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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
Desarrollo, Validación y Aplicación de ensayos analíticos para péptidos y proteínas, farmacológicamente activas, utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución. Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Ciencias Farmacéuticas, por
CRISTÓBAL ANTONIO VALLEJOS RAMOS DIRECTOR DE TESIS Dra. Maria Nella Gai Hernández
Santiago - Chile 2007
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGISTER
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Magister presentada por el candidato:
CRISTÓBAL ANTONIO VALLEJOS RAMOS Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis para optar al grado de Magister en Ciencias Farmacéuticas, en el examen de defensa de Tesis rendido el día de del 2007. ________________________________________________________________________________ DIRECTOR DE TESIS Dra. María Nella Gaí Hernández ______________________ COMISIÓN INFORMANTE DE TESIS Prof. Inés Ruiz Alvarez (Presidente) ______________________
Prof. Iván C. Sturm Schaub ______________________
Prof. Fernando López Silva ______________________
Prof. María Teresa Andonaegui ______________________
“Para mi familia, en especial mi esposa, mis Hijos y mis Padres
que tanto Amo”.
“El amor es el gozo de los buenos, la maravilla de los sabios, el
asombro de los Dioses”
Platón
AGRADECIMIENTO
A la Gerencia de la Corporación Farmacéutica Recalcine S.A., por darme todas las facilidades para
emplear equipos e instalaciones durante el desarrollo de este trabajo de Tesis, para optar al Grado
de Magister en Ciencias Farmacéuticas.
A mi Director de Tesis Dra. María Nella Gaí Hernádez, por su guía, apoyo incondicional y por
confiar siempre en la finalización exitosa de este trabajo de investigación .
A mi querido amigo Profesor Ronny Bocic Vildosola, por su paciente compañía y estimulo
constante en la realización de este trabajo.
A mi colega, Químico Farmacéutico Andrés Navarrete, por su apoyo, consejos y estimulo para
finalizar esta Tesis.
A Carmen Cecilia Jeldrez, por su apoyo y aporte en la realización de todo el trabajo de
investigación.
A Jeannette Labra, por su colaboración en el escrito final de esta Tesis.
A todos los analistas y amigos del Departamento de Control de Calidad de Laboratorios Lafi, que
me ayudaron y colaboraron en la realización del trabajo de investigación plasmado finalmente en
esta Tesis.
A mis muy queridos amigos, por mis prolongadas ausencias debido al tiempo que requirio mi
trabajo de Tesis.
INDICE GENERAL Página
Indice General
Abstract 2
Resumen 4
Introducción 6
Fundamento del trabajo efectuado y objetivos del estudio 11
Hipótesis 18
Objetivo General 18
Objetivos Específicos 18
Materiales y Métodos 19
Materiales 19
Protocolo para la validación analítica de proteínas y péptidos 20
Equipos Utilizados 20
Parámetros de la validación 21
Selectividad 21
Linealidad 22
Exactitud 23
Precisión 25
Límite de Detección y Cuantificación 26
Características de las Insulinas 28
Características de las Calcitonina 31
Características de la Desmopresina 32
Resultados 34
Validación Insulina Humana
(Primer ensayo, siguiendo la técnica de la USP 27)
34
Composición del producto 34
Metodología empleada 34
Resultados de la validación 39
Página
Validación Insulina Humana
(Segundo ensayo, TFA-Gradiente)
49
Composición del Producto 49
Metodología Empleada 49
Resultados de la validación 53
Validación Insulina Lispro 61
Composición del Producto 61
Metodología Empleada 61
Resultados de la validación 65
Validación Calcitonina 72
Composición del producto 72
Metodología Empleada 72
Resultados de la validación 76
Validación Desmopresina 83
Composición del producto 83
Metodología Empleada 83
Resultados de la validación 87
Discusión de los resultados 95
Conclusiones 99
Referencias 100
Anexos 104
2
Abstract
Nowadays, the validation of analytical methods is more than a necessity. It’s a mandatory
practice in every laboratory of analysis in order to guarantee the quality of the products
manufactured by the pharmaceutical industry.
Validation is the process that allows to verify if a specific method is appropriate to solve an
specific analytical problem. Partial or complete validation of official compendial methods is also
necessary as the only way to establish the parameters of an analytical validation.
In this work the following hypothesis was tested: using high performance liquid chromatography
with UV detection and making an appropriate selection of chromatographic columns, is possible
the development and validation of simple, fast and specific analytical methods in order to
quantify peptidic drugs in pharmaceutical dosage forms.
