 1500.
73
Materiales y Métodos
9. Cromatografía en capa fina (TLC)
La cromatografía en capa fina (TLC) también se utilizó para visualizar la
transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona en extractos proteicos o en
cultivos de diversas cepas de M. smegmatis en colesterol.
Los residuos concentrados de las muestras se resuspendieron en 40 µL de
acetato de etilo y se cargaron 5 µL en placas de cromatografía en capa fina de
silica gel (40 x 80 mm Polygram® SIL G/UV254, Macherey-Nagel). Las
cromatografías se llevaron acabo utilizando n-hexano-acetato de etilo (65:35,v/v)
como fase móvil. Los productos esteroideos se visualizaron en luz ultravioleta y/o
mediante tinción con una solución de ácido fosfomolíbdico en etanol (10%, p/v).
Los productos marcados con 14C se localizaron mediante autorradiografía
utilizando un escáner FLA300 (Fuji Photo Film Co., Ltd., Kanagawa, Japan).
10. Análisis de los datos de secuencia
Los análisis de secuencias de DNA y proteínas se realizaron utilizando el
paquete de programas DNASTAR y los programas y bases de datos detallados a
continuación. El análisis y búsqueda de secuencias nucleotídicas y proteicas de M.
smegmatis y M. tuberculosis fue realizado con el servidor Comprehensive
Microbial Resource (CMR) (Craig Venter’s Institute) (http://cmr.jcvi.org/tigr-
scripts/CMR/CmrHomePage.cgi) y el servidor Tuberculist
(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/). Para la búsqueda de secuencias
nucleotídicas y proteicas de Rhodococcus jostii RHA1 se utilizaron las
herramientas disponibles en el sitio Rhodococus Genome Project (McLeod et al.,
2006; Warren et al., 2004) (http://www.rhodococcus.ca/). Las secuencias de
nucleótidos y las secuencias de aminoácidos fueron comparadas con las
existentes en las bases de datos mediante el uso de los algoritmos BLASTN y
BLASTP, respectivamente (Altschul et al., 1990) a través del servidor del National
Center for Biotechnology Information (NCBI),
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/Entrez/genom_table_cgi), a través del servidor
74
Materiales y Métodos
CMR o el sitio Rhodococus Genome Project. Los alineamientos múltiples de
proteínas se llevaron a cabo con el programa CLUSTALW (Thompson et al., 1994)
alojado en el servidor EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/). Las masas
moleculares teóricas de las proteínas se calcularon con el programa Compute
pI/Mw del servidor ExPASy (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html). Las
predicciones de estructura secundaria y tridimensional se realizaron con el
programa LOOPP alojado en el servidor BioHPC
(http://cbsuapps.tc.cornell.edu/loopp.aspx) y la visualización de los distintos
modelos y los análisis posteriores se realizaron con el programa PyMol (DeLano,
2002). La búsqueda de dominios conservados en secuencias proteicas se llevó a
cabo utilizando la base de datos PROSITE alojada en el servidor ExPASy
(http://www.expasy.ch/prosite/).
75
76
Resultados
IV. RESULTADOS
77
Resultados
78
Resultados
IV. RESULTADOS
1. Potencial catabólico de compuestos esteroideos y
caracterización genética in silico y mediante RT-PCR de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis mc2155
Como una primera aproximación al conocimiento del potencial catabólico de
compuestos esteroideos de M. smegmatis mc2155, se analizó su capacidad de
degradar distintas moléculas esteroideas mediante ensayos de crecimiento.
Posteriormente, el primer gran objetivo de esta tesis doctoral ha sido localizar
regiones del genoma de Mycobacterium smegmatis mc2155 que pudiesen estar
directamente relacionadas con la degradación del colesterol sirviéndonos de
distintos análisis in silico y que posteriormente serían validados mediante RT-PCR.
1.1 Crecimiento de M. smegmatis mc2155 en distintos esteroides
Para estudiar el potencial catabólico para degradar compuestos esteroideos
de M. smegmatis mc2155 se cultivó la cepa en medio mínimo 457 utilizando como
fuente de carbono distintos esteroides. Estos esteroides fueron disueltos en β-
ciclodextrina (apartado 2.2 de Materiales y Métodos). En el caso del ergosterol,
debido a su baja solubilidad, se aumentó la concentración de ciclodextrina
utilizada hasta una concentración final 35 mM en lugar de utilizar 18 mM, como en
el resto de esteroides. La concentración de esteroides utilizada en los cultivos se
ajustó de tal forma que los medios de todos los cultivos contuviesen el mismo
número de átomos de carbono que un medio con colesterol a concentración 1,8
mM y poder así comparar el rendimiento que aportan las distintas fuentes de
carbono. Debido a las propiedades detergentes del desoxicolato este ajuste en el
número de átomos de carbono no se realizó con esta molécula y se utilizó una
concentración menor que permitiese la viabilidad del cultivo. La concentración de
ácido cólico se igualó a la de desoxicolato.
79
Resultados
Los resultados obtenidos a partir de estos ensayos de crecimiento indicaron
que M. smegmatis mc2155 crece hasta DO600 cercanas a 2 tanto en colesterol
como en el primer intermediario de su ruta de degradación, 4-colesten-3-ona,
alcanzando una DO600 de 1,8 para colesterol y 1,5 para la 4-colesten-3-ona (Fig.
13 A). Sin embargo, su crecimiento es bastante inferior en otros esteroides que no
poseen la cadena lateral del colesterol, como la androsterona, AD, ADD,
dehidroandrosterona (Fig. 13 B), β-estradiol, pregnenolona, progesterona y
testosterona (Fig. 13 C), donde se alcanzan DO600 próximas a 0,6. El crecimiento
fue nulo en ácido cólico o desoxicolato a las concentraciones utilizadas de estos
compuestos (0,25 mM, Fig. 13 D), ya que alcanza los mismos valores de DO600
que los cultivos control en β-ciclodextrina (DO600 de 0,3). En ergosterol alcanza
también DO600 próximas a 0,6 (Fig. 13 D), pero necesita para ello un intervalo
mayor de tiempo que para los demás esteroides. Cabe destacar sin embargo que
comparativamente al crecimiento en ciclodextrina 35 mM (concentración utilizada
para el crecimiento con ergosterol) la capacidad de crecimiento en este esteroide
es notable.
80
Resultados
alor
Figura 13. Crecim
iento de M. sm
egó el increm
ento de absorbancia a 600 nm(D
O600 ) de M
. smegm
atism
c²155 cultivado en medio m
ínimo 457 suplem
entado con distintos esteroides solubilizadosen β-ciclodextrina
metilada
al azar. Se siguieron también dos
cultivos con β-ciclodextrinacom
o única fuente de carbono a las dos concentraciones finales que se utilizaron para solubilizarlos distintos esteroides: 18 mM
(para todos ellos excepto el ergosterol) y 35 mM
(para el ergosterol).A.4-colesten-3-ona
y colesterol. B. Androsterona, dehidroandrosterona, AD
y ADD
. Cβ-
estradiol, pregnenolona, progesterona y testosterona. DÁcido cóloico, desoxicolato
(DO
C) y ergosterol.
matis
mc2155 en distintos esteroides.Se v
0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Ciclodextrina 18mM
β-estradiol 2,7mM
Pregnenolona 2,34m
MProgesterona 2,34m
MTestosterona 2,52m
M0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Ac. Cólico 0,25 m
MCiclodextrina 18m
MDO
C 0,25 mM
Ergosterol 1,73 mM
Ciclodextrina 35mM
0,01
0,1 1 10
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Colestenona 1,8 mM
Colesterol 1,8 mM
Ciclodextrina 18mM
0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Androsterona 2,52
mM
AD 2,52 m
M
ADD 2,52 m
M
Ciclodextrina 18mM
Dehidroandrosterona2,52 m
M
AB
CD
0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Ciclodextrina 18mM
β-estradiol 2,7mM
Pregnenolona 2,34m
MProgesterona 2,34m
MTestosterona 2,52m
M0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Ac. Cólico 0,25 m
MCiclodextrina 18m
MDO
C 0,25 mM
Ergosterol 1,73 mM
Ciclodextrina 35mM
0,01
0,1 1 10
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Colestenona 1,8 mM
Colesterol 1,8 mM
Ciclodextrina 18mM
0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Androsterona 2,52
mM
AD 2,52 m
M
ADD 2,52 m
M
Ciclodextrina 18mM
Dehidroandrosterona2,52 m
M
0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Ciclodextrina 18mM
β-estradiol 2,7mM
Pregnenolona 2,34m
MProgesterona 2,34m
MTestosterona 2,52m
M0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Ac. Cólico 0,25 m
MCiclodextrina 18m
MDO
C 0,25 mM
Ergosterol 1,73 mM
Ciclodextrina 35mM
0,01
0,1 1 10
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Colestenona 1,8 mM
Colesterol 1,8 mM
Ciclodextrina 18mM
0,01
0,1 1
0100
200
Tiempo (h)
DO 600
Androsterona 2,52
mM
AD 2,52 m
M
ADD 2,52 m
M
Ciclodextrina 18mM
Dehidroandrosterona2,52 m
M
81
AB
CD
Resultados
1.2. Identificación y caracterización in silico de genes de M. smegmatis y M.
tubeculosis implicados en el metabolismo del colesterol
Como ya se comentó en el apartado de Introducción, la mayoría de los genes
implicados en la degradación de la testosterona (denominados genes tes) se han
caracterizado en la bacteria Gram-negativa Comamonas testosteroni TA441
(Horinouchi et al., 2004b). Dado que la ruta de degradación de la testosterona
confluye con la de degradación del colesterol en el compuesto 4-androsten-3,17
diona (AD), y que al comienzo de esta tesis doctoral no se había descrito ningún
gen de M. smegmatis directamente relacionado con la ruta catabólica del
colesterol, decidimos realizar un análisis in silico del genoma de M. smegmatis
mc²155 utilizando como sondas las secuencias de las enzimas ya descritas para la
degradación de testosterona en C. testosteroni. Utilizando el programa BLASTP a
través del servidor CMR se pudieron localizar diversas proteínas en M. smegmatis
que presentaban similitud con la mayoría de las distintas sondas de C. testosteroni
(Tabla 6). Estas proteínas se encontraban codificadas por genes que forman
agrupaciones génicas (clusters), representadas en la figura 14, lo que sugería una
funcionalidad común de los genes situados dentro de estas regiones.
82
Resultados
Comamonas testosteroni Mycobacterium smegmatis mc²155
Función
Gen
Función
Gen (locus) %
Dominio similar a flavin reductasa
tesA1 Nitrilotriacetato monooxigenasa, componente B
MSMEG_6035 31
Naftociclinona hidroxilasa tesA2 Hidroxilasa de producción de pigmento MSMEG_6038 33 Enzima de meta-apertura tesB 2,3-dihidroxibifenil 1,2-dioxigenasa MSMEG_6036 42 Hidrolasa de plegamiento alfa/beta
tesD Hidrolasa, familia plegamiento alfa/beta
MSMEG_6037 34
Hidratasa/descarboxilasa tesE 2-ceto-4-pentenoato hidratasa MSMEG_5940 39 Acetaldehido deshidrogenasa
tesF Acetaldehido deshidrogenasa MSMEG_5939 55
Deshidrogenasa tesG Oxovalerato aldolasa MSMEG_5937 46 3-oxoesteroide-Δ-1-deshidrogenasa
tesH 3-cetosteroide-delta-1-deshidrogenasa MSMEG_5941 36
3-cetoesteroide-Δ4(5α)-deshidrogenasa
tesI
Coenzima A transferasa ORF1 3-oxoadipato:succinil-CoA transferasa, subunidad A
MSMEG_6002 42
Acil CoA:acetato/3-cetoácido CoA transferasa, subunidad β [metabolismo lipídico]
ORF2 3-oxoadipato:succinil-CoA transferasa, subunidad B
MSMEG_6003 34
Enoil-CoA hidratasa/isomerasa
ORF3
Enoil-ACP reductasa ORF4 Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas
MSMEG_6004 44
Enoil-CoA hidratasa ORF5 Enoil-CoA hidratasa MSMEG_6001 43 ORF17 ORF17 Oxidorreductasa, componente de
transferencia de electrones MSMEG_6039 44
ORF18 ORF18 Substrato--CoA ligasa (fadD3) MSMEG_6013 45 Acil-CoA deshidrogenasa ORF21 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6014 49 Acil-CoA deshidrogenasa ORF22 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6015 30 Tiolasa ORF23 Acetil-CoA acetil transferasa MSMEG_6008 60 ORF25, proteina hipotética ORF25 ORF26, proteina hipotética ORF26 Oxidorreductasa ORF27 Oxidorreductasa, familia
deshidrogenasas/reductasas de cadena corta
MSMEG_5999 53
Acil-CoA deshidrogenasa ORF28 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6016 31 Acil-CoA deshidrogenasa ORF30 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6012 52 Oxidorreductasa ORF31 Deshidrogenasa de cadena corta MSMEG_6011 62 ORF32, proteina hipotética ORF32 Acil-CoA tiolasa ORF33 acetil-CoA acetil transferasa MSMEG_5996 36 Factor de transcripción tipo LuxR
tesR Supuesta proteína reguladora LuxR MSMEG_6568 22
83
Resultados
Tabla 6. Comparación in silico de sondas de C. testosteroni TA441 frente a M. smegmatis mc2155. Se señala el porcentaje de identidad (%) hallado en cada caso entre las secuencias
proteicas con mayor similitud utilizando el programa ClustalW. Las secuencias de las sondas
utilizadas de C. testosteroni se encuentran depositadas en las bases de datos de secuencias
DDBJ, EMBL y GenBank con los números de acceso AB040808 (tesB, ORF1-3), AB063482 (tes
A1, tesA2, tesD, tesE, tesF y tesG), AB076368 (tesH, tesI, ORF17 y 18) y AB186487 (ORF4, 5, 21-
23, 25-28, 30-33 y tesR).
El análisis in silico también se llevó a cabo con el genoma de M. tuberculosis
H37Rv, ya que aunque hasta recientemente se pensaba que esta bacteria no era
capaz de utilizar el colesterol como única fuente de carbono y energía (Pandey y
Sassetti, 2008), si que se postulaba que el colesterol podía estar implicado en su
supervivencia dentro de los macrófagos (Gatfield y Pieters, 2000). Así se
comprobó que existían igualmente agrupaciones génicas que presentaban una
alta similitud con los genes de C. testosteroni y M. smegmatis (Tabla 7).
84
Resultados
Función
Gen
Función
Gen
%
Dominio similar a flavin reductasa
tesA1 Posible oxidorreductasa Rv3567c 30
Naftociclinona hidroxilasa tesA2 Posible oxidorreductasa Rv3570c 32 Enzima de meta-apertura tesB 2,3-dihidroxibifenil 1,2-dioxigenasa
(DHBD) Rv3568c 42
Hidrolasa de plegamiento α/β
tesD 2-hidroxi-6-oxo-6-fenilhexa-2,4-dienoato hidrolasa
Rv3569c 32
Hidratasa/descarboxilasa tesE 2-hidroxipenta-2,4-dienoato hidratasa Rv3536c 41 Acetaldehido deshidrogenasa
tesF Acetaldehido deshidrogenasa Rv3535c 56
Deshidrogenasa tesG 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (HOA)
Rv3534c 47
3-oxoesteroide-Δ-1-deshidrogenasa
tesH 3-cetoesteroide 1-deshidrogenasa Rv3537 36
3-cetoesteroide-delta4(5α)-deshidrogenasa
tesI
Coenzima A transferasa ORF1 Posible CoA-Transferasa (subunidad alfa)
Rv3551 41
Acil CoA:acetato/3-cetoácido CoA transferasa, subunidad β [metabolismo lipídico]
ORF2 CoA transferasa, subunidad beta
Rv3552 37
Enoil-CoA hidratasa/isomerasa
ORF3
Enoil-ACP reductasa ORF4 Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas
Rv3553 45
Enoil-CoA hidratasa ORF5 EchA20 (fad) Rv3550 43 ORF17 ORF17 Oxigenasa reductasa KshB (PA5411) Rv3571 43 ORF18 ORF18 Substrato--CoA ligasa (ligasa) Rv3561 47 Acil-CoA deshidrogenasa ORF21 FadE31 (acd) Rv3562 50 Acil-CoA deshidrogenasa ORF22 FadE32 Rv3563 30 Tiolasa ORF23 FadA6_1 (fadA) Rv3556c 60 ORF25, proteina hipotética ORF25 ORF26, proteina hipotética ORF26 Oxidorreductasa ORF27 Oxidorreductasa, familia de
deshidrogenasas/reductasas de cadena corta
Rv3548c 53
Acil-CoA deshidrogenasa ORF28 Probable proteína fadE27 (acd) Rv3564 29 Acil-CoA deshidrogenasa ORF30 FadE30 (acd) Rv3560c 52 Oxidorreductasa ORF31 Oxidorreductasa, familia de
deshidrogenasas/reductasas de cadena corta
Rv3559c 60
ORF32, proteina hipotética ORF32 Acil-CoA tiolasa ORF33 FadA5 (PA1736) Rv3546 35 Factor de transcripción tipo LuxR
tesR Proteína hipotética Rv2488c 12
Comamonas testosteroni Mycobacterium tuberculosis H37Rv
85
Resultados
Tabla 7. Comparación in silico de sondas de C. testosteroni TA441 frente a M. tuberculosis H37Rv. Se señala el porcentaje de identidad (%) hallado en cada caso entre las secuencias
proteicas con mayor similitud utilizando el programa ClustalW. Las secuencias de las sondas
utilizadas de C. testosteroni se encuentran depositadas en las bases de datos de secuencias
DDBJ, EMBL y GenBank con los números de acceso AB040808 (tesB, ORF1- 3), AB063482 (tes
A1, tesA2, tesD, tesE, tesF y tesG), AB076368 (tesH, tesI, ORF17 y 18) y AB186487 (ORF4, 5, 21-
23, 25-28, 30-33 y tesR).
Las únicas sondas de C. testosteroni para las que no se encontraron genes
similares en ninguna de las dos especies de Mycobacterium fueron las
correspondientes al gen tesI y a las ORFs 25, 26 y 32. El producto del gen tesI no
afecta al crecimiento en testosterona en C. testosteroni, pero sí limita la
degradación de androsterona en esta cepa. El gen tesI codifica una 3-
cetoesteroide-Δ4(5α)-deshidrogenasa que cataliza el paso de androstan-3,17
diona a AD (Horinouchi et al., 2003b). La ruta postulada de degradación de
colesterol no alberga esta transformación (Kieslich, 1985; Martin, 1977; Owen et
al., 1983; Schoemer y Martin, 1980; Sedlaczek y Smith, 1988; Szentirmai, 1990).
Este hecho unido al bajo crecimiento que presenta M. smegmatis en androsterona
(ver apartado 1.1 de resultados) apoyarían el hecho de que esta enzima no esté
presente en su genoma. Para las ORFs 25, 26 y 32 todavía no se ha postulado
una posible función en la ruta de degradación de la testosterona u otros esteroides
(Horinouchi et al., 2004b).
Por otra parte, en las dos especies de Mycobacterium se encontraron
proteínas con similitud con tesR, la proteína reguladora del catabolismo de la
testosterona tipo LuxR, pero los porcentajes de identidad fueron bajos (ver tablas
6 y 7). La posición en el genoma de estos posibles genes reguladores, muy
alejada de los genes catabólicos, sugiere que no están relacionados con la
regulación del catabolismo de esteroides.
Curiosamente, los genes similares a las sondas de C. testosteroni se sitúan
de forma diferente en M. smegmatis y M. tuberculosis. En M. tuberculosis se
distribuyen más próximos entre sí en el genoma que en M. smegmatis, donde se
distinguen hasta tres agrupaciones génicas distintas (véase la figura 14). Estas
agrupaciones fueron delimitadas preliminarmente para su posterior análisis
86
Resultados
mediante RT-PCR, y comprenden en M. smegmatis las regiones del genoma
situadas entre:
1. La posición 5996 y la 6003 (en kb), donde se ubican los genes similares a
tesE, tesF, tesG y tesH;
2. La posición 6060 y la 6083, donde se sitúan los genes similares a las
ORFs 1, 2, 4, 5, 18, 17, 21, 22, 23, 27, 28, 30, 31 y 33;
3. La posición 6102 y 6108, que incluye los genes similares a tesA1, tesA2,
tesB, tesD y la ORF17.
En M. tuberculosis todos los genes similares a los genes tes y ORFs de C.
testosteroni se sitúan en una región de tan sólo 46 kb que comprende desde la
posición 3972 a la posición 4018. Dado que de manera común en los organismos
patógenos se produce la pérdida de genes prescindibles a medida que se
incrementa su adaptación al hospedador, estos datos obtenidos en M. tuberculosis
insinúan que se han conservado los genes imprescindibles para la degradación
del colesterol frente a otras regiones situadas entre ellos que se han ido
perdiendo, lo que sugiere la gran importancia que la degradación de esta molécula
tiene para el patógeno.
87
Resultados
5938
tesB
OR
F12
34
521
2223
2526
2728
3031
tesR
3332
tesD
tesA
1te
sEte
sGte
sFO
RF1
8O
RF1
7te
sIte
sHte
sA2
Com
amon
aste
stos
tero
niTA
441
5943
5937
5939
5941
5940
6.00
6
Myc
obac
teriu
msm
egm
atis
mc²
155
5942
5.99
6
5996
5999
6001
6004
6002
6003
6000
6007
6005
6006
6013
6009
6008
6011
6012
5997
5998
6010
5995
5994
6.06
0
6014
6015
6016
6017
6.08
3
6035
6036
6037
6038
6039
6.10
8
6033
6034
6040
6.10
2
Myc
obac
teriu
mtu
berc
ulos
isH
37R
v
3534
c35
3735
3835
3935
36c
3535
c35
40c
3541
c35
42c
3543
c35
44c
3545
c35
4635
4735
5035
5135
5235
5335
48c
3549
c35
56c
3557
c35
60c
3554
3555
c
3558
3561
3559
c35
6235
6335
6535
7135
7235
6435
67c
3568
c35
69c
3566
c35
70c
3573
c
4.01
8
5936
5938
tesB
OR
F12
34
521
2223
2526
2728
3031
tesR
3332
tesD
tesA
1te
sEte
sGte
sFO
RF1
8O
RF1
7te
sIte
sHte
sA2
Com
amon
aste
stos
tero
niTA
441
5943
5937
5939
5941
5940
6.00
6
Myc
obac
teriu
msm
egm
atis
mc²
155
5942
5.99
6
5996
5999
6001
6004
6002
6003
6000
6007
6005
6006
6013
6009
6008
6011
6012
5997
5998
6010
5995
5994
6.06
0
6014
6015
6016
6017
6.08
3
6035
6036
6037
6038
6039
6.10
8
6033
6034
6040
6.10
2
Myc
obac
teriu
mtu
berc
ulos
isH
37R
v
3534
c35
3735
3835
3935
36c
3535
c35
40c
3541
c35
42c
3543
c35
44c
3545
c35
4635
4735
5035
5135
5235
5335
48c
3549
c35
56c
3557
c35
60c
3554
3555
c
3558
3561
3559
c35
6235
6335
6535
7135
7235
6435
67c
3568
c35
69c
3566
c35
70c
3573
c
4.01
8
5936
Figu
ra14
88
Resultados
Figura 14. Representación esquemática de zonas relacionadas con la ruta baja de degradación del colesterol en C. testosteroni TA441, M. smegmatis mc2155 y M. tuberculosis H37Rv. En esta figura se representa esquemáticamente en primer lugar los genes de C.
testosteroni cuya participación en la degradación de la testosterona está estudiada o en proceso de
estudio (genes tes, mostrados como flechas coloreadas) y los marcos abiertos de lectura (ORFs)
de los que se postula su participación en este catabolismo (Genes numerados según la ORF que
representan. Se muestran como flechas blancas con el borde coloreado). La representación de
estos genes se ha adaptado de la propuesta por Horinouchi et al (2004). No se especifica su
posición en el genoma ya que C. testosteroni TA441 no está completamente secuenciada. A
continuación, se representan los genes de M. smegmatis mc2155 con elevada similitud con los de
C. testosteroni hallados mediante análisis in silico, así como algunos de los genes circundantes a
estos. Se han coloreado de manera idéntica al gen al que se asemejan de C. testosteroni, y el
número que los representa es su denominación en la base de datos Comprehensive Microbial
Resource (CMR). Por ejemplo, el gen representado como 5936 es el gen denominado
MSMEG_5936 en CMR. Por último, se representan los genes de M. tuberculosis H37Rv similares a
los de C. testosteroni. El número que incluye cada gen es su denominación. Por ejemplo, 3534c
representa el gen Rv3534c. Tanto en este caso como en el de M. smegmatis mc²155, los números
que aparecen sobre las líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que
se encuentran las distintas agrupaciones génicas.
1.3. Validación de los genes identificados in silico mediante análisis de su expresión por RT-PCR
A partir de los análisis in silico realizados sobre el genoma de M. smegmatis
mc²155, se llevaron a cabo ensayos de RT-PCR para averiguar si los genes
identificados como responsables del catabolismo del colesterol se expresan
específicamente cuando la bacteria crece con colesterol como única fuente de
carbono y energía. Así mismo, se analizaron los genes circundantes a éstos que
probablemente podrían estar también relacionados con el catabolismo de
esteroides, lo que al mismo tiempo servía para delimitar con mayor precisión en el
genoma las regiones implicadas en el catabolismo del colesterol. Los ensayos de
RT-PCR se realizaron a partir de cultivos de M. smegmatis mc²155 cultivado en
colesterol 2 mM o glicerol 0,6 M, tal y como se expone en el apartado 7.1 de
Materiales y Métodos.
89
Resultados
Los resultados de las RT-PCR se muestran en las figuras 15. A, B y C junto
con la representación esquemática de los genes analizados y como cabía esperar
se observó que muchos de estos genes efectivamente se expresan cuando la
bacteria crece con colesterol como única fuente de carbono pero no cuando crece
en glicerol (véase tabla 8. A).
Por otra parte, algunos de los genes que no presentaron expresión diferencial
en colesterol como MSMEG_5994, MSMEG_6004, MSMEG_6007,
MSMEG_6014, MSMEG_6016 (Véase Tabla 8. B) parece que están formando
operones con genes que sí presentan inducción en colesterol. Esto sugiere que
los resultados negativos obtenidos mediante la técnica de RT-PCR hay que
tomarlos siempre como posibles falsos negativos, ya que podrían ser debidos a un
problema de ajuste de las condiciones de amplificación o a otros problemas
relacionados con la estabilidad de los mensajeros y necesitan ser comprobados
mediante otras técnicas de estudio cuantitativas. Como se verá en otros apartados
de resultados, la inducción con colesterol de algunos de estos genes se hizo
efectivamente evidente utilizando otros métodos de análisis.
90
Resultados
59965997
59985995
5994 [18][124]
[2][7]
6.060
1 2
3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
2 3 4 5 1
59385943
59375939
59415940
6.0035.995
(4)[38]
[73][1]
5936[86]
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
59965997
59985995
5994 [18][124]
[2][7]
6.060
1 2 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 2 3 4 5
31
59385943
59375939
59415.995
(4)[38]
[73][1]
59406.003
5936[86]
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
Figura 15 A
91
Resultados
92
5999
6001
6004
6002
6003
6000
6005
6006
[15]
[61]
(4)
(4)
(4)
[43]
(4)
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
6007
6013
6009
6008
6011
6012
6010
6014
6015
6016
6017
6.08
3[8
8](8
)[3
14]
[125
](4
)[1
05]
(1)
(4)
(4)
[17]
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
5999
6001
6004
6002
6003
6000
6005
6006
[15]
[61]
(4)
(4)
(4)
[43]
(4)
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
6007
6013
6009
6008
6011
6012
6010
6014
6015
6016
6017
6.08
3[8
8](8
)[3
14]
[125
](4
)[1
05]
(1)
(4)
(4)
[17]
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
1 2
3
4
5
Figu
ra 1
5 B
Resultados
60356036
60376038
60396.108
603360346040
6.102(133)
[142][7]
[2](0)
[159][42]
1 2 3 4 5 1 2
3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
60356036
60336037
60386039
6.1086034
60406.102
(133)[142]
[7][2]
(0)[159]
[42]
1 2 3 4 5 1 2
3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Figura 15 C
Figura 15. Resultados de los
ayos de inducción en colesterol de los genes de Mycobacterium
smegm
atism
c²155 similares
a las
sondasde C
. testosteroniy agunos
genes circudantesm
ediante RT-PC
R. Se m
uestran los productos de las RT-P
CR
cargados en geles
de agarosa 1,5% y el esquem
genes a los que corresponden. A.Se muestran los genes 5936-5943 y 5994-5998. B
. Se muestran los
genes 5999-6017. C.Se m
uesan los genes 6033-6040. En todos los casos se cargaron cinco m
uestras, señaladas con números : 1.
Amplificación del cD
NA proc
de cultivo en colesterol 1,8 mM
. 2. Amplificación del R
NA procedente del cultivo en colesterol (control de
DN
A contaminante). 3. Am
plifición del cD
NA procedente del cultivo en glicerol 0,6 M
. 4. Amplificación del R
NA procedente del cultivo en
glicerol (control de DN
A containante). 5. Am
plificación de DN
A (control positivo). Se han señalado con un círculo rojo aquellas muestras de
cDN
Aque presentaron am
plifición. Los núm
eros que se muestran por encim
a de los genes señalan el número de pares de bases entre los
genes adyacentes. Los númer
entre corchetes indican separación y los números entre paréntesis solapam
iento.
ens
l
a de los
tr
edente
ac
mac
os
93
Resultados
8.B
orf17MSMEG_6039
tesA2MSMEG_6038
tesDMSMEG_6037
tesBMSMEG_6036
tesA1MSMEG_6035
orf21MSMEG_6014
orf30MSMEG_6012
orf31MSMEG_6011
MSMEG_6010
MSMEG_6009
orf23MSMEG_6008
orf2MSMEG_6003
orf1MSMEG_6002
orf5MSMEG_6001
MSMEG_6000
orf27MSMEG_5999
MSMEG_5998
MSMEG_5997
orf33MSMEG_5996
MSMEG_5995
MSMEG_5943
tesHMSMEG_5941
tesEMSMEG_5940
tesFMSMEG_5939
tesGMSMEG_5937
Gen similar en C. testosteroni
TA441
Genes de M. smegmatis mc2155
con expresióndiferencial en
colesterol mediante RT-PCR
semicuantitativa
orf17MSMEG_6039
tesA2MSMEG_6038
tesDMSMEG_6037
tesBMSMEG_6036
tesA1MSMEG_6035
orf21MSMEG_6014
orf30MSMEG_6012
orf31MSMEG_6011
MSMEG_6010
MSMEG_6009
orf23MSMEG_6008
orf2MSMEG_6003
orf1MSMEG_6002
orf5MSMEG_6001
MSMEG_6000
orf27MSMEG_5999
MSMEG_5998
MSMEG_5997
orf33MSMEG_5996
MSMEG_5995
MSMEG_5943
tesHMSMEG_5941
tesEMSMEG_5940
tesFMSMEG_5939
tesGMSMEG_5937
Gen similar en C. testosteroni
TA441
Genes de M. smegmatis mc2155
con expresióndiferencial en
colesterol mediante RT-PCR
semicuantitativa
MSMEG_6040
MSMEG_6034
MSMEG_6033
MSMEG_6017
orf22MSMEG_6015
orf18MSMEG_6013
MSMEG_6007
orf33MSMEG_6006
MSMEG_6005
orf4MSMEG_6004
MSMEG_5994
MSMEG_5938
MSMEG_5936
Gen similar en C. testosteroni
TA441
Genes de M. smegmatis mc2155 que
no presentaron expresión diferencial
en colesterol mediante RT-PCR
semicuantitativa
MSMEG_6040
MSMEG_6034
MSMEG_6033
MSMEG_6017
orf22MSMEG_6015
orf18MSMEG_6013
MSMEG_6007
orf33MSMEG_6006
MSMEG_6005
orf4MSMEG_6004
MSMEG_5994
MSMEG_5938
MSMEG_5936
Gen similar en C. testosteroni
TA441
Genes de M. smegmatis mc2155 que
no presentaron expresión diferencial
en colesterol mediante RT-PCR
semicuantitativa
8.A
Tabla 8. Resumen de los genes con (A) y sin (B) expresión diferencial en colesterol mediante los ensayos de RT-PCR.
94
Resultados
1.4 Búsqueda de un indicador genético de degradación de esteroides en bacterias
Dada la conservación de genes ortólogos a los genes tes de Comamonas
testosteroni dentro de las principales bacterias degradadoras de esteroides
conocidas, muchas de ellas actiomicetos, nos propusimos investigar si estos
genes eran específicos de microorganismos catabolizadores de compuestos con
dicha estructura, pudiendo servir así como “indicador genético” de
microorganismos degradadores de esteroides. Para ello se llevaron a cabo
comparaciones de las secuencias de tres proteínas codificadas por los genes tes:
TesA2, TesB y TesH mediante el programa BLASTP, contra la base de datos de
secuencias de proteínas no redundantes (nr) y se seleccionaron aquellos
microorganismos que presentaban proteínas similares a estas tres (las tres
inclusive) dentro de las 100 primeras secuencias con homología. El porcentaje de
identidad que presentan las proteínas seleccionadas con las respectivas de C.
testosteroni es de 30% o mayor (cuantificado por ClustalW). Se escogieron estas
tres proteínas porque el conjunto de microorganismos que poseen ortólogas a las
mismas el bastante homogéneo. Otras como por ejemplo TesA1, componente de
la monooxigenasa TesA1TesA2, tiene similitud con componentes flavín reductasa
de proteínas pertenecientes a un mayor rango de microorganismos, para algunos
de los cuales el crecimiento en esteroides no ha sido constatado, como varias
especies pertenecientes al género Pseudomonas. Los resultados de este análisis
se muestran en la tabla 9 e incluyen β-proteobacterias como C. testosteroni y
distintas especies del género Burkholderia, ambas especies conocidos
degradadores de compuestos esteroideos y aromáticos, respectivamente
(Horinouchi et al., 2003b; Krumme et al., 1993). También aparecen otras β-
proteobacterias como Cupriavidus taiwanensis, un fijador de nitrógeno metal-
resistente simbionte de leguminosas (Amadou et al., 2008) y Ralstonia eutropha,
degradadora de compuestos aromáticos clorados (Trefault et al., 2004).
Como cabía esperar, la mayoría de bacterias que aparecen en esta
búsqueda pertenecen al grupo de los actinomicetos, conocidos degradadores de
esteroides. Nos encontramos así con numerosas especies de bacterias del género
95
Resultados
Mycobacterium, tanto patógenas como saprófitas. Cabe destacar la ausencia de
M. leprae, que un análisis más detallado ha confirmado que no posee genes
ortólogos a los relacionados con la degradación de colesterol. Hay representantes
de otros géneros como Gordonia, Rhodococcus, Nocardia, Nocardioides,
Streptomyces y otros menos conocidos como los actinomicetos marinos
Salinispora arenicola y S. tropica (Maldonado et al., 2005), el termófilo
Thermomonospora curvata (Stutzenberger, 1971) y Tsukamurella paurometabola
(Collins et al., 1988).
Fuera de las β-proteobacterias y los actinomicetos nos encontramos con
algunos representantes de otros grupos de bacterias, así por ejemplo presentan
proteínas similares a las Tes dos α-proteobacterias: Novosphingobium
aromaticivorans, degradadora de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) que
porta un plásmido catabólico que incluye genes responsables de la degradación
de bifenilo, m-xileno o p-cresol, entre otros compuestos (Romine et al., 1999) y
Sphingomonas wittichii, degradadora de dioxinas y herbicidas difenil éter (Keum et
al., 2008).
Por último, aparecen representantes del grupo de las γ-proteobacterias, todos
ellos de origen marino: Shewanella halifaxensis, un psicrófilo desnitrificante
degradador del compuesto explosivo hexahidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX)
(Zhao et al., 2006), el mesófilo Shewanella pealeana (Leonardo et al., 1999), la
bacteria antártica Pseudoalteromonas haloplanktis, degradadora de compuestos
aromáticos dioxigenados como los catecoles (Papa et al., 2009) y otras dos γ-
proteobacterias marinas mesófilas todavía sin clasificar: HTCC2080 y HTCC2148.
Aunque no se ha descrito todavía la posible capacidad de degradación de
esteroides para las bacterias de los grupos α y γ encontradas en esta búsqueda,
nos aventuramos a decir que muy probablemente la poseen, y el hecho de que un
microorganismo posea tres genes ortólogos a tesA2, tesB y tesH puede ser un
“marcador genético” de su potencial catabólico de compuestos esteroideos. No
obstante, para definir la utilidad real de este análisis habrá que demostrar que
alguna de las bacterias detectadas crece en colesterol. Por otra parte es necesario
aclarar que el hecho de que un organismo no presente estas proteínas no
descarta su implicación en estas rutas de degradación, como le sucede por
96
Resultados
ejemplo al anaerobio facultativo Sterolibacterium denitrificans (Chiang et al.,
2008b).
Uncultured marine bacterium 442Mycobacterium sp. MCSTsukamurella paurometabola DSM 20162Mycobacterium sp. JLSThermomonospora curvata DSM 43183Mycobacterium smegmatis str. mc²155Streptomyces sp. AA4Mycobacterium kansasii ATCC 12478Sphingomonas wittichii RW1Mycobacterium intracellulare ATCC 13950Shewanella pealeana ATCC 700345Mycobacterium gilvum PYR-GCKShewanella halifaxensis HAW-EB4Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10Salinispora tropica CNB-440Mycobacterium avium subsp. avium ATCC 25291Salinispora arenicola CNS-205Mycobacterium avium 104Rhodococcus opacus B4Mycobacterium abscessus ATCC 19977Rhodococcus jostii RHA1marine gamma proteobacterium HTCC2148Rhodococcus erythropolismarine gamma proteobacterium HTCC2080Ralstonia eutrophaGordonia bronchialis DSM 43247]Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125Cupriavidus taiwanensisNovosphingobium aromaticivorans DSM 12444Comamonas testosteroni KF-1Nocardioides sp. JS614Comamonas testosteroni CNB-2Nocardia farcinica IFM 10152Burkholderia sp. H160Mycobacterium vanbaalenii PYR-1Burkholderia sp. 383Mycobacterium ulcerans Agy99Burkholderia cenocepacia J2315Mycobacterium tuberculosis H37RvBurkholderia ambifaria IOP40-10
Uncultured marine bacterium 442Mycobacterium sp. MCSTsukamurella paurometabola DSM 20162Mycobacterium sp. JLSThermomonospora curvata DSM 43183Mycobacterium smegmatis str. mc²155Streptomyces sp. AA4Mycobacterium kansasii ATCC 12478Sphingomonas wittichii RW1Mycobacterium intracellulare ATCC 13950Shewanella pealeana ATCC 700345Mycobacterium gilvum PYR-GCKShewanella halifaxensis HAW-EB4Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10Salinispora tropica CNB-440Mycobacterium avium subsp. avium ATCC 25291Salinispora arenicola CNS-205Mycobacterium avium 104Rhodococcus opacus B4Mycobacterium abscessus ATCC 19977Rhodococcus jostii RHA1marine gamma proteobacterium HTCC2148Rhodococcus erythropolismarine gamma proteobacterium HTCC2080Ralstonia eutrophaGordonia bronchialis DSM 43247]Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125Cupriavidus taiwanensisNovosphingobium aromaticivorans DSM 12444Comamonas testosteroni KF-1Nocardioides sp. JS614Comamonas testosteroni CNB-2Nocardia farcinica IFM 10152Burkholderia sp. H160Mycobacterium vanbaalenii PYR-1Burkholderia sp. 383Mycobacterium ulcerans Agy99Burkholderia cenocepacia J2315Mycobacterium tuberculosis H37RvBurkholderia ambifaria IOP40-10
Tabla 9. Microorganismos que presentan proteínas similares a TesA2, TesB y TesH utilizando el programa BlastP. Se escogieron todas las especies dentro de las 100 primeras que
contienen proteínas con similitud (identidad ≥30%) con las tres de C. testosteroni (TesA2, TesB y
TesH), las tres inclusive. Se señalan en naranja las bacterias del grupo de los actinomicetos, en
amarillo las α-proteobacterias, en azul las β-proteobacterias y en verde las γ-proteobacterias. La
prevalencia de actinomicetos es apreciable.
2. Estudio de enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona
Como ya se ha comentado en la introducción, el primer paso de la ruta de
degradación del colesterol es, según las rutas postuladas hasta el momento, la
oxidación de colesterol a 5-colesten-3-ona (Figura 5 Introducción (2)) seguida de
su isomerización a 4-colesten-3-ona (Figura 5 Introducción (3)). En primer lugar
para dilucidar esta ruta catalítica en M. smegmatis, nos propusimos identificar
genes que por similitud de secuencia fueran claros candidatos para ser los
97
Resultados
responsables de esta transformación. Los productos de estos genes se
sometieron posteriormente a ensayos de actividad y a mutagénesis para confirmar
su posible función. Además la inducción de su expresión en presencia de
colesterol se estudió mediante RT-PCR a tiempo real.
2. 1 Análisis in silico de genes que codifican actividad colesterol oxidasa o deshidrogenasa
Mediante comparaciones in silico utilizando como sondas las secuencias de
dos proteínas diferentes responsables ambas de catalizar el paso de colesterol a
4-colesten-3-ona en otros microorganismos, se identificaron en el genoma de M.
smegmatis mc2155 dos genes que podrían codificar la actividad catalítica
buscada. A continuación se expone de manera detallada la determinación de los
mismos.
2.1.1 MSMEG_1604
La primera secuencia proteica que se comparó frente al genoma de M.
smegmatis fue la correspondiente a la colesterol oxidasa de M. tuberculosis
H37Rv, codificada por el gen Rv3409c y denominada ChoD, como nombre
genérico de las colesterol oxidasas de micobacterias patógenas y de
Streptomyces coelicolor (Navas et al., 2001). La hiperproducción de ChoD en M.
tuberculosis produce la acumulación temporal de 4-colesten-3-ona, y su
mutagénesis disminuye la virulencia de este patógeno (Brzostek et al., 2007), pero
su implicación directa en la ruta de degradación de colesterol todavía no ha sido
constatada.
En primer lugar se hizo una comparación de ChoD frente a la totalidad de las
secuencias proteicas de las bases de datos utilizando el programa BLASTP. Como
puede verse en la tabla 10, se conservan proteínas muy similares a ChoD en las
especies del género Mycobacterium, tanto en las de crecimiento lento (todas ellas
98
Resultados
patógenas) (M. ulcerans, M. kansasii, M. intracellulare, M. avium, M. leprae) como
en las de crecimiento rápido (M. vanbaalenii, M. smegmatis, M. gilvum, M. sp JLS,
M. sp MCS, M. abscessus), (no patógenas, excepto M. abscessus, que es
oportunista). ChoD es así mismo muy similar a las colesterol oxidasas de otros
actinomicetos como algunas de los géneros Rhodococcus o Nocardia; la mayoría
son saprófitos de vida libre aunque algunos de ellos pueden actuar como
patógenos oportunistas en pacientes inmunocomprometidos, como por ejemplo
Nocardia farcinica (Ishikawa et al., 2004) o Gordonia bronchialis (Richet et al.,
1991).
66
Colesterol oxidasa[Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338]YP_001108796.1
83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_952352.1
69Flavoproteína Colina deshidrogenasa-like[Saccharomonospora viridis DSM
43017]YP_003132378.1
88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae TN]NP_301379.1
70Posible colesterol oxidasa[Nocardia farcinica IFM 10152]
YP_118824.187
ChoD[Mycobacterium leprae]AAC43233.1
68Posible oxidorreductasa[Rhodococcus opacus B4]YP_002783453.1
88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae Br4923]YP_002503010.1
68Colesterol oxidasa[Rhodococcus jostii RHA1]
YP_706136.1 87
Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium subsp. AviumATCC 25291]ZP_05218299.1
70Colesterol oxidasa[Rhodococcus erythropolis SK121]
ZP_04383195.187
Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium 104]YP_883489.1
71Proteína hipotética RER_19350[Rhodococcus erythropolis PR4]YP_002765382.1
88Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium intracellulare ATCC13950]ZP_05226006.1
78Posible colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium abscessus ATCC19977]YP_001704447.1
90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium kansasii ATCC12478]ZP_04746501.1
79Oxidorreductasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. MCS]YP_638338.1
90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_905003.1
% ID conRv3409c(ChoD)
ClustalW
Proteína/microorganismo
% ID con Rv3409c (ChoD)
ClustalW
Proteína /microorganismo
66Colesterol oxidasa[Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338]YP_001108796.1
83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_952352.1
69Flavoproteína Colina deshidrogenasa-like[Saccharomonospora viridis DSM
43017]YP_003132378.1
88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae TN]NP_301379.1
70Posible colesterol oxidasa[Nocardia farcinica IFM 10152]
YP_118824.187
ChoD[Mycobacterium leprae]AAC43233.1
68Posible oxidorreductasa[Rhodococcus opacus B4]YP_002783453.1
88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae Br4923]YP_002503010.1
68Colesterol oxidasa[Rhodococcus jostii RHA1]
YP_706136.1 87
Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium subsp. AviumATCC 25291]ZP_05218299.1
70Colesterol oxidasa[Rhodococcus erythropolis SK121]
ZP_04383195.187
Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium 104]YP_883489.1
71Proteína hipotética RER_19350[Rhodococcus erythropolis PR4]YP_002765382.1
88Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium intracellulare ATCC13950]ZP_05226006.1
78Posible colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium abscessus ATCC19977]YP_001704447.1
90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium kansasii ATCC12478]ZP_04746501.1
79Oxidorreductasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. MCS]YP_638338.1
90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_905003.1
% ID conRv3409c(ChoD)
ClustalW
Proteína/microorganismo
% ID con Rv3409c (ChoD)
ClustalW
Proteína /microorganismo
99
Resultados
62Flavoproteína colina deshidrogenasa[Kribbella flavida DSM 17836]ZP_03859915.1
80Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. JLS]YP_001069491.1
65Oxidorreductasa FAD dependiente[Gordonia bronchialis DSM 43247]YP_003272883.1
81Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001136160.1
65Colesterol oxidasa[Streptomyces sp. AA4]ZP_05476910.1
83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_885983.1
62Flavoproteína colina deshidrogenasa[Kribbella flavida DSM 17836]ZP_03859915.1
80Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. JLS]YP_001069491.1
65Oxidorreductasa FAD dependiente[Gordonia bronchialis DSM 43247]YP_003272883.1
81Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001136160.1
65Colesterol oxidasa[Streptomyces sp. AA4]ZP_05476910.1
83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_885983.1
Tabla 10. Resultados de la comparación de ChoD de M. tuberculosis H37Rv frente a las bases de datos de secuencias proteicas utilizando el programa BLASTP. Se muestran las 24
proteínas más similares, el microorganismo al que pertenecen, su código de acceso y su similitud
con ChoD indicada en porcentaje de identidad hallado con ClustalW. La proteína producto del gen
MSMEG_1604 de M. smegmatis mc2155 se ha señalado en color azul.
Centrándonos en el genoma de M. smegmatis, la proteína más similar a
Rv3409c (y la novena en una comparación frente al total de secuencias proteicas)
es la oxidorreductasa FAD-dependiente codificada por el gen MSMEG_1604 (1737
pb), con la que comparte un 83% de identidad (cuantificado por ClustalW, tabla
10). La siguiente secuencia proteica más similar a ChoD en el genoma de M.
smegmatis sería la correspondiente a la glucosa-metanol-colina oxidorreductasa
codificada por el gen MSMEG_5967, que sólo presenta una identidad del 17%
(cuantificado por ClustalW) con ChoD, (e igualmente un 17% con MSMEG_1604)
con lo que se puede concluir que ChoD no tiene más ortólogos en mc2155 que
MSMEG_1604. Tanto ChoD como el producto del gen MSMEG_1604 (al que a partir de
ahora nos referiremos como ChoDMS) presentan características propias de las
proteínas FAD-dependientes. Así, presentan un motivo Gly-X-Gly-(X)2-Gly-(X)10-
Gly (donde X representa cualquier aminoácido) en la región N-terminal, que es
común a proteinas de unión a FAD y NAD (Vrielink et al., 1991), como se verá más
adelante. Con respecto al sitio activo, se ha visto que las colesterol oxidasas de
Brevibacterium sterolicum y Streptomyces así como otras oxidorreductasas tienen
en su centro activo 3 residuos hidrofílicos conservados que actúan como bases
catalíticas: His447, Glu361 y Asn485 (Vrielink et al., 1991; Yue et al., 1999). ChoD
y ChoDMS también presentan estos residuos en posiciones cercanas a las
descritas (Fig. 16).
100
Resultados
MSMEG_1604 MKPDYDVLVIGSGFGGSVSALRLTEKGYRVGVLEAGRRFSDEEFAKTSWQLRKFLWAPKL 60 NT02MT3722 MKPDYDVLIIGSGFGGSVTALRLTEKGYRVGVLEAGRRFSDEEFAKTSWDLRKFLWAPRL 60 ********:*********:******************************:********:* MSMEG_1604 GCYGIQRIHLLRNVMILAGAGVGGGSLNYANTLYVPPEPFFADRQWAGITDWRAELTPHY 120 NT02MT3722 GCYGIQRIHPLRNVMILAGAGVGGGSLNYANTLYVPPEPFFADQQWSHITDWRGELMPHY 120 ********* *********************************:**: *****.** *** MSMEG_1604 DQAQRMLGVVTNPTFTDADRVVKEVADDMGVGDTFVQTPVGVFFGPDGEKTPGKTVPDPY 180 NT02MT3722 QQAQRMLGVVQNPTFTDADRIVKEVADEMGFGDTWVPTPVGVFFGPDGTKTPGKTVPDPY 180 :********* *********:******:**.***:* *********** *********** MSMEG_1604 FGGVGPDRTGCIECGSCMTGCRYGAKNTLLKNYLGLAERGGAEVHPLRTVAGFEQLPDGT 240 NT02MT3722 FGGAGPARTGCLECGCCMTGCRHGAKNTLVKNYLGLAESAGAQVIPMTTVKGFERRSDGL 240 ***.** ****:***.******:******:******** .**:* *: ** ***: .** MSMEG_1604 WRVDTVRTGRWARKDKRSFTATHVVLAAGTWGTQRLLFKMRDTGKLPKLSSRLGVLTRTN 300 NT02MT3722 WEVRTVRTGSWLRRDRRTFTATQLVLAAGTWGTQHLLFKMRDRGRLPGLSKRLGVLTRTN 300 *.* ***** * *:*:*:****::**********:******* *:** **.********* MSMEG_1604 SESIVGAGRYEVTPDLDLTHGVAITSSIHPTPDTHIEPVRYGKGSNAMGLLQTLMTDGDG 360 NT02MT3722 SESIVGAATLKVNPDLDLTHGVAITSSIHPTADTHIEPVRYGKGSNAMGLLQTLMTDGSG 360 *******. :*.******************.**************************.* MSMEG_1604 PDGAGIPRWKQLLRNAAEDPRGTLRLLNVHRWSERTLIALVMQHLDNSITTYTKRNRLGI 420 NT02MT3722 PQGTDVPRWRQLLQTASQDPRGTIRMLNPRQWSERTVIALVMQHLDNSITTFTKRGKLGI 420 *:*:.:***:***:.*::*****:*:** ::*****:**************:***.:*** MSMEG_1604 RRYLSKQGHGAPNPTWIPVGNEVTRRIAKKIDGVAGGTWGELFNIPLTAHFLGGAAIGDS 480 NT02MT3722 RWYSSKQGHGEPNPTWIPIGNQVTRRIAAKIDGVAGGTWGELFNIPLTAHFLGGAVIGDD 480 * * ****** *******:**:****** **************************.***. MSMEG_1604 PETGVIDPYQRVYNYPTLHVMDGAAISANLGVNPSLSITAQAERATSLWPNKGEQDQRPA 540 NT02MT3722 PEHGVIDPYHRVYGYPTLYVVDGAAISANLGVNPSLSIAAQAERAASLWPNKGETDRRPP 540 ** ******:***.****:*:*****************:******:******** *:**. MSMEG_1604 QGEPYRRLAPIAPVRPVVPADAPGALRRLPIEPVSSAG 578 NT02MT3722 QGEPYRRLAPIQPAHPVVPADAPGALRWLPIDPVSNAG 578 *********** *.:************ ***:***.** Figura 16. Alineamiento del producto del gen MSMEG_1604 (ChoDMS) y ChoD de M. tuberculosis H37Rv y supuestos motivos consenso hallados en las secuencias. Los residuos
marcados en amarillo estarían implicados en la unión de la coenzima FAD y los residuos marcados
en rojo formarían parte del centro activo.
Para apoyar estos datos, se llevó a cabo la predicción de la estructura
secundaria y la estructura tridimensional de ChoDMS utilizando para ello el
programa LOOPP, alojado en el servidor BioHPC
(http://cbsuapps.tc.cornell.edu/loopp.aspx). Este programa busca el molde más
adecuado para la secuencia proteica problema dentro de las estructuras presentes
en las bases de datos. En el caso de ChoDMS, se seleccionó como molde para la
construcción del modelo la cadena A de la colesterol oxidasa de Streptomyces
(PDB: 1B4V) (Yue et al., 1999), ya que el programa en este caso fue capaz de
comparar el 86 % de la secuencia de la proteína con una identidad de secuencia
101
Resultados
de 21 %. Su estructura se presenta con la proteína unida a la coenzima FAD.
Aunque el modelo no presenta una elevada confianza, permite visualizar la
disposición conservada de los aminoácidos consenso (Figura 17).
A B Figura 17. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína ChoDMS tomando como modelo la colesterol oxidasa de Streptomyces (PDB: 1B4V cadena A). A. Modelo de la
estructura propuesto para ChoDMS. B. Estructura publicada de la cadena A de la colesterol oxidasa
de Streptomyces (Yue et al., 1999). Los aminoácidos marcados en amarillo son aquellos para los
que se predice su implicación en la unión de la coenzima FAD. La Gly27 de ChoDMS así como la
Gly28 de 1B4V no parecen implicadas en esta unión, ya que se sitúan en la superficie externa de
la proteína alejadas del sitio de unión a FAD. Los residuos marcados en rojo formarían parte del
centro activo. En verde se ha marcado la coenzima FAD en la proteína de Streptomyces.
102
Resultados
2.1.2 MSMEG_5228
La transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona puede estar catalizada,
además de por enzimas del tipo colesterol oxidasa, por las hidroxiesteroide
deshidrogenasas, como ya se comentó en la Introducción. Así, Horinouchi et al.
(1991) describieron una colesterol deshidrogenasa NAD(P)-dependiente (NAD(P)-
CDH, número de acceso BAA14290.1) en Nocardia sp. encargada de realizar esta
transformación. El análisis comparativo in silico de esta proteína se efectuó, como
en el apartado anterior, comparando su secuencia frente a la totalidad de las
secuencias proteicas de las bases de datos utilizando el programa BLASTP. Este
análisis nos condujo al gen MSMEG_5228 (1068 pb) cuyo producto, que se
describe como perteneciente a la familia de las 3-β hidroxiesteroide
deshidrogenasas/isomerasas, presenta una identidad del 77% (cuantificado por
ClustalW) con la proteína de Nocardia (tabla 12). Las demás proteínas bacterianas
que mostraron cierta similitud con la NAD(P)-CDH que salieron a la luz como
resultado de este análisis pertenecen todas ellas, sorprendentemente, a especies
bacterianas del género Mycobacterium (las siguientes proteínas en orden de
similitud con NAD(P)-CDH pertenecen a vegetales, datos no mostrados). Al igual
que en el caso de ChoD, aparecen proteínas de especies tanto patógenas como
no patógenas, y tanto de crecimiento rápido como lento (tabla 11). En el genoma
de M. smegmatis parece ser el gen MSMEG_5228 el único ortólogo al gen de
Nocardia, siendo el siguiente gen en orden de similitud MSMEG_6142, que
codifica una nucleósido-difosfato-azúcar epimerasa, con una identidad de sólo el
22% con la proteína de Nocardia.
103
Resultados
72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis T17]ZP_03536067.1
73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]NP_215622.1
71Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium leprae TN]NP_302310.1
763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. JLS]YP_001072602.1
72Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium intracellulare ATCC 13950]ZP_05224707.1
763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. MCS]YP_641270.1
73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium marinum M]YP_001852621.1
753-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001133341.1
72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_904397.1
75Posible colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749754.1
73Proteína hipotética MAP2688 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_961622.1
77Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_889474.1
74Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium avium 104]YP_880472.1
773-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_955416.1
% ID con NAD(P)-
CDHClustalW
Proteína/microorganismo
% ID con NAD(P)-
CDHClustalW
Proteína /microorganismo
72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis T17]ZP_03536067.1
73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]NP_215622.1
71Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium leprae TN]NP_302310.1
763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. JLS]YP_001072602.1
72Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium intracellulare ATCC 13950]ZP_05224707.1
763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. MCS]YP_641270.1
73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium marinum M]YP_001852621.1
753-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001133341.1
72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_904397.1
75Posible colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749754.1
73Proteína hipotética MAP2688 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_961622.1
77Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_889474.1
74Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium avium 104]YP_880472.1
773-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_955416.1
% ID con NAD(P)-
CDHClustalW
Proteína/microorganismo
% ID con NAD(P)-
CDHClustalW
Proteína /microorganismo
Tabla 11. Resultados de la comparación de la NAD(P)-CDH de Nocardia sp. frente a las bases de datos de secuencias proteicas utilizando el programa BLASTP. Se muestran las 14
proteínas más similares, el microorganismo al que pertenecen, su código de acceso y su similitud
con la NAD(P)-CDH indicada en porcentaje de identidad hallado con ClustalW. La proteína
producto del gen MSMEG_5228 de M. smegmatis mc2155 se ha señalado en color azul.
La NAD(P)-CDH de Nocardia sp. así como el producto del gen MSMEG_5228
(a partir de ahora denominado en el texto 3-β HSDMS) presentan un motivo Gly-X-
Gly-(X)2-Gly-(X)10-Gly (donde X representa cualquier aminoácido) en la región N-
terminal (Fig. 18) que está bien conservado entre los dominios de unión a NAD de
muchas deshidrogenasas NAD(P)-dependientes (Scrutton et al., 1990). Así
104
Resultados
mismo, presentan una tétrada catalítica característica de proteínas de la
superfamilia de las deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR)
constituída por una Asn alrededor de la posición 111, una Ser alrededor de la
posición 138 y Tyr-(X3)-Lys alrededor de la posición 151 (Oppermann et al., 2003).
Además de esta tétrada presentan otras características propias de las SDR, como
son un Asp alrededor de la posición 60, una Ala alrededor de la posición 88 y un
motivo Pro-Gly alrededor de la posición 180 seguido de una Thr conservada
alrededor de la posición 188 (Fig. 18).
MSMEG_5228 MADS--TTDLGRILVTGGSGFVGANLVTELLDRGYAVRSFDRVPSPLPAHAGLEVATGDI 58 NAD_P_-CDH MGDASLTTDLGCVLVTGGSGFVGANLVTELLDRGYAVRSFDRAPSPLGDHAGLEVIEGDI 60 *.*: ***** :*****************************.**** ****** *** MSMEG_5228 CDLDNVTNAVAGVDTVFHTAAIIDLMGGASVTAEYRQRSFAVNVGGTENLVRAAQSAGVK 118 NAD_P_-CDH CDKETVAAAVKDIDTVIHTAAIIDLMGGASVTEAYRQRSFAVNVEGTKNLVHASQEAGVK 120 ** :.*: ** .:***:*************** ********** **:***:*:*.**** MSMEG_5228 RFVYTASNSVVMGGQHIVHGDETLPYTERFNDLYTETKVVAEKFVLGRNGVAGMLTCSIR 178 NAD_P_-CDH RFVYTASNSVVMGGQDIVNGDETMPYTTRFNDLYTETKVVAEKFVLAENGKHDMLTCAIR 180 ***************.**:****:*** ******************..** .****:** MSMEG_5228 PSGIWGRGDQTMFRKVFESVLAGHVKVLVGRKSTLLDNSYVHNLVHGFILAAEHLTPNGT 238 NAD_P_-CDH PSGIWGRGDQTMFRKVFENVLAGHVKVLVGNKNIKLDNSYVHNLIHGFILAGQDLVPGGT 240 ******************.***********.*. *********:******.:.*.*.** MSMEG_5228 APGQAYFINDGEPVNMFEFARPVIEACGRKLPRVRVPGRAVHAAMSGWQRLHFRFGIPEP 298 NAD_P_-CDH APGQAYFINDGEPINMFEFARPVLAACGRPLPTFYVSGRLVHKVMMAWQWLHFKFALPEP 300 *************:*********: **** ** . *.** ** .* .** ***:*.:*** MSMEG_5228 LLEPLAVERLYLNNYFSIAKATRDLGYRPLFTTEQARVDCLPYYVDLFKQME-AQARPA- 356 NAD_P_-CDH LIEPLAVERLYLNNYFSIAKAKRDLGYEPLFTTEQAMAECMPYYVEMFHQMESAQKAPAA 360 *:*******************.*****.******** .:*:****::*:*** ** ** MSMEG_5228 ---- NAD_P_-CDH AVAR 364 Figura 18. Alineamiento del producto del gen MSMEG_5228 (3-β HSDMS) y la NAD(P)-CDH de Nocardia sp. y supuestos motivos consenso hallados en las secuencias. Los residuos
marcados en amarillo estarían implicados en la unión de la coenzima mediante el mantenimiento
de la estructura de la lámina β central; los residuos marcados en azul estarían implicados en
interacciones con la coenzima y los residuos marcados en rojo formarían la tétrada catalítica.
Las funciones postuladas para estos residuos en estas posiciones
particulares se resumen en la tabla 12, adaptada de Opperman et al. (2003).
105
Resultados
Unión a la carboxamida del anillo de nicotinamida188T
Dirección de la reacción183-184P-G
Conexión del bucle de unión al sustrato y el sitio activo179N
Sitio activo138, 151,155S-Y-K
Sitio activo111N
Estabilización de la lámina β central88A
Estabilización del bolsillo del anillo de adenina, unión débil a la coenzima
60D
FunciónPosición aproximada
Motivo
Unión a la carboxamida del anillo de nicotinamida188T
Dirección de la reacción183-184P-G
Conexión del bucle de unión al sustrato y el sitio activo179N
Sitio activo138, 151,155S-Y-K
Sitio activo111N
Estabilización de la lámina β central88A
Estabilización del bolsillo del anillo de adenina, unión débil a la coenzima
60D
FunciónPosición aproximada
Motivo
Tabla 12. Función de los motivos conservados encontrados en enzimas SDR. Para las
posiciones se ha utilizado como referencia la 3β/17β-HSD de C. testosteroni (código PDB 1hxh)
(Oppermann et al., 2003). Los aminoácidos se han escrito en código de una letra.
Las SDR forman una gran familia de proteínas funcionalmente heterogénea.
A pesar de las bajas identidades de secuencia entre las diferentes formas
(alrededor de un 15-20 %), las estructuras tridimensionales presentan patrones de
plegamiento α/β similares con una lámina β central típica del plegamiento de
Rossmann (motivo estructural de unión a NAD).
La predicción de las estructuras secundaria y tridimensional de 3-β HSDMS se
llevó a cabo, al igual que se hizo con ChoDMS, utilizando el programa LOOPP. En
el caso de 3-β HSDMS se seleccionó como molde para la construcción del modelo
la cadena A de la proteína DesIV (dTDP-glucosa 4,6-deshidratasa) de
Streptomyces venezuelae (PDB: 1R66) (Allard et al., 2004), un miembro de la
familia de las SDR. Su estructura se presenta con la proteína unida a la coenzima
NAD y a dTDP (el nucleótido desoxitimidina difosfato, que forma parte del sustrato
de DesIV, la dTDP glucosa). El programa pudo comparar el 90 % de DesIV con
una identidad de secuencia de 22 %. Este modelo presenta un bajo nivel de
confianza, pero permite visualizar la disposición conservada de los aminoácidos
consenso (Figura 19).
106
Resultados
A B Figura 19. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína 3-β HSDMS tomando
como modelo la SDR DesIV de Streptomyces venezuelae (PDB: 1R66 cadena A). A. Modelo
de la estructura propuesto para 3-β HSDMS. B. Estructura publicada de la cadena A de la proteína
DesIV de Streptomyces venezuelae (Allard et al., 2004). Los aminoácidos marcados en amarillo
son aquellos para los que se predice su implicación en la unión de la coenzima NAD. La Gly24 de
3-β HSDMS así como la Gly23 de DesIV no parecen implicadas en esta unión, ya que se sitúan
alejadas del sitio de unión de NAD (la Gly23 de DesVI se sitúa detrás de una hélice α y
prácticamente no es visible en esta imagen). Los residuos marcados en rojo formarían parte del
centro activo. En azul se ha señalado el Asp60 relacionado con interacciones con la coenzima
NAD. En lila se ha señalado la Asn180 que actúa como conector del bucle de unión al sustrato y el
sitio activo. Este residuo no aparece en la proteína 3-β HSDMS. En verde se ha marcado la
coenzima NAD en la proteína de Streptomyces, y en rosa, la desoxitimidina difosfato (dTDP).
107
Resultados
2.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228
Una vez localizados los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228 mediante
análisis in silico, que podrían ser responsables de catalizar la transformación de
colesterol en 4-colesten-3-ona, se analizó en primer lugar su expresión diferencial
en colesterol para comprobar si el crecimiento en este esteroide inducía la
expresión de ambos o alguno de los genes, lo que apoyaría su papel en la
degradación del colesterol. Para ello se cultivó M. smegmatis mc2155 en colesterol
1,8 mM en β-ciclodextrina y en glicerol 18 mM en β-ciclodextrina, se extrajo el
RNA de los cultivos en fase logarítmica como se describe en el apartado 7.1 de
Materiales y Métodos y se ejecutaron análisis mediante RTq-PCR como se
describe en los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos. Los resultados
indican que el gen MSMEG_5228 sí se expresa de manera diferencial en
colesterol, resultado que se reproduce con cada una de las tres cantidades de
cDNA total con las que se realizó la PCR en tiempo real: 5, 2 y 0,5 ng (Figura 20
A). Sin embargo, el gen MSMEG_1604 no presenta expresión diferencial en
colesterol, sino una expresión basal en colesterol y glicerol (Figura 20 B). Estos
resultados parecían implicar al gen MSMEG_5228 en la degradación de colesterol
frente a MSMEG_1604, aunque eran necesarios estudios de actividad enzimática
para corroborar esta hipótesis.
108
Resultados
Expresión diferencial de MSMEG_1604 en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM
0,000E+00
5,000E-02
1,000E-01
1,500E-01
2,000E-01
2,500E-01
3,000E-01
3,500E-01
1 2 3
Nive
l de
trans
crip
ción
(ng
de tr
ánsc
rito
)
Colesterol
Glicerol
Expresión difrencial de MSMEG_5228 en colesterol 1,8 mM-Glic 18 mM
0,000E+00
5,000E-0
A B Figura 20. Expresión diferencial obtenida mediante RTq-PCR de los genes MSMEG_5228 (A) y MSMEG_1604 (B) de M. smegmatis mc2155 cultivado en colesterol 1,8 mM comparado con M. smegmatis mc2155 cultivado en glicerol 18 mM. Los niveles de transcripción se midieron
mediante RTq-PCR como se describe en los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos. Las
barras de error representan la desviación estándar calculada. Los valores de P del test t de Student
no pareado fueron menores de 0,05 para MSMEG_5228 en todos los casos, lo que implica que la
diferencia de expresión es estadísticamente significativa a este nivel de confianza, mientras que
para MSMEG_1604 fueron mayores de 0,1, lo que implica que la diferencia de expresión no es
estadísticamente significativa a este nivel de confianza (datos no mostrados). Las parejas de
barras colesterol (azul)/glicerol (morado) se han señalado con los números 1, 2 o 3 que indican el
nivel de transcripción obtenido a partir de distintas cantidades de cDNA: 1: 5 ng, 2: 2 ng y 3: 0,5 ng.
2.3 Clonación y expresión heteróloga de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228
2.3.1 Clonación de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228
Para estudiar el posible papel del producto de los genes MSMEG_1604 y
MSMEG_5228 en la ruta de degradación del colesterol se procedió, en primer
lugar, a su clonación e hiperexpresión en E. coli. Para ello, fueron amplificados por
PCR y subclonados en el vector de hiperexpresión pET-29a (+) bajo el control de
un promotor fuerte, el promotor 10 del fago T7, y con una región de unión al
ribosoma (SD) heteróloga consenso, resultando en los plásmidos pET1604 y
pET5228, respectivamente (Fig. 21). Estos plásmidos fueron posteriormente
1 tra
1,000E+00
1,500E+00
2,000E+00
1 2 3
Niv
el d
ens
crip
ción
(ng
de tr
ánsc
rito)
Colesterol
Glicerol
Expresión diferencial de MSMEG_1604 en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM
0,000E+00
5,000E-02
1,000E-01
1,500E-01
2,000E-01
2,500E-01
3,000E-01
3,500E-01
1 2 3
Nive
l de
trans
crip
ción
(ng
de tr
ánsc
rito
)
Colesterol
Glicerol
Expresión difrencial de MSMEG_5228 en colesterol 1,8 mM-Glic 18 mM
0,000E+00
5,000E-0
1,000E+00
1,500E+00
2,000E+00
1 2 3
ánsc
rito)
1 tra
Niv
el d
ens
crip
ción
(ng
de tr
Colesterol
Glicerol
109
Resultados
transferidos a la cepa E. coli BL21 (DE3) (Tabla 1 Materiales y Métodos) que
posee el fondo genético necesario para la correcta expresión desde el promotor
PT7.
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM1604(4,7 kb)
pGEM5228(4 kb)
ApR
ori
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
pET1604(7,1 kb)
pET5228(6,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
MSMEG_1604
MSMEG_5228
NdeI
NdeI
EcoRI
HindIII
CO5 CO3
5228-F 5228-R
Ligación
Ligación
Digestión
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM1604(4,7 kb)
pGEM5228(4 kb)
ApR
ori
pGEM1604(4,7 kb)
pGEM5228(4 kb)
ApR
ori
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
pET1604(7,1 kb)
pET5228(6,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7 pET1604(7,1 kb)
pET5228(6,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
MSMEG_1604
MSMEG_5228
NdeI
NdeI
EcoRI
HindIII
CO5 CO3
5228-F 5228-R
MSMEG_1604
MSMEG_5228
NdeI
NdeI
EcoRI
HindIII
CO5 CO3
5228-F 5228-R
Ligación
Ligación
Digestión
Figura 21. Representación esquemática de la construcción de los plásmidos pET1604 y pET5228. Los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228 fueron amplificados mediante PCR utilizando
cada uno la pareja de oligonucleótidos correspondiente señalada en la figura (secuencias en Tabla
3 de Materiales y Métodos) y DNA genómico de M. smegmatis mc2155 como molde. Cada gen
amplificado se clonó en el plásmido pGEM-T easy (dando lugar a los plásmidos pGEM1604 y
pGEM5228) y fue subclonado en el vector pET-29a (+) empleando las enzimas de restricción
correspondientes para cada gen señaladas en la figura (y que están presentes en los
oligonucleótidos utilizados para la amplificación de los genes), dando lugar a los plásmidos
pET1604 y pET5228. Las abreviaturas utilizadas son: ApR, gen que confiere resistencia a
ampicilina; KmR, gen que confiere resistencia a kanamicina; lacI, gen que codifica el represor LacI;
PT7, promotor del gen 10 del fago T7; ori, origen de replicación.
110
Resultados
2.3.2 Expresión heteróloga de MSMEG_1604
Los extractos proteicos obtenidos de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET1604),
fueron analizados mediante SDS-PAGE. Tras analizar distintas condiciones de
fermentación, en las cuales se cambiaron la temperatura, agitación, tiempo de
inducción con IPTG, etc., finalmente se seleccionaron las indicadas en el apartado
5.1.1 de Materiales y Métodos (inducción de cultivos a DO600 de 0,6 con IPTG 50
μM en agitación durante 3 horas a 20 ºC). Estas condiciones provocan la
insolubilización de parte de la proteína, pero también se detectan niveles
apreciables de proteína soluble (Fig. 22, calle 3).
66,0
116,0
KDa
200,0
45,0
31,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
97,4
A B Figura 22. Geles SDS-PAGE en los que se muestra la expresión del producto de MSMEG_1604 (ChoDMS) en células E. coli BL21 (DE3) bajo distintas condiciones y tratamientos. A: 1. Marcadores de peso molecular (en el margen izquierdo de la figura se detallan
los pesos moleculares de los marcadores en KDa). El peso molecular de ChoDMS se ajusta al
teórico calculado por el programa Compute pI/Mw del servidor Expasy
(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html): 62,88 KDa. La posición de la proteína se indica con una
flecha roja. 2-10: Fracciones celulares solubles de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) inducidas a
temperatura ambiente (20 ºC) con: 2. IPTG 50 µM 4 h. 3. IPTG 50 µM 3 h. 4. IPTG 50 µM 2 h. 5. IPTG 50 µM 1,5 h. 6. IPTG 50 µM 1 h. 7. IPTG 50 µM 45 min. 8. IPTG 50 µM 30 min. 9. IPTG 1,25
µM 12 h. 10. IPTG 0,125 µM 12 h. B: 1. Marcadores de peso molecular. 2-10: Fracciones celulares
insolubles de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) inducidas a temperatura ambiente (20 ºC) con: 2. IPTG
50 µM 4 h. 3. IPTG 50 µM 3 h. 4. IPTG 50 µM 2 h. 5. IPTG 50 µM 1,5 h. 6. IPTG 50 µM 1 h. 7. IPTG 50 µM 45 min. 8. IPTG 50 µM 30 min. 9. IPTG 1,25 µM 12 h. 10. IPTG 0,125 µM 12 h.
111
Resultados
2.3.3 Expresión heteróloga de MSMEG_5228
Los extractos proteicos de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET5228) fueron
analizados mediante SDS-PAGE. Se probaron distintas condiciones de
fermentación, pero en ningún caso se pudo obtener un extracto en el que fuese
visible proteína en forma soluble, sino que se mostraba hiperproducida en forma
insoluble. Como norma general para posteriores experimentos se utilizaron las
mismas condiciones de inducción que para E. coli BL21 (DE3) (pET1604) (Fig.
23).
66,097,4
KDa
21,5
116,0
45,0
31,0
1 2 3
14,4
Figura 23. Geles SDS-PAGE en los que se muestra la expresión del producto de MSMEG_5228 (3-β HSDMS) en células E. coli BL21 (DE3). En este caso se cargaron como
muestra células enteras, ya que no hay proteína visible en las fracciones celulares solubles expresando esta proteína con las condiciones utilizadas. 1. Marcadores de peso molecular (en el
margen izquierdo de la figura se detallan los pesos moleculares de los marcadores). 2. Células
enteras E. coli BL21(DE3) con plásmido pET29 (control negativo de expresión) inducidas 3 h a 20
ºC con 50 μM IPTG. 3. Células enteras E. coli BL21(DE3) (pET5228) inducidas 3 h a 20 ºC con 50
μM IPTG. El peso molecular de 3-β HSDMS se ajusta al teórico calculado por el programa Compute
pI/Mw del servidor Expasy (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html): 38,8 KDa.
2.4 Ensayos enzimáticos mediante TLC con colesterol marcado con 14C
Las proteínas ChoDMS y 3-β HSDMS fueron ensayadas utilizando colesterol
marcado radiactivamente. Los productos de las reacciones fueron separados
mediante la técnica de cromatografía en capa fina (TLC) y éstos fueron detectados
112
Resultados
posteriormente mediante autorradiografía. Esta técnica supone una alternativa
más sensible a los ensayos espectrofotométricos, que fueron probados
previamente, sin que se pudiese detectar con ellos actividad enzimática. La
técnica de TLC con radiactividad ya se había utilizado con anterioridad para la
determinación de la actividad colesterol deshidrogenasa/isomerasa de la proteína
AcmA de S. denitrificans (Chiang et al., 2008b). Los protocolos utilizados para el
ensayo de AcmA se adaptaron para ensayar y posteriormente visualizar nuestras
muestras proteicas (véanse los apartados 5.4.1, 5.4.2 y 9 de Materiales y
Métodos). Mediante esta metodología adaptada se ensayaron extractos proteicos
de E. coli BL21 (DE3) (pET1604), E. coli BL21 (DE3) (pET5228) y sobrenadantes
de cultivos de E. coli BL21(DE3) (pET1604) y de M. smegmatis mc2155 y distintos
mutantes de esta cepa.
2.4.1 Experimentos in vitro con ChoDMS y 3-β HSDMS. Cinética enzimática
La puesta a punto del método cromatográfico con muestras procedentes de
in vitro se llevó a cabo utilizando como control positivo la colesterol oxidasa
comercial de Pseudomonas fluorescens. Se cargaron las placas de TLC con
muestras procedentes de soluciones de proteína incubadas con colesterol
marcado radiactivamente durante 20 min a 30 ºC. Los resultados muestran la
aparición de una marca cuyo tiempo de retención (Rf) coincidía con el de la 4-
colesten-3-ona (Datos no mostrados). Esta marca no aparecía en ninguno de los
controles negativos empleados (muestra incubada sin proteína o extracto soluble
de E. coli BL21 (DE3) portando el plásmido pET29 sin inserto) (Fig. 24).
Curiosamente, en la muestra de colesterol oxidasa comercial aparece además de
las marcas de colesterol y de la 4-colesten-3-ona, otra marca por debajo de la del
colesterol, que podría corresponder, teniendo en cuenta la fase móvil utilizada en
nuestros ensayos, a la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona (Fig. 25), un compuesto
que aparece, incluso de manera mayoritaria, como producto de algunas colesterol
oxidasas (Doukyu y Aono, 1999; Doukyu et al., 2008).
113
Resultados
N
C
H
1 2 3
N
C
H
N
C
H
1 2 3
Figura 24. Producción de productos a partir de colesterol marcado con 14C por soluciones de colesterol oxidasa comercial. La línea marcada con una C indica la altura a la que migra el
colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-3-ona y la marcada con una H la de un
producto no identificado que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las muestras
se cargaron en las placas de TLC tras un ensayo enzimático de 20 min. Las muestras cargadas
proceden de ensayos realizados con: 1. Colesterol radiactivo sin extracto proteico. 2. Ensayo con
colesterol oxidasa comercial. 3. Ensayo con extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) portando el
plásmido pET29 vacío.
Para confirmar la estructura del compuesto que se hipotetiza como 6β-
hidroperoxi-4-colesten-3-ona, la muestra de reacción fue analizada por LC/MS
(véanse los apartados 5.4.1 y 8 de Materiales y Métodos). En un primer análisis,
en el que se recogieron los iones producidos en full scan, encontramos un pico a
tiempo de retención 14,53 minutos en el que el ión quasimolecular [M+H]+
corresponde a m/z 417 y en el que los iones mayoritarios son, en orden de
abundancia, m/z 371, m/z 400 y m/z 383. El ión quasimolecular corresponde con
la masa de la 6-β-hidroxi-4-colesten-3-ona (peso molecular 416) mientras que los
iones mayoritarios concuerdan con la pérdida de un grupo carboxilo, un grupo
hidroxilo y dos grupos hidroxilo respectivamente, presentes en la estructura de
este compuesto. Al fraccionar tanto el ión quasimolecular como los iones
mayoritarios, encontramos espectros de masas que indican que el compuesto que
estamos estudiando presenta una cadena lateral similar a la del colesterol y que
114
Resultados
puede perder hasta tres moléculas de agua al ser sometido a la energía de
colisión necesaria para producir su fragmentación.
O
OOH
O
OOH
Figura 25. Estructura de la 6-β-hidroxi-4-colesten-3-ona.
Estos resultados sugieren que el compuesto tiene una estructura similar a la
6-β-hidroxi-4-colesten-3-ona, en cuanto a su estructura esteroidea y a su cadena
lateral, aunque serían necesarios análisis de RMN para establecer definitivamente
esta estructura en su totalidad.
Tras el ensayo realizado con éxito empleando la colesterol oxidasa comercial,
se procedió a realizar el mismo protocolo con los extractos proteicos de E. coli
expresando ChoDMS y 3-β HSDMS (E. coli BL21 (DE3) (pET1604) y E. coli BL21
(DE3) (pET5228)). En este caso se analizaron en las placas de TLC las muestras
incubadas y extraídas a distintos tiempos de reacción, a los 2, 20, 40 y 60 min.
En las muestras que expresan 3-β HSDMS se aprecia una marca en la
movilidad corrrespondiente a la 4-colesten-3-ona, y su intensidad aumenta con el
tiempo de ensayo (Fig. 26). También se aprecia, como ya se había visto con el
control con colesterol oxidasa comercial, otra marca con menor movilidad que el
colesterol, que podría corresponder a la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Esta es
la primera vez que se describe la presencia de este tipo de metabolito para una
hidroxiesteroide deshidrogenasa hasta el momento.
En las muestras procedentes de extractos que expresan ChoDMS no se
aprecia ninguna banda adicional a la de colesterol. Estos resultados confirman la
115
Resultados
capacidad de transformación del colesterol de 3-β HSDMS y mantienen las dudas
sobre la actividad de ChoDMS.
2 min ensayo 20 min 40 min 60 min
N
H
C
1 2 3 41 2 3 41 2 3 41 2 3 4
2 min ensayo 20 min 40 min 60 min
N
H
CC
1 2 3 41 2 3 41 2 3 41 2 3 4
Figura 26. Producción de productos a partir de colesterol marcado con 14C por extractos celulares solubles expresando las proteínas ChoDMS y 3-β HSDMS. La línea marcada con una C
indica la altura a la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-3-ona y la
marcada con una H la de un producto no identificado que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-
colesten-3-ona. Las muestras se cargaron en las placas de TLC a diferentes tiempos de reacción
que se indica en la vertical: 2, 20, 40 y 60 min. Las muestras cargadas proceden de ensayos
realizados con: 1. Colesterol oxidasa comercial. 2. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3)
(pET5228). 3. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET5228) al que no se adicionó NAD en el
ensayo enzimático (el resultado indica que en el extracto proteico hay suficiente NAD para que la
reacción enzimática tenga lugar). 4. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604).
2.4.2 Detección de la actividad de ChoDMS in vivo
El hecho de que los extractos proteicos que expresan ChoDMS no produzcan
4-colesten-3-ona podría ser debido a que la proteína se esté excretando al medio
de cultivo y sea a nivel extracelular donde se cataliza esta transformación. De
hecho, se ha sugerido que la ChoD de M. tuberculosis es extracelular (Cowley y
Av-Gay, 2001). Para comprobar si esto era lo que estaba sucediendo, se cultivó la
cepa E. coli BL21 (DE3) (pET1604) durante 24 h en medio mínimo con glicerol 20
mM como fuente de carbono y colesterol 1 mM marcado radiactivamente. Tras
tomar muestras de sobrenadante de cultivo (véase apartado 5.4.2 de Materiales y
116
Resultados
Métodos), éstas se visualizaron mediante TLC. Como se muestra en la figura 27,
no se apreció la existencia de una marca de 4-colesten-3-ona.
N
C
H
N
C
H
Figura 27. Producción de metabolitos a partir de colesterol marcado con 14C por muestras procedentes de sobrenadante de cultivo de E. coli. La línea marcada con una C indica la altura a
la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-
3-ona y la marcada con una H la de un producto no identificado
que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las
muestras cargadas proceden de ensayos realizados con: 1. Colesterol oxidasa comercial. 2. Sobrenadante de cultivo de E. coli
BL21 (DE3) portando el plásmido pET29 vacío en glicerol 20 mM-
colesterol 1 mM. 3. Sobrenadante de cultivo de E. coli BL21 (DE3)
(pET1604) en glicerol 20 mM-colesterol 1mM.
1 2 3
2.5 Ensayo de ChoDMS y 3-β HSDMS mediante LC/MS
Como método de análisis complementario a los ensayos de radiactividad, se
llevaron a cabo análisis mediante LC/MS con muestras procedentes de extractos
proteicos expresando los productos de MSMEG_1604 y MSMEG_5228.
Estos ensayos se realizaron con distintas muestras procedentes de ensayos
enzimáticos para determinar actividad colesterol oxidasa o colesterol
deshidrogenasa a tiempo de ensayo 1 h (véanse los apartados 5.4.1 y 8 de
Materiales y Métodos). Los ensayos enzimáticos se realizaron siguiendo el mismo
método que para su análisis mediante TLC pero sin adición de colesterol
radiactivo. La figura 28 muestra el espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido
por APCI+ para extractos de E. coli BL21(DE3) (pET5228) a tiempo final 1 h.
Como se puede observar, aparece un pico correspondiente a la 4-colesten-3-ona,
concretamente el ión 367 procedente a su vez de la reacción del ión 385 de la 4-
colesten-3-ona. Este ión es uno de los iones que se generan al fragmentarse la
molécula de 4-colesten-3-ona mediante espectrometría de masas. Esta
fragmentación siempre genera los mismos iones padre para una molécula dada.
117
Resultados
La fragmentación de uno de estos iones mediante espectrometría de masas (por
ejemplo el 385 en el caso de la 4-colesten-3-ona) genera a su vez varios iones,
que igualmente siempre son los mismos (en el caso de la 4-colesten-3-ona uno de
ellos es el 367). Así, la detección del ión de fraccionamiento de una molécula
mediante MS/MS ofrece una garantía mucho mayor sobre la identidad de la misma
que limitarse a detectar uno de los iones originales, ya que dos moléculas pueden
tener un ión original común, pero difícilmente la fragmentación de éste dará a su
vez lugar a iones de fragmentación comunes. Estos resultados confirmarían los
obtenidos mediante ensayos con colesterol radiactivo visualizados mediante TLC.
Los espectros MS/MS obtenidos con los extractos de E. coli BL21 (DE3)
(pET1604) no se muestran ya que en ellos no apareció el pico de 4-colesten-3-
ona, con lo que se repiten los resultados negativos ya obtenidos mediante
ensayos espectrofotométricos y TLC.
Hay que destacar que la concentración más elevada de 4-colesten-3-ona
que se consiguió obtener en estos ensayos fue de 9 μM, valor obtenido en los
ensayos de tiempo 1 h con el extracto proteico de E. coli BL21 (DE3) (pET5228).
Teniendo en cuenta que por cada mol de colesterol que se degrada se forma un
mol de NADH, el coeficiente de extinción molar del NADH y el volumen total de
muestra, se puede estimar que el aumento de absorbancia a 340 nm del NADH
sería de unas 0,055 unidades en estas condiciones de ensayo, un valor que
habría sido considerado poco significativo de haberse utilizado ensayos
espectrofotométricos. Estos valores tan bajos de transformación pueden deberse a
que la expresión heteróloga de estas proteínas no es adecuada para su correcto
plegamiento.
118
Resultados
: 7,84 - 51,69 SM: 9B
10 15 20 25 30 35 40 45 500
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100 NL: 1,99E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS cal3
: Figura 28. Espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido por APCI+ a partir de muestras procedentes de ensayos de actividad deshidrogenasa a tiempo final 1 h con extractos solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5228). Se registradó el ión hijo m/z 367 del ión padre m/z 385
de la 4-colesten-3-ona. En la figura se señalan en el primer espectro los picos correspondientes al
colesterol y a la 4-colesten-3-ona. Las muestras proceden de ensayos de actividad deshidrogenasa
realizados durante 1 h. E.p. pET5228 indica la muestra procedente de un ensayo con extractos
solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5228). En la misma se puede apreciar la aparición del pico
correspondiente a la 4-colesten-3-ona.
2.6 Ensayo de afinidad de ChoDMS por el colesterol
Como complemento a los ensayos de actividad de ChoDMS se hizo un
sencillo ensayo de purificación de colesterol oxidasa por afinidad con colesterol
(Ghasemian et al., 2009). Brevemente, a 2 ml de un extracto proteico que contiene
la proteína ChoDMS se añadieron 20 mg de colesterol en polvo y se incubó a 4 ºC
durante 2 h. Tras centrifugar la mezcla a 10000 g durante 10 min se retiró el
sobrenadante y se hicieron tres lavados sucesivos del precipitado con los
NL: 9,89E2TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrab
NL: 2,76E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrac
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Patrón
4-colesten-3-ona
Colesterol
Control negativo
E.p. pET5228
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Abun
danc
ia re
lativ
a
7,84 - 51,69 SM: 9B
10 15 20 25 30 35 40 45 500
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100 NL: 1,99E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS cal3
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Patrón
4-colesten-3-ona
Colesterol
: 7,84 - 51,69 SM: 9B
NL: 9,89E2TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrab
NL: 2,76E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrac
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Abun
danc
ia re
lativ
a
10 15 20 25 30 35 40 45 500
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
100
0
20
40
60
80
NL: 1,99E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS cal3
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Patrón
4-colesten-3-ona
Colesterol
Control negativo
E.p. pET5228
Control negativo
E.p. pET5228
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tiva
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NL: 2,76E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrac
119
Resultados
siguientes tampones: tampón fosfato potásico 0,1 M pH 7,5 (para eliminar las
proteínas no unidas a colesterol), tampón fosfato potásico pH 7,5 con NaCl 0,5 M
(para precipitar las proteínas remanentes) y tampón fosfato potásico pH 7,5 con
1% de Triton X-100 (para extraer las proteínas unidas a colesterol). Se recogió el
sobrenadante de la muestra tras la centrifugación posterior a este último lavado y
se analizaron 5 μl mediante SDS-PAGE. Los resultados indican que la supuesta
colesterol oxidasa ChoDMS se extrae de manera selectiva en estas condiciones
(Fig. 29), lo que apoyaría la hipótesis de la existencia de algún tipo de interacción
de esta proteina con el colesterol, a pesar de no haber presentado actividad
colesterol oxidasa en nuestros distintos ensayos. No obstante, serían necesarios
controles de hidrofobicidad con otros compuestos hidrofóbicos insolubles distintos
al colesterol.
97,4
KDa
21,5
116,0
66,0
45,0
31,0
1 2 3
Figura 29. Purificación de ChoDMS mediante afinidad por colesterol. 1. Marcadores de peso
molecular (en el margen izquierdo de la figura se detallan los pesos moleculares de los
marcadores). 2. Fracción celular soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) antes de la purificación.
3. Fracción celular soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) después de la purificación. Se observa
un aumento notable de la concentración relativa de la supuesta colesterol oxidasa. La posición de
la proteína se indica con una flecha roja.
120
Resultados
2.7 Mutagénesis de MSMEG_1604 y MSMEG_5228
Para comprobar si la mutagénesis de los supuestos genes implicados en el
primer paso del catabolismo del colesterol hallados mediante análisis in silico
alteraba la utilización de este esteroide en M. smegmatis, se procedió a la
interrupción de los mismos mediante la inserción del plásmido no replicativo en
micobacterias pJQ200x (véase el apartado 4.6 de Materiales y Métodos), o bien a
su deleción, en el caso del gen MSMEG_5228 (deleción necesaria para la
construcción de un doble mutante de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228)
(véase el apartado 4.7 de de Materiales y Métodos).
2.7.1 Ensayos de crecimiento en colesterol de los distintos mutantes
Los mutantes así obtenidos se crecieron con colesterol 1,8 mM en β-
ciclodextrina como única fuente de carbono. Como puede observarse en las
figuras 30 A, B y C, el crecimiento en colesterol no se ve alterado en ninguno de
los mutantes simples en los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228. Tampoco ve
reducida su capacidad de crecimiento en el mutante doble M.
smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 (Fig. 30 D), que presenta el gen
MSMEG_5228 delecionado y el gen MSMEG_1604 interrumpido con pJQ200x.
Estos resultados podían indicar que se trata de un caso de redundancia, y existan
más genes no descritos que codifican proteínas con esta misma actividad en el
genoma de M. smegmatis.
121
Resultados
Figu
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30 A
, B, C
y D
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mat
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c²15
5
M. s
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mat
is::M
SM
EG_5
228
A CDB
122
Resultados
2.7.2 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos mutantes mediante TLC
Por otra parte, se analizaron los sobrenadantes de cultivos de las distintas
cepas mutantes M. smegmatis::MSMEG_1604, M. smegmatisΔMSMEG_5228 y
M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 con el fin de comprobar si, a pesar
de ser todas ellas capaces de crecer en colesterol, se apreciaba alguna diferencia
en el perfil de los intermediarios producidos durante su catabolismo. Las células se
cultivaron durante 24 h en medio mínimo con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina
como fuente de carbono y tras extraer los sobrenadantes se visualizaron en placas
de TLC (véanse los apartados 5.4.2 y 9 de Materiales y Métodos). Los resultados
indican que, comparativamente, el mutante M. smegmatisΔMSMEG_5228 y el
mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 presentan menos 4-
colesten-3-ona que los demás mutantes a este tiempo de cultivo. También se
aprecia menos cantidad de la supuesta 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona (Fig. 31).
Estos resultados son reproducibles y parecen indicar que la proteína codificada
por MSMEG_5228 sería la implicada en la degradación del colesterol para su
aprovechamiento como fuente de carbono y energía, aunque su ausencia es
suplida sin que el crecimiento de M. smegmatis en el esteroide se vea
apreciablemente alterado.
123
Resultados
N
C
H
N
C
H
1 2 3 1 2 4 1 2 5
Figura 31. Producción de metabolitos a partir de colesterol marcado con 14C por muestras procedentes de sobrenadante de cultivo de distintas cepas de M. smegmatis. La línea
marcada con una C indica la altura a la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-
colesten-3-ona y la marcada con una H la de un producto no identificado que podría tratarse de la
6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las muestras cargadas derivan de sobrenadantes de cultivos de
distintas cepas de M. smegmatis crecidas en colesterol 1,8 mM durante 24 h. 1. Control procedente
de un ensayo con colesterol oxidasa comercial. 2. M. smegmatis mc2155. 3. M.
smegmatis::MSMEG_5228. 4. M. smegmatis::MSMEG_1604. 5. M. smegmatis::MSMEG_1604-
ΔMSMEG_5228.
2.7.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos mutantes mediante LC/MS
Para analizar el perfil de intermediarios de la degradación del colesterol en
distintas cepas de M. smegmatis, éstas se crecieron en medio mínimo con
colesterol en β-ciclodextrina como única fuente de carbono, y se fueron
extrayendo alícuotas a distintos tiempos de incubación para su análisis mediante
LC/MS (véanse los apartados 5.4.2 y 8 de Materiales y Métodos). Los resultados
se muestran en la figura 32. Como cabría esperar teniendo en cuenta los
crecimientos de los distintos mutantes en colesterol, la desaparición del esteroide
sigue una tendencia muy similar en los distintos mutantes y la cepa salvaje (Fig.
32 A). Sin embargo, la tendencia que se aprecia tanto en el mutante en el gen
MSMEG_5228 como en el mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-
ΔMSMEG_5228 es una aparición mucho menor de 4-colesten-3-ona y de los
124
Resultados
posibles tercer y cuarto intermediarios de la ruta de degradación (26-hidroxi-4-
colesten-3-ona y 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona, estructuras 5A y 5B de la figura
15 de introducción, respectivamente) que en el mutante en el gen MSMEG_1604 y
en M. smegmatis mc2155 (Fig. 32 B, C y D). Las concentraciones de
intermediarios parece que tienden a igualarse en las distintas cepas en
intermediarios posteriores (ácido 4-colesten-3-ona-26-oico y ácido 1,4-colestadien-
3-ona-26-oico, estructuras 6A y 6B de la figura 15 de introducción,
respectivamente) (Fig. 32 E y F).
4-colesten-3-ona
0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000
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0,10000
0,15000
0,20000
0,25000
0,30000
0,35000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Áre
a de
l c
Figura 32. Perfil de intermediarios de la degradación del colesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de distintas cepas de M. smegmatis. Las figuras
representan la relación entre las áreas de los compuestos indicados en la leyenda con respecto al
área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado como patrón interno, frente al tiempo. A. Colesterol;
B. 4-colesten-3-ona; C. 26-hidroxi-4-colesten-3-ona; D. 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona; E. Ácido
4-colesten-3-ona-26-oico; F. Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico.
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A B
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Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico
26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona
4-colesten-3-ona
0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000
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0,00000
0,02000
0,04000
0,06000
0,08000
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M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155
Colesterol
0,000000,100000,200000,300000,400000,500000,600000,700000,80000
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M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155
Colesterol 4-colesten-3-ona
26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona
0,00000
0,00100
0,00200
0,00300
0,00400
0,00500
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0,00000
0,05000
0,10000
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M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155
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0,000000,000200,000400,000600,000800,001000,001200,001400,00160
0 24 48 72
Tiempo (h)
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tern
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M. smegmatis::MSMEG_1604
M. smegmatisΔMSMEG_5228
M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155
A B
C D
E F
26-hidroxi-4-colesten-3-ona 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona
Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico
125
Resultados
La menor producción de 4-colesten-3-ona en las cepas con el gen
MSMEG_5228 mutado y en la cepa mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-
ΔMSMEG_5228 ya se había observado en los ensayos con colesterol radiactivo.
En la tabla 13 se muestran la concentración de colesterol y 4-colesten-3-ona
cuantificada en cada cepa en cada punto de la extracción.
0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h
0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h
0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h
0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h
trazas0,172M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522872h
0,0111,312M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522848h
0,0081,427M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522824h
0,0071,737M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_52280h
trazas0,163M. smegmatisΔMSMEG_5228 72h
0,0080,754M. smegmatisΔMSMEG_5228 48h
0,0071,187M. smegmatisΔMSMEG_5228 24h
n.d.1,782M. smegmatisΔMSMEG_5228 0h
0,0070,160M. smegmatis::MSMEG_1604 72h
0,0810,802M. smegmatis::MSMEG_1604 48h
0,0561,490M. smegmatis::MSMEG_1604 24h
n.d.1,715M. smegmatis::MSMEG_1604 0h
Conc. 4-colesten-3-ona (mM)
Conc. Colesterol(mM)
Muestra
0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h
0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h
0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h
0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h
trazas0,172M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522872h
0,0111,312M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522848h
0,0081,427M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522824h
0,0071,737M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_52280h
trazas0,163M. smegmatisΔMSMEG_5228 72h
0,0080,754M. smegmatisΔMSMEG_5228 48h
0,0071,187M. smegmatisΔMSMEG_5228 24h
n.d.1,782M. smegmatisΔMSMEG_5228 0h
0,0070,160M. smegmatis::MSMEG_1604 72h
0,0810,802M. smegmatis::MSMEG_1604 48h
0,0561,490M. smegmatis::MSMEG_1604 24h
n.d.1,715M. smegmatis::MSMEG_1604 0h
Conc. 4-colesten-3-ona (mM)
Conc. Colesterol(mM)
Muestra
Tabla 13. Concentración de 4-colesten-3-ona hallada en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de distintas cepas de M. smegmatis a distintos tiempos.
126
Resultados
Curiosamente, en las cepas M. smegmatisΔMSMEG_5228 y M.
smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 se detectan niveles bastante
superiores de hidroxicolesterol (26-hidroxicolesterol o 27-hidroxicolesterol) que en
las cepas M. smegmatis::MSMEG_1604 y M. smegmatis mc2155 (Fig. 33). Estos
resultados sugieren que la carencia del gen MSMSEG_5228 tiene como resultado
la acumulación de este compuesto por la acción sobre el colesterol de la primera
enzima de la degradación de la cadena lateral (Cyp125) y la posibilidad de que
parte del catabolismo del colesterol se desvíe hacia una ruta alternativa.
Hidroxicolesterol
0,0000000,0020000,0040000,0060000,0080000,0100000,0120000,0140000,0160000,0180000,020000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Áre
a de
l com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_1604
M. smegmatisΔMSMEG_5228
M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155
Figura 33. Perfil de hidroxicolesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de distintas cepas de M. smegmatis. Las figuras representan la relación entre el área de
hidroxicolesterol con respecto al área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado como patrón interno,
frente al tiempo.
2.8 Búsqueda de nuevas enzimas con actividad colesterol oxidasa/ deshidrogenasa: SDRMS
Los resultados de los ensayos enzimáticos realizados con ChoDMS y 3-β
HSDMS y los resultados de los experimentos realizados con los distintos mutantes
de estos genes hacían pensar en la necesidad de la existencia de una o más
proteínas adicionales capaces de catalizar la conversión de colesterol en 4-
colesten-3-ona en M. smegmatis. Por lo tanto se realizó una nueva búsqueda de
127
Resultados
posibles enzimas con actividad colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa
presentes en este microorganismo.
2.8.1 Análisis in silico de genes ortólogos a acmA
El primer paso en el catabolismo anóxico del colesterol en S. denitrificans
está catalizado por la proteína AcmA (una colesterol deshidrogenasa/isomerasa)
(Chiang et al., 2008b). Dado que el análisis mediante RT-PCR reveló que AcmA
se expresa tanto si las células crecen aeróbica como anaeróbicamente en
colesterol (Chiang et al., 2008b), lo que indica que puede ser activa también en
aerobiosis, se decidió hacer un análisis comparativo de su secuencia frente a la
base de datos de secuencias proteicas generales (Tabla 14) y frente al genoma de
M. smegmatis mc2155, por si este microorganismo presentase algún gen ortólogo
a acmA. En la comparación de AcmA frente a las bases de datos proteicas
generales, aparece en cuarto lugar con mayor grado de similitud el producto del
gen MSMEG_5233 (1080 pb) de M. smegmatis mc2155, anotado como un
miembro de la superfamilia de dominio de unión a sustrato RmlD. RmlD es una
proteína implicada en la síntesis del precursor de la L-ramnosa, monosacárido
presente en la pared micobacteriana (Blankenfeldt et al., 2002). Las demás
proteínas similares a AcmA que se detectan en las bases de datos generales son
la mayoría pertenecientes a micobacterias, aunque también aparecen proteínas de
otros actinomicetos como Rhodococcus, de algunos anaerobios como
Dictyoglomus (Saiki et al., 1985) o Pelotomaculum (Imachi et al., 2002), y de algún
patógeno como Brucella.
128
Resultados
23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella ceti M644/93/1]ZP_05173817
27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacterium aviumsubsp. avium ATCC25291]ZP_05216670
25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Burkholderia multivorans ATCC
17616]YP_001583471
30Epimerasa nucleósidodifosfato-azúcar[Pelotomaculumthermopropionicum SI]YP_001213184
21Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Brucella canis ATCC 23365]YP_001594114
26Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacterium gilvumPYR-GCK]YP_001133690
25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Delftia acidovorans SPH-1]YP_001563835
29Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05225603
23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella sp. 83/13]ZP_05182429
31Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1]YP_955010
27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. MCS]YP_640922
30Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05223429
27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. JLS]YP_001072039
27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumsmegmatis mc2155]YP_889479
30Proteína hipotética MAP1751 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_960685
27Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Dictyoglomusthermophilum H-6-12]YP_002251571
29Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749067
27Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Dictyoglomus turgidumDSM 6724]YP_002352010
27Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium avium 104]YP_881689
39Colesterol deshidrogenasa/isomerasa[Rhodococcus erythropolisSK121]ZP_04385748
% ID conAcmA
ClustalW
Proteína/microorganismo
% ID conAcmA
ClustalW
Proteína /microorganismo
23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella ceti M644/93/1]ZP_05173817
27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacterium aviumsubsp. avium ATCC25291]ZP_05216670
25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Burkholderia multivorans ATCC
17616]YP_001583471
30Epimerasa nucleósidodifosfato-azúcar[Pelotomaculumthermopropionicum SI]YP_001213184
21Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Brucella canis ATCC 23365]YP_001594114
26Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacterium gilvumPYR-GCK]YP_001133690
25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Delftia acidovorans SPH-1]YP_001563835
29Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05225603
23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella sp. 83/13]ZP_05182429
31Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1]YP_955010
27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. MCS]YP_640922
30Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05223429
27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. JLS]YP_001072039
27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumsmegmatis mc2155]YP_889479
30Proteína hipotética MAP1751 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_960685
27Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Dictyoglomusthermophilum H-6-12]YP_002251571
29Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749067
27Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Dictyoglomus turgidumDSM 6724]YP_002352010
27Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium avium 104]YP_881689
39Colesterol deshidrogenasa/isomerasa[Rhodococcus erythropolisSK121]ZP_04385748
% ID conAcmA
ClustalW
Proteína/microorganismo
% ID conAcmA
ClustalW
Proteína /microorganismo
129
Resultados
Tabla 14. Resultados de la comparación de AcmA de S. denitrificans frente a las bases de datos de secuencias proteicas utilizando el programa BLASTP. Se muestran las 20 proteínas
más similares, el microorganismo al que pertenecen, su código de acceso y su similitud con AcmA
indicada en porcentaje de identidad hallado con ClustalW. La proteína producto del gen
MSMEG_5233 de M. smegmatis mc2155 se ha señalado en color azul.
El producto de MSMEG_5233 presenta un 27% de identidad (cuantificado por
ClustalW) con AcmA. El siguiente gen del genoma de M. smegmatis con mayor
similitud con AcmA es MSMEG_4184, cuyo producto codifica una dTDP-glucosa-
46-deshidratasa y tiene una identidad de secuencia del 25% con AcmA
(cuantificado por ClustalW), aunque su longitud es de tan sólo 60 aminoácidos.
AcmA presenta un 18 % de similitud (cuantificado por ClustalW) con la
NAD(P)-CDH de Nocardia sp. descrita en el apartado 2.1.2; como esta, tanto
AcmA como el producto de MSMEG_5233 (al que a partir de ahora nos
referiremos como SDRMS) presentan un motivo Gly-X-Gly-(X)2-Gly-(X)10-Gly de
unión a NAD (aunque en estas dos proteínas la glicina inicial está separada de la
segunda no por uno, sino por dos aminoácidos) y la tétrada catalítica característica
de proteínas de la superfamilia de las deshidrogenasas/reductasas de cadena
corta (SDR) N-S-Y-K. También presentan un Asp alrededor de la posición 60 y
una Ala alrededor de la posición 88, aunque carecen del motivo Pro-Gly alrededor
de la posición 180 seguido de una Thr 188 también propio de las SDR (Fig. 34).
130
Resultados
MSMEG_5233 --------MSDAVLVTGAFGLVGSAVVATLAAQGRPVVATDVGTPANRKSATGLPPTVEV 52 AcmA ---------MKTVLVTGACGAIGRRVVAGLVERGCAVSTLDFDTSANRAAARDRDARVRS 51 NAD_P_-CDH MGDASLTTDLGCVLVTGGSGFVGANLVTELLDRGYAVRSFDRAPSP-----LGDHAGLEV 55 *****. * :* :*: * :* .* : * ... . . :. MSMEG_5233 RWADLTDAAAVDTLVADVAPAAIVHLAAIIPPF-----CYMRRELARKVNVDATESLLRA 107 AcmA HFGDLDDAAPLRAAVAGVA--HVIHLAELRPPD-----TDADQFAGYRANVCATRALLAA 104 NAD_P_-CDH IEGDICDKETVAAAVKDID--TVIHTAAIIDLMGGASVTEAYRQRSFAVNVEGTKNLVHA 113 .*: * .: : * .: ::* * : : . .** .*. *: * MSMEG_5233 AEARATPPRFVLASSVAVYGTRNPHRITDMLTADTPVNPVDIYGAHKVEAENLVRASRLD 167 AcmA CADRVTPPRFVFASSVAVFGGQ-QTDAARRADAPAILAAADSYGRQKAAAEALVRASGLD 163 NAD_P_-CDH SQEAGVKRFVYTASNSVVMGGQDIVNGDETMPYTTRFN--DLYTETKVVAEKFVLAENGK 171 . . . **. .* * : : . * * *. ** :* *. . MSMEG_5233 WLILRLGGVMSSTFSVDMDVELIS-------LESVLPADGRLQTVDVRDVATAFAAATTV 220 AcmA HLILRLALTPDLAPDAGRPHPWLFGFHPDMRVEFLHPADAALALVNALD---AFGVLDSL 220 NAD_P_-CDH HDMLTCAIRPSGIWGRGDQTMFRK------VFENVLAGHVKVLVGNKNIKLDNSYVHNLI 225 :* . . . . .* : ... : : . : MSMEG_5233 PVETANHEVLLIGGDPQTHRHTQARVGSEAAQAMGIRGGLPAGRPGNPDDDHAWFHTDWM 280 AcmA DGQAVRGRTLLLGGG-ARNRYRYLDWLNMALEARGLR-PLPRTAFGRAD-----YLTDWV 273 NAD_P_-CDH HGFILAGQDLVPGGTAPGQAYFINDGEPINMFEFARPVLAACGRPLPT------FYVSGR 279 . *: ** : : . . . : .. MSMEG_5233 DTTRAQEVLTFQHHSWPQLLADTRANAGWKRYPLGLAAPLIRAFLRSKSAYKNYPGRYAD 340 AcmA DTDESEALLRYQRHDYPDWLREQVG-AVRPRWLDAGSAPLARRYLLAHSAHHAAASGQRP 332 NAD_P_-CDH LVHKVMMAWQWLHFKFALPEPLIEPLAVERLYLNNYFSIAKAKRDLGYEPLFTTEQAMAE 339 . . : :..:. * : : . .. MSMEG_5233 VWNAVEKRWGNPRPDRSEA------ 359 AcmA RLLELRRAWTLARRGLAAARLYLS- 356 NAD_P_-CDH CMPYYVEMFHQMESAQKAPAAAVAR 364 . : . .
Figura 34. Alineamiento del producto del gen MSMEG_5233 (SDRMS), AcmA y la NAD(P)-CDH de Nocardia sp. y supuestos motivos consenso hallados en las secuencias. Los residuos
marcados en amarillo estarían implicados en la unión de la coenzima mediante el mantenimiento
de la estructura de la lámina β central; los residuos marcados en azul estarían implicados en
interacciones con la coenzima y los residuos marcados en rojo formarían la tétrada catalítica.
La predicción de la estructura secundaria y la estructura tridimensional de
SDRMS se llevó a cabo, al igual que se hizo con ChoDMS y 3-β HSDMS, utilizando el
programa LOOPP. En el caso de SDRMS se seleccionó como plantilla para la
construcción del modelo la cadena A de la proteína WbmH de Bordetella
bronchiseptica (PDB:2Q1W) (King et al., 2007) un miembro de la familia de las
SDR. Su estructura se presenta con la proteína unida a la coenzima NAD. El
programa pudo comparar el 83 % de WbmH con una identidad de secuencia de 22
%. Este modelo presenta un bajo nivel de confianza, pero permite visualizar la
disposición conservada de los aminoácidos consenso (Figura 35).
131
Resultados
A B Figura 35. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína SDRMS tomando como modelo la SDR WbmH de Bordetella bronchiseptica (PDB:2Q1W, cadena A). A. Modelo
propuesto para SDRMS. B. Estructura publicada de la cadena A de la proteína WbmH de B.
bronchiseptica (King et al., 2007). Los aminoácidos marcados en amarillo son aquellos para los
que se predice su implicación en la unión de la coenzima NAD. La Gly26 de SDRMS así como la
Gly25 de WbmH no parecen implicadas en esta unión, ya que se sitúan alejadas del sitio de unión
de NAD. Los residuos marcados en rojo formarían parte del centro activo. En azul se ha señalado
el Asp60 relacionado con interacciones con la coenzima NAD. En verde se ha marcado la
coenzima NAD en la proteína WbmH. 2.8.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol
del gen MSMEG_5233
La expresión diferencial en colesterol de MSMEG_5233 fue analizada como
en el caso de MSMEG_1604 y MSMEG_5228. Para ello se cultivó M. smegmatis
mc2155 en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina y en glicerol 18 mM en β-
ciclodextrina, se extrajo el RNA de los cultivos en fase logarítmica (véase el
apartado 7.1 de Materiales y Métodos) y se llevaron a cabo análisis mediante RTq-
PCR (véanse los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos). Los resultados
132
Resultados
indican que MSMEG_5233 presenta una ligera inducción en colesterol en los
ensayos efectuados con 5 ng y 2 ng de cDNA total, pero no en los efectuados con
0,5 ng (Figura 36). Los valores de P del test t de Student fueron mayores de 0,05
en todos los casos (datos no mostrados), lo que implica que la inducción en
colesterol no es estadísticamenete significativa a este nivel de confianza.
Expresión diferencial de MSMEG_5233 en colesterol 1.8 mM-glicerol 18 mM
0,000E+005,000E-021,000E-011,500E-012,000E-012,500E-013,000E-013,500E-014,000E-014,500E-01
1 2 3Niv
eles
de
tran
scrip
ción
(ng
de tr
ánsc
rito)
ColesterolGlicerol
Figura 36. Expresión diferencial obtenida mediante RTq-PCR del gen MSMEG_5233 de M. smegmatis mc2155 cultivado en colesterol 1,8 mM comparado con M. smegmatis mc2155 cultivado en glicerol 18 mM. Los niveles de transcripción se midieron mediante RTq-PCR
(véanse los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos). Las barras de error representan la
desviación estándar calculada. Los valores de P del test t de Student no pareado fueron mayores
de 0,05 en todos los casos, lo que implica que la diferencia de expresión no es estadísticamente
significativa a este nivel de confianza (datos no mostrados). Las parejas de barras colesterol
(azul)/glicerol (morado) se han señalado con los números 1, 2 o 3 que indican el nivel de
transcripción obtenido a partir de distintas cantidades de cDNA: 1: 5 ng, 2: 2 ng y 3: 0,5 ng.
2.8.3 Clonación y expresión heteróloga del gen MSMEG_5233
Para estudiar el papel de la posible colesterol deshidrogenasa codificada por
el gen MSMEG_5233, este se clonó e hiperexpresó en E. coli. Para ello, se
amplificó por PCR y se subclonó en el vector de hiperexpresión pET-29a (+) (tal y
como se hizo con los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228) resultando en el
133
Resultados
plásmido pET5233 (Fig. 37). Este plásmido fue posteriormente transferido a la
cepa E. coli BL21 (DE3).
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM5233(4 kb)
ApR
ori
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
pET5233(6,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
MSMEG_5233
NdeI BamHI
5233 pET F 5233 pET R
Ligación
Ligación
Digestión
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM5233(4 kb)
ApR
ori
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
pET5233(6,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
MSMEG_5233
NdeI BamHI
5233 pET F 5233 pET R
Ligación
Ligación
Digestión
Figura 37. Representación esquemática de la construcción del plásmido pET5233. El gen
MSMEG_5233 fue amplificado mediante PCR utilizando la pareja de oligonucleótidos señalada en
la figura (secuencias en Tabla 3 de Materiales y Métodos) y DNA genómico de M. smegmatis
mc2155 como molde. El gen amplificado se clonó en el plásmido pGEM-T easy (dando lugar al
plásmido pGEM5233) y fue subclonado en el vector pET-29a (+) empleando las enzimas de
restricción señaladas en la figura (y que están presentes en los oligonucleótidos utilizados para la
amplificación del gen), dando lugar al plásmido pET5233. Las abreviaturas utilizadas son: ApR, gen
que confiere resistencia a ampicilina; KmR, gen que confiere resistencia a kanamicina; lacI, gen que
codifica el represor LacI; PT7, promotor del gen 10 del fago T7; ori, origen de replicación.
134
Resultados
Los extractos de la cepa recombinante E. coli BL21 (DE3) (pET5233) fueron
analizados mediante SDS-PAGE y aunque se probaron distintas condiciones de
fermentación e inducción con IPTG, con ninguna de ellas se pudo obtener un
extracto en el que fuese visible la proteína en forma soluble. La proteína aparecía
siempre hiperproducida en forma insoluble. Como norma general para posteriores
experimentos se utilizaron las mismas condiciones de inducción que para E. coli
BL21(DE3) (pET1604) (Fig. 38).
66,0
97,4
KDa
21,5
116,0
45,0
31,0
1 2 3
14,4
Figura 38. Gel SDS-PAGE en el que se muestra la expresión de SDRMS en células E. coli BL21 (DE3). En este caso se cargaron como muestra células enteras, ya que no hay proteína
visible en las fracciones celulares solubles expresando esta proteína con las condiciones utilizadas. 1. Marcadores de peso molecular (en el margen izquierdo de la figura se detallan los pesos
moleculares de los marcadores). 2. Células enteras E. coli BL21(DE3) con plásmido pET29 sin
inserto (control negativo de expresión) inducidas 3 h a 20 ºC con 50 μM IPTG. 3. Células enteras E.
coli BL21(DE3) (pET5233) inducidas 3 h a 20 ºC con 50 μM IPTG. El peso molecular de SDRMS se
ajusta al teórico calculado por el programa Compute pI/Mw del servidor Expasy
(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html): 38,68 KDa. La posición aproximada de la proteína se
indica con una flecha roja.
135
Resultados
2.8.4 Cinética enzimática de SDRMS mediante TLC con colesterol marcado con 14C
y 3-β HSD la actividad enzimática de SDRComo en el caso de ChoDMS MS MS
se analizó mediante la técnica de TLC (véanse los apartados 5.4.1 y 9 de
Materiales y Métodos). Se analizaron las muestras procedentes de extractos
proteicos de E. coli BL21(DE3) (pET5233) incubados con colesterol marcado
radiactivamente durante 2, 20, 40 y 60 min a 30 ºC. Los resultados indicaron que
aparecía una marca radiactiva a la altura de la del patrón de 4-colesten-3-ona en
las muestras que expresan SDRMS. Esta marca aumenta su intensidad con el
tiempo de ensayo (Figura 39). En este caso no se aprecia una marca en la zona
de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona.
Estos resultados indican que la SDR posee, al igual que la 3-β HSDMS MS, una
actividad colesterol deshidrogenasa productora de 4-colesten-3-ona a partir de
colesterol, lo que confirma las sospechas de que existe más de una enzima capaz
de catalizar esta reacción en M. smegmatis mc2155.
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
N
H
C
2 min ensayo 20 min 40 min 60 min
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
N
H
CC
2 min ensayo 20 min 40 min 60 min
Figura 39. Producción de productos a partir de colesterol marcado con 14C por extractos celulares solubles expresando la proteína SDRMS. La línea marcada con una C indica la altura a
la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-3-ona y la marcada con una H
la de un producto no identificado que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las
muestras se cargaron en las placas de TLC a diferentes tiempos de reacción que se indica en la
vertical: 2, 20, 40 y 60 min. Las muestras cargadas proceden de ensayos realizados con: 1. Colesterol oxidasa comercial. 2. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET5233). 3. Extracto
soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) (aquí actúa como control negativo de reacción).
136
Resultados
2.8.5 Ensayos mediante LC/MS de SDRMS
Estos ensayos se realizaron con muestras procedentes de ensayos
enzimáticos con extractos de E. coli BL21 (DE3) (pET5233) para determinar la
actividad colesterol deshidrogenasa a distintos tiempos de reacción hasta un
máximo de 40 min (véanse los apartados 5.4.1 y 8 de Materiales y Métodos). Los
ensayos enzimáticos se realizaron de la misma manera que para su análisis
mediante TLC pero sin adición de colesterol radiactivo. La figura 40 muestra el
espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido por APCI+ para extractos de E. coli
BL21 (DE3) (pET5233) a distintos tiempos. Como se puede observar, en todos
ellos aparece un pico correspondiente a la 4-colesten-3-ona (concretamente el ión
367 procedente a su vez del ión 385 de la 4-colesten-3-ona). Estos resultados
confirmarían los obtenidos mediante ensayos con colesterol radiactivo
visualizados mediante TLC.
Las concentraciones de 4-colesten-3-ona obtenidas en los ensayos a
distintos tiempos con los extractos de E. coli BL21(DE3) (pET5233) fueron
cuantificadas y se muestran en la figura 41.
137
Resultados
Figura 40. Espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido por APCI + a partir de muestras procedentes de ensayos de actividad deshidrogenasa a distintos tiempos con extractos solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5233). Se registradó el ión hijo m/z 367 del ión padre m/z 385
de la 4-colesten-3-ona. En la figura se señalan en el primer espectro los picos correspondientes al
colesterol y a la 4-colesten-3-ona. Las muestras proceden de ensayos de actividad deshidrogenasa
realizados durante 2, 20 y 40 min con extractos solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5233). Se
puede observar cómo la relación entre las áreas de los picos de colesterol y 4-colesten-3-ona varía
con el tiempo.
Figura 41. Concentración de colesterol y 4-colesten-3-ona hallada a distintos tiempos de ensayo hidroxiesteroide deshidrogenasa con los extractos proteicos de E. coli BL21(DE3) (pET5233).
2,94120,67E. coli BL21(DE3) (pET5233) 40 min
2,91155,32E. coli BL21(DE3) (pET5233) 20 min
n.d.163,46E. coli BL21(DE3) (pET5233) 2 min
Conc. 4-colesten-3-ona (µM) (en los 900 μl)
Conc. colesterol (µM) (en los 900 μl)
MUESTRA
2,94120,67E. coli BL21(DE3) (pET5233) 40 min
2,91155,32E. coli BL21(DE3) (pET5233) 20 min
n.d.163,46E. coli BL21(DE3) (pET5233) 2 min
Conc. 4-colesten-3-ona (µM) (en los 900 μl)
Conc. colesterol (µM) (en los 900 μl)
MUESTRA
Abu
ndan
cia
ra
And
anc
e
0.00 - 60.09
elat
ivbu
ia r
lativ
a
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100 NL: 7.03E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-2
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Colesterol
4-colesten-3-ona pET5233 2 min
pET5233 20 min
pET5233 40 min
nda
ra
And
anc
e
0.00 - 60.09
ncia
elat
ivbu
ia r
lativ
a
NL: 5.66E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-22
NL: 5.85E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-42
Abu
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100 NL: 7.03E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-2
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Colesterol
4-colesten-3-ona pET5233 2 min
pET5233 20 min
pET5233 40 min
0.00 - 60.09
NL: 5.66E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-22
NL: 5.85E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-42
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
100
0
20
40
80
60
NL: 7.03E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-2
Tiempo (min)
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Colesterol
4-colesten-3-ona pET5233 2 min
pET5233 20 min
pET5233 40 min
NL: 5.66E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-22
NL: 5.85E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-42
138
Resultados
2.8.6 Mutagénesis del gen MSMEG_5233
El gen MSMEG_5233 fue mutado para comprobar si su ausencia afectaba a
la capacidad de de transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona de M.
smegmatis, aunque habiendo comprobado la existencia de, por lo menos, otro gen
que codifica una actividad colesterol deshidrogenasa (MSMEG_5228) no se
esperaba una pérdida significativa de la capacidad de crecimiento en colesterol.
La interrupción de MSMEG_5233 se llevó a cabo mediante el método ya descrito
para MSMEG_1604 y MSMEG_5228, la inserción del plásmido no replicativo en
micobacterias pJQ200x tal y como se detalla en el apartado 4.6 de Materiales y
Métodos.
2.8.6.1 Ensayos de crecimiento con el mutante M.
smegmatis::MSMEG_5233
El mutante en MSMEG_5233 se cultivó con colesterol 1,8 mM en β-
ciclodextrina como única fuente de carbono. Como puede observarse en la figura
42, el crecimiento en colesterol no se ve alterado en el mutante M.
smegmatis::MSMEG_5233.
139
Resultados
Figura 42. Crecimiento en colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 frente a la cepa control M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en
β-ciclodextrina como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_5233 (línea naranja) representa
al mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155 (línea azul) representa a la
cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_5233
0,01
0,1
1
10
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
DO
600
M. smegmat is mc²155
M. smegmat is::MSMEG_5233
2.8.6.2 Análisis de la composición del sobrenadante de cultivo en colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 mediante TLC
El sobrenadante de cultivos del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 en
colesterol se analizó mediante TLC con el fin de comprobar si, a pesar de ser
capaz de crecer en colesterol, se apreciaba alguna diferencia en el perfil de los
intermediarios producidos durante su catabolismo. Las células se cultivaron
durante 24 h en medio mínimo con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como
fuente de carbono y tras extraer el sobrenadante se visualizaron las muestras en
placas de TLC (véanse los apartados 5.4.2 y 9 de Materiales y Métodos). Los
resultados indican que este mutante tiene un perfil de intermediarios idéntico a la
cepa salvaje a las 24 h (Fig. 43). Este hecho apoyaría la hipótesis de que la
enzima 3-β HSDMS está más implicada que la enzima SDRMS en la degradación
del colesterol para su aprovechamiento como fuente de carbono y energía,
aunque también apunta hacia la posibilidad de que haya más proteínas implicadas
en este paso enzimático en M. smegmatis.
140
Resultados
Figura 43. Producción de metabolitos a partir de colesterol radiactivo por muestras procedentes de sobrenadante de cultivo del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233. La línea
marcada con una C indica la altura a la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-
colesten-3-ona y la marcada con una H la de un producto no identificado que podría tratarse de la
6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las muestras cargadas derivan de sobrenadantes de cultivos de
distintas cepas de M. smegmatis crecidas en colesterol 1,8 mM durante 24 h. 1. Control procedente
de un ensayo con colesterol oxidasa comercial. 2. M. smegmatis mc2155. 3. M.
smegmatis::MSMEG_5233.
N
C
H
N
C
H
1 2 3
2.8.6.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 mediante LC/MS
Para analizar el perfil de intermediarios de la degradación del colesterol en M.
smegmatis::MSMEG_5233, la cepa se creció en medio mínimo con colesterol en
β-ciclodextrina como única fuente de carbono, y se fueron extrayendo alícuotas a
distintos tiempos de incubación para su análisis mediante LC/MS (véanse los
apartados 5.4.2 y 8 de Materiales y Métodos). La desaparición del esteroide no
presenta diferencias entre el mutante y la cepa salvaje, así como tampoco hay
diferencias en la aparición de 4-colesten-3-ona y de otros intermediarios de la ruta
de degradación (26-hidroxi-4-colesten-3-ona, 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona,
ácido 4-colesten-3-ona-26-oico y ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico; estructuras
5A, 5B, 6A y 6B de la figura 15 de introducción, respectivamente) (Fig. 44). Los
resultados obtenidos mediante LC/MS coinciden con los observados mediante
141
Resultados
TLC, donde no se apreciaban diferencias en la concentración de colestenona
entre la cepa M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155.
26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona
0,00000
0,00100
0,00200
0,00300
0,00400
0,00500
0,00600
0,00700
0 24 48 72
Tiempo (h)
Áre
a de
l com
pues
to/á
rea
del
patr
ón in
tern
oM. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico
0,000000,050000,100000,150000,200000,250000,300000,350000,40000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico
0,000000,000200,000400,000600,000800,001000,001200,001400,00160
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
Colesterol
0,00000
Figura 44. Perfil de intermediarios de la degradación del colesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155. Las figuras representan la relación entre las áreas de los compuestos indicados en la
leyenda con respecto al área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado como patrón interno, frente al
tiempo. A. Colesterol; B. 4-colesten-3-ona; C. 26-hidroxi-4-colesten-3-ona; D. 26-hidroxi-1,4-
colestadien-3-ona; E. Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico; F. Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico.
0,20000
40000
60000
80000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Áre
a de
l com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
0,
0,
0,
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
4-colesten-3-ona
0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patr
ón in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
26-hidroxi-4-colesten-3-ona
0,00000
0,01000
0,02000
0,03000
0,04000
0,05000
0,06000
0,07000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patr
ón in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
C D
E F
BA
Colesterol 4-colesten-3-ona
26-hidroxi-4-colesten-3-ona
Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico
26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona
0,00000
0,00100
0,00200
0,00300
0,00400
0,00500
0,00600
0,00700
0 24 48 72
Tiempo (h)
Áre
a de
l com
pues
to/á
rea
del
patr
ón in
tern
oM. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico
0,000000,050000,100000,150000,200000,250000,300000,350000,40000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico
0,000000,000200,000400,000600,000800,001000,001200,001400,00160
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
Colesterol
0,00000
20000
40000
60000
80000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Áre
a de
l com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
0,
0,
0,
0,
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
4-colesten-3-ona
0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patr
ón in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
Colesterol 4-colesten-3-ona
26-hidroxi-4-colesten-3-ona
0,00000
0,01000
0,02000
0,03000
0,04000
0,05000
0,06000
0,07000
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patr
ón in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
C D
E F
BA
26-hidroxi-4-colesten-3-ona 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona
Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico
142
Resultados
La concentración de colestenona cuantificada en cada punto se muestra en
la tabla 15.
Tabla 15. Concentración de colestenona hallada en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155 a distintos tiempos.
En el caso de la aparición de hidroxicolesterol, tampoco se aprecian
diferencias significativas entre la cepa M. smegmatis::MSMEG_5233 y M.
smegmatis mc2155 (Fig. 45). En conjunto todos estos resultados obtenidos
mediante LC/MS parecen apuntar a que aunque SDRMS sí transforma el colesterol
en 4-colesten-3-ona, no ejerce un papel principal en este paso, y esto sugiere
nuevamente la posible existencia de más enzimas con esta misma actividad y/o
enzimas que permiten que parte de la degradación de colesterol se efectúe a
través de hidroxicolesterol cuando la enzima 3-β HSDMS no es funcional en M.
smegmatis mc2155.
0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h
0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h
0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h
0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h
0,0080,171M. smegmatis::MSMEG_5233 72h
0,0921,200M. smegmatis::MSMEG_5233 48h
0,0271,426M. smegmatis::MSMEG_5233 24h
n.d.1,747M. smegmatis::MSMEG_5233 0h
Conc. 4-colesten-3ona (mM)
Conc. colesterol(mM)
Muestra
0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h
0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h
0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h
0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h
0,0080,171M. smegmatis::MSMEG_5233 72h
0,0921,200M. smegmatis::MSMEG_5233 48h
0,0271,426M. smegmatis::MSMEG_5233 24h
n.d.1,747M. smegmatis::MSMEG_5233 0h
Conc. 4-colesten-3ona (mM)
Conc. colesterol(mM)
Muestra
143
Resultados
Figura 45. Perfil de hidroxicolesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155. Las figuras representan la relación
entre el área de hidroxicolesterol con respecto al área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado
como patrón interno, frente al tiempo.
Hidroxicolesterol
0,0000000,0005000,0010000,0015000,0020000,0025000,0030000,0035000,0040000,004500
0 24 48 72
Tiempo (h)
Área
del
com
pues
to/á
rea
del
patró
n in
tern
o
M. smegmatis::MSMEG_5233
M. smegmatis mc2155
3. Análisis genómico mediante microarrays de la ruta de degradación del colesterol
Para tener una visión global de las zonas del genoma de M. smegmatis
mc2155 implicadas en el catabolismo del colesterol, se realizaron estudios de
expresión diferencial de la cepa cultivada en colesterol 1,8 mM frente a glicerol 18
mM utilizando la técnica de los microarrays y RTq-PCR. (véanse los apartados
7.3, 7.4 y 7.5 de Materiales y Métodos).
Como se detalla más adelante, los resultados obtenidos apoyan el papel de
los reguladores KstR y KstR2 como represores de esta ruta de degradación y
ponen de manifiesto las similitudes existentes para esta ruta entre las especies de
Rhodococcus y Mycobacterium. Así mismo, se han identificado nuevos genes
cuya posible implicación en el catabolismo del colesterol no había sido constatada
en ningún microorganismo hasta el momento.
144
Resultados
3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays del genoma de M.
smegmatis mc2155
El análisis de los microarrays reveló que 89 genes se inducían durante su
crecimiento en colesterol al menos 3 veces comparado con el crecimiento en
glicerol. Estos genes inducidos se encuentran repartidos a lo largo de todo el
genoma de M. smegmatis (alojado en el servidor CMR: http://cmr.jcvi.org/tigr-
scripts/CMR/GenomePage.cgi?org=gms) y parecen reflejar una adaptación
fisiológica general de la bacteria al crecimiento en este compuesto policíclico
altamente hidrofóbico. Sin embargo, muchos de ellos se encuentran dentro de dos
regiones localizadas en el genoma (agrupaciones génicas o clusters). Otro grupo
de genes inducidos se encuentra a lo largo de todo el genoma, algunos formando
unidades transcripcionales sencillas y otros dentro de operones.
Para facilitar la presentación del elevado número de genes hallados, se
dividirán en cinco grupos:
- Cluster 1: Abarca la región MSMEG_5990-MSMEG_6042.
Comprende genes que se encuentran bajo el control del represor KstR
o KstR2 (Tabla 16 y Figura 46).
- Cluster 2: Abarca la región MSMEG_5903-MSMEG_5943. Comprende
genes que se encuentran bajo el control del represor KstR (Tabla 17 y
Figura 47).
- Genes no incluidos en el cluster 1 o 2 y que se encuentran bajo el
control del represor KstR (Tabla 18).
- Genes inducidos en colesterol que no presentan motivos de unión
para KstR o KstR2 en su región 5’ (Tabla 19). - Genes bajo el control de KstR que no se encuentran inducidos en
colesterol en nuestros experimentos (Tabla 20).
145
Resultados
Cluster 1 (Tabla 16 y Figura 46) Este cluster abarca 42 kb del cromosoma (MSMEG_5990-MSMEG_6042).
Del total de genes incluidos en esta región, 33 están regulados por KstR o KstR2
como ha sido identificado previamente (Kendall et al., 2007) y en este trabajo,
como se verá más adelante (Kendall et al., 2010) (Tabla 16). Estos genes se
encuentran organizados en 8 posibles operones más algunas unidades
transcripcionales sencillas. Los ensayos mediante microarrays revelaron que 21
de los genes presentan inducción con colesterol (Tabla 16 y Figura 46). Dos de los
genes de este cluster codifican reguladores tipo TetR y han sido ya descritos, se
trata de MSMEG_6042 y MSMEG_6009.
El producto del gen MSMEG_6042 ha sido identificado como el represor
KstR, que controla la expresión de 83 genes relacionados con el metabolismo del
colesterol (Kendall et al., 2007).
El producto del gen MSMEG_6009 ha sido identificado como el represor
KstR2, que controla la expresión de 15 genes adicionales también implicados en
esta ruta degradativa (Kendall et al., 2010).
El primer supuesto operón que aparece en esta región está compuesto por
los genes MSMEG_5995_5994_5993_5992_5991_5990, y muestra una similitud
elevada con el operón igr de M. tuberculosis, el que se ha comprobado
recientemente que es necesario para la utilización del colesterol como fuente de
carbono en esta bacteria, aunque se desconoce su implicación exacta en esta ruta
de degradación (Miner et al., 2009). Estos dos operones micobacterianos son muy
similares a su vez al operón de función desconocida ro04483-04484-04485-04486-
04487-04488 de Rhodococcus jostii RHA1, que también se induce en presencia
de colesterol (van der Geize et al., 2007). Aunque el gen ro4483 (fadE34) no
aparece en el operón de M. smegmatis, tiene una elevada identidad con el gen
MSMEG_6041 localizado lejos de este operón pero en esta misma región
denominada cluster 1. Aunque la inducción de este gen no se detecta mediante
microarrays, sí fue confirmada mediante RTq-PCR (apartado 3.2 de Resultados).
Curiosamente, ambos genes fadE34 de M. smegmatis y Rhodococcus se localizan
contiguos pero en sentido opuesto al regulador KstR, lo que sugiere una
146
Resultados
ordenación genética original común a ambas especies. En M. tuberculosis, el gen
Rv3573c, ortólogo de MSMEG_6041, se encuentra en una posición en el genoma
equivalente a la del gen de M. smegmatis (Figura 48). El gen MSMEG_5990
codifica una supuesta cetoacil-CoA tiolasa (Lpt2). Los genes MSMEG_5993
(fadE29) y MSMEG_5994 (fadE28) codifican dos supuestas acil-CoA
deshidrogenasas, mientras que el gen MSMEG_5991 codifica una proteína similar
a MaoC, una enzima que puede actuar como una enoil-CoA hidratasa frente al
crotonil-CoA (Park y Lee, 2003). Es interesante apuntar que MaoC es homóloga a
la enoil-CoA hidratasa PhaJ1 de Pseudomonas aeruginosa (Tsuge et al., 2000). El
gen MSMEG_5992 también codifica una proteína que contiene en su extremo N-
terminal el típico plegamiento denominado hot-dog que se encuentra en las enoil-
CoA hidratasas que muestran especificidad por el enántiomero (R). En
Pseudomonas se ha visto que estas hidratasas que muestran especificidad por el
enántiomero (R) son enzimas que interconectan la β-oxidación con la biosíntesis
de polihidroxialcanoato. Además, este operón de M. smegmatis presenta el gen
MSMEG_5995, que codifica un citocromo P450 (Cyp125) que también se induce
en colesterol. Como se verá en el apartado 4.3, la mutación de este citocromo
impide el crecimiento en este esteroide, lo que sugiere que este operón puede
estar implicado en la oxidación de la cadena lateral. Curiosamente, en R. jostii
RHA1 el ortólogo de MSMEG_5995 (r04679) aparece alejado de este operón.
Como ya se ha comentado anteriormente, el gen ortólogo a MSMEG_5995 en M.
tuberculosis, Rv3545c, codifica un citocromo implicado en patogénesis (Chang et
al., 2009), y ha sido recientemente propuesto como una hidroxilasa del C27
esteroideo (Capyk et al., 2009b). Por otra parte, la enzima ortóloga en R. jostii
RHA1 parece ser la responsable de iniciar el catabolismo del colesterol en esta
especie, también iniciando la degradación de la cadena lateral (Rosłoniec et al.,
2009).
Contiguo pero en sentido opuesto al gen MSMEG_5995 se encuentra otro
posible operón formado por los genes MSMEG_5996_5997_5998. El gen
MSMEG_5996 codifica una supuesta acetil-CoA acetiltransferasa (tiolasa, FadA5),
y los otros dos genes codifican dos proteínas hipotéticas, una de ellas similar a la
147
Resultados
orf33 de C. testosteroni (MSMEG_5997). Hay que destacar que este gen
MSMEG_5997 no presenta ortólogos ni en M. tuberculosis ni en R. jostii RHA1.
Este nuevo operón también podría estar implicado en la degradación de la
cadena lateral del colesterol, ya que como se ha explicado en el apartado 1.3 de
Resultados hemos constatado la expresión diferencial en colesterol de este
operón mediante RT-PCR semicuantitativa.
Cabe mencionar que la cadena lateral del colesterol muy probablemente se
transforma en un 2-metil ácido graso ramificado (BFA) y por tanto, el primer paso
de la β-oxidación requeriría enzimas adicionales y específicas para oxidar este
BFA.
Otro supuesto operón que se ha identificado en este cluster 1 es el formado
por los genes MSMEG_6001_6002_6003_6004, que son muy similares a las
orfs5-1-2-4 de C. testosteroni, respectivamente. La expresión diferencial de los
genes MSMEG_6001 a MSMEG_6003 se había comprobado anteriormente
mediante RT-PCR semicuantitativa (apartado 1.3 de Resultados). Este operón
está próximo a los genes MSMEG_5999 (que podría formar un operón con
MSMEG_6000) y MSMEG_6008, que son muy similares a las orf27 y orf23 de C.
testosteroni, respectivamente (Horinouchi et al., 2004b) y de los que también se
había visto inducción en colesterol mediante RT-PCR semicuantitativa (apartado
1.3 de Resultados).
Como ya se ha comentado anteriormente, el gen MSMEG_6009 codifica el
represor KstR2 (Kendall et al., 2010), lo que sugiere claramente la implicación de
esta región en el catabolismo del colesterol. Concretamente se encuentran bajo el
control de KstR2 los genes de la región MSMEG_5999-MSMEG_6017, con la
excepción de los genes MSMEG_6005, MSMEG_6006, MSMEG_6007 y
MSMEG_6010 (véase con más detalle en el apartado 5.3 de Resultados).
Aunque se ha propuesto la implicación de todos estos genes en la
mineralización completa del DOHNAA (Figura 5 de Introducción, estructura 15)
sus funciones exactas son todavía desconocidas. Los cuatro primeros genes del
supuesto operón MSMEG_6013_6014_6015_6016_6017 son ortólogos a las
orfs18-21-22-28 de C. testosteroni, respectivamente. La orf18 codifica una
supuesta CoA ligasa de ácidos grasos que parece participar en la degradación del
148
Resultados
DOHNAA en C. testosteroni, mientras que las orfs21-22-28 codifican tres
supuestas acil-CoA deshidrogenasas (Horinouchi et al., 2004b). Mediante RT-PCR
semicuantitativa se observó que estos genes no se inducían en M. smegmatis en
presencia de colesterol, sin embargo mediante microarrays se ven inducidos los
genes MSMEG_6013, MSMEG_6015 y MSMEG_6016 de este operón.
Un operón muy similar a este también se detectó en R. jostii RHA1: fadD3-
ro4594-fadE31-fadE32-fadE33 (van der Geize et al, 2007). Curiosamente, el
supuesto operón contiguo MSMEG_6012_6011 que está localizado en sentido
opuesto es también muy similar al operón conservado en la misma posición en R.
jostii RHA1 (fadE30-ro04597). Ambos operones contienen genes ortólogos a las
orfs30-31 de C. testosteroni que codifican una supuesta FadE30 acil-CoA
deshidrogenasa y una oxidorreductasa, respectivamente, también supuestamente
implicadas en la degradación de DOHNAA (Horinouchi et al., 2004). Los genes
que conforman este posible operón no aparecen inducidos en los microarrays,
aunque sí se ha comprobado su inducción en colesterol mediante RT-PCR
semicuantitativa (apartado 1.3 de Resultados) y RTq-PCR (apartado 3.2 de
Resultados).
Aunque se han descrito varios compuestos como posibles intermediarios de
la mineralización de DOHNAA, la información disponible no permite establecer una
ruta catabólica precisa (Kieslich, 1985). Sin embargo, se asume que el primer
paso en la degradación de este compuesto podría ser la eliminación de su fracción
propionil para producir ácido 9,17-dioxo-1,2,3,4,5,6,10,19-octanorandrostan-7-oico
(Figura 5 introducción, (17)) a través de una β-oxidación típica (Kieslich, 1985). El
gen MSMEG_6013, que codifica una supuesta acil-CoA ligasa podría representar
el primer gen de esta ruta.
Por otra parte, en este cluster 1 se encuentra un supuesto operón catabólico
muy similar al operón hsaADCB de R. jostii RHA1 (van der Geize et al., 2007)
(MSMEG_6038_6037_6036_6035) que codifica cuatro proteínas que comparten
una similitud significativa (33, 34, 42 y 31 % cuantificados por ClustalW), con las
enzimas codificadas por los genes tesA2, tesD, tesB y tesA1, respectivamente, de
C. testosteroni TA441, que transforman el compuesto 3-HSA en DOHNAA y ácido
2-hidroxihexa-2,4-dienoico (Figura 5 de Introducción, estructuras 11-15) durante el
149
Resultados
crecimiento en testosterona (Horinouchi et al., 2001; Horinouchi et al., 2003a;
Horinouchi et al., 2004a). Se confirman así los resultados obtenidos mediante
análisis in silico del genoma de M. smegmatis frente a estos genes de C.
testosteroni así como los análisis mediante RT-PCR semicuantitativa que se
presentaron en el apartado 1.3 de Resultados en los que estos genes presentaban
inducción en colesterol. Este operón es contiguo, pero en dirección opuesta, al
gen MSMEG_6039, probable ortólogo del gen kshB, implicado en la
transformación de ADD en 3-HSA (Figura 5 de introducción, estructuras 9B y 11)
junto con el gen kshA en R. erythropolis (van der Geize et al., 2001; van der Geize
et al., 2002b; van der Geize et al., 2008) y en M. tuberculosis (Capyk et al.,
2009a). El ortólogo de kshA en M. smegmatis es el gen MSMEG_5925, que
codifica la proteína KstH (Andor et al., 2006) y que está localizado lejano a kshB,
en el cluster 2.
150
Resultados
ro04482 Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR1)89Rv3574KstR121.99*MSMEG_6042
ro04483 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE34)73Rv3573cKstR1_MSMEG_6041
_Proteína hipotética conservada 30Rv3572KstR1_MSMEG_6040
ro05833Cetoesteroide 9α-hidroxilasa, reductasa (kshB)73Rv3571KstR1_MSMEG_6039
ro04539 Hidroxilasa de producción de pigmento (hsaA)81Rv3570cKstR147.73*MSMEG_6038
ro04540 Hidrolasa del ácido 2-hidroxi-6-cetonona-2,4-dienodioico (hsaD)81Rv3569cKstR131.54*MSMEG_6037
ro04541 Bifenil-2,3-diol 1,2-dioxigenasa (hsaC)81Rv3568cKstR18.33MSMEG_6036
ro04542 Nitrilotriacetato monooxigenasa, componente B (hsaB)79Rv3567cKstR14.14MSMEG_6035
_Proteína hipotética__KstR1_MSMEG_6033
_Aminotransferasa, clase I 80Rv3565KstR2_MSMEG_6017
ro04591Supuesta acil-CoA deshidrogenasa68Rv3564KstR28.98MSMEG_6016
ro04592 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)75Rv3563KstR28.61MSMEG_6015
ro04593 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)84Rv3562KstR2_MSMEG_6014
ro04595 Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)74Rv3561KstR28.72MSMEG_6013
ro04596 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)84Rv3560cKstR2_MSMEG_6012
ro04597Deshidrogenasa de cadena corta84Rv3559cKstR2_MSMEG_6011
ro04598Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)73Rv3557cKstR23.29MSMEG_6009
ro04599 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)80Rv3556cKstR2_MSMEG_6008
ro04649Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas82Rv3553KstR2_MSMEG_6004
ro04650Coenzima A transferasa, subunidad B 81Rv3552KstR23.32MSMEG_6003
ro04651Coenzima A transferasa, subunidad A 81Rv3551KstR28.41MSMEG_6002
ro04652 Enoil-CoA hidratasa (echA20)86Rv3550KstR25.76MSMEG_6001
ro04653Deshidrogenasa de cadena corta73Rv3549cKstR217.51*MSMEG_6000
ro04654Deshidrogenasa de cadena corta83Rv3548cKstR25.93MSMEG_5999
ro04677Proteína hipotética conservada 49Rv3547KstR117.92*MSMEG_5998
_Proteína hipotética conservada __KstR18.07MSMEG_5997
ro04678 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA5)84Rv3546KstR110.31MSMEG_5996
ro04679Citocromo P450 125 (cyp125)75Rv3545cKstR166.03*MSMEG_5995
ro04484 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE28)73Rv3544cKstR173.05*MSMEG_5994
ro04485 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE29)77Rv3543cKstR149.89*MSMEG_5993
ro04486Proteína hipotética conservada 74Rv3542cKstR122.46*MSMEG_5992
ro04487Supuesto dominio MaoC76Rv3541cKstR123.15*MSMEG_5991
ro04488Proteína de transferencia de lípidos (ltp2)84Rv3540cKstR125.48*MSMEG_5990
7654321
ro04482 Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR1)89Rv3574KstR121.99*MSMEG_6042
ro04483 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE34)73Rv3573cKstR1_MSMEG_6041
_Proteína hipotética conservada 30Rv3572KstR1_MSMEG_6040
ro05833Cetoesteroide 9α-hidroxilasa, reductasa (kshB)73Rv3571KstR1_MSMEG_6039
ro04539 Hidroxilasa de producción de pigmento (hsaA)81Rv3570cKstR147.73*MSMEG_6038
ro04540 Hidrolasa del ácido 2-hidroxi-6-cetonona-2,4-dienodioico (hsaD)81Rv3569cKstR131.54*MSMEG_6037
ro04541 Bifenil-2,3-diol 1,2-dioxigenasa (hsaC)81Rv3568cKstR18.33MSMEG_6036
ro04542 Nitrilotriacetato monooxigenasa, componente B (hsaB)79Rv3567cKstR14.14MSMEG_6035
_Proteína hipotética__KstR1_MSMEG_6033
_Aminotransferasa, clase I 80Rv3565KstR2_MSMEG_6017
ro04591Supuesta acil-CoA deshidrogenasa68Rv3564KstR28.98MSMEG_6016
ro04592 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)75Rv3563KstR28.61MSMEG_6015
ro04593 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)84Rv3562KstR2_MSMEG_6014
ro04595 Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)74Rv3561KstR28.72MSMEG_6013
ro04596 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)84Rv3560cKstR2_MSMEG_6012
ro04597Deshidrogenasa de cadena corta84Rv3559cKstR2_MSMEG_6011
ro04598Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)73Rv3557cKstR23.29MSMEG_6009
ro04599 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)80Rv3556cKstR2_MSMEG_6008
ro04649Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas82Rv3553KstR2_MSMEG_6004
ro04650Coenzima A transferasa, subunidad B 81Rv3552KstR23.32MSMEG_6003
ro04651Coenzima A transferasa, subunidad A 81Rv3551KstR28.41MSMEG_6002
ro04652 Enoil-CoA hidratasa (echA20)86Rv3550KstR25.76MSMEG_6001
ro04653Deshidrogenasa de cadena corta73Rv3549cKstR217.51*MSMEG_6000
ro04654Deshidrogenasa de cadena corta83Rv3548cKstR25.93MSMEG_5999
ro04677Proteína hipotética conservada 49Rv3547KstR117.92*MSMEG_5998
_Proteína hipotética conservada __KstR18.07MSMEG_5997
ro04678 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA5)84Rv3546KstR110.31MSMEG_5996
ro04679Citocromo P450 125 (cyp125)75Rv3545cKstR166.03*MSMEG_5995
ro04484 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE28)73Rv3544cKstR173.05*MSMEG_5994
ro04485 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE29)77Rv3543cKstR149.89*MSMEG_5993
ro04486Proteína hipotética conservada 74Rv3542cKstR122.46*MSMEG_5992
ro04487Supuesto dominio MaoC76Rv3541cKstR123.15*MSMEG_5991
ro04488Proteína de transferencia de lípidos (ltp2)84Rv3540cKstR125.48*MSMEG_5990
7654321
Tabla 16. Genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155 (Cluster 1). Columna 1. Anotación de los genes de M. smegmatis mc2155 que presentan inducción en colesterol. Se
seleccionaron aquellos como mínimo más de 3 veces inducidos y con un valor máximo de P de 0,1,
tras un análisis visual previo de las imágenes escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se
muestra el número de veces que cada gen está inducido. Los valores marcados con un asterisco
tienen un valor de P ajustado (FDR) <0,05. Se marcan con una línea aquellos casos en los que los
valores de inducción no se ajustaban a los parámetros seleccionados y por tanto fueron
descartados. Columna 3. Regulón al que pertenece cada gen (KstR o KstR2). Columna 4. Genes
similares en M. tuberculosis H37Rv. Columna 5. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre los
genes de M. smegmatis y M. tuberculosis. Columna 6. Descripción de los productos de los genes.
151
Resultados
Entre paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 7. Genes similares
en R. jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol (van der Geize et al, 2007).
Figura 46. Representación esquemática de la disposición en el genoma de los genes de M. smegmatis mc2155 incluidos en el cluster 1. Se señalan con una estrella aquellos genes que
presentan inducción en colesterol en los microarrays. Los números que se muestran por debajo de
los genes señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los números entre corchetes indican
separación y los números entre paréntesis solapamiento. Los números que aparecen sobre las
líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que se encuentran las
distintas agrupaciones génicas.
5996 5999 6001 60046002 600360005997 5998
6035 6036 6037 6038 6039
6102
59955994
6033 6034 6040 6041 6042
6110
6013 6014 6015 6016
6082
5993599259915990
6011 60126010
60076005 6006 60096008
6056
6017
(4) (19) (4) (1) [18] [124] [2] [7] [77] [15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314]
[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17] (133) [142] [7] (0) [2] [159] [42] [80] [263]
5996 5999 6001 60046002 600360005997 5998
6035 6036 6037 6038 6039
6102
59955994
6033 6034 6040 6041 6042
6110
6013 6014 6015 6016
6082
5993599259915990
6011 60126010
60076005 6006 60096008
6056
6017
(4) (19) (4) (1) [18] [124] [2] [7] [77] [15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314]
[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17] (133) [142] [7] (0) [2] [159] [42] [80] [263]
Cluster 2 (Tabla 17 y figura 47) El segundo cluster de genes inducidos en colesterol comprende una zona de
50 kb en el cromosoma de M. smegmatis mc2155 (MSMEG_5903-MSMEG_5943).
Del total de genes incluidos en esta región, 24 están regulados por KstR (Tabla
17) y aparecen organizados en 8 posibles operones. De ellos, 16 genes presentan
inducción en colesterol en nuestros ensayos de expresión con los microarrays
(Tabla 17 y Figura 47).
El primer supuesto operón incluido en este cluster comprende los genes
MSMEG_5904_5903, y ambos presentan inducción en colesterol. El gen hsd4A,
ortólogo a MSMEG_5903 en R. jostii RHA1, junto con otros cuatro genes, hsd4B,
fadD19, fadE26 y ltp3, que también están inducidos por colesterol, y que se
corresponden con los genes MSMEG_5943, MSMEG_5914, MSMEG_5906 y
MSMEG_5923 de M. smegmatis también presentes en este cluster e inducidos por
152
Resultados
colesterol, parece que podría llevar a cabo un ciclo completo de β- oxidación, ya
que codifican todas las enzimas necesarias para realizar este proceso (van der
Geize et al., 2007). Por tanto, estos genes podrían estar implicados en la
degradación de la cadena lateral del colesterol. Además, Hsd4A es homóloga al
dominio N-terminal de la 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa IV de eucariotas
(17βHSD4) (Mindnich et al., 2004). Este dominio actúa como una 17β-
hidroxiesteroide deshidrogenasa y, en presencia de ácidos grasos ramificados y
ácidos biliares, como una D-3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa. Hsd4B es
homóloga al dominio central de esta 17βHSD4, que es una 2-enoil acil-CoA
hidratasa de la que se ha propuesto que puede estar implicada en el acortamiento
de la cadena lateral del colesterol. Estas homologías apoyarían la implicación de
Hsd4A y Hsd4B en la transformación a través de un ciclo de β-oxidación de la
cadena lateral del C17 para dar lugar a propionil-CoA y acetil-CoA (van der Geize
et al., 2007).
También en Rhodococcus se ha identificado otro grupo de genes, echA19,
fadD17, fadE27 y ltp4, relacionados con la β-oxidación (van der Geize et al., 2007)
cuyos ortólogos en M. smegmatis se sitúan así mismo en este cluster 2. Estos
genes de Rhodococcus presentan una menor inducción por colesterol que los
anteriormente señalados. Los genes ortólogos en M. smegmatis son
MSMEG_5915, MSMEG_5908, MSMEG_5907 y MSMEG_5922,
respectivamente. Todos ellos se encuentran inducidos por colesterol o dentro de
un operón que presenta inducción por colesterol según los datos obtenidos
mediante microarrays (Fig. 47).
Dentro de este cluster 2 de M. smegmatis encontramos así mismo el gen
MSMEG_5925, ortólogo del gen kshA de R. erythropolis y que en M. smegmatis
codifica la proteína KstH (Andor et al., 2006). KstH está implicada en la
hidroxilación del ADD que conlleva, tras la apertura espontánea del anillo A, a su
transformación en 3-HSA (Figura 5 de introducción, estructuras 9B, 10B y 11).
Como se ha comentado anteriormente, la proteína KshA de Rhodococcus y M.
tuberculosis actúa junto con la proteína KshB (cuyo ortólogo en M. smegmatis es
el gen MSMEG_6039) para llevar a cabo esta transformación (Capyk et al., 2009a;
van der Geize et al., 2001; van der Geize et al., 2002b). Hasta la fecha se
153
Resultados
desconoce si en M. smegmatis sucede lo mismo. El gen MSMEG_5925 se
organiza dentro de un posible operón MSMEG_5925_5927, lo que sugiere la
participación del gen MSMEG_5927, que codifica una proteína hipotética, en esta
ruta catabólica.
Finalmente, en este cluster 2 se encuentra también el posible operón
hsaEGF (MSMEG_5940_5939_5937) que codifica proteínas que comparten una
alta similitud de secuencia de aminoácidos (39, 55 y 46 % cuantificados por
ClustalW, respectivamente) con las enzimas codificadas por los genes tesEFG de
C. testosteroni, que transforman el ácido 2-hidroxi-2,4-hexadienoico (Figura 5 de
introducción, estructura 14) en propionil-CoA y piruvato durante la degradación de
la testosterona (Horinouchi et al, 2003). La inducción de este operón de M.
smegmatis en presencia de colesterol ya se había observado mediante ensayos
de RT-PCR semicuantitativa (véase el apartado 1.3 de resultados). Este operón es
contiguo, pero su transcripción es opuesta, a la del gen kstD (MSMEG_5941) cuyo
producto transforma el AD en ADD (Figura 5 de introducción, estructuras 9A y 9B)
(Brzostek et al, 2005). Es interesante apuntar que los operones hsaEGF y
hsaADCB (comentados en el apartado anterior) se disponen en posiciones
adyacentes en R. jostii RHA1 y C. testosteroni (excepto el gen tesB, que en en
este microorganismo parece hallarse aislado del resto), pero se encuentran
considerablemente alejados en M. smegmatis y M. tuberculosis.
154
Resultados
ro04531Supuesta enzima peroxisomal multifuncional tipo 2 (hsd4B)73Rv35389.09MSMEG_5943
ro045323-cetoesteroide deshidrogenasa (kstD)82Rv353713.00*MSMEG_5941
ro045332-ceto-4-pentenoato hidratasa (hsaE)78Rv3536c_MSMEG_5940
ro04534Acetaldehido deshidrogenasa (hsaG)83Rv3535c13.30*MSMEG_5939
ro045354-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (hsaF)89Rv3534c7.23MSMEG_5937
_conserved hypothetical protein80Rv3531c_MSMEG_5932
ro04537Proteína hipotética conservada 62Rv35274.71MSMEG_5927
ro04538Cetoesteroide-9α-hidroxilasa (kstH, kshA)79Rv35266.91MSMEG_5925
ro046833-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp3)87Rv352332.15*MSMEG_5923
ro046843-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp4)80Rv352227.42*MSMEG_5922
ro04685Proteína hipotética conservada 76Rv352112.05*MSMEG_5921
ro04686Monooxigenasa FMN-dependiente 85Rv3520c_MSMEG_5920
ro04586Monooxigenasa66Rv3519_MSMEG_5919
ro04588Citocromo P450 monooxigenasa (cyp142)78Rv3518c_MSMEG_5918
ro04688Enoil-CoA hidratasa (echA19)82Rv351613.74MSMEG_5915
ro04689Acil-CoA sintasa (fadD19)83Rv3515c7.19MSMEG_5914
_Dioxigenasa__3.55MSMEG_5913
_Regulador transcripcional similar a AraC_MSMEG_5911
_Oxidorreductasa___MSMEG_5909
ro04691Acil-CoA sintasa (fadD17)65Rv3506_MSMEG_5908
ro04692Acil-CoA deshidrogenasa (fadE27)74Rv350510.74MSMEG_5907
ro04693Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE26)84Rv35049.59MSMEG_5906
ro04694Ferredoxina (fdxD)80Rv3503c7.34MSMEG_5904
ro04695Proteína de la familia deshidrogenasas/reductasas de
cadena corta (hsd4A)72Rv3502c3.33MSMEG_5903
654321
ro04531Supuesta enzima peroxisomal multifuncional tipo 2 (hsd4B)73Rv35389.09MSMEG_5943
ro045323-cetoesteroide deshidrogenasa (kstD)82Rv353713.00*MSMEG_5941
ro045332-ceto-4-pentenoato hidratasa (hsaE)78Rv3536c_MSMEG_5940
ro04534Acetaldehido deshidrogenasa (hsaG)83Rv3535c13.30*MSMEG_5939
ro045354-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (hsaF)89Rv3534c7.23MSMEG_5937
_conserved hypothetical protein80Rv3531c_MSMEG_5932
ro04537Proteína hipotética conservada 62Rv35274.71MSMEG_5927
ro04538Cetoesteroide-9α-hidroxilasa (kstH, kshA)79Rv35266.91MSMEG_5925
ro046833-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp3)87Rv352332.15*MSMEG_5923
ro046843-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp4)80Rv352227.42*MSMEG_5922
ro04685Proteína hipotética conservada 76Rv352112.05*MSMEG_5921
ro04686Monooxigenasa FMN-dependiente 85Rv3520c_MSMEG_5920
ro04586Monooxigenasa66Rv3519_MSMEG_5919
ro04588Citocromo P450 monooxigenasa (cyp142)78Rv3518c_MSMEG_5918
ro04688Enoil-CoA hidratasa (echA19)82Rv351613.74MSMEG_5915
ro04689Acil-CoA sintasa (fadD19)83Rv3515c7.19MSMEG_5914
_Dioxigenasa__3.55MSMEG_5913
_Regulador transcripcional similar a AraC_MSMEG_5911
_Oxidorreductasa___MSMEG_5909
ro04691Acil-CoA sintasa (fadD17)65Rv3506_MSMEG_5908
ro04692Acil-CoA deshidrogenasa (fadE27)74Rv350510.74MSMEG_5907
ro04693Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE26)84Rv35049.59MSMEG_5906
ro04694Ferredoxina (fdxD)80Rv3503c7.34MSMEG_5904
ro04695Proteína de la familia deshidrogenasas/reductasas de
cadena corta (hsd4A)72Rv3502c3.33MSMEG_5903
654321
Tabla 17. Cluster 2 de genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155. Columna 1. Anotación de los genes de M. smegmatis mc2155 que presentan inducción en colesterol. Se
seleccionaron aquellos como mínimo más de 3 veces inducidos y con un valor máximo de P de 0,1,
tras un análisis visual previo de las imágenes escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se
muestra el número de veces que cada gen está inducido. Los valores marcados con un asterisco
tienen un valor de P ajustado (FDR) <0,05. Se marcan con una línea aquellos casos en los que los
valores de inducción no se ajustaban a los parámetros seleccionados y por tanto fueron
descartados. Columna 3. Genes similares en M. tuberculosis H37Rv. Columna 4. Porcentaje de
identidad (ClustalW) entre los genes de M. smegmatis y M. tuberculosis. Columna 5. Descripción
de los productos de los genes. Entre paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del
gen. Columna 6. Genes similares en R. jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol
(van der Geize et al., 2007).
155
Resultados
Figura 47. Representación esquemática de la disposición en el genoma de los genes de M. smegmatis mc2155 incluidos en el cluster 2. Se señalan con una estrella aquellos genes que
presentan inducción en colesterol en los microarrays. Los números que se muestran por debajo de
los genes señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los números entre corchetes indican
separación y los números entre paréntesis solapamiento. Los números que aparecen sobre las
líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que se encuentran las
distintas agrupaciones génicas.
59245923 5926592759255922
5963
59435939 59415940
6003
5936 59385921
59155913 59145907 59085906590559045903
5989
59375928
59105911 59165912 5918 5919
5995
59205917
[42] [133] (65) [19] [2] (4) (46) (64) [127] [3] [10] [68] [54] [275] [71] (4) [43] [159]
5909
[39] (1) [158] [104] (1) (4) [35] [86] (4) [38] [73] [1]
59245923 5926592759255922
5963
59435939 59415940
6003
5936 59385921
59155913 59145907 59085906590559045903
5989
59375928
59105911 59165912 5918 5919
5995
59205917
[42] [133] (65) [19] [2] (4) (46) (64) [127] [3] [10] [68] [54] [275] [71] (4) [43] [159]
5909
[39] (1) [158] [104] (1) (4) [35] [86] (4) [38] [73] [1]
156
Resultados
157
tesBO
RF1
23
45
2122
2325
2627
2830
3134
3332
tesDtesA
1tesE
tesGtesF
OR
F18O
RF17
tesItesH
tesA2
Com
amonas
testosteroniTA441
Rhodococcus
jostiiRH
A1
59965999
60016004
60026003
60005997
5998
60356036
60376038
6039
6102
59245923
59265927
59255922
599559946033
60346040
5963 Mycobacterium
smegm
atism
c²155
hsaEhsaG
hsaFro04536
ro04537kshA
hsaAhsaD
hsaChsd4B
hsaBkstD
gabD3
4789
4842
47764733
4724ro04481kstR
fadE34fadE28
fadE29ro04486
ro04487ltp2
ro04489
ro04590fadE33
fadE32fadE31
ro04594fadD
3fadE30
ro04597fadA
6ro04598
ro04600
48534902ro04648
ro04649ro04650
ro04651echA20
ro04653ro04654
ro04655
4909
4929ro04677fadA
5ro04681
ro04682ltp3
ltp4ro04685
ro04687ro04686
ro04679ro04680
fadD19
ro04690ro04694
echA19fadD
17fadE27
fadE26hsd4A
ro04696
495160416042
6110
60136014
60156016
6082
59935992
59915990
60116012
60106007
60056006
60096008
59435939
59415940
6005
59365938
5942
59215909
59155913
59145907
59085906
59055904
5903
9946056
5989
5
Mycobacterium
tuberculosisH
37 Rv
3534c3537
35383539
3536c3535c
3540c3541c
3542c3543c
3544c3545c
35463547
35503551
35523553
3548c3549c
3557c3560c
3554
35583561
3559c3562
35633565
35713572
35643567c
3568c3569c
3566c3570c
3573c
4018
3574
3972
3566A3556c
3555c
35213522
35253524
35233527
3526
3965
3515c3504
3505
39513925
3921
3502c3503c
Genes inducidos en colesterol 1,8 m
Men los m
icroarrays
6017
5937
5928
3516
59165918
59195920
5917
3518c3520
35173519
tesBO
RF1
23
45
2122
2325
2627
2830
3134
3332
tesDtesA
1tesE
tesGtesF
OR
F18O
RF17
tesItesH
tesA2
Com
amonas
testosteroniTA441
Rhodococcus
jostiiRH
A1
59965999
60016004
60026003
60005997
5998
60356036
60376038
6039
6102
59245923
59265927
59255922
599559946033
60346040
5963 Mycobacterium
smegm
atism
c²155
hsaEhsaG
hsaFro04536
ro04537kshA
hsaAhsaD
hsaChsd4B
hsaBkstD
gabD3
4789
4842
47764733
4724ro04481kstR
fadE34fadE28
fadE29ro04486
ro04487ltp2
ro04489
ro04590fadE33
fadE32fadE31
ro04594fadD
3fadE30
ro04597fadA
6ro04598
ro04600
48534902ro04648
ro04649ro04650
ro04651echA20
ro04653ro04654
ro04655
4909
4929ro04677fadA
5ro04681
ro04682ltp3
ltp4ro04685
ro04687ro04686
ro04679ro04680
fadD19
ro04690ro04694
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17fadE27
fadE26hsd4A
ro04696
495160416042
6110
60136014
60156016
6082
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59915990
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59415940
6005
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5942
59215909
59155913
59145907
59085906
59055904
5903
9946056
5989
5
Mycobacterium
tuberculosisH
37 Rv
3534c3537
35383539
3536c3535c
3540c3541c
3542c3543c
3544c3545c
35463547
35503551
35523553
3548c3549c
3557c3560c
3554
35583561
3559c3562
35633565
35713572
35643567c
3568c3569c
3566c3570c
3573c
4018
3574
3972
3566A3556c
3555c
35213522
35253524
35233527
3526
3965
3515c3504
3505
39513925
3921
3502c3503c
Genes inducidos en colesterol 1,8 m
Men los m
icroarrays
6017
5937
5928
3516
59165918
59195920
5917
3518c3520
35173519
Resultados
Figura 48. Representación esquemática de las zonas del genoma que abarcarían los denominados en este trabajo cluster 1 y 2 en M. smegmatis mc2155 y zonas relacionadas encontradas en los genomas de C. testosteroni TA441, R. jostii RHA1 y M. tuberculosis H37Rv. Los genes supuestos ortólogos de los distintos organismos se han coloreado de manera
idéntica y el número que los representa es su denominación en las bases de datos. Los números
que aparecen sobre las líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que
se encuentran las distintas agrupaciones génicas.
Genes no incluidos en el cluster 1 o 2 y que se encuentran bajo el control del represor KstR (Tabla 18)
Aparte de las dos grandes regiones del genoma de M. smegmatis que se
acaban de describir (cluster 1 y 2) que incluyen una gran cantidad de genes
supuestamente relacionados con el catabolismo del colesterol, a lo largo de todo
el genoma de M. smegmatis nos encontramos con genes no agrupados en ningún
gran cluster metabólico definido que se encuentran inducidos en colesterol según
se ha comprobado en los experimentos de expresión mediante microarrays. En
este apartado se tratará de aquellos genes que, además de inducirse en presencia
del esteroide, están precedidos por secuencias que pueden funcionar como
operadores para el regulador KstR, lo que sugiere que se inducen directamente
por colesterol y por tanto estarían muy probablemente implicados en su
metabolismo. Cabe destacar que ninguno de los genes incluidos en este apartado
tienen ortólogos en R. jostii RHA1 que se hayan observado inducidos por
colesterol en esta bacteria (van der Geize et al., 2007). El gen MSMEG_0302,
aunque no presentó inducción en colesterol mediante microarrays se ha incluido
en este grupo de genes, ya que se encuentra formando parte de un operón que sí
presentó inducción en colesterol.
El primero y más significativo de estos genes es el gen MSMEG_0217, que
codifica una alcohol deshidrogenasa B, y es muy similar a genes implicados en la
oxidación de alcoholes primarios. Se induce de manera muy notable en colesterol,
más de 20 veces, y su mutagénesis produce una disminución de la capacidad de
crecimiento en colesterol de M. smegmatis (véase el apartado 4.4 de Resultados).
158
Resultados
Por todo ello postulamos que podría catalizar la oxidación de la 26-hidroxi-4-
colesten-3-ona a ácido 4-colesten-3-ona-26-oico (figura 5 de Introducción,
estructuras 5A y 6A).
La región situada desde el gen MSMEG_0302 al gen MSMEG_0310 incluye
8 genes organizados en 3 supuestos operones, i) MSMEG_0305_0304_0302, ii)
MSMEG_0306_0307_0308 y iii) MSMEG_0309_0310, de los cuales el primero y el
último poseen sitios de unión para KstR en las regiones que los preceden. En los
ensayos de expresión con microarrays aparecen inducidos en colesterol los genes
MSMEG_0304, MSMEG_0305 y MSMEG_0309. El producto del gen
MSMEG_0305 presenta similitud con aciltransferasas implicadas en la biosíntesis
de fosfolípidos; el gen MSMEG_0304 codifica una posible acil-CoA sintetasa y el
gen MSMEG_0302 codifica una posible esterasa. El gen MSMEG_0309 codifica
una proteína que tiene similitud con las 5-carboximetil-2-hidroximuconato
semialdehido deshidrogenasas y succinato-semialdehido deshidrogenasas, por lo
que podría participar en los pasos finales de degradación de colesterol a
succinato. El gen MSMEG_0310 codifica una proteína que presenta similitud con
la familia de las metiltransferasas S-adenosilmetionina dependientes (SAM o
AdoMet-MTase) de clase I.
El gen MSMEG_1098 (fadD18) codifica una acil-CoA sintetasa y el gen
MSMEG_1410 una deshidrogenasa/reductasa de cadena corta, y ambos podrían
estar implicados en la degradación de la cadena lateral del colesterol.
Los genes MSMEG_3515, MSMEG_3516 y MSMEG_3519 están bajo el
control de KstR y también aparecen inducidos en presencia de colesterol. Aunque
están localizados próximos en el cromosoma no forman parte de un operón, ya
que el gen MSMEG_3515 es divergente a los genes MSMEG_3516 y
MSMEG_3519. Se desconoce el papel que podrían jugar estos genes en la ruta
catabólica del colesterol. El gen MSMEG_3515 codifica una hidroxiesteroide
deshidrogenasa, el gen MSMEG_3516 una proteína hipotética conservada que
parece relacionada con la actividad dihidrodipicolinato reductasa que participa en
la biosíntesis de la lisina y el producto del gen MSMEG_3519 ha sido identificado
como una 2-nitropropano dioxigenasa (NDP), enzima implicada en la
desnitrificación oxidativa de nitroalcanos a sus correspondientes compuestos
159
Resultados
carbonilo y nitritos. NDP pertenece a la familia de las flavin oxidorreductasas
NADP(H)-dependientes. La mutación de este gen en M. smegmatis no altera la
capacidad de crecimiento en colesterol de la bacteria (véase el apartado 4.6 de
Resultados).
El posible operón formado por los genes MSMEG_3843_3844 también se
encuentra inducido en colesterol. El gen MSMEG_3843 presenta un dominio de
función desconocida, y el gen MSMEG_3844 podría estar relacionado con la
biosíntesis y degradación de polisacáridos y lipopolisacáridos de superficie.
El gen MSMEG_5228, que codifica una 3β-hidroxiesteroide
deshidrogenasa/isomerasa (3-β HSDMS) y que se ha estudiado en profundidad en
esta Tesis doctoral, se sitúa dentro de este conjunto de genes. Las observaciones
de que presente un motivo de unión para KstR y de que se induzca en colesterol
en los ensayos de expresión con microarrays apoyan su implicación directa en
esta ruta catabólica actuando en la transformación de colesterol en 4-colesten-3-
ona. Relacionado con este aspecto hay que señalar que se ha demostrado en este
trabajo que el gen MSMEG_5233, que codifica una deshidrogenasa de cadena
corta (SDRMS), puede también catalizar el paso de colesterol a 4-colesten-3-ona.
Además este gen presenta en la región que lo precede un motivo de unión para
KstR, aunque curiosamente este gen no se encuentra inducido en una cepa con el
regulador KstR delecionado (Kendall et al., 2007). Así mismo, este gen no aparece
inducido en colesterol en los ensayos de expresión con microarrays, aunque se
puede apreciar una ligera inducción en RTq-PCR (véase apartado 2.8.2 de
resultados) lo que sugiere que también podría estar directamente implicado en
esta ruta de degradación.
Por último, el gen MSMEG_5520, que codifica una proteína hipotética,
también se encuentra claramente inducido en colesterol.
160
Resultados
Tabla 18. Genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155 no incluidos en el cluster 1 o 2 y que se encuentran bajo el control del represor KstR. Columna 1. Anotación de los
genes de M. smegmatis mc2155 que presentan inducción en colesterol. Se seleccionaron aquellos
como mínimo más de 3 veces inducidos y con un valor máximo de P de 0,1, tras un análisis visual
previo de las imágenes escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se muestra el número de
veces que cada gen está inducido. Los valores marcados con un asterisco tienen un valor de P
ajustado (FDR) <0,05. Se marcan con una línea aquellos casos en los que los valores de inducción
no se ajustaban a los parámetros seleccionados y por tanto fueron descartados. Columna 3. Genes similares en M. tuberculosis H37Rv. Columna 4. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre
los genes de M. smegmatis y M. tuberculosis. Columna 5. Descripción de los productos de los
genes. Entre paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 6. Genes
similares en R. jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol (van der Geize et al.,
2007). Como se muestra en la tabla, no se halló ningún gen similar a los genes de Mycobacterium
en este microorganismo que estuviese inducido en colesterol en los microarrays.
_Proteína hipotética conservada 84Rv0953c16.77*MSMEG_5520
_3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa77Rv1106c5.01MSMEG_5228
_Proteína de transferencia de lípidos91Rv1627c5.52MSMEG_3844
_Proteína hipotética conservada 73Rv1628c9.3MSMEG_3843
_Oxidorreductasa, 2-nitropropano dioxigenasa89Rv1894c10.90MSMEG_3519
_Proteína hipotética conservada 60Rv0926c10.20MSMEG_3516
_3-α-(o 20-β)-hidroxiesteroide deshidrogenasa 60Rv200210.42MSMEG_3515
_Deshidrogenasa/reductasa de cadena corta 76Rv06879.25MSMEG_1410
_Acil-CoA sintasa (fadD8)80Rv0551c8.04MSMEG_1098
_Aldehido deshidrogenasa 68Rv0223c9.89MSMEG_0309
_Proteína de dominio aciltransferasa65Rv1428c18.89*MSMEG_0305
_Acil-CoA sintasa (fadD12)76Rv1427c8.61MSMEG_0304
_Esterasa (lipO)59Rv1426c_MSMEG_0302
_Alcohol deshidrogenasa B (adhE1)31Rv0162c22.92*MSMEG_0217
654321
_Proteína hipotética conservada 84Rv0953c16.77*MSMEG_5520
_3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa77Rv1106c5.01MSMEG_5228
_Proteína de transferencia de lípidos91Rv1627c5.52MSMEG_3844
_Proteína hipotética conservada 73Rv1628c9.3MSMEG_3843
_Oxidorreductasa, 2-nitropropano dioxigenasa89Rv1894c10.90MSMEG_3519
_Proteína hipotética conservada 60Rv0926c10.20MSMEG_3516
_3-α-(o 20-β)-hidroxiesteroide deshidrogenasa 60Rv200210.42MSMEG_3515
_Deshidrogenasa/reductasa de cadena corta 76Rv06879.25MSMEG_1410
_Acil-CoA sintasa (fadD8)80Rv0551c8.04MSMEG_1098
_Aldehido deshidrogenasa 68Rv0223c9.89MSMEG_0309
_Proteína de dominio aciltransferasa65Rv1428c18.89*MSMEG_0305
_Acil-CoA sintasa (fadD12)76Rv1427c8.61MSMEG_0304
_Esterasa (lipO)59Rv1426c_MSMEG_0302
_Alcohol deshidrogenasa B (adhE1)31Rv0162c22.92*MSMEG_0217
654321
Genes inducidos en colesterol que no presentan motivos de unión para KstR o KstR2 (Tabla 19)
Existen 37 genes a lo largo del genoma de M. smegmatis que presentan
inducción en colesterol en los microarrays pero que no están precedidos por
secuencias que puedan funcionar como operadores para los reguladores KstR o
161
Resultados
KstR2. Muchos de ellos parecen estar inducidos por una respuesta de estrés
general provocada por el cultivo del microorganismo en un medio que incluye un
compuesto altamente hidrofóbico como es el colesterol. Otros parecen poder
participar genuinamente en el catabolismo de este compuesto, y para otros su
posible función y el motivo de su inducción en colesterol es desconocido.
La región MSMEG_1203-1205-1206 incluye dos genes que forman un
posible operón (MSMEG_1205_1203) y poseen ortólogos en M. tuberculosis
(Rv0644c y Rv0645c, respectivamente) y el gen MSMEG_1206, situado a 220 bp
en la región 5’ de este operón, y que codifica una proteína hipotética sin ortólogo
en M. tuberculosis. La inducción del operón MSMEG_1205_1203 en presencia de
colesterol podría deberse a una respuesta a estrés, ya que los productos de
MSMEG_1203 y MSMEG_1205 pueden identificarse como una sintasa 1 de ácido
metoximicólico y una sintasa 1 de ciclopropano-acil-fosfolípido respectivamente, y
están muy probablemente implicadas en la biosíntesis de ácidos micólicos, que
podría ser necesaria para reparar el posible daño causado por el colesterol en la
pared celular micobacteriana.
Un caso diferente es el del gen MSMEG_1366 (mceG en M. tuberculosis),
muy probablemente implicado en el transporte del colesterol junto con el locus
mce, situado en otra región del genoma. Se ha postulado que el gen mceG
codifica una ATPasa responsable de aportar la energía necesaria para la
traslocación del colesterol (Pandey y Sassetti, 2008). En esta Tesis doctoral se ha
comprobado que un mutante en este gen tiene reducida drásticamente su
capacidad de crecimiento en colesterol (véase el apartado 4.2 de Resultados), por
lo que su implicación en esta ruta catabólica parece demostrada.
El gen MSMEG_1543 codifica una aldehido deshidrogenasa inducible por
EPTC (S-etil dipropiltiocarbamato). Un mutante en este gen no tiene alterada su
capacidad de crecimiento en colesterol (véase apartado 4.5 de resultados), por lo
que posiblemente se trate de un gen inducido por respuesta a estrés. Un supuesto operón que también parece inducido como consecuencia de
una respuesta a estrés es el constituido por los genes
MSMEG_1683_1682_1681_1680_1679_1677. Las proteínas codificadas por estos
genes no parecen estar en absoluto relacionadas con el catabolismo del
162
Resultados
colesterol: el gen MSMEG_1677 codifica una supuesta aspartato-amonio liasa, el
gen MSMEG_1679 una amidasa/aminoacilasa/carboxipeptidasa metal-
dependiente, el gen MSMEG_1680 una proteína de función desconocida, el gen
MSMEG_1681 un dominio conservado (que ha sido implicado en diferentes
funciones como la biosíntesis de isoleucina y purina, la degradación anaeróbica de
treonina y el mantenimiento del DNA mitocondrial), el gen MSMEG_1682 codifica
una supuesta flavoproteína implicada en el transporte del ión potasio y el gen
MSMEG_1683 una permeasa para citosina/purinas, uracilo, tiamina y alantoína.
El gen MSMEG_1786 codifica un supuesto dominio STAS (transportador de
sulfato y antagonista anti-sigma) que también podría inducirse en respuesta a
estrés.
Con respecto a los genes que parecen inducidos por una respuesta general a
estrés, es particularmente interesante el caso de un operón que codifica una
supuesta propano monooxigenasa multicomponente. Este operón contiene los
genes MSMEG_1971_1972_1973_1974, que son muy similares a los genes
prmABCD que codifican la propano monooxigenasa de Gordonia sp. cepa TY-5
(Kotani et al., 2003). Estos genes parecen formar un operón con cinco orfs
adicionales MSMEG_1975_1976_1977_1978_1979. El mismo operón ha sido
encontrado en R. jostii RHA1, y ha sido implicado en la degradación de N-
nitrosodimetilamina (Sharp et al., 2007). El gen MSMEG_1970 que codifica una
proteína similar a un factor sigma se localiza en sentido opuesto a este operón, y
también aparece inducido. Aunque los genes prmABCD parecen participar en el
metabolismo del propano, también están implicados en la respuesta a
condiciones de estrés (Sharp et al., 2007) y son capaces de hidroxilar otros
compuestos diferentes al propano (Shennan, 2006; Steffan et al., 1997). Por lo
tanto, hemos asumido que estos genes no están directamente implicados en el
metabolismo del colesterol sino que su inducción indica que las células se
encuentran bajo condiciones de estrés.
Otros genes de los que se desconoce su posible función en el catabolismo
del colesterol y que podrían estar inducidos como respuesta a estrés son: el gen
MSMEG_2303 (proteína hipotética conservada), el gen MSMEG_2514 (proteína
hipotética), el gen MSMEG_2663 (proteína hipotética conservada), el gen
163
Resultados
MSMEG_3164 (proteína hipotética), el operón formado por los genes
MSMEG_3330-3329-3328 (que codifica tres proteínas hipotéticas cortas, una de
ellas (el producto del gen MSMEG_3330) similar a la proteína CsbD bacteriana de
respuesta general a estrés), el gen MSMEG_3562 (proteína con dominio 4-
carboximuconolactona decarboxilasa PcaC), el gen MSMEG_4298 (3-metil-2-
oxobutanoato hidroximetiltransferasa, PanB), el gen MSMEG_4829 (citocromo
P450) y el gen MSMEG_5230 (proteína hipotética conservada).
La región MSMEG_3727 a MSMEG_3719 forma un supuesto operón que
incluye una posible deshidrogenasa que utiliza pirrolo-quinolina quinona (PQQ)
como cofactor (MSMEG_3726) similar a etanol, metanol y glucosa
deshidrogenasas. Los genes MSMEG_3725-3721 codifican las proteínas A, B, C,
D y E de biosíntesis de coenzima PQQ. Los genes MSMEG_3720 y
MSMEG_3719 codifican una supuesta proteína activadora de recombinación 1 y
un intercambiador de sodio/calcio, respectivamente. El papel de este operón en la
degradación del colesterol es desconocido en la actualidad.
Por último nos encontramos con el operón inducido en colesterol
MSMEG_6645_6646_6647_6648, que codifica enzimas similares a una 2-
metilcitrato deshidratasa (PrpD), una metilisocitrato liasa (PrpB), una citrato
sintasa (PrpC) y una piruvato carboxilasa (Pyc), respectivamente. Su inducción
sugiere que estos genes pueden estar implicados en el catabolismo del propionil
CoA (Pandey y Sassetti, 2008). A este respecto, es interesante comentar el papel
que la enzima Pyc podría desempeñar en este operón. Pyc transforma el piruvato
en oxalacetato, que puede ser condensado con propionil-CoA por PrpC para
formar 2-metilcitrato, el primer producto del ciclo del metilcitrato (Upton y
McKinney, 2007) (Fig. 49), lo que sugeriría que este operón ha evolucionado
específicamente para la degradación de colesterol. De acuerdo con esta hipótesis,
se ha descrito que las enzimas Prp de M. smegmatis son responsables de la
transformación del propionil-CoA en piruvato a través del ciclo del metilcitrato
(Upton and McKinney, 2007) pero es también cierto que M. smegmatis puede
crecer en propionato en ausencia de este operón usando los genes icl1 e icl2
(Upton and McKinney, 2007). Además, la presencia del gen pyc en este operón es
única para M. smegmatis, ya que en otros casos el operón prpBCD contiene un
164
Resultados
gen adicional prpE que codifica una propionil-CoA sintasa (Horswill y Escalante-
Semerena, 1999) que no se requiere en este caso porque el propionil-CoA es el
producto final de la ruta catabólica del colesterol junto con el piruvato. Por tanto,
dado que no se requiere una propionol-CoA sintasa, una rápida transformación de
piruvato en oxalacetato por Pyc debería reducir el tiempo de procesado del
propionil-CoA.
Propionil-CoA
Piruvato
Ciclo del metilcitrato
Oxalacetato
Propionato
Piruvato
2-metilisocitrato
2-metil-cis-aconitato
2-metilcitratoPrpD
Acn
Figura 49. Representación esquemática del catabolismo del propionil-CoA. Particularidades propuestas para M. smegmatis. En la bacteria M. smegmatis el catabolismo del colesterol tiene
como productos finales piruvato y propionil-CoA (señalados en azul). Los resultados obtenidos
mediante microarrays sugieren que una piruvato carboxilasa (Pyc) transforma el piruvato en
oxalacetato, que junto con el propionil-CoA entrarían en el ciclo del metilcitrato (cuyos
intermediarios y productos se señalan en verde) transformándose en 2-metilcitrato por la enzima
citrato sintasa (PrpC). El proceso metabólico seguiría a través de la enzima 2-metilcitrato
deshidratasa (PrpD), una enzima aconitasa (Acn) y la enzima metilisocitrato liasa (PrpB), que tiene
como productos piruvato y succinato. En el catabolismo del colesterol llevado a cabo por M.
smegmatis no es necesaria por tanto una enzima propionil CoA sintasa (PrpE) que transforme el
propionato (señalado en negro) en propionil CoA.
Utilizando este operón especializado, las células de M. smegmatis no
requieren un ciclo real de metilcitrato porque el propionil-CoA y el piruvato son
transformados directamente en piruvato y succinato a través de un proceso
metabólico único constituido por las enzimas PrpBCD, Pyc y una aconitasa Acn
adicional.
PrpE
Pyc
PrpC
Propionil-CoA
Piruvato
Ciclo del metilcitrato
Oxalacetato
Propionato
Succinato
PrpBPiruvato
2-metilisocitrato
2-metil-cis-aconitato
2-metilcitratoPrpD
Acn
PrpE
Pyc
PrpC
ColesterolColesterol
PrpB
Succinato
165
Resultados
_Piruvato carboxilasa (pyc) 80Rv2967c_MSMEG_6648
_Citrato sintasa 2 (prpC)79Rv1131_MSMEG_6647
_Metilisocitrato liasa (prpB) __13.92*MSMEG_6646
_2-metilcitrato deshidratasa 2 (prpD) 81Rv113011.35*MSMEG_6645
_Proteína hipotética conservada 34Rv1738 5.99MSMEG_5230
_Citocromo P450 32Rv0766c10.71MSMEG_4829
_3-metil-2-oxobutanoato hidroximetiltransferasa (panB)79Rv222510.23MSMEG_4298
_Proteína hipotética__20.09*MSMEG_3727
_Alcohol deshidrogenasa __12.00*MSMEG_3726
_Proteína A de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqA) __5.40MSMEG_3725
_Proteína B de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqB) __7.81MSMEG_3724
_Proteína C de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqC) __9.53MSMEG_3723
_Proteína bifuncional C/D de biosíntesis de coenzima PQQ ___MSMEG_3722
_Proteína E de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqE)___MSMEG_3721
_Proteína activadora de recombinación 1___MSMEG_3720
_Proteína intercambiadora de sodio/calcio___MSMEG_3719
_Proteína con dominio 4-carboximuconolactona descarboxilasa (pcaC)__11.88*MSMEG_3562
_Proteína hipotética conservada __9.66MSMEG_3330
_Proteína hipotética__8.10MSMEG_3329
_Proteína hipotética__5.70MSMEG_3328
_Proteína hipotética__13.15*MSMEG_3164
_Proteína hipotética conservada 41Rv1128c8.77MSMEG_2663
_Proteína hipotética conservada __7.49MSMEG_2514
_Transportador integral de membrana __10.39MSMEG_2303
ro00449Monooxigenasa de biosíntesis de antibiótico 58Rv111711.84*MSMEG_1979
ro00448Chaperonina GroL (groL)50Rv04406.61MSMEG_1978
ro00447Alcohol deshidrogenasa 29Rv22595.45MSMEG_1977
ro00446Proteína hipotética conservada __5.38MSMEG_1976
ro00445Amidohidrolasa 2 __4.80MSMEG_1975
ro00444Proteína de enganche de la propano monooxigenasa__6.33MSMEG_1974
ro00443Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad pequeña __4.64MSMEG_1973
ro00442 Metano monooxigenasa, componente C (reductasa)___MSMEG_1972
ro00441Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad grande __17.15*MSMEG_1971
ro00440Factor sigma__13.28*MSMEG_1970
_Posible dominio stas__10.97MSMEG_1786
_Proteína de la familia citosina/purina/uracilo/tiamina/alantoina permeasa25Rv3065 8.79MSMEG_1683
_Monooxigenase FMO contenedora de flavina__10.21MSMEG_1682
_Proteína de la superfamilia endorribonucleasa L-PSP 26Rv270412.05*MSMEG_1681
_AmiB46Rv3306c10.33MSMEG_1679
_Aspartato-amonio liasa (aspA)40Rv1098c_MSMEG_1677
_Aldehido deshidrogenasa eptc-inducible84Rv04588.07MSMEG_1543
_Transportador ABC, proteína de unión a ATP 79Rv06557.80MSMEG_1366
_Proteína hipotética__5.09MSMEG_1206
_Sintasa 1 de ciclopropano-graso-acil-fosfolípidos 61Rv0644c6.59MSMEG_1205
_Sintasa 1 de ácido metoxi micólico58Rv0645c7.08MSMEG_1203
654321
_Piruvato carboxilasa (pyc) 80Rv2967c_MSMEG_6648
_Citrato sintasa 2 (prpC)79Rv1131_MSMEG_6647
_Metilisocitrato liasa (prpB) __13.92*MSMEG_6646
_2-metilcitrato deshidratasa 2 (prpD) 81Rv113011.35*MSMEG_6645
_Proteína hipotética conservada 34Rv1738 5.99MSMEG_5230
_Citocromo P450 32Rv0766c10.71MSMEG_4829
_3-metil-2-oxobutanoato hidroximetiltransferasa (panB)79Rv222510.23MSMEG_4298
_Proteína hipotética__20.09*MSMEG_3727
_Alcohol deshidrogenasa __12.00*MSMEG_3726
_Proteína A de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqA) __5.40MSMEG_3725
_Proteína B de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqB) __7.81MSMEG_3724
_Proteína C de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqC) __9.53MSMEG_3723
_Proteína bifuncional C/D de biosíntesis de coenzima PQQ ___MSMEG_3722
_Proteína E de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqE)___MSMEG_3721
_Proteína activadora de recombinación 1___MSMEG_3720
_Proteína intercambiadora de sodio/calcio___MSMEG_3719
_Proteína con dominio 4-carboximuconolactona descarboxilasa (pcaC)__11.88*MSMEG_3562
_Proteína hipotética conservada __9.66MSMEG_3330
_Proteína hipotética__8.10MSMEG_3329
_Proteína hipotética__5.70MSMEG_3328
_Proteína hipotética__13.15*MSMEG_3164
_Proteína hipotética conservada 41Rv1128c8.77MSMEG_2663
_Proteína hipotética conservada __7.49MSMEG_2514
_Transportador integral de membrana __10.39MSMEG_2303
ro00449Monooxigenasa de biosíntesis de antibiótico 58Rv111711.84*MSMEG_1979
ro00448Chaperonina GroL (groL)50Rv04406.61MSMEG_1978
ro00447Alcohol deshidrogenasa 29Rv22595.45MSMEG_1977
ro00446Proteína hipotética conservada __5.38MSMEG_1976
ro00445Amidohidrolasa 2 __4.80MSMEG_1975
ro00444Proteína de enganche de la propano monooxigenasa__6.33MSMEG_1974
ro00443Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad pequeña __4.64MSMEG_1973
ro00442 Metano monooxigenasa, componente C (reductasa)___MSMEG_1972
ro00441Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad grande __17.15*MSMEG_1971
ro00440Factor sigma__13.28*MSMEG_1970
_Posible dominio stas__10.97MSMEG_1786
_Proteína de la familia citosina/purina/uracilo/tiamina/alantoina permeasa25Rv3065 8.79MSMEG_1683
_Monooxigenase FMO contenedora de flavina__10.21MSMEG_1682
_Proteína de la superfamilia endorribonucleasa L-PSP 26Rv270412.05*MSMEG_1681
_AmiB46Rv3306c10.33MSMEG_1679
_Aspartato-amonio liasa (aspA)40Rv1098c_MSMEG_1677
_Aldehido deshidrogenasa eptc-inducible84Rv04588.07MSMEG_1543
_Transportador ABC, proteína de unión a ATP 79Rv06557.80MSMEG_1366
_Proteína hipotética__5.09MSMEG_1206
_Sintasa 1 de ciclopropano-graso-acil-fosfolípidos 61Rv0644c6.59MSMEG_1205
_Sintasa 1 de ácido metoxi micólico58Rv0645c7.08MSMEG_1203
654321
166
Resultados
Tabla 19. Genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155 que no presentan motivos de unión para KstR o KstR2. Columna 1. Anotación de los genes de M. smegmatis mc2155 que
presentan inducción en colesterol. Se seleccionaron aquellos como mínimo más de 3 veces
inducidos y con un valor máximo de P de 0,1, tras un análisis visual previo de las imágenes
escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se muestra el número de veces que cada gen está
inducido. Los valores marcados con un asterisco tienen un valor de P ajustado (FDR) <0,05. Se
marcan con una línea aquellos casos en los que los valores de inducción no se ajustaban a los
parámetros seleccionados y por tanto fueron descartados. Columna 3. Genes similares en M.
tuberculosis H37Rv. Columna 4. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre los genes de M.
smegmatis y M. tuberculosis. Columna 5. Descripción de los productos de los genes. Entre
paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 6. Genes similares en R.
jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol (van der Geize et al., 2007).
Genes bajo el control de KstR que no se encuentran inducidos en
colesterol en nuestros experimentos (Tabla 20)
Por último, en este apartado se han querido reseñar aquellos genes situados
fuera de los clusters 1 y 2 que, pese a presentar un motivo de unión para KstR
precediéndolos y estar inducidos en una cepa con el regulador KstR delecionado
(Kendall et al., 2007) no aparecen inducidos en colesterol en los ensayos de
expresión con microarrays hibridados y analizados como parte del trabajo de esta
tesis doctoral, ni forman parte de un operón que aparezca inducido. Muchos de
estos genes codifican proteínas hipotéticas, por lo que su supuesta función en el
catabolismo del colesterol es desconocida. Sin embargo, hay una excepción
notable, el locus mce4, que está implicado en el transporte de colesterol (véase el
apartado 4 de Introducción), lo que ha sido confirmado en R. jostii RHA1 (Mohn et
al., 2008) y también en M. tuberculosis (Pandey y Sassetti, 2008). Este hecho
unido a la presencia de un motivo para unión de KstR precediendo este operón
hacía pensar que éste aparecería claramente inducido en colesterol, lo que
sorprendentemente, según el resultado obtenido en los microarrays, no sucede
(Tabla 20). Este locus mce4 se corresponde en M. smegmatis con los genes
MSMEG_5893-MSMEG_5902. Como en el caso de M. tuberculosis y R. jostii
RHA1, está formado por dos genes yrbE (denominados sup en Rhodococcus), que
167
Resultados
presentan homología con permeasas de transportadores ABC, y seis genes mce,
homólogos a proteínas de unión a sustrato. A continuación de lo genes mce se
sitúan dos genes conservados que codifican proteínas asociadas a mce (mas4A y
mas4B) (Casali y Riley, 2007) (Figura 50). Este operón se sitúa justo precediendo
el cluster 1 antes definido, lo que concuerda con su implicación en el catabolismo
de colesterol y nuevamente hace que el hecho de que no se induzcan estos genes
sea extraño. Para descartar que la técnica de microarrays no fuese
suficientemente sensible para captar la inducción de este operón, se llevó a cabo
la RTq-PCR de uno de los genes del operón, MSMEG_5895. Los resultados
mostraron que sí existe una inducción, aunque leve, de este gen (véase el
apartado 3.2, figura 51) que no se detecta por lo tanto mediante la técnica de
microarrays.
168
Resultados
_Proteína hipotética conservada 71Rv0138MSMEG_6475
_Oxidorreductasa67Rv0139MSMEG_6474
ro04696Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4A)90Rv3501cMSMEG_5902
ro04697Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4B)92Rv3500cMSMEG_5901
ro04698Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4A)67Rv3499cMSMEG_5900
ro04699Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4B)67Rv3498cMSMEG_5899
ro04700Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4C)65Rv3497cMSMEG_5898
ro04701Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4D)63Rv3496cMSMEG_5897
ro04702Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4E)63Rv3495cMSMEG_5896
ro04703Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4F)65Rv3494cMSMEG_5895
ro04704 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4A)60Rv3493cMSMEG_5894
ro04705 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4B)58Rv3492cMSMEG_5893
_Proteína hipotética conservada 75Rv0926cMSMEG_5586
_Deshidrogenasa de cadena corta81Rv0927cMSMEG_5584
_Proteína hipotética conservada 80Rv0940cMSMEG_5555
_Supuesto regulador de respuesta anti-terminador__MSMEG_5554
_Monooxigenasa__MSMEG_5519
_Dihidrodipicolinato reductasa (dapB) 71Rv1059MSMEG_5286
_Proteína hipotética conservada 72Rv1132MSMEG_5202
_Proteína hipotética conservada __MSMEG_3658
_Proteína hipotética conservada 49Rv2668MSMEG_2790
_Acetiltransferasa, familia GNAT 60Rv2669MSMEG_2789
_Proteína hipotética conservada 61Rv2799MSMEG_2645
_Supuesta hidrolasa64Rv2800MSMEG_2644
54321
_Proteína hipotética conservada 71Rv0138MSMEG_6475
_Oxidorreductasa67Rv0139MSMEG_6474
ro04696Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4A)90Rv3501cMSMEG_5902
ro04697Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4B)92Rv3500cMSMEG_5901
ro04698Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4A)67Rv3499cMSMEG_5900
ro04699Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4B)67Rv3498cMSMEG_5899
ro04700Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4C)65Rv3497cMSMEG_5898
ro04701Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4D)63Rv3496cMSMEG_5897
ro04702Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4E)63Rv3495cMSMEG_5896
ro04703Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4F)65Rv3494cMSMEG_5895
ro04704 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4A)60Rv3493cMSMEG_5894
ro04705 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4B)58Rv3492cMSMEG_5893
_Proteína hipotética conservada 75Rv0926cMSMEG_5586
_Deshidrogenasa de cadena corta81Rv0927cMSMEG_5584
_Proteína hipotética conservada 80Rv0940cMSMEG_5555
_Supuesto regulador de respuesta anti-terminador__MSMEG_5554
_Monooxigenasa__MSMEG_5519
_Dihidrodipicolinato reductasa (dapB) 71Rv1059MSMEG_5286
_Proteína hipotética conservada 72Rv1132MSMEG_5202
_Proteína hipotética conservada __MSMEG_3658
_Proteína hipotética conservada 49Rv2668MSMEG_2790
_Acetiltransferasa, familia GNAT 60Rv2669MSMEG_2789
_Proteína hipotética conservada 61Rv2799MSMEG_2645
_Supuesta hidrolasa64Rv2800MSMEG_2644
54321
Tabla 20. Genes bajo el control de KstR que no se encuentran inducidos en colesterol en nuestros experimentos de expresión diferencial mediante microarrays. Columna 1. Anotación
de los genes de M. smegmatis mc2155 que no presentan inducción en colesterol significativa en los
microarrays (menos de 3 veces inducidos y/o con un valor de P > 0,1) pero sí presentan un motivo
de unión para KstR precediendo su secuencia. Columna 2. Genes similares en M. tuberculosis
H37Rv. Columna 3. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre los genes de M. smegmatis y M.
tuberculosis. Columna 4. Descripción de los productos de los genes. Entre paréntesis se indica, de
tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 5. Genes similares en R. jostii RHA1 que también
presentan inducción en colesterol (van der Geize et al., 2007) (a excepción de los genes seguidos
de las siglas NI, que indican que no están inducidos en colesterol).
169
Resultados
Figura 50. Representación esquemática del locus mce4. Se representa la disposición en el
genoma de M. tuberculosis, M. smegmatis y R. jostii RHA1 de este operón. La nomenclatura de los
genes se sitúa por encima de los mismos. Los números que se muestran por debajo de los genes
señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los números entre corchetes indican separación
y los números entre paréntesis solapamiento. Los números que aparecen sobre las líneas en
diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que se encuentran las distintas
agrupaciones génicas.
Rhodococcus jostii RHA1
04697 04698 04699 04700 04701 04702 04703 04704 04705
4960
04696
[20] [12] [2] [2] (3) (4) (4) (4) (4)
4949 supA supB mce4A mce4B mce4C mce4D mce4E mce4F mas4A mas4B
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
3921
3492c 3493c 3494c 3495c 3496c 3497c 3498c 3499c 3500c 3501c
[1] (0) [11] (3) (3) (10) [3] [20] [34]
3910 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A
Mycobacterium smegmatis mc²155
5964
5893 5895 5896 5897 5898 5899 5900 5901 59025894
(0) [68] (0) [59] (4) (8) (0) [6] [34]
5952 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A
Rhodococcus jostii RHA1
04697 04698 04699 04700 04701 04702 04703 04704 04705
4960
04696
[20] [12] [2] [2] (3) (4) (4) (4) (4)
4949 supA supB mce4A mce4B mce4C mce4D mce4E mce4F mas4A mas4B
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
3921
3492c3492c 3493c3493c 3494c3494c 3495c3495c 3496c3496c 3497c3497c 3498c3498c 3499c3499c 3500c3500c 3501c3501c
[1] (0) [11] (3) (3) (10) [3] [20] [34]
3910 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A
Mycobacterium smegmatis mc²155
5964
58935893 58955895 58965896 58975897 58985898 58995899 59005900 59015901 5902590258945894
(0) [68] (0) [59] (4) (8) (0) [6] [34]
5952 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A
3.2 Validación de los resultados de expresión obtenidos con los microarrays mediante RTq-PCR de diversos genes
Los análisis de expresión diferencial en colesterol mediante microarrays
fueron validados para 12 de los genes mediante retrotranscripción-PCR en tiempo
real (cuantitativa) (RTq-PCR) (véanse los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y
Métodos). Dentro de los genes así analizados se encuentra un gen que presenta
una inducción elevada en colesterol en los microarrays (MSMEG_0217), seis
170
Resultados
genes con una inducción más discreta (MSMEG_1366, MSMEG_5906,
MSMEG_5228, MSMEG_5925, MSMEG_6009, MSMEG_6036) y cinco genes que
no presentaron inducción en colesterol a pesar de estar precedidos por
secuencias de unión a KstR o dentro de operones inducidos (MSMEG_5895,
MSMEG_5920, MSMEG_6012, MSMEG_6039 y MSMEG_6041) (Figura 51). Los
resultados indicaron que todos los genes que muestran inducción en colesterol
mediante microarrays también la muestran mediante RTq-PCR, siendo el gen
MSMEG_0217 el que presenta unos niveles más elevados de inducción (Figura
52). Con respecto a los genes que no presentan inducción en colesterol en los
microarrays, se comprobó que en tres de ellos esta inducción sin embargo existe,
como se esperaba en un principio (MSMEG_6012, MSMEG_6039 y
MSMEG_6041, que se inducen en colesterol respecto a en glicerol 9,7, 3,6 y 9
veces respectivamente). En los otros dos (MSMEG_5895 y MSMEG_5920) se
corrobora sin embargo una inducción bastante más leve (1,6 y 1,9 veces,
respectivamente) que por lo tanto no fue detectada en los microarrays.
171
Resultados
Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
MSMEG_1
366
MSMEG_5
906
MSMEG_5
228
MSMEG_5
895
MSMEG_5
920
MSMEG_5
925
MSMEG_6
009
MSMEG_6
012
MSMEG_6
036
MSMEG_6
039
MSMEG_6
041
Nive
l de
trans
crip
ción
(ng
de tr
ánsc
rito)
ColesterolGlicerol
Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18
mM
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
MSMEG_021
7
Niv
el d
e tr
ansc
ripci
ón (n
g de
trán
scrit
o)
Colesterol
Glicerol
Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
MSMEG_1
366
MSMEG_5
906
MSMEG_5
228
MSMEG_5
895
MSMEG_5
920
MSMEG_5
925
MSMEG_6
009
MSMEG_6
012
MSMEG_6
036
MSMEG_6
039
MSMEG_6
041
Nive
l de
trans
crip
ción
(ng
de tr
ánsc
rito)
ColesterolGlicerol
Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18
mM
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
MSMEG_021
7
Niv
el d
e tr
ansc
ripci
ón (n
g de
trán
scrit
o)
Colesterol
Glicerol
Figura 51. Expresión diferencial obtenida mediante RTq-PCR de los genes seleccionados de M. smegmatis mc2155 crecido en colesterol 1,8 mM comparado con M. smegmatis mc2155 crecido en glicerol 18 mM. Los niveles de transcripción se midieron mediante RTq-PCR como se
describe en los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos. Las barras de error representan la
desviación estándar calculada. Los niveles de transcripción del gen MSMEG_0217 se muestran
separadamente, ya que son significativamente mayores que el del resto de los genes. Los valores
de P del test t de Student no pareado fueron menores de 0,05 en todos los casos excepto para los
genes MSMEG_5895 y MSMEG_5920 (datos no mostrados).
4. Estudio mediante mutagénesis insercional de diversos genes implicados en el catabolismo del colesterol
Para validar los datos obtenidos mediante RT-PCR y también los datos de
expresión diferencial en colesterol/glicerol de M. smegmatis mc2155 obtenidos
mediante microarrays, se llevó a cabo la mutagénesis insercional de distintos
genes probablemente implicados en la degradación del colesterol. Los mutantes
se obtuvieron mediante interrupción del gen de interés utilizando el plásmido
suicida pJQ200x (véase apartado 4.6 de Materiales y Métodos). Posteriormente
los mutantes así obtenidos fueron cultivados en medio mínimo con colesterol 1,8
172
Resultados
mM en β-ciclodextrina como única fuente de carbono y se comparó su crecimiento
con el de la cepa no mutada.
Como se verá a continuación los resultados obtenidos indican que para la
mayoría de los genes analizados la capacidad o la velocidad de crecimiento en
colesterol de M. smegmatis mc2155 se encuentra atenuada cuando éstos son
mutados, lo que apoya una implicación directa en su catabolismo.
4.1 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_6036
El gen MSMEG_6036 es ortólogo al gen tesB de C. testosteroni (Horinouchi
et al., 2001) en M. smegmatis mc2155. El gen correspondiente en R. erythropolis
(van der Geize et al., 2007) y en M. tuberculosis (Yam et al., 2009) se denomina
hsaC. La proteína codificada por este gen está anotada en M. smegmatis mc2155
como una bifenil-2,3-diol-1,2-dioxigenasa por su similitud con estradiol
dioxigenasas que catalizan la apertura de 2,3-dihidroxibifenilo, pero su principal
función, como en el caso de los microorganismos anteriormente expuestos, sería
la apertura meta de 3,4-DHSA para producir 4,9-DSHA (Figura 5 de introducción,
intermediarios (12) y (13)). En estos microorganismos se ha comprobado que la
mutación de este gen conlleva efectivamente la acumulación de 4,9-DSHA y
disminuye en gran medida la capacidad de crecimiento en colesterol. Así mismo,
los mutantes presentan un rasgo fenotípico característico, que es la coloración
rojiza que producen en el medio cuando crecen en colesterol. El color rojizo se
aprecia a menudo cuando se acumulan derivados catecólicos durante la
degradación microbiana de compuestos aromáticos, debido a que el catecol se
oxida para producir derivados quinónicos que confieren un color rojizo oscuro al
medio (Horinouchi et al., 2004a). En el caso de M. smegmatis mc2155 nuestros
resultados demuestran que la mutación del gen MSMEG_6036 conlleva
efectivamente una disminución notable en el crecimiento en colesterol (Figura 52),
así como la aparición de una coloración rojiza en colesterol 1,8 mM a partir de las
48 horas de cultivo (Figura 53).
173
Resultados
Figura 52. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_6036 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina
como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_6036 (línea naranja) representa a M. smegmatis
mc2155 con el gen MSMEG_6036 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis
mc²155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_6036
0,01
0,1
1
10
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
DO
600 M. smegmat is mc²155
M. smegmat is::MSMEG_6036
Estos resultados apoyan los obtenidos por RT-PCR (véase apartado 1.3 de
Resultados) y microarrays (véase apartado 3.1 de Resultados, tabla 16), por lo
que se ha confirmado el papel del producto del gen MSMEG_6036 en la ruta de
degradación del colesterol.
174
Resultados
A B
Figura 53. Coloración del medio con colesterol producida por el mutante M. smegmatis::MSMEG_6036.
A. Cultivo del mutante M. smegmatis::MSMEG_1366 en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina de 96
horas. B. Cultivo de 96 horas de la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
4.2 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1366
Como se ha comentado en la introducción (apartado 4), el locus mce4 parece
ser el responsable del transporte de colesterol en distintas actinobacterias. En M.
smegmatis mc2155 el locus mce4 se corresponde, por homología de secuencia
con M. tuberculosis, con los genes MSMEG_5893-MSMEG_5902, siendo el grado
de similitud muy elevado (véase apartado 3.1 de Resultados, tabla 19). La ATPasa
mceG de M. tuberculosis se corresponde así mismo con el gen MSMEG_1366.
Este gen aparece inducido en los microarrays de expresión diferencial en
colesterol/glicerol (véase apartado 3.1 de resultados), lo que apoya su
participación en el transporte de colesterol. La interrupción de este gen con el
plásmido suicida pJQ200x conlleva una reducción drástica en la capacidad de
crecimiento en colesterol de M. smegmatis mc2155 (Figura 54). A diferencia de lo
que sucede en M. tuberculosis (Pandey y Sassetti, 2008), la capacidad de
175
Resultados
crecimiento en colesterol parece no recuperarse con el tiempo; el aumento en la
DO600 que puede ser atribuido al colesterol a las 98 h es de aproximadamente 0,3
unidades, una vez que se resta el crecimiento facilitado por la presencia de β-
ciclodextrina. Sin embargo, al tratarse de una micobacteria de crecimiento rápido
es difícil equiparar este resultado al obtenido para M. tuberculosis, ya que el
tiempo final difiere en ambos experimentos.
Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_1366
0,01
0,1
1
10
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
DO
600
mc2 155
M. smegmat is::MSMEG_1366
Figura 54. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_1366 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina
como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_1366 (línea naranja) representa a M. smegmatis
mc2155 con el gen MSMEG_1366 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis
mc²155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
Tras estos resultados, nos propusimos investigar si el colesterol podría ser
transportado al interior de la micobacteria por algún otro sistema alternativo si se
suministra energía al sistema de transporte a partir de otra fuente de carbono
distinta del colesterol. Para ello M. smegmatis fue cultivado en glicerol 5 mM al
que se añadió colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como inductor o β-ciclodextrina
únicamente como control. Los resultados indicaron que el mutante crecía en
medio con glicerol y colesterol hasta una DO600 próxima a 2 a las 135 h, mientras
que el medio sin colesterol en estas condiciones alcanzaba una DO600 de 0,8
(Figura 55). El valor de la DO600 alcanzado en el medio con glicerol y colesterol
comparado con el valor alcanzado en medio con glicerol es mayor al esperado
176
Resultados
teniendo en cuenta el comportamiento del mutante en medio sólo con colesterol.
En el caso del colesterol era de 0,3 unidades y con glicerol y colesterol el
aumento de DO600 atribuido al crecimiento en colesterol a las 98 h es
aproximadamente el doble, es decir de 0,6 unidades. Este hecho podría deberse a
que al disponer de una fuente de carbono adicional, el mutante puede utilizar la
energía obtenida para activar otro/s sistema/s de transporte capaces de
transportar colesterol. Esta hipótesis está en proceso de estudio en nuestro
laboratorio. Figura 55. Diferencia de crecimiento de M. smegmatis::MSMEG_1366 en glicerol 5mM con/sin colesterol 1,8 mM. Crecimiento del mutante M. smegmatis::MSMEG_1366 en medio
mínimo 457 con glicerol 5mM y colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como fuente de carbono (línea
rosa) o con glicerol 5 mM en β-cilcodextrina (línea azul). Los resultados mostrados son la media de
tres experimentos independientes.
Crecimiento en glicerol +/- colesterol de M. smegmatis ::MSMEG_1366
0,01
0,1
1
10
0 50 100 150
Tiempo (h)
DO
600 Glicerol
Glicerol +Colesterol
4.3 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_5995
El gen MSMEG_5995 se encuentra en una región del genoma delimitada por
los genes MSMEG_5990 y MSMEG_6004 cuyos genes se inducen en colesterol,
como indican los resultados obtenidos mediante RT-PCR (véase apartado 1.3 de
177
Resultados
Resultados) y mediante microarrays (véase apartado 3.1 de Resultados, tabla 16).
Aun así, hasta hace muy poco tiempo no se había empezado a dilucidar la posible
función de ninguno de estos genes en la ruta de degradación del colesterol. Como
se comentó en la introducción, estudios muy recientes han demostrado que la
proteína codificada por el gen ro04679 de R. jostii RHA1 (Rosłoniec et al., 2009),
que codifica el citocromo P450 125 (Cyp125), así como su homóloga en M.
tuberculosis H37Rv, codificada por el gen Rv3545c (Capyk et al., 2009b), son
responsables del primer paso de hidroxilación de la cadena lateral del colesterol.
El supuesto gen ortólogo de ro04679 y Rv3545c en M. smegmatis es
MSMEG_5995, cuyo producto presenta una identidad del 75% (cuantificado por
ClustalW) con el del gen de M. tuberculosis.
Como se puede apreciar en la figura 56, la mutagénesis insercional de
MSMEG_5995 produce una reducción drástica del crecimiento en colesterol.
Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_5995
0,01
0,1
1
10
0 20 40 60
Tiempo (h)
DO
600
M. smegmat is mc²155
M. smegmat is::MSMEG_5995
Figura 56. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5995 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina
como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_5995 (línea naranja) representa a M. smegmatis
mc2155 con el gen MSMEG_5995 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis
mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
Los mutantes de R. jostii RHA1 y M. bovis BCG en el gen ortólogo también
pierden la capacidad de crecimiento en colesterol (Capyk et al., 2009; Rosłoniec et
al., 2009), pero curiosamente, M. tuberculosis crece perfectamente en colesterol
178
Resultados
cuando se deleciona el gen Rv3545c. La explicación más probable es que exista
una enzima que complementa la pérdida de Cyp125.
Se ha observado que existen tres genes que están presentes en el genoma
de H37Rv pero no en el de M. bovis que codifican monooxigenasas que parecen
implicadas en patogénesis (Rv1256c, Rv3121 y Rv3618) y se postula que alguno
de ellos podría complementar a cyp125 en H37Rv (Capyk et al., 2009). Para
comprobar si M. smegmatis mc2155 poseía ortólogos a estos genes, se hicieron
comparaciones in silico y se encontraron dos genes con elevada similitud con
Rv1256c y Rv3618 (Tabla 21). El gen Rv3121 no tiene un claro ortólogo en M.
smegmatis; la proteína más similar, denominada FAS1, a pesar de codificar
también un citocromo P450, presenta sólo una similitud del 28% (cuantificado por
ClustalW).
81Limoneno 1,2monooxigenasa
MSMEG_6107Limonenomonooxigenasa
Rv3618
28Citocromo P450 FAS1
MSMEG_0762Citocromo P450Cyp141
Rv3121
77Posible citocromoP450 Cyp123
MSMEG_5038Citocromo P450Cyp130
Rv1256c
% ClustalWFunciónGen M. smegmatismc2155
FunciónGen M. tuberculosis
81Limoneno 1,2monooxigenasa
MSMEG_6107Limonenomonooxigenasa
Rv3618
28Citocromo P450 FAS1
MSMEG_0762Citocromo P450Cyp141
Rv3121
77Posible citocromoP450 Cyp123
MSMEG_5038Citocromo P450Cyp130
Rv1256c
% ClustalWFunciónGen M. smegmatismc2155
FunciónGen M. tuberculosis
Tabla 21. Comparación de secuencias de monooxigenasas de M. tuberculosis H37Rv vs M. smegmatis mc2155.
El hecho de que R. jostii RHA1 tampoco posea ningún claro gen ortólogo a
Rv3121 (Tabla 22) puede apoyar que Rv3121 podría efectivamente codificar la
enzima que complementa la actividad de Cyp125 en M. tuberculosis.
179
Resultados
Tabla 22. Comparación de secuencias de monooxigenasas de M. tuberculosis H37Rv vs R.
jostii RHA1.
40Monooxigenasaro00392Limonenomonooxigenasa
Rv3618
29Citocromo P450Cyp105
ro02604Citocromo P450Cyp141
Rv3121
69Citocromo P450Cyp130
ro05719Citocromo P450Cyp130
Rv1256c
% ClustalWFunciónGen R. jostii RHA1FunciónGen M.tuberculosis
40Monooxigenasaro00392Limonenomonooxigenasa
Rv3618
29Citocromo P450Cyp105
ro02604Citocromo P450Cyp141
Rv3121
69Citocromo P450Cyp130
ro05719Citocromo P450Cyp130
Rv1256c
% ClustalWFunciónGen R. jostii RHA1FunciónGen M.tuberculosis
4.4 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_0217
El gen MSMEG_0217 es uno de los más interesantes hallados mediante
análisis de expresión diferencial en colesterol mediante microarrays (véase
apartado 3.1 de Resultados, tabla 18). La inducción en colesterol de este gen es
muy clara, tanto en microarrays como en RT-PCR cuantitativa, y su expresión está
sujeta al control del represor transcripcional KstR (Kendall et al., 2007). Este gen
es muy similar a genes implicados en la oxidación de alcoholes primarios y
aldehídos y es un candidato claro para ser el responsable de la transformación de
26-hidroxi-4-colesten-3-ona en ácido 4-colesten-3-ona-26-oico (estructuras (5A) y
(6A) de la figura 5 de introducción). El mutante por inserción de pJQ200x crece
lentamente en colesterol durante las primeras 50 horas de cultivo, llegando a
DO600 entre 0,6-0,8 a las 48 horas, mientras que la cepa salvaje alcanza en ese
intervalo una DO600 próxima a 2 (Figura 57). Además, el cultivo presenta un
fenotipo característico a partir de las 35-40 h, cuando las células comienzan a
formar agregados. A tiempos más largos, la capacidad de crecer se recupera, y se
ha comprobado que a estos tiempos se ha producido la reversión de la
recombinación homóloga y se puede detectar mediante RT-PCR el gen completo
no mutado en el genoma (resultados no mostrados). Debido a la inestabilidad de
este mutante, en el presente se está construyendo en nuestro laboratorio el
mutante por deleción para posteriores estudios, dado que los resultados hallados
180
Resultados
con el mutante por inserción resultan prometedores y parecen apoyar la
implicación directa de este gen en la ruta de degradación de colesterol.
Figura 57. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_0217 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina
como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_0217 (línea naranja) representa a M. smegmatis
mc2155 con el gen MSMEG_0217 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis
mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_0217
0,01
0,1
1
10
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
DO
600
M. smegmat is mc²155
M. smegmat is::MSMEG_0217
4.5 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1543
El gen MSMEG_1543, que codifica una aldehído deshidrogenasa inducible
por EPTC (S-etil dipropiltiocarbamato) aparece inducido en los microarrays de
colesterol frente a glicerol (véase apartado 3.1 resultados, tabla 19). Este gen no
parece estar regulado por KstR1 o KstR2 por lo que se postula que su inducción
puede estar relacionada con una respuesta a estrés producida por el colesterol. La
interrupción del gen mediante la inserción de pJQ200x no altera el crecimiento en
colesterol (Figura 58), lo que apoya esta hipótesis.
181
Resultados
Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_1543
0,01
0,1
1
10
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
DO
600
M. smegmat is mc²155
M. smegmat is::MSMEG_1543
Figura 58. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_1543 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina
como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_1543 (línea naranja) representa a M. smegmatis
mc2155 con el gen MSMEG_1543 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis
mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
4.6 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_3519
El producto de MSMEG_3519, un gen inducido diferencialmente en colesterol
(véase apartado 3.1 de resultados, tabla 18), ha sido identificado como una 2-
nitropropano dioxigenasa (NDP), una de las enzimas oxidantes de nitroalcanos,
que catalizan la desnitrificación oxidativa de nitroalcanos a compuestos
carbonílicos y nitritos. NDP es un miembro de la familia de las flavin
oxidoreductasas NAD(P)H-dependientes. Este gen así como algunos genes
adyacentes (MSMEG_3515, MSMEG_3516) parecen estar bajo el control de
KstR1 (Kendall et al., 2007). Sin embargo, la interrupción del gen MSMEG_3519
no produce una disminución en el crecimiento de M. smegmatis en colesterol
(Figura 59), lo que podría indicar que, en caso de que este gen efectivamente
participe en la degradación del colesterol, podría ser complementado por otro gen
alternativo.
182
Resultados
Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_3519
0,01
0,1
1
10
0 50 100
Tiempo (h)
DO
600
M. smegmat is mc²155
M. smegmat is::MSMEG_3519
Figura 59. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_3519 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina
como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_3519 (línea naranja) representa a M. smegmatis
mc2155 con el gen MSMEG_3519 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis
mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.
5. Introducción al estudio de la regulación transcripcional del catabolismo del colesterol por las proteínas represoras KstR y KstR2
Como se ha visto en el apartado 3 de esta sección de Resultados, gran parte
de los genes que se han relacionado con el catabolismo del colesterol en M.
smegmatis mc2155 están regulados por alguno de los dos represores descritos
hasta la fecha: KstR (Kendall et al., 2007) o KstR2 (Kendall et al., 2010). Ambos
pertenecen a la familia de reguladores transcripcionales TetR, una familia bien
representada y ampliamente distribuida entre las bacterias, cuyos miembros
presentan un motivo de unión a DNA hélice-giro-hélice (HTH) (Ramos et al.,
2005). Para ambos reguladores se han identificado secuencias de unión en la
región 5’ de distintos genes y operones en M. smegmatis mc2155,
aproximadamente 32 secuencias para KstR y 3 para KstR2. En el caso de KstR,
se ha podido demostrar su unión a la región 5’ del gen KstR en M. tuberculosis
183
Resultados
(Kendall et al., 2007). En el caso de KstR2, se ha demostrado su unión a tres
regiones con secuencias consenso en M. tuberculosis (Kendall et al., 2010).
En este apartado se presentan los resultados de los estudios llevados a cabo
sobre algunos aspectos funcionales de ambos reguladores.
5. 1 Ensayos de crecimiento con los mutantes de los reguladores KstR y KstR2
Para comenzar el estudio de estos reguladores, se analizó el efecto que
tienen sobre el crecimiento de M. smegmatis mc2155 distintos mutantes en los
genes reguladores. Estos mutantes se construyeron mediante deleción (Kendall et
al., 2007; Kendall et al., 2010) y actualmente se dispone de tres mutantes: M.
smegmatisΔkstR, M. smegmatisΔkstR2 y M. smegmatisΔkstR/ΔkstR2, que
corresponden respectivamente a un mutante en el gen kstR (ΔkstR), otro en el
gen kstR2 (ΔkstR2), y un tercer mutante doble que posee los dos genes
reguladores delecionados (ΔkstR/ΔkstR2). Se comparó el crecimiento de estos
tres mutantes en un medio con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como fuente
de carbono frente al crecimiento de la cepa salvaje. Dado que en los tres mutantes
se encuentran desreprimidos un gran número de genes relacionados con el
catabolismo del colesterol, se podría esperar un aumento en la capacidad o
velocidad de crecimiento en colesterol en los mismos, pero no se encontraron
diferencias respecto a la cepa control en ninguno de ellos. (Figura 60). Este
resultado parece indicar que KstR y KstR2 dejan de ejercer su acción represora de
manera rápida cuando existe colesterol en el medio. Por este motivo no se
aprecian diferencias en el crecimiento de la cepa salvaje en colesterol respecto a
los mutantes en estos reguladores.
184
Resultados
0,01
0,1
1
0 50 100 150
Tiempo (h)
DO
600
mc²155
ΔkstR
ΔkstR2
ΔkstR/kstR2
Figura 60. Crecimiento en colesterol 1,8 mM-ciclodextrina de los distintos mutantes en los reguladores KstR y KstR2 frente al crecimiento de la cepa M. smegmatis mc2155. Como se
puede observar en la gráfica, no se aprecian diferencias en la capacidad o velocidad de
crecimiento en colesterol de los distintos mutantes KstR y KstR2 frente a la cepa salvaje M. smegmatis mc2155.
5.2 Introducción al estudio del represor transcripcional KstR
El regulador KstR perteneciente a la familia TetR está implicado en el control
directo de 83 genes en M. smegmatis y de 74 en M. tuberculosis (Kendall et al.,
2007). En un primer momento, se apuntó que estos genes podrían estar
implicados en la utilización de diversos lípidos, no solo el colesterol, como fuente
de energía (Kendall et al., 2007). Los resultados presentados en el apartado 3 de
esta sección sin embargo sugieren que el colesterol por sí solo es capaz de
producir la inducción de la gran mayoría de ellos. Parece que, para ejercer su
acción represora, KstR se une a un motivo conservado (TnnAACnnGTTnnA) que
ha sido localizado en su propio promotor y en 31 regiones intergénicas del
genoma de M. smegmatis que preceden a un gran número de genes y operones
relacionados con el catabolismo del colesterol (Kendall et al., 2007). Se ha
comprobado que la proteína KstR de M. tuberculosis (KstRMtb) se une a una sonda
185
Resultados
de DNA que contiene este motivo conservado de su región promotora (Kendall et
al., 2007). Así mismo, se comprobó mediante cromatografía de exclusión
molecular (SEC) que la unión a DNA se lleva a cabo como un dímero (Kendall et
al., 2007).
Con el fin de estudiar la regulación mediada por la proteína KstR de M.
smegmatis (KstRMsm), se procedió a la clonación del gen kstR y a la realización de
distintos ensayos in vitro para estudiar la interacción de KstR con sus regiones
operadoras. Para ello se eligió la región que precede al gen MSMEG_5228, uno
de los genes pertenecientes al regulón de KstR (Kendall et al., 2007) que codifica
la 3-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3-β HSDMS) ampliamente estudiada en
este trabajo y de la que se ha comprobado su capacidad de catalizar el primer
paso en el catabolismo del colesterol, la transformación del colesterol en 4-
colesten-3-ona (apartado 2 de Resultados).
5.2.1 Caracterización del promotor P5228
El gen MSMEG_5228 codifica la proteína 3-β HSDMS responsable (como se
ha demostrado en este trabajo) de realizar el primer paso de la ruta de
degradación del colesterol. El promotor de dicho gen, P5228, contiene una probable
secuencia operadora para el regulador KstR (Kendall et al., 2007) aunque hasta la
fecha no se había demostrado experimentalmente. Con el fin de caracterizar el
promotor P5228, se realizó una fusión de la región promotora (situada entre los
genes MSMEG_5227 y MSMEG_5228) con el gen marcador lacZ. El fragmento
que portaba la región promotora se amplificó por PCR a partir de DNA
cromosómico utilizando los oligonucleótidos 5228pUJ9 F y 5228pUJ9 R. El
fragmento amplificado de 191 pb se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y
BamHI y se clonó en el plásmido pUJ9. El plásmido resultante pUJ9-5228 se
secuenció para confirmar que la secuencia de nucleótidos del fragmento clonado
era la correcta (Fig. 61 B).
186
Resultados
5.2.1.1 Identificación del sitio de inicio de la transcripción del promotor P5228
Para determinar el sitio de inicio de la transcripción se utilizó la técnica de
extensión del cebador o primer extension utilizando el oligonucleótido Lac57 y
como molde el plásmido pUJ9-5228. Como resultado se obtuvo una monohebra
de cDNA cuyo tamaño coincidía con el tránscrito debido al promotor P5228.
Sorprendentemente se comprobó que la transcripción comienza en el codón de
iniciación (ATG) de la traducción del gen MSMEG_5228 (Fig 61 A). Este resultado
indica que por la posición del inicio el mRNA transcrito a partir de P5228 es un
mRNA denominado leaderless, es decir, un mRNA que carece de la región 5’ no
traducida (5’UTR) que normalmente contiene la secuencia Shine-Dalgarno (SD)
(Moll et al., 2002). Justo aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción se
encuentra una posible caja −10 (TATGCT) cuya secuencia se ha reconocido en
micobacterias (Gomez y Smith, 2000) y a 17 pb de ésta se encuentra una posible
caja −35 (TCGAAA) que difiere en un nucleótido de regiones −35 consenso
reconocidas en micobacterias (Gomez y Smith, 2000).
187
Resultados
+1 T G C A
AAAGTCAATACGACGCCC
+1 T G C A
A TTGGATGATTCGCTGCAGCTCTGGGAGCGTGGCGAGGCGCTGGCGAAACGCTGTGAAGAGCACTTAGCCGGAGCGCGTCAGCGCGTCGAGCAGGCGATCGCCGCCCGCGAGGCCGACGAGGACTGAAATGCGCGTAGTGCCCGCCGCTCACCATCGAAACTGGAACGTGTTTCAGTTATGCTGCGGGCATG B Figura 61. Localización del sitio de inicio de la transcripción en el promotor P5228. A. Ensayo
de extensión del cebador. El experimento de extensión del cebador se realizó según se detalla en
el apartado 7.6 de Materiales y Métodos a partir del RNA total aislado de células de las cepas E.
coli DH10B conteniendo el plásmido pUJ9-5228. Se utilizó el oligonucleótido Lac57, el cual hibrida
entre los nucleótidos 39 y 62 en posición 3’ respecto al residuo de adenina del codón de inicio de la
traducción del gen lacZ (Tabla 3) para producir la extensión. La localización del producto de
extensión se determinó comparándolo con el patrón de secuencia del promotor utilizando el mismo
oligonucleótido Lac57 (calles T, G, C, A). En el lateral derecho de la figura se muestra la secuencia
5228pUJ9 F
5228pUJ9 R
GTAC
AAAGTCAATACGACGCCC
AC
GT
188
Resultados
de nucleótidos que flanquea el sitio +1 (señalado en rojo), de la hebra no codificante. B. Secuencia
del promotor P5228. En azul se han marcado las zonas donde hibridan los oligonucleótidos
5228pUJ9 F y 5228pUJ9 R utilizados para la amplificación de esta región promotora. En gris se ha
marcado el supuesto sitio −10 de la región promotora del gen. El posible sitio −35 se ha señalado
en rosa. En rojo se ha marcado el sitio +1 de inicio de la transcripción, que coincide con la adenina
del codón de iniciación del gen MSMEG_5228, y en verde el final del gen (codón STOP) que
precede a MSMEG_5228.
5.2.2 Regulación del promotor P5228 por KstR
La región promotora del gen MSMEG_5228 así como el principio de este gen
se analizó con el fin de diseñar los oligonucleótidos necesarios para amplificar una
sonda de DNA adecuada para el análisis de su regulación mediante KstR. Esta
región se muestra en la figura 62 donde se pueden apreciar las zonas donde
hibridan los oligonucleótidos 5228 FP F y 5228 FP R. La amplificación de la región
comprendida entre estas zonas da lugar a la sonda 5228 FP (196 pb). En la figura
se ha marcado el supuesto sitio −10 de la región promotora del gen. Este
supuesto sitio −10 de MSMEG_5228 (TATGCT) se sitúa a una distancia de dos
bases del motivo de unión a KstR (señalado en la figura). La posible caja −35 se
encuentra a una base de distancia del motivo de unión a KstR. Aunque no
coincide exactamente (por una posición de diferencia) con regiones −35 conocidas
(Gomez y Smith, 2000), se sabe que las regiones −35 micobacterianas toleran una
gran variedad de secuencias (Bashyam et al., 1996). En la figura también se han
marcado el codón de iniciación de MSMEG_5228, y el final del gen (codón STOP)
que precede a MSMEG_5228.
189
Resultados
TCAGCGCGTCGAGCAGGCGATCGCCGCCCGCGAGGCCGACGAGGACTGAAATGCGCGTAGTGCCCGCCGCTCA
CCATCGAAACTGGAACGTGTTTCAGTTATGCTGCGGGCATGGCTGACTCCACCACCGACCTCGGGCG
GATCCTGGTCACCGGGGGTTCCGGCTTCGTCGGCGCCAACCTGGTCACCGAACTGC
5228 FP F
5228 FP R Figura 62. Región amplificada por la sonda 5228 FP. En azul se han marcado las zonas donde
hibridan los oligonucleótidos 5228 FP F y 5228 FP R. La amplificación de la región comprendida
entre estas zonas da lugar a la sonda 5228 FP. En gris se ha marcado el supuesto sitio −10 de la
región promotora del gen. El motivo de unión a KstR se ha señalado en rojo. El posible sitio −35 se
ha señalado en rosa. En amarillo se ha marcado el codón de iniciación de MSMEG_5228, y en
verde el final del gen (codón STOP) que precede a MSMEG_5228.
5.2.2.1 Clonación, hiperexpresión y purificación de la proteína KstRMsm
Para caracterizar el mecanismo de regulación mediado por KstRMsm se
procedió en primer lugar a la clonación del gen kstRMsm (MSMEG_6042). Para ello,
se amplificó por PCR y se subclonó en el vector de hiperexpresión pET-29a (+),
fusionando 6 tripletes en fase en su extremo 3’ que codifican un tag de 6His,
dando como resultado el plásmido pET6042 (Fig. 63). Este plásmido fue
posteriormente transferido a la cepa E. coli BL21 (DE3) y los extractos proteicos
de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET6042) fueron analizados mediante SDS-PAGE.
Se probaron distintas condiciones de cultivo, y finalmente se seleccionaron las
descritas en el apartado 5.3 de Materiales y Métodos (inducción de cultivos a
DO600 0,6 con IPTG 200 μM durante 3 h a 37 ºC), que dan lugar a la aparición de
una banda de hiperproducción cuyo tamaño aproximado coincide con el predicho
de 27,7 kDa (24,84 kDa + 2,86 kDa) para KstR fusionada con un tag de 6His
(Kendall et al., 2007) (Figura 64).
La proteína de fusión fue purificada a homogeneidad electroforética a partir
del extracto de E. coli mediante cromatografía de afinidad utilizando columnas de
níquel-nitrilotriacetato en gel de sílice (véase apartado 5.3 de Materiales y
Métodos) (figura 64).
190
Resultados
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
pET6042(6,1 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
MSMEG_6042
NdeI XhoI
pET6042 F pET6042 R
Ligación
Ligación
Digestión
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM6042(3,7kb)
ori
ApRKmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
Polilinker
pET-29a(+)(5,4 kb)
pET6042(6,1 kb)
KmR
ori
lacI
PT7
MSMEG_6042
NdeI XhoI
pET6042 F pET6042 R
Ligación
Ligación
Digestión
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM®-TEasy (3,0 kb)
ori
ApR
pGEM6042(3,7kb)
ori
ApR
Figura 63. Representación esquemática de la construcción del plásmido pET6042. El gen
kstR (MSMEG_6042) fue amplificado por PCR utilizando la pareja de oligonucleótidos pET6042 F y
pET6042 R (Tabla 3 de Materiales y Métodos) y DNA genómico de M. smegmatis mc2155 como
molde. El oligonucleótido pET6042 R fue diseñado eliminando el codón stop del gen kstR e
introduciendo en su lugar la diana de restricción XhoI. El gen se clonó directamente en el vector
pGEMT-easy originando el plásmido pGEMT6042. Posteriormente, el fragmento que contenía el
gen kstR fue subclonado en el vector pET-29a (+) como un inserto NdeI/XhoI originando el
plásmido pET6042 que expresa un gen kstR cuyo extremo 3’ tiene fusionados en fase 6 tripletes
que codifican un tag de 6His. Las abreviaturas utilizadas son: ApR, gen que confiere resistencia a
ampicilina; KmR, gen que confiere resistencia a kanamicina; lacI, gen que codifica el represor LacI;
PT7, promotor del gen 10 del fago T7; ori, origen de replicación.
191
Resultados
192
Las fracciones de elución de la columna seleccionadas se concentraron y se
eliminó el imidazol de las mismas (véase el apartado 5.3 de Materiales y
Métodos). La concentración de proteína pura KstR-His se calculó
espectrofotométricamente utilizando un Nanodrop. Siguiendo este protocolo, se
obtuvieron concentraciones de entre 80-100 μM de proteína purificada a partir de
100 ml de cultivo inicial.
66 ,0
116
45 ,0 ,0
,0 97,4
31
21,5
14,4
200,0
KDa 1 2 3 4 5 6
Figura 64. Purificación de la proteína KstR-His a partir de extractos de E. coli BL21 (DE3) (pET6042). Se muestran las fracciones de la proteína KstR-His eluída desde columnas de níquel
utilizando distintas concentraciones de imidazol. 1. Marcadores de peso molecular (en el margen
izquierdo de la figura se detallan los pesos moleculares de los marcadores). 2-6. Fracciones de un
extracto de E. coli BL21 (DE3) (pET6042) eluído tras la cromatografía de afinidad utilizando
sucesivamente las distintas concentraciones de imidazol: 2. 10 mM. 3. 200 mM. 4. 300 mM. 5. 500
mM. 6. 1 M. En todas las calles se cargaron 5 μl de muestra.
5.2.2.2 Unión de KstR a la región intergénica 5228
Con el fin de estudiar el mecanismo de represión ejercido por KstR se
realizaron ensayos de retardo en gel para analizar la capacidad de unión de esta
proteína a la región intergénica 5228. Para ello en primer lugar se utilizó como
sonda de DNA el fragmento 5228 FP (196 pb) y concentraciones crecientes de
extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042) (0,5-10 μg totales) (Fig. 65). Los
resultados muestran que el extracto que contiene la proteína KstR se une a la
Resultados
región intergénica 5228, mientras que el extracto obtenido a partir de la cepa con
el plásmido sin inserto no (Fig. 65). Además, esta unión es específica, ya que
cuando se añade a la mezcla de reacción la sonda 5228 FP no marcada no se
observó retardo debido a la proteína KstR (datos no mostrados).
1 2 3 4 51 2 3 4 5
Sonda 5228 FP
Complejo 5228 FP/Extracto 6042
Figura 65. Ensayos de retardo en gel con el extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042) sobre la sonda 5228 FP. 1. Sonda sin proteína. 2. Sonda con extracto control E. coli BL21 (DE3)
conteniendo el plásmido pET29 sin inserto. Se añadieron 20 μg de proteínas totales. 3-5, sonda
con concentraciones crecientes de extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042): 3. 0,5 μg de
proteínas totales. 4. 5 μg de proteínas totales. 5. 10 μg de proteínas totales. Los ensayos de
retardo en gel se realizaron como se indica en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos. La
localización de las sondas y los complejos sonda/proteína se indican con flechas.
Los ensayos de retardo en gel también se llevaron a cabo adicionando
cantidades crecientes de KstR purificada (Fig. 66). El resultado muestra que el
complejo KstR-DNA se observa ya a concentraciones muy bajas de la proteína
cercanas a 20 nM.
La mayoría de los represores transcripcionales descritos ejercen su efecto
represor mediante un mecanismo de unión a la región operadora que bloquearía la
unión de la RNA polimerasa, o bien la elongación del mRNA. La represión se
anularía en presencia de la molécula inductora, que provocaría un cambio
conformacional en el represor y la posterior desunión de éste al DNA, permitiendo
así la transcripción. Para comprobar si KstR era capaz de desunirse del DNA en
presencia de colesterol, se realizaron ensayos de retardo en gel en presencia de
colesterol disuelto en Triton X-100 al 10% (0,25-4,00 mM). En todas las
193
Resultados
condiciones ensayadas la proteína KstR permanecía unida a la sonda 5228 FP en
presencia de este compuesto, y tampoco se observó una disminución de la
afinidad del regulador por la sonda (resultados no mostrados).
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Sonda 5228 FP
Complejo 5228 FP/KstR
Figura 66. Ensayo de retardo en gel con la proteína KstR purificada sobre la sonda 5228 FP. 1. Sonda sin proteína. 2-8, concentraciones crecientes de sonda con la proteína KstR-His6: 2. 2,5
nM. 3. 5 nM. 4. 10 nM. 5. 20 nM. 6. 40 nM. 7. 80 nM. 8. 100 nM. Los ensayos de retardo en gel se
realizaron como se indica en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos. La localización de las
sondas y los complejos sonda/proteína se indican con flechas.
5.2.2.3 Determinación de las regiones operadoras de KstR en la región promotora de MSMEG_5228
Para identificar los sitios de unión de KstR a la región promotora de
MSMEG_5228 se analizó el complejo KstR-DNA mediante un ensayo de
protección de la sonda de DNA 5228 FP a la digestión con DNasaI con
concentraciones crecientes de extracto proteico de E. coli BL21 (DE3) (pET6042)
(Fig. 67, calles 4-6) y proteína KstR purificada (Fig. 67, calles 7-10) (véase el
apartado 6.3 de Materiales y Métodos). El resultado reveló que el operador de
KstR es una secuencia de 31 nucleótidos, localizados entre la posición −5 y −35
respecto al codón de inicio ATG del gen MSMEG_5228, siendo curiosamente la
huella obtenida con extractos proteicos más nítida que la hallada con la proteína
KstR pura. Esta región solapa por tanto con las posibles cajas −10 y −35, lo que
sugiere que la unión de KstR al operador impediría la unión de la RNA polimerasa
y con ello el inicio de la transcripción desde el promotor.
194
Resultados
A+G DNA Control Ep Ep6042 KstR DNA
C G T C G T A T T G
C A A A G C T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A C T T T G T G C A A G G T
Figura 67. Identificación de los sitios de unión de la proteína KstR a la región promotora de MSMEG_5228 mediante experimentos de protección frente a la digestión con DNasaI. La
calle señalada como A+G muestra la reacción de secuenciación de la sonda 5228 FP por el
método de Maxam y Gilbert. Como sonda se utilizó el fragmento 5228 FP marcado en el extremo
5’. Como control se utilizaron 5 y 20 μg de extracto de E. coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido
pET29 sin inserto (calles 2 y 3, respectivamente). Los ensayos se llevaron a cabo tanto con
extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042) como con proteína KstR pura. Para los
experimentos realizados con extractos se utilizaron 5, 10 y 20 μg de proteínas totales (calles 4, 5 y
6, respectivamente). Las concentraciones de proteína KstR pura utilizadas en los experimentos
fueron 2,5, 40, 100 y 400 nM (calles 7, 8, 9 y 10, respectivamente). A la izquierda de la figura se
muestra la secuencia de la región protegida por KstR, señalándose en rojo el motivo de unión a
KstR (cuyas regiones palindrómicas se señalan con flechas), en azul el supuesto sitio −10 y en
verde el supuesto sitio −35.
195
Resultados
5.3 Estudio de la regulación mediada por KstR2 mediante la técnica de microarrays
La presencia y posible función del regulador transcripcional KstR2 se hizo
evidente tras el análisis de la región regulada por KstR (Kendall et al., 2007) ya
que dentro de esta región destacaba una zona formada por 19 genes
(MSMEG_5999-MSMEG_6017) cuya expresión no estaba afectada en el mutante
del regulador KstR. En R. jostii RHA1 los correspondientes genes ortólogos
estaban inducidos en colesterol (van der Geize et al., 2007). Así mismo, genes de
M. smegmatis mc2155 situados dentro de esta zona también presentaron
inducción en colesterol en los experimentos con microarrays realizados durante
esta tesis doctoral (véase apartado 3 de Resultados). Estas pruebas apoyaban la
implicación de este conjunto de genes en el catabolismo del colesterol. Dentro de
esta zona se localiza un gen que codifica una segunda proteína que presenta
similitud con reguladores tipo TetR (MSMEG_6009), lo que sugería la posible
implicación de esta proteína, denominada KstR2 (Kendall et al., 2010) en la
regulación de estos genes, así como la posibilidad de que se tratase de un
represor transcripcional, como en el caso de KstR y de la mayoría de los
reguladores tipo TetR (Ramos et al., 2005).
Mediante el programa MEME se identificó un posible motivo de unión para
KstR2 (AnCAAGnnCTTGnT) y se encontraron tres de ellos en el genoma de M.
smegmatis y M. tuberculosis, dos de ellos situados en regiones intergénicas de
genes divergentes cercanos a kstR2 y el tercero en la región que lo precede
(Kendall et al., 2010) (Fig. 68). Estos datos apoyaban el papel de KstR2 como
regulador de genes relacionados con el catabolismo del colesterol.
Para demostrar esta posible función reguladora, se llevaron a cabo
experimentos de expresión diferencial de un mutante de deleción del gen kstR2
frente a la cepa salvaje M. smegmatis mc2155. Estos experimentos de expresión
diferencial mediante microarrays se han realizado en colaboración con el grupo de
Neil G. Stoker en el Departamento de Patología y enfermedades Infecciosas del
Royal Veterinary College de Londres.
196
Resultados
5.3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays de M.
smegmatisΔkstR2
Para determinar los genes de M. smegmatis mc2155 regulados por KstR2, se
realizaron estudios de expresión diferencial de una cepa con el gen kstR2
delecionado frente a la cepa salvaje, ambas crecidas en medio rico (7H9-ADC)
utilizando la técnica de los microarrays (véase el apartado 7.5 de Materiales y
métodos).
5999 6001 60046002 60036000 6013 6014 6015 6016
6082
6011 6012601060076005 6006 60096008
6064
6017
[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17][15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314] 5999 6001 60046002 60036000 6013 6014 6015 6016
6082
6011 6012601060076005 6006 60096008
6064
6017
[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17][15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314]
Figura 68. Región del genoma de M. smegmatis mc2155 controlada por KstR2. Se han
señalado con una estrella aquellos genes cuya represión (o la del operón del que forman parte) por
KstR2 se ha comprobado mediante microarrays o RTq-PCR. Con una flecha roja se han señalado
las 3 regiones intergénicas donde se han hallado motivos de unión para KstR2. Los números que
se muestran por debajo de los genes señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los
números entre corchetes indican separación y los números entre paréntesis solapamiento. Los
números que aparecen sobre las líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb,
entre las que se encuentra esta región.
Los resultados muestran un total de 8 genes significativamente inducidos
(con un valor de P<0,05) en esta zona, sin embargo se ha asumido que en total
son 14 los genes que presentan inducción en el mutante (Tabla 23), ya que
aunque el valor de P es mayor de 0,05, se encuentran dentro de un operón
inducido. Además en algunos de los genes se ha confirmado su inducción
mediante RTq-PCR (Kendall et al., 2010).
Los niveles de inducción de los genes MSMEG_5999-MSMEG_6004 en el
mutante en KstR2 son muy elevados. Estos genes parecen estar organizados en
dos operones divergentes, MSMEG_6001-MSMEG_6004 y MSMEG_6000-
197
Resultados
MSMEG_5999, y en la región intergénica de 61 pb que los separa se encuentra un
motivo de unión para KstR2 (Fig.68).
Los genes MSMEG_6005-MSMEG_6007 parecen no estar regulados por
KstR2. Su expresión no está alterada significativamente en los microarrays y
tampoco presentan motivos de unión para KstR2 en las regiones que los
preceden. Estos datos se ven apoyados por el hecho de que estos genes no
aparecen inducidos en colesterol en los microarrays de expresión diferencial en
este esteroide (véase el apartado 3 de Resultados), y porque tampoco presentan
genes ortólogos en M. tuberculosis o R. jostii (Kendall et al., 2010).
El gen MSMEG_6009, que codifica la proteína KstR2, se encuentra ausente
en el mutante, ya que está delecionado. El gen situado tras kstR2, MSMEG_6008,
parece formar un operón con él, y se detectan niveles de expresión muy elevados
en el mutante. Sin embargo, la expresión del gen MSMEG_6010 no se encuentra
alterada en el mutante y tampoco muestra inducción en colesterol (véase el
apartado 3 de Resultados), lo que sugiere que KstR2 se une a la región
intergénica entre MSMEG_6009 y MSMEG_6010 para regular la expresión génica
en una sola dirección (Kendall et al., 2010).
Los genes MSMEG_6011-MSMEG_6017 también aparecen inducidos en el
mutante y parecen organizarse en dos operones divergentes, MSMEG_6012-
MSMEG_6011 y MSMEG_6013-MSMEG_6017 (Fig. 68). En la región intergénica
de 105 pb que separa a MSMEG_6012 de MSMEG_6013 se encuentra un motivo
de unión para KstR2.
198
Resultados
M M M M M
M
M M M M M M M
M
M M M M M
Tabla 23. Análisis de expresión de ΔkstR2Msm y el regulón kstR2. Se muestran los valores de
fold change de los genes de la región regulada por KstR2. Aquellos señalados con un asterisco
presentaron un valor de P<0,05. Los genes MSMEG_6005-MSMEG_6007 y MSMEG_6010 no se
consideran inducidos, así como el gen MSMEG_6009, que codifica KstR2 y por tanto está
delecionado en el mutante. Se señalan los genes ortólogos en M. tuberculosis y la función de las
proteínas codificadas. Tabla adaptada de Kendall et al., 2010.
Aminotransferasa, clase I Rv3565100,8SMEG_6017
Supuesta acil-CoA deshidrogenasaRv35649,5SMEG_6016
Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)Rv356315,5*SMEG_6015
Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)Rv35621,6SMEG_6014
Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)Rv35612,2SMEG_6013
Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)Rv3560c173,6*SMEG_6012
Deshidrogenasa de cadena cortaRv3559c3,2SMEG_6011
Proteína hipotética_-3,0SMEG_6010
Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)Rv3557c-1,2SMEG_6009
Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)Rv3556c88,8*SMEG_6008
Transportador de difusión de cationes_-1,1SMEG_6007
Proteína hipotética_1,1SMEG_6006
Proteína hipotética_2,3SMEG_6005
Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasasRv35535,2SMEG_6004
Coenzima A transferasa, subunidad B Rv3552110,6*SMEG_6003
Coenzima A transferasa, subunidad A Rv3551150,5*SMEG_6002
Enoil-CoA hidratasa (echA20)Rv3550250,7*SMEG_6001
Deshidrogenasa de cadena cortaRv3549c2017,0*SMEG_6000
Deshidrogenasa de cadena cortaRv3548c140,3*SMEG_5999
FunciónGen de M.
tuberculosisFold
change
Gen de M.egmatis
mc²155Sm
Aminotransferasa, clase I Rv3565100,8SMEG_6017
Supuesta acil-CoA deshidrogenasaRv35649,5SMEG_6016
Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)Rv356315,5*SMEG_6015
Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)Rv35621,6SMEG_6014
Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)Rv35612,2SMEG_6013
Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)Rv3560c173,6*SMEG_6012
Deshidrogenasa de cadena cortaRv3559c3,2SMEG_6011
Proteína hipotética_-3,0SMEG_6010
Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)Rv3557c-1,2SMEG_6009
Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)Rv3556c88,8*SMEG_6008
Transportador de difusión de cationes_-1,1SMEG_6007
Proteína hipotética_1,1SMEG_6006
Proteína hipotética_2,3SMEG_6005
Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasasRv35535,2SMEG_6004
Coenzima A transferasa, subunidad B Rv3552110,6*SMEG_6003
Coenzima A transferasa, subunidad A Rv3551150,5*SMEG_6002
Enoil-CoA hidratasa (echA20)Rv3550250,7*SMEG_6001
Deshidrogenasa de cadena cortaRv3549c2017,0*SMEG_6000
Deshidrogenasa de cadena cortaRv3548c140,3*SMEG_5999
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
Función
Gen de M.egmatis
mc²155Fold
changeGen de M.
tuberculosisSm
199
200
Discusión
V. DISCUSIÓN
201
Discusión
202
Discusión
V. DISCUSIÓN
1. Estudio del potencial catabólico de degradación de esteroides de M. smegmatis mc2155
A lo largo de esta tesis doctoral se ha abordado el estudio de la degradación
de esteroides, principalmente el colesterol, llevado a cabo por la bacteria M.
smegmatis mc2155. Así, uno de los primeros objetivos fue la realización de un
perfil de los compuestos esteroideos que pueden ser utilizados como fuente de
carbono y energía por este microorganismo.
El crecimiento de M. smegmatis mc2155 en diferentes esteroides parece
bastante específico para aquellos de cadena lateral de 8 átomos de carbono como
son el colesterol y la 4-colesten-3-ona. Su crecimiento es bastante más limitado en
derivados de estas moléculas que son intermediarios de la ruta de degradación del
colesterol, como AD y ADD, y en otros esteroides sin cadena lateral o con una
cadena lateral más corta que la del colesterol, como son la androsterona,
dehidroandrosterona, β-estradiol o pregnenolona, entre otros (véase apartado 1.1
de Resultados). Este comportamiento sugiere la importancia que la presencia de
la cadena lateral puede tener en la capacidad de crecimiento en esteroides de M.
smegmatis. Comparativamente, en especies del género Rhodococcus se ha
observado el crecimiento en un mayor rango de compuestos esteroídicos. Por
ejemplo R. erythropolis SQ1 es capaz de degradar AD, ADD y 9α-hidroxi-4-
androsten-3,17-diona (van der Geize et al., 2000). R. jostii RHA1 por su parte es
capaz de crecer, además de en colesterol, en AD, 5-α-colestanol, 5-α-colestanona,
ácido cólico, progesterona y β-sitosterol, aunque como en el caso de M.
smegmatis, su crecimiento es deficiente en esteroides como el ergosterol o el
estradiol (Mohn et al., 2008). Curiosamente, un mutante de R. jostii RHA1 en el
locus mce4, que está implicado en el transporte de esteroides, pierde la
capacidad de crecimiento en colesterol, 5-α-colestanol, 5-α-colestanona y en β-
sitosterol, mientras que la conserva en AD, ácido cólico y progesterona (Mohn et
al., 2008). El colesterol, 5-α-colestanol, 5-α-colestanona y β-sitosterol tienen
203
Discusión
estructuras muy similares con largas cadenas laterales (de 8 átomos de carbono
las 3 primeras y de 10 el β-sitosterol). Las estructuras de AD, ácido cólico y
progesterona tienen cadenas laterales más cortas y polares (la AD presenta un
grupo ceto en el C-17 y las cadenas laterales del ácido cólico y la progesterona
son de 5 y de 2 átomos de carbono respectivamente). Este resultado sugiere que
estos esteroides con cadena lateral más corta y polar podrían ser transportados en
R. jostii RHA1 por otro sistema distinto del constituido por el locus mce4 (Mohn et
al., 2008). Esta hipótesis podría explicar el crecimiento deficiente de M. smegmatis
en esteroides con cadena lateral corta, ya que esta bacteria podría carecer de un
sistema de transporte eficiente para los mismos, por lo que su capacidad
degradativa se centraría principalmente en los esteroides con cadena lateral larga,
que se transportarían por el sistema codificado por el locus mce4 que M.
smegmatis posee. Un caso aparte parece ser el del ergosterol, que a pesar de
poseer una cadena lateral de 9 átomos de carbono permite un crecimiento limitado
a M. smegmatis, pero curiosamente este comportamiento también se observa en
R. jostii RHA1. Este hecho sugiere que la dificultad de crecimiento en este
esteroide podría estar relacionada con otras propiedades estructurales. A este
respecto podría tener importancia la existencia de un doble enlace en la cadena
lateral del ergosterol más que la longitud de su cadena lateral.
2. Análisis de las enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona en M. smegmatis mc2155
Otro de los objetivos de este trabajo fue el estudio de distintas proteínas
posiblemente implicadas en el primer paso de degradación del colesterol. Así,
dentro del apartado 2 de Resultados se han analizado 3 enzimas que podrían
catalizar la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona. Sin embargo, se ha
constatado este paso solo en dos de ellas, 3-β HSDMS y SDRMS. La tercera
enzima, ChoDMS, que presenta una elevada identidad (83% cuantificada por
ClustalW) con la ChoD de M. tuberculosis no ha demostrado ser activa en
nuestros experimentos. En M. tuberculosis se verificó que un mutante en el gen
204
Discusión
ksdD (que es incapaz de transformar AD en ADD y por tanto continuar la
degradación de colesterol a partir de este paso) complementado con el gen choD
(expresado bajo un promotor micobacteriano fuerte, el promotor de choque
térmico Phsp65, e integrado en el cromosoma utilizando el vector integrativo
pMV306) podía acumular temporalmente 4-colesten-3-ona, lo que sugería la
capacidad de catalizar la oxidación de colesterol por ChoD (Brzostek et al., 2007).
En ese mismo trabajo también se apuntó que el gen choD de M. tuberculosis
clonado en un sistema de expresión de E. coli bajo el control de un promotor
inducible por IPTG mostró actividad utilizando un ensayo colorimétrico. Sin
embargo, no se verificó la conversión de colesterol en 4-colesten-3-ona, por lo que
algunos autores cuestionan este resultado (Kreit y Sampson, 2009), y se inclinan
por la opinión de que las enzimas tipo ChoD podrían no poseer actividad colesterol
oxidasa, aunque sí pertenecer al grupo de las glucosa-metanol-colina (GMC)
oxidorreductasas (Navas et al., 2001). Nuestros intentos de ensayar la actividad
enzimática de ChoDMS en un sistema de expresión de E. coli (en nuestro caso
utilizando el vector pET29) que se realizaron, además de con ensayos
colorimétricos, con ensayos de LC/MS y mediante visualización de intermediarios
radiactivos mediante TLC, no dieron lugar a resultados positivos. Este hecho pone
en duda también para nosotros los datos obtenidos por Brzostek et al. (2007), ya
que aunque su trabajo está realizado con la ChoD de M. tuberculosis ésta es muy
similar a ChoDMS, y cabría esperar por tanto un comportamiento similar en ambas
enzimas. Sin embargo, tampoco se puede descartar que la falta de actividad de
ChoDMS pueda deberse a que la proteína no se excreta o se pliega de manera
adecuada en el sistema heterólogo utilizado. Por otra parte, cabe destacar que en
este trabajo se ha demostrado que un mutante en el gen choDMS no presenta
alterado su crecimiento en colesterol, lo que no es sorprendente dado que, como
ya se ha apuntado, en este trabajo se han encontrado otras dos enzimas capaces
de catalizar este paso enzimático en M. smegmatis.
Por otro lado, el gen choDMS (MSMEG_1604) se localiza en una zona del
genoma de M. smegmatis que no parece tener ninguna relación con la
degradación de esteroides (Fig. 69).
205
Discusión
Figura 69. Región del genoma de M. smegmatis mc2155 circundante al gen MSMEG_1604. En
el cuadro se indica la posible función de los productos de los genes de la zona. Información
extraída del servidor CMR: http://cmr.jcvi.org/tigr-scripts/CMR/CmrHomePage.cgi
MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteina hipotetica conservada MSMEG_1601: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteina de la familia IMP deshidrogenasa
MSMEG_1605: Proteina reguladora del transporte de fosfatoMSMEG_1606: BenzoilformatodecarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: GlicosiltransferasaMSMEG_1609: Beta-fosfoglucomutasahidrolasa
MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteínahipotética conservada MSMEG_1601: Proteína hipotética conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteína de la familia IMP deshidrogenasa
MSMEG_1605: Proteína reguladora de transporte de fosfatoMSMEG_1606: Benzoilformato decarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: Glicosil transferasaMSMEG_1609: Beta -fosfoglucomutasa hidrolasa
MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteina hipotetica conservada MSMEG_1601: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteina de la familia IMP deshidrogenasa
MSMEG_1605: Proteina reguladora del transporte de fosfatoMSMEG_1606: BenzoilformatodecarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: GlicosiltransferasaMSMEG_1609: Beta-fosfoglucomutasahidrolasa
MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteínahipotética conservada MSMEG_1601: Proteína hipotética conservadahipotética conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteína de la familia IMP deshidrogenasa
MSMEG_1605: Proteína reguladora de transporte de fosfatoMSMEG_1606: Benzoilformato decarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: Glicosil transferasaMSMEG_1609: Beta -fosfoglucomutasa hidrolasa
Al igual que sucede en el gen choDMS, el cual se ha comprobado que no se
induce en presencia de colesterol y que no posee en su región promotora
secuencias operadoras de KstR o KstR2, ninguno de los genes circundantes se ha
visto implicado en el metabolismo del colesterol o inducido en su presencia, y
ninguno de ellos presenta en su región promotora secuencias consenso para la
unión de KstR o KstR2, que aunque como hemos visto no es requisito
indispensable para inducirse en la presencia de colesterol, podría indicar una
posible implicación de esta zona con el catabolismo del colesterol.
La secuencia completa del genoma de M. leprae, un patógeno intracelular
obligado, muestra una reducción dramática de genes funcionales, con una
capacidad codificante menor del 50%. A pesar de esta reducción masiva de
genes, el bacilo de la lepra ha conseguido preservar un grupo mínimo de genes, la
mayoría de ellos compartidos con M. tuberculosis, que permiten su supervivencia
en el hospedador dando lugar a las consiguientes manifestaciones patológicas.
Uno de estos genes conservados y cuya expresión se ha comprobado in vivo en
M. leprae es choD (Marques et al., 2008). La proteína codificada por este gen se
encuentra en la fracción de proteínas presentes en la pared celular, donde se
produciría la oxidación del colesterol. La pared celular parece de hecho un
compartimento celular muy activo en la degradación lipídica en general en este
206
Discusión
patógeno (Marques et al., 2008). Aunque M. leprae no parece contener la
maquinaria metabólica necesaria para catabolizar completamente el colesterol, se
ha propuesto que el colesterol es un factor necesario para su crecimiento en
macrógafos (Kato, 1978). Además M. leprae es capaz de adquirir colesterol del
medio ambiente y parece que incluso podría sintetizarlo (Lamb et al., 1998). Se
desconoce aún el porqué de la necesidad de colesterol en M. leprae, y para qué lo
oxida (supuestamente utilizando ChoD). Estos datos sugieren que esta proteína
presente en general en todas las micobacterias no estaría implicada
exclusivamente en el catabolismo del colesterol para su aprovechamiento como
fuente de carbono y energía. El hecho de que un mutante en este gen en M.
tuberculosis esté atenuado en ratones (Brzostek et al., 2007) puede sugerir que
podría actuar sobre el colesterol de algún modo que favorezca su patogenicidad
(mecanismo que compartiría con M. leprae). Un estudio in vitro sugiere que
durante la invasión de macrófagos por parte de Rhodococcus equi, la lisis de la
membrana está facilitada por la inducción de una colesterol oxidasa extracelular
(Fuhrmann et al., 2002). Esta posible implicación en un mecanismo invasivo
explicaría la presencia de ChoD en M. leprae, aunque el hecho de que esté
también presente en bacterias no patógenas parece indicar que en principio su
función no está exclusivamente relacionada con mecanismos de patogenicidad.
Curiosamente, de los posibles genes relacionados con la degradación del
colesterol, M. leprae tan sólo posee ortólogos a choD y a MSMEG_5228, que
codifica la proteína 3-β-HSDMS. El gen kstR está presente como un pseudogen. La
presencia de estos dos genes transformadores de colesterol pero no de los demás
genes catabólicos de esta ruta apoya la posible implicación de este paso
enzimático en patogénesis en esta bacteria.
Al contrario que ChoD, la enzimas 3-β HSDMS y SDRMS sí han presentado
actividad deshidrogenasa en nuestros ensayos y se ha podido constatar la
producción de 4-colesten-3-ona a partir de ambas proteínas, tanto con ensayos de
LC/MS como mediante visualización de intermediarios radiactivos mediante TLC.
Los genes que codifican ambas enzimas (MSMEG_5228 y MSMEG_5233,
respectivamente) se sitúan próximos en el genoma (Fig. 70).
207
Discusión
MSMEG_5223: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteina hipoteticaMSMEG_5230: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5231: Proteina hipotetica
MSMEG_5232: Proteina hipoteticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteina de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237:Dominio de funcion desconocidaMSMEG_5238: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5239: fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II
MSMEG_5223: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteína hipotéticaMSMEG_5230: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5231: Proteína hipotética
MSMEG_5232: Proteína hipotéticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteína de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237: Dominio de función desconocidaMSMEG_5238: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5239: Fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II
MSMEG_5223: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteina hipoteticaMSMEG_5230: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5231: Proteina hipotetica
MSMEG_5232: Proteina hipoteticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteina de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237:Dominio de funcion desconocidaMSMEG_5238: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5239: fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II
MSMEG_5223: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteína hipotéticaMSMEG_5230: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5231: Proteína hipotética
MSMEG_5232: Proteína hipotéticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteína de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237: Dominio de función desconocidaMSMEG_5238: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5239: Fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II
Figura 70. Región del genoma circundante a los genes MSMEG_5228 y MSMEG_5233. En
el cuadro se indica la la posible función de los productos de los genes de la zona. Información
extraída del servidor CMR: http://cmr.jcvi.org/tigr-scripts/CMR/CmrHomePage.cgi
Sus regiones promotoras presentan secuencias consenso del operador KstR,
pero tan sólo MSMEG_5228 aparece inducido en el mutante del regulador KstR
mediante la técnica de microarrays (Kendall et al., 2007). Este gen también
aparece inducido en colesterol en los ensayos de expresión diferencial de M.
smegmatis mediante microarrays realizados en esta tesis.
El gen MSMEG_5233 no se encuentra inducido en los microarrays del
mutante de KstR, ni en los microarrays de expresión diferencial en M. smegmatis
en colesterol, aunque sí se puede apreciar una ligera inducción mediante RTq-
PCR. El hecho de que la proteína codificada por este gen, SDRMS, presente la
misma actividad colesterol deshidrogenasa que 3-β HSDMS, sugiere que podría
suplir la carencia de esta enzima.
Los mutantes tanto en el gen MSMEG_5228 como en el gen MSMEG_5233
no presentan alterada su capacidad de crecimiento en colesterol, lo que sugiere
que ninguna de las enzimas codificadas por estos dos genes ejerce su función de
manera exclusiva, lo que apunta la posibilidad de que existan más genes que
puedan catalizar este paso. La redundancia de genes que codifican una misma
función puede indicar la versatilidad metabólica de M. smegmatis.
208
Discusión
3. Análisis global de los genes inducidos diferencialmente en colesterol en M. smegmatis mc2155
Uno de los grandes objetivos de esta tesis doctoral fue la búsqueda global de
los genes implicados en la degradación del colesterol en M. smegmatis mc2155.
Tras confirmarse mediante análisis in silico la implicación en esta ruta catabólica
de los genes ortólogos a los implicados en la degradación de testosterona en C.
testosteroni, la técnica de microarrays, validada mediante RTq-PCR y
mutagénesis, nos aportó gran cantidad de información acerca de los posibles
genes implicados en la degradación del colesterol a lo largo de todo el genoma de
M. smegmatis mc2155. Estos datos se han contrastado con los resultados
anteriormente obtenidos por otros investigadores, en particular con los estudios
sobre los genes regulados por KstR, que se ha identificado como un represor de
gran número de genes relacionados con el catabolismo del colesterol (Kendall et
al., 2007) y con los estudios de expresión diferencial en colesterol de R. jostii
RHA1 (van der Geize et al., 2007).
El regulón KstR está formado por 84 genes; este elevado número sugería
que no todos ellos debían estar implicados en la degradación del colesterol
(Kendall et al., 2007). Sin embargo, nuestros resultados de expresión diferencial
en colesterol de M. smegmatis mc2155 mediante microarrays presentados en este
trabajo muestran que de hecho el colesterol por sí solo es capaz de inducir la gran
mayoría de los genes del regulón KstR (70 incluyendo el operón mce4, cuya
inducción en colesterol es pequeña pero cuya implicación en su transporte está
demostrada) y además inducir los genes regulados por KstR2. Dado que ha sido
posible asignarles una función específica dentro del catabolismo del colesterol a
gran parte de ellos, parecería que estos dos regulones se han especializado en la
degradación de este esteroide.
La ruta de degradación de colesterol parece estar altamente conservada en
R. jostii RHA1 y M. smegmatis mc2155, y las comparaciones in silico indican que
así mismo está conservada en otras especies micobacterianas como M.
tuberculosis, M. bovis y M. avium (van der Geize et al., 2007). Sin embargo, cabe
209
Discusión
destacar algunas diferencias entre los genes que se han relacionado con el
catabolismo del colesterol en R. jostii RHA1 y M. smegmatis mc2155 teniendo en
cuenta sus respectivos análisis de expresión diferencial en presencia de
colesterol.
En primer lugar se ha sugerido un catabolismo distinto de los anillos C y D de
colesterol para R. jostii RHA1 frente a las especies micobacterianas (van der
Geize et al., 2007). En R. jostii RHA1, aparece inducido en colesterol el cluster
ro06687-ro06698 constituido por genes que podrían relacionarse con el
metabolismo de cicloalcanonas, entre los que se incluyen ro06698 y ro06693, que
codifican una probable monooxigenasa y una lactona hidrolasa, respectivamente,
que podrían ser identificadas con la Baeyer-Villiger monooxigenasa y la hidrolasa
típicamente asociadas con la fisión de anillos de cicloalcanonas. Por estos datos
se sugiere que este cluster podría estar implicado en la degradación del anillo
esteroideo D del DOHNAA (Figura 5 de introducción, estructura 15) (van der Geize
et al., 2007). Este cluster de genes no está conservado en las especies
micobacterianas. Los datos obtenidos en el presente trabajo sugieren que en la
mineralización del DOHNAA en M. smegmatis mc2155 están implicados los genes
MSMEG_5996-MSMEG_6017. La degradación de alcanos cíclicos y policíclicos
no se ha estudiado en profundidad, y existe una información limitada para
especular sobre los mecanismos implicados en la degradación de los anillos C y D
del colesterol, sin embargo, teniendo en cuenta que muchas proteínas codificadas
por los genes de la región MSMEG_5996 a MSMEG_6017 son similares a
enzimas asociadas con la β-oxidación de ácidos grasos, se puede asumir que la
apertura de los anillos C y D podría ser llevada a cabo por actividades tiolasa,
aunque este tipo de mecanismo de apertura mediante tiolasas no ha sido descrito
hasta la fecha para alcanos cíclicos. R. jostii RHA1 posee genes ortólogos a estos
de M. smegmatis (con la excepción notable de MSMEG_5997, que curiosamente
no está tampoco presente en M. tuberculosis, aunque sí en C. testosteroni
(orf33)), con lo cual de confirmarse su implicación en el metabolismo del DOHNAA
es posible que R. jostii RHA1 dispusiese de dos clusters distintos para la
mineralización de este compuesto.
210
Discusión
La segunda diferencia que podría dar lugar a un metabolismo distinto de los
anillos C y D en las especies micobacterianas es la presencia (observada
concretamente en M. bovis BCG y M. tuberculosis H37Rv) de un gen que codifica
una N-acetil-transferasa en el operón hsa (Anderton et al., 2006) (que como se ha
visto en este trabajo es el encargado de la transformación de 3-HSA en DOHNAA
y ácido 2-hidroxihexa-2,4-dienoico (Figura 5 de Introducción, estructuras 11-15)).
Se ha sugerido que esta enzima podría ser utilizada para transformar esta porción
de la molécula del colesterol para obtener una función alternativa a su
metabolismo completo, posiblemente relacionada con señalización o con el
mantenimiento de la integridad de la pared celular (van der Geize et al., 2007). Sin
embargo, un análisis detallado muestra que aunque en M. bovis BCG sí existe
este gen al final del operón posiblemente ortólogo a hsa, en M. tuberculosis
H37Rv no. La afirmación de la presencia de una N-acetil-transferasa en el operón
hsa de M. tuberculosis H37Rv (Anderton et al., 2006) está basada en la primera
anotación completa del genoma de M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998), que
fue posteriormente reanotado (Camus et al., 2002). En esta segunda anotación, la
longitud del gen nat (el supuesto codificante de una N-acetil-transferasa en este
operón) fue acortada 49 aminoácidos. Consultando la anotación del genoma de M.
tuberculosis H37Rv en las bases de datos (Tuberculist, CMR) se observa que este
gen no está formando parte de este operón, encontrándose a 286 pb del mismo
(según Tuberculist) o a 181 pb (y divergente) según el servidor CMR. Además, ya
es un hecho confirmado que M. tuberculosis H37Rv puede utilizar el colesterol
como fuente de carbono y energía (Pandey y Sassetti, 2008), y por lo tanto este
hecho apoya que su metabolismo no difiera del llevado a cabo por especies no
patógenas como R. jostii RHA1 o M. smegmatis mc2155, que tampoco posee un
gen en el operón hsa que codifique una N-acetil-transferasa. No obstante, la
presencia del gen nat en M. bovis BCG, especie que también es capaz de crecer
en colesterol, supone una incógnita.
Otras diferencias entre el metabolismo del colesterol de R. jostii RHA1 y M.
smegmatis mc2155 han sido observadas a partir de nuestros ensayos de
expresión diferencial durante el crecimiento en este esteroide.
211
Discusión
En primer lugar cabe destacar un conjunto de genes controlados por KstR y
con expresión diferencial en colesterol en M. smegmatis mc2155 demostrada
mediante microarrays que sin embargo no aparecen inducidos en R. jostii RHA1
mediante la técnica de microarrays. Estos genes se muestran en la tabla 18 del
apartado 3.1 de Resultados. Se desconoce la posible función para la mayoría de
los genes situados dentro de este conjunto; sin embargo cabe destacar dos de los
genes aquí presentes. El primero de ellos, MSMEG_0217, que codifica una
alcohol deshidrogenasa B, presenta una inducción muy elevada en colesterol, y su
mutagénesis afecta al crecimiento de M. smegmatis en el esteroide, lo que apoya
su implicación directa en esta ruta degradativa; curiosamente, su probable
ortólogo en R. jostii RHA1 ro01205 (67% de identidad cuantificada por ClustalW)
no se induce en presencia de colesterol (van der Geize et al., 2007). El segundo
de los genes que cabe destacar es MSMEG_5228, que codifica la proteína 3-β
HSDMS, una de las encargadas de catalizar el paso de colesterol a 4-colesten-3-
ona en M. smegmatis. Este gen no presenta un claro ortólogo en R. jostii RHA1.
Cabría esperar que la enzima encargada de oxidar el colesterol en esta bacteria
fuera, al igual que sucede en R. equi, una colesterol oxidasa (Navas et al., 2001).
Y efectivamente, dentro de los genes asignados específicamente a la ruta de
degradación del colesterol en R. jostii RHA1 se encuentra una colesterol oxidasa,
codificada por el gen ro04305 (van der Geize et al., 2007). Este gen, además de
presentar similitud con colesterol oxidasas de distintas especies de Rhodococus y
de otros actinomicetos degradadores de colesterol como Gordonia
cholesterolivorans (Drzyzga et al., pendiente de publicación), comparte una
identidad del 61% con la proteína ChoDMS, cuya implicación en este paso
enzimático se cuestiona en este trabajo. Los resultados obtenidos en esta tesis
parecen apuntar a que el género Rhodococcus y otras actinobacterias como
Gordonia utilizan enzimas tipo colesterol oxidasa en esta ruta catabólica, mientras
otros, como el género Mycobacterium o Nocardia (Horinouchi et al., 1991) utilizan
enzimas tipo colesterol deshidrogenasa NAD(P) dependientes.
En el análisis de la expresión diferencial en colesterol de M. smegmatis
también nos encontramos un caso opuesto a los mencionados anteriormente: un
operón regulado por KstR, inducido en R. jostii RHA1 pero no en M. smegmatis: el
212
Discusión
operón mce4, del que se ha comprobado que está implicado en el transporte de
colesterol en R. jostii RHA1 (Mohn et al., 2008) y en M. tuberculosis (Pandey y
Sassetti, 2008) y que curiosamente apenas se encuentra inducido en colesterol en
M. smegmatis, apreciándose tan sólo una leve inducción del mismo mediante
RTq-PCR (apartado 3.2 de resultados). Este resultado contrasta con la inducción
que se esperaba encontrar en colesterol de un operón especializado para el
transporte de esteroides. Sin embargo, los resultados obtenidos en R. jostii RHA1
tampoco muestran una inducción elevada de este cluster, siendo el valor más
elevado de fold change de 3,6 (yrbE4A; ro04696), e incluso los dos últimos genes
del operón (mas4A y mas4B; ro04704 y ro04705, respectivamente) aparecen
ligeramente reprimidos en colesterol (van der Geize, 2007). Por lo tanto, el hecho
de que este operón no se induzca en colesterol de manera apreciable ni en R.
jostii RHA1 ni en M. smegmatis podría ser debido a que se esté expresando de
manera basal para poder captar de una manera más rápida y por tanto eficiente el
esteroide que en momentos puntuales podría ponerse en contacto con la bacteria
en el medio ambiente. De hecho, en R. jostii RHA1 se han hecho ensayos de
transporte de colesterol por el operón mce4 con células no inducidas en el
esteroide (Mohn et al., 2008) y el sistema de transporte funciona igualmente, lo
que implica la existencia de una expresión basal del mismo.
De las proteínas de esta ruta catabólica conservadas en R. jostii RHA1 y las
micobacterias, las proteínas Mce4 son las que presentan una identidad más baja,
lo que podría reflejar funciones distintas en los dos tipos de organismos aparte de
su implicación en el transporte del colesterol, que es común para ambos. Aunque
estas diferencias entre las proteínas Mce4 homólogas también podría reflejar las
diferencias del medio del que estas bacterias obtienen el colesterol (van der Geize
et al., 2007).
Otro grupo de genes que aparece inducido en colesterol en M. smegmatis
mc2155 pero no en R. jostii RHA1 (a excepción del operón MSMEG_1971-
MSMEG1979 y el gen adyacente MSMEG_1970), se muestra en la tabla 19 del
apartado de resultados 3.1. Estos genes no se encuentran regulados por KstR o
KstR2, y de ellos una gran mayoría además de inducirse en colesterol, presentan
la característica de que tienen una elevada expresión basal en glicerol, lo que
213
Discusión
sugiere que su mayor inducción en el esteroide puede ser debida a condiciones de
estrés y no a una implicación directa en su metabolismo. Además, no se ha podido
asignar ninguna posible función claramente relacionada con el catabolismo del
colesterol a estos genes. El hecho curioso de que los únicos genes que parecen
inducirse como respuesta a estrés en R. jostii RHA1 de manera común con M.
smegmatis sean los ortólogos a MSMEG_1970-MSMSEG_1979 podría indicar que
el género Rhodococcus es más resistente a los posibles daños causados en la
pared celular por el colesterol, o simplemente que ambos géneros de
microorganismos tienen una maquinaria genética de respuesta a estrés por
compuestos hidrofóbicos distinta.
Existen dos excepciones dentro de este grupo de genes referidas a genes no
relacionados con estrés; en primer lugar el gen MSMEG_1366, que codifica la
probable ATPasa implicada en el sistema de transporte de colesterol. El supuesto
ortólogo en R. jostii RHA1 (identidad del 74% a nivel de secuencia de aminoácidos
cuantificado por ClustalW) es el gen ro02744. El hecho de que no aparezca
inducido en colesterol puede deberse, como también hipotetizamos para la
discreta inducción en colesterol del operón mce4 en ambas especies, a que en R.
jostii RHA1 se exprese de manera basal para poder captar de manera eficiente el
colesterol del medio. También podría suceder que esta actividad enzimática esté
catalizada por una enzima diferente a la de M. smegmatis en R. jostii RHA1. Sin
embargo, ninguna enzima ATPasa se ha visto inducida en colesterol en R. jostii
RHA1 cuando se analiza la expresión mediante la técnica de microarrays (van der
Geize et al., 2007).
La segunda excepción es el operón MSMEG_6648-MSMEG_6645, que
puede estar implicado en el catabolismo del propionil-CoA (Pandey y Sassetti,
2008). En este caso, R. jostii RHA1 ni siquiera posee ortólogos a estos genes, lo
que sugiere que en esta bacteria el metabolismo del propionil-CoA procedente de
la degradación del colesterol es diferente al descrito para M. smegmatis.
Dentro de las semejanzas entre ambas rutas, cabe destacar la presencia de
varios grupos de genes en cada una de ellas que parecen implicados en una
misma función: la degradación de la cadena lateral esteroidea. Esta redundancia
en un proceso específico pone de manifiesto la importancia que este paso tiene en
214
Discusión
la degradación de las moléculas esteroideas, y sugiere un gran potencial
catabólico.
En el presente estudio también se ha profundizado en el análisis de la
regulación del catabolismo del colesterol mediada por KstR tomando como modelo
de estudio el gen MSMEG_5228 que codifica la enzima 3-β HSDMS.
Mediante estudios de retardo en gel (EMSA) se confirmó la unión específica
del represor a una sonda de DNA formada por la región promotora del gen
MSMEG_5228. Posteriormente los ensayos de footprinting demostraron por
primera vez la unión del regulador al motivo de unión predicho in silico. Sin
embargo, los resultados más sorprendentes se obtuvieron a partir del estudio
mediante primer extension de la región promotora del gen MSMEG_5228. Este
estudio mostró que el mRNA que se transcribe a partir de este gen es leaderless,
es decir, carece de una región 5’ no traducida (5’UTR) y comienza directamente
con el codón de iniciación 5’AUG. Los mRNAs leaderless son muy frecuentes en
bacterias Gram-positivas como Streptococci, Lactococci, Streptomyces y
Corynebacterium (Janssen, 1993), siendo menos comunes en bacterias Gram-
negativas. El estudio de genomas completos de algunas arqueas sugiere que los
mRNAs leaderless son también bastante comunes en este dominio (Slupska et al.,
2001; Tolstrup et al., 2000). El hecho de que mRNAs leaderless heterólogos
derivados de una bacteria puedan ser transcritos con éxito en sistemas eucariotas
y arqueas justifica la suposición de que los mRNAs leaderless actuales podrían
ser remanentes de mRNAs ancestrales (Moll et al., 2002). La presencia de ocho
tránscritos leaderless en el pequeño genoma de las mitocondrias humanas
(Janssen, 1993) apoya esta hipótesis.
El hecho de la existencia de un mRNA leaderless dentro de los genes
relacionados con el catabolismo del colesterol nos impulsó a realizar un análisis in
silico de las regiones promotoras de otros genes/operones relacionados con este
metabolismo para comprobar si se trata de un hecho extendido.
Dentro de los genes/operones a analizar se seleccionaron tanto genes
regulados por KstR (como es el caso del gen MSMEG_5228) como por KstR2 y
también un gen no regulado por ninguno de estos dos represores pero sí inducido
en colesterol (MSMEG_1366). En total se analizaron 17 genes. Como control se
215
Discusión
estudiaron otros 17 genes adicionales no relacionados con el catabolismo del
colesterol que fueron seleccionados al azar.
Los resultados para los genes relacionados con el metabolismo del colesterol
(Tabla 24) muestran que por una parte, la mayoría de los genes/operones
investigados presentaron en su región promotora una secuencia que podría actuar
como sitio de unión al ribosoma (RBS) y regiones −10 y −35 que se ajustan a las
posiciones esperadas. Sin embargo se encontraron otros 5 genes además de
MSMEG_5228 que podrían dar lugar a tránscritos leaderless. Todos estos casos
se corresponden con genes regulados por KstR o KstR2, y en ellos la secuencia
consenso de unión del regulador se sitúa entre las supuestas cajas −10 y −35,
salvo en uno de los genes, en que se situaría 8 pb secuencia arriba de la región
−35 (MSMEG_6013). De los genes analizados, los regulados por KstR que no
presentan un posible RBS en su región promotora (MSMEG_0217, MSMEG_5228,
MSMEG_5520), curiosamente se sitúan a lo largo del genoma de M. smegmatis, y
no dentro de ninguno de los dos grandes clusters de catabolismo del colesterol
descritos en este trabajo (véase apartado 3.1). Este resultado sugería que la
ausencia de RBS quizás fuese una característica común a los genes regulados
por KstR no agrupados en uno de los dos grandes clusters de catabolismo de
colesterol, pero sin embargo el gen MSMEG_0305 que entra dentro de este grupo,
sí presenta un posible RBS en su promotor.
Caso especialmente curioso es el de los genes regulados por KstR2, que
como ya se ha explicado en el apartado 5.3 se agrupan en 5 operones, 4 de ellos
divergentes dos a dos, por lo que existen 3 secuencias de unión a KstR2 en el
genoma. Los resultados indican que en el caso de los operones que comparten
región intergénica por situarse divergentes en el genoma, uno de ellos presenta
RBS, mientras el otro no (el operón que comienza con el gen MSMEG_6000 no
presenta RBS, mientras que su operón divergente que comienza con el gen
MSMEG_6001 sí, y lo mismo sucede con los operones que comienzan con
MSMEG_6012, que no presenta RBS, y MSMEG_6013, que sí). En el caso de los
genes divergentes MSMEG_6041/MSMEG_6042 que comparten secuencia de
unión a KstR ambos presentan RBS.
216
Discusión
Por último, cabe mencionar que el gen kstR (MSMEG_6042) sí presenta RBS
en su promotor, mientras que el gen kstR2 (MSMEG_6009) no. Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6042
Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6041
Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6038
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6013
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6012
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6009
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6001
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6000
Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5925
Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5920
Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5906
Regulado por KstR. Adyacente al cluster 2SíMSMEG_5902
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5520
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5228
No regulado por KstR ni KstR2. No situado en cluster 1 o 2SíMSMEG_1366
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2SíMSMEG_0305
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_0217
Características del gen/operónPresencia deposible RBS
Gen analizado(región
promotora)
Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6042
Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6041
Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6038
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6013
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6012
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6009
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6001
Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6000
Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5925
Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5920
Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5906
Regulado por KstR. Adyacente al cluster 2SíMSMEG_5902
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5520
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5228
No regulado por KstR ni KstR2. No situado en cluster 1 o 2SíMSMEG_1366
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2SíMSMEG_0305
Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_0217
Características del gen/operónPresencia deposible RBS
Gen analizado(región
promotora)
Tabla 24. Análisis de la región promotora de genes relacionados con el catabolismo del colesterol.
Los resultados obtenidos en el caso de los genes no relacionados con el
metabolismo del colesterol son así mismo dispares; de las 17 regiones promotoras
analizadas 9 presentaron un posible sitio RBS, mientras que las 8 restantes no
(Tabla 25).
217
Discusión
O-metiltransferasa, familia de proteínas 3NoMSMEG_5003
Proteína periplásmica de unión de transportador ABC YphSíMSMEG_3999
Proteína reguladora del operón glicerolSíMSMEG_2125
selenido, agua diquinasaNoMSMEG_1852
Proteína de catabolismo de rizopinaSíMSMEG_1304
Deshidrogenasa de cadena cortaSíMSMEG_1114
Proteína hipotéticaNoMSMEG_0938
serina/treonina-proteína quinasa PknDNoMSMEG_0886
3-oxoacil-[ proteina transportadora de acilo] reductasaNoMSMEG_0715
Proteína de la familia glioxilasaSíMSMEG_0608
Posible factor sigma RpoE1NoMSMEG_0574
Oxidorreductasa FAD dependienteNoMSMEG_0481
2-nitropropano dioxigenasaSíMSMEG_0332
Tauria dioxigenasa alfa-cetoglutarato-dependienteSíMSMEG_0181
Fosfoenolpiruvato-proteína fosfotransferasaSíMSMEG_0088
Proteína hipotéticaNoMSMEG_0041
Formil transferasaSíMSMEG_0014
Función del genPresencia de posible RBS
Gen analizado(región promotora)
O-metiltransferasa, familia de proteínas 3NoMSMEG_5003
Proteína periplásmica de unión de transportador ABC YphSíMSMEG_3999
Proteína reguladora del operón glicerolSíMSMEG_2125
selenido, agua diquinasaNoMSMEG_1852
Proteína de catabolismo de rizopinaSíMSMEG_1304
Deshidrogenasa de cadena cortaSíMSMEG_1114
Proteína hipotéticaNoMSMEG_0938
serina/treonina-proteína quinasa PknDNoMSMEG_0886
3-oxoacil-[ proteina transportadora de acilo] reductasaNoMSMEG_0715
Proteína de la familia glioxilasaSíMSMEG_0608
Posible factor sigma RpoE1NoMSMEG_0574
Oxidorreductasa FAD dependienteNoMSMEG_0481
2-nitropropano dioxigenasaSíMSMEG_0332
Tauria dioxigenasa alfa-cetoglutarato-dependienteSíMSMEG_0181
Fosfoenolpiruvato-proteína fosfotransferasaSíMSMEG_0088
Proteína hipotéticaNoMSMEG_0041
Formil transferasaSíMSMEG_0014
Función del genPresencia de posible RBS
Gen analizado(región promotora)
Tabla 25. Análisis de la región promotora de genes no relacionados con el catabolismo del colesterol.
La eficiencia traduccional de los mRNAs leaderless comparada con la de los
RNAs bacterianos canónicos no está intrínsecamente determinada, pero parece
que puede alterarse dependiendo de la disponibilidad de los componentes de la
maquinaria traduccional. Así, estudios en E. coli han mostrado que el ratio de los
factores de iniciación IF2 e IF3 juega un papel decisivo en la iniciación de la
traducción de mRNAs leaderless (Grill et al., 2001; Moll et al., 2002). Por tanto, se
puede especular que la relativa deficiencia de IF3 que tiene lugar a velocidades de
crecimiento elevadas podría favorecer el incremento de la velocidad de traducción
de los mRNAs leaderless y una competición más eficiente de estos mRNAs con
los mRNAs canónicos. Un efecto similar se ha observado debido a una elevación
transitoria del nivel de IF2 (Grill et al., 2000; Grill et al., 2001), que tiene lugar
cuando las células de E. coli son sometidas a un choque de frío (Jones et al.,
1987). Así, parece concebible que cambios en las condiciones medioambientales
218
Discusión
y diferentes tipos de estrés puedan incrementar las oscilaciones transitorias de los
niveles relativos de los factores de iniciación y por tanto modular la eficiencia
traduccional de los mRNAs leaderless en bacterias. Por otra parte, parece que los
mRNAs leaderless, a diferencia de los mRNAs canónicos, no requieren de la
presencia de la proteína ribosomal S1 para su traducción (Moll et al., 2002; Tedin
et al., 1997). Existe la posibilidad de que, dado que no existen homólogos
funcionales de S1 en todos los sistemas biológicos que contienen mRNAs
leaderless, la población ribosomal sea heterogénea en lo que respecta a la
presencia de S1, y esto podría contribuir al control traduccional de estos mRNAs.
La traducción de mRNAs leaderless se ha estudiado in vivo en un rango de
temperaturas desde 25 ºC a 42 ºC (Grill et al., 2000). Los ensayos de competición
de traducción con extractos de E. coli revelaron que los mRNAs leaderless pueden
competir eficazmente a baja temperatura (25 ºC) con mRNAs canónicos, mientras
que a 42 ºC la traducción de mRNAs canónicos sobrepasa completamente a la de
los mRNAs leaderless.
La correlación inversa de la traduccionalidad de las dos clases de mRNA en
función de la temperatura se ha atribuido a la proteína ribosómica S1, cuya
actividad parece ser sensible al frío (Grill et al., 2000). Así, la reducción de la
traducción de mRNAs canónicos causada por la reducción de S1 a bajas
temperaturas parece conducir a un incremento en la traducción de mRNAs
leaderless debido a una competición reducida frente a los mRNAs canónicos (Moll
et al., 2002).
Los mRNAs leaderless identificados en bacterias hasta el momento no
codifican genes funcionalmente relacionados. Cabe señalar sin embargo que al
menos tres mRNAs leaderless de elementos genéticos accesorios, dos en E. coli
(Baumeister et al., 1991; Walz et al., 1976) y uno en Lactococcus lactis (Nauta et
al., 1996) codifican proteínas reguladoras. Para asegurar un estado latente de
estos elementos genéticos, los represores correspondientes tienen que ser
continuamente sintetizados, aunque a un nivel bajo. Se podría por tanto especular
que el hecho de ser leaderless proporciona un medio para conseguir un bajo nivel
de traducción en un rango de diferentes condiciones biológicas.
219
Discusión
El control traduccional de los mRNAs leaderless en las bacterias Gram-
positivas, entre las que incluiríamos al género Mycobacterium, así como en
arqueas requiere ser estudiado para comprobar si se lleva a cabo por los mismos
mecanismos observados en E. coli.
4. Estudio de los reguladores transcripcionales KstR y KstR2
Los reguladores KstR y KstR2 implicados en la regulación de la ruta de
degradación del colesterol pertenecen por homología de secuencia a la familia
TetR de reguladores transcripcionales. Utilizando la base de datos PROSITE, que
permite la búsqueda de dominios, familias y sitios funcionales de secuencias
proteicas y que está alojada en el servidor ExPASy, se identifica tanto en la
secuencia de KstR como en la de KstR2 el dominio HTH de la familia de
reguladores TetR. Este es un dominio de unión a DNA hélice-giro-hélice de
aproximadamente 60 residuos presente en esta familia de reguladores
transcripcionales procariotas. El motivo de unión a DNA hélice-giro-hélice se
localiza en el extremo N-terminal de estos reguladores (Aramaki et al., 1995). La
región C-terminal de los reguladores TetR contiene varias regiones que pueden
estar implicadas en i) la unión de inductores y ii) en oligomerización. La familia de
reguladores TetR incluye más de 2000 secuencias no redundantes, mientras que
la función específica regulada por los miembros de esta familia sólo es conocida
para cerca de 90 de ellos. Estas proteínas controlan genes implicados en
multiresistencia a fármacos, enzimas implicadas en distintas rutas catabólicas,
biosíntesis de antibióticos, estrés osmótico y patogenicidad en bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas (Ramos et al., 2005). Utilizando la base de datos
PROSITE no se ha encontrado ningún motivo conservado en la región C-terminal
de KstR o KstR2. Tampoco haciendo una búsqueda frente a la base de
secuencias de proteínas no redundante (nr) utilizando el programa BLASTP se
encuentra una posible similitud de estas regiones C-terminal con regiones
relacionadas con la unión a colesterol u otros esteroides derivados, que podrían
ser los inductores de esta ruta de degradación y por tanto unirse a estos
220
Discusión
represores para inhibir su unión al DNA. Ambos extremos C-terminal sólo
presentan similitud con reguladores tipo TetR de micobacterias y otros
actinomicetos principalmente, nada que las relacione con unión a esteroides, lo
que no permite hacer conjeturas acerca de la posible molécula inductora. El hecho
de no existir proteínas homólogas a la región C-terminal de estos dos reguladores
unido a la posibilidad de que estos dominios reconozcan como ligandos
estructuras esteroideas hace particularmente interesantes a estos dos reguladores
para un estudio más detallado de los mismos que incluiría su cristalización y la
posibilidad de construir a partir de los mismos sensores de estructuras
esteroideas.
Se han resuelto varias estructuras de reguladores transcripcionales TetR.
Sus dominios de unión a DNA están formados por un conjunto de tres hélices (H1-
H3) y la parte N-terminal de la siguiente hélice 4, que contribuye al centro
hidrofóbico del dominio de unión a DNA y lo une al dominio regulador (Orth et al.,
2000).
En este estudio hemos llevado a cabo la predicción de la estructura
tridimensional de KstR y KstR2 utilizando para ello el programa LOOPP, alojado
en el servidor BioHPC.
En el caso de KstR, se seleccionó como molde para la construcción del
modelo la cadena A del represor transcripcional EthR (PDB: 1T56), miembro de la
familia TetR/CamR presente en M. tuberculosis e implicado en la resistencia a
etionamida (Dover et al., 2004). El programa en este caso fue capaz de comparar
el 80 % de la secuencia de la proteína con una identidad de secuencia del 16 %.
La proteína EthR es responsable de la regulación negativa de EthA, una
monooxigenasa implicada en la activación del fármaco etionamida. Para ejercer su
acción represora EthR se une a la región intergénica situada entre los genes ethA
y ethR (Dover et al., 2004). En su dominio C-terminal, EthR presenta una larga
cavidad hidrofóbica en forma de túnel (que podría aparecer de forma similar en
KstR) que se especula que podría ser el sitio de unión de su ligando, todavía
desconocido (Dover et al., 2004). En otro trabajo sobre la estructura de EthR, se
observó la presencia de un ligando fortuito identificado como hexadecil octanoato,
221
Discusión
que induce un estado conformacional en EthR incompatible con la función
represora, lo que conduce a la inducción de ethA (Frénois et al., 2004).
En el caso de KstR2, el molde utilizado fue el del supuesto regulador
transcripcional de la familia TetR Rha06780 de Rhodococcus jostii RHA1 (PDB:
2NX4) (Zhang et al., pendiente de publicación). El programa comparó el 86 % de
la secuencia de la proteína con una identidad de secuencia del 22 %.
En las figuras 71 y 72 se representan los modelos de KstR y KstR2,
respectivamente, junto con sus proteínas molde correspondientes. En rojo se ha
marcado la región predicha por el programa PROSITE para ser el dominio de
unión a DNA HTH.
A B Figura 71. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína KstR tomando como modelo el represor transcripcional tipo TetR EthR de Mycobacterium tuberculosis (PDB: 1T56). A. La estructura corresponde con el modelo propuesto para KstR. B. Estructura del regulador
transcripcional EthR de M. tuberculosis (PDB: 1T56) (Dover et al., 2004). Las zonas de las proteínas
señaladas en rojo se corresponden con el dominio HTH de unión a DNA encontrado para ambas
proteínas utilizando la base de datos PROSITE.
Como se puede observar, los modelos de ambas proteínas presentan una
región que se ajusta muy bien al dominio HTH de los reguladores tipo TetR.
222
Discusión
En el caso concreto de KstR ya se había demostrado que se une a las
regiones operadoras de los distintos promotores que regula en forma de dímero
(Kendall et al., 2007), como la mayoría de los reguladores de la familia TetR
(Ramos et al., 2005). En este trabajo se ha demostrado que el regulador KstR se
une a su región operadora en el promotor del gen MSMEG_5228 y que esta unión
es específica. Concretamente KstR se une a una región de 31 nucleótidos,
localizados entre la posición −5 y −35 respecto al codón de inicio ATG de
MSMEG_5228. Esta región solapa con las posibles cajas −10 y −35, lo que
sugiere que la unión de KstR al operador impediría la unión de la RNA polimerasa
y con ello el inicio de la transcripción desde el promotor. Concentraciones de hasta
4 mM de colesterol no causan la desunión de KstR en este promotor. Los ensayos
de inhibición de retardo frente a un posible inductor de la ruta se deberían efectuar
en un futuro también con intermediarios de la ruta de degradación como por
ejemplo la 4-colesten-3-ona, o AD o ADD, y también con ácido palmítico, el cual
se ha demostrado que induce 22 genes del regulón KstR (Kendall et al., 2007). Si
la 4-colesten-3-ona fuese la molécula inductora de la ruta quizás se explicaría la
existencia de enzimas redundantes encargadas de su producción a partir del
colesterol, ya que sin este compuesto no se podría inducir la ruta de degradación
del colesterol.
223
Discusión
A B
Figura 72. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína KstR2 tomando como modelo el supuesto regulador transcripcional de la familia TetR Rha06780 de Rhodococcus jostii RHA1 (PDB: 2NX4). A. La estructura corresponde con el modelo propuesto para KstR2. B. Estructura del supuesto regulador transcripcional tipo TetR de Rha06780 de Rhodococcus jostii
RHA1 (PDB: 2NX4) (Zhang et al., pendiente de publicación). Las zonas de las proteínas señaladas
en rojo se corresponden con el dominio HTH de unión a DNA encontrado para ambas proteínas
utilizando la base de datos PROSITE.
Como se ha indicado con anterioridad, 22 de los genes regulados por KstR e
inducidos en colesterol también se inducen en ácido palmítico (ácido graso
saturado de 16 átomos de carbono) en M. tuberculosis, incluido el propio KstR
(Kendall et al., 2007; Schnappinger et al., 2003), por lo que se sugirió que el
regulón KstR podría estar implicado en el transporte y catabolismo de una
variedad de lípidos además del colesterol (Kendall et al., 2007). No obstante, no
se puede descartar que la inducción de estos genes por palmitato se lleve a cabo
de manera inespecífica. El hecho de que el palmitato no induzca todos los genes
del regulón KstR parece indicar que no sería el efector para el regulador, o bien la
existencia de otros posibles sistemas reguladores además del de KstR.
224
Discusión
También se ha observado que los genes homólogos a MSMEG_6008 y
MSMEG_6013, que están bajo el control de KstR2, aparecen inducidos en
presencia de palmitato en M. tuberculosis (Schnappinger et al., 2003). El hecho de
que KstR2 también sea capaz de interaccionar con palmitato es intrigante, ya que
los genes controlados por él parecen estar implicados en la degradación del
DOHNAA, y cabría esperar que una molécula similar a ésta, que no posee una
cadena lateral larga, fuera el inductor de este regulador.
Se ha demostrado que ambos reguladores actúan independientemente el
uno del otro, ya que la expresión de los genes del regulón de KstR2 no está
afectada por una deleción en el gen que codifica KstR (Kendall et al., 2007), y así
mismo la expresión del gen MSMEG_6038, controlado por KstR, no se ve
afectada por un mutante en KstR2 (Kendall et al., 2010). Tanto KstR como KstR2
se autorregulan reprimiendo su propia expresión (Kendall et al., 2007; Kendall et
al., 2010). Esta es una característica común en la regulación génica, y ocurre en
más del 40% de los factores transcripcionales en E. coli (Shen-Orr et al., 2002).
Recientemente se ha demostrado que la autorregulación negativa acelera el
tiempo de respuesta, reduce el ruido producido por la expresión genética
estocástica y es económico metabólicamente para la célula (Nevozhay et al.,
2009).
El hecho de que los genes responsables del catabolismo del colesterol estén
controlados por, al menos, dos reguladores transcripcionales distintos parece
indicar una inducción secuencial de los regulones. Los datos sugieren que el
primero en inducirse sería el regulón de KstR, que aparentemente contiene los
genes responsables de la degradación de la cadena lateral del colesterol y los
genes necesarios para las consiguientes transformaciones desde el intermediario
AD (Figura 5 de introducción, estructura 9A) hasta DOHNAA (Figura 5 de
introducción, estructuras 15), propionil-CoA y piruvato. Posteriormente se podría
inducir el regulón de KstR2, que parece contener los genes necesarios para la
transformación de DOHNAA hasta succinato. Esta inducción secuencial de genes
metabólicos podría ayudar al ahorro energético de la célula. Así mismo podría
sugerir que ambos represores están regulados por distintas moléculas efectoras,
que en el caso de KstR2 podría ser DOHNAA.
225
Discusión
En conclusión, los resultados presentados en esta tesis han permitido
avanzar significativamente en el conocimiento global del metabolismo aeróbico del
colesterol principalmente en Mycobacterium smegmatis, aunque muchos de los
hallazgos son también extrapolables a la bacteria patógena Mycobacterium
tuberculosis, cuyo metabolismo del colesterol ha cobrado recientemente una gran
importancia. Al mismo tiempo este trabajo ha aportado una cantidad notable de
material que presenta un gran interés para el desarrollo de futuros trabajos de
investigación. Así mismo, el estudio de una ruta de degradación en un
microorganismo Gram-positivo es un tema pionero en nuestro laboratorio, lo que
ha servido para el aprendizaje y utilización de nuevas técnicas de trabajo
diferentes a las utilizadas normalmente en nuestro grupo.
226
Conclusiones
VI.CONCLUSIONES
227
Conclusiones
228
Conclusiones
VI. CONCLUSIONES
El trabajo descrito a lo largo de esta Tesis ha dado lugar a las siguientes
conclusiones:
1. Micobacterium smegmatis mc2155 es capaz de utilizar diferentes compuestos
con estructura esteroidea como única fuente de carbono y energía tales como
colesterol, 4-colesten-3-ona, ADD, AD, testosterona y β-estradiol, siendo mayor el
rendimiento obtenido con colesterol y 4-colesten-3-ona. Se han identificado 89
genes en el genoma de M. smegmatis mc2155 que presentan una expresión
diferencial en colesterol frente a glicerol, de los cuales al menos 59 genes parecen
implicados directamente en el metabolismo, regulación o transporte del colesterol.
Estos genes se encuentran principalmente agrupados en 2 grandes clusters. Sin
embargo, fuera de estos dos clusters también aparecen genes inducidos en este
esteroide, y para algunos de ellos su implicación en el metabolismo del colesterol
se ha constatado.
2. Se han identificado al menos dos genes en el genoma de M. smegmatis mc2155
implicados en la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona: MSMEG_5228
y MSMEG_5233, que codifican las enzimas 3-β HSD y SDRMS MS respectivamente,
que pueden englobarse dentro de la familia de las deshidrogenasas de cadena
corta. La actividad enzimática de estas dos proteínas ha sido comprobada
mediante ensayos in vitro.
3. Resulta improbable que el gen homólogo de choD contenido en M. smegmatis,
MSMEG_1604, codifique una colesterol oxidasa, ya que no ha podido asignarse a
este gen una actividad colesterol oxidasa ni in vivo ni in vitro y el gen no se induce
selectivamente en presencia de colesterol.
4. El regulador transcripcional KstR está implicado mayoritariamente en la
represión de genes que se inducen en presencia de colesterol, lo que sugiere que
229
Conclusiones
su acción se ejerce exclusivamente sobre genes relacionados con su catabolismo
y no sobre genes adicionales relacionados con el metabolismo de otros lípidos,
como había sido propuesto por otros autores.
5. Se ha confirmado la interacción de la proteína KstR con el promotor P5228 del
gen MSMEG_5228 en su región operadora mediante estudios de footprinting y
retardo en gel. Esta región operadora es una secuencia palindrómica de 31 pb
centrada en la posición −5 respecto al inicio de la transcripción. Así mismo se ha
comprobado que el mRNA derivado de la transcripción de este gen es leaderless,
ya que la posición +1 coincide con el primer nucleótido del codón de inicio del gen.
6. El regulador KstR2 es un represor transcripcional implicado en la regulación de
genes relacionados con el catabolismo del colesterol. Mediante la técnica de
microarrays se han identificado 15 genes regulados por KstR2.
230
Bibliografía
VII.BIBLIOGRAFÍA
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Bibliografía
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