Consecuently, the specific aims of this work were: to study the experimental conditions for the
development and validation of HPLC methods for the assay of human insulin, lispro insulin,
desmopresin and calcitonin in pharmaceutical dosage forms.
No stability problems were found in the peptides studied in this work, therefore no special
precautions in sample handling were needed. Undoubtedly, this behavior is attributable to the
characteristics of each peptide. It is not possible to make a generalization, but we can assert that
human insulin, lispro insulin, calcitonin and desmopresin remain stable for several days at room
temperature in the solvents indicated in each methodology for each drug.
The use of appropriate columns for high molecular weight peptides as Calcitonin and Insulin,
long and short chain, C-4 or C-8, with a pore size over 100 Aº (specifically 300 Aº, used in this
work) allowed the development of reliable analytical techniques, on times according to the needs
of a high demanding work quality control laboratory.
The analytical techniques developed in this work for Human Insulin, Lispro Insulin, Calcitonin
and Desmopresin were validated for its use in routine analysis of the pharmaceutical products
3
containing those peptides. All the parameters involved in the validation of the analytical
methodology, according the USP Category I classification, were established for each drug.
Additionally, detection and quantitation limits were determined.
The experience obtained in the handling of adequate solvents to dissolve the samples and to
form the mobile phases and the type of column (filling and length) will allow a faster
development and validation of analytical techniques for other peptides in the future.
4
Resumen Hoy en día la validación de los métodos analíticos es más que una necesidad: es una exigencia y
una práctica necesaria en todos los laboratorios de análisis que pretendan garantizar la calidad
de los productos que elaboran.
La validación es el proceso que permite verificar que un método es adecuado, para resolver un
problema analítico particular, incluso es necesaria la validación de métodos considerados
oficiales, ya sea en forma parcial o completa, como única forma de conocer los parámetros
exigidos en una validación analítica.
En este trabajo la siguiente hipótesis fue examinada: aplicando cromatografía líquida de alta
resolución con detector UV y seleccionando adecuadamente las columnas cromatográficas, es
posible desarrollar metodologías analíticas sencillas, rápidas y específicas para cuantificar
fármacos de naturaleza polipeptídica en formas farmacéuticas.
Consecuentemente los objetivos específicos de este trabajo fueron: estudiar las condiciones
experimentales para el desarrollo y validación por HPLC para métodos de análisis para insulina
humana, insulina lispro, desmopresina y calcitonina en sus respectivas formas farmacéuticas.
En el rango de péptidos estudiados no se encontraron grandes problemas de estabilidad que
obligaran a tomar precauciones especiales en el manejo de las muestras, pero sin duda esto más
bien recae en las características particulares de cada péptido y no se puede generalizar, pero sí se
puede asegurar que la insulina humana, la insulina lispro, la calcitonina y la desmopresina, se
mantienen estables por varios días, incluso a temperatura ambiente, disueltas en los solventes
indicados en cada metodología, parte de este trabajo.
El empleo de columnas apropiadas, para péptidos de alto peso molecular, como calcitonina e
insulinas, columnas largas y de cadena corta C-4 o C-8 con un tamaño de poro sobre 100 A°,
por ejemplo de 300 A°, permite montar técnicas analíticas , confiables, de buena resolución y
rápido desarrollo, absolutamente validables para su empleo en análisis de rutina en productos
farmacéuticos que contengan estas moléculas.
5
Se estableció un método preciso y confiable, para el análisis de todos los péptidos estudiados:
insulina humana, insulina lispro, calcitonina y desmopresina , para ser aplicada en su forma
farmacéutica comercial.
Se estudiaron todos los parámetros involucrados en la validación de cada una de las
metodologías analíticas, para cada uno de los péptidos involucrados en el estudio, logrando
finalmente validar los métodos de análisis.
La experiencia lograda en el manejo de solventes adecuados, para disolver las muestras y para
formar las fases móviles, como también el tipo de columna (relleno y largo), sin duda permitirá
el desarrollo más rápido y la validación de técnicas analíticas para otros péptidos que se deseen
evaluar en el futuro.
6
INTRODUCCIÓN Una de las cualidades más importantes de toda Empresa Farmacéutica es la calidad de los
productos que manufactura, ya que de esto dependerá tanto el prestigio como el desarrollo
económico y el crecimiento de la misma, con medicamentos de calidad y al alcance de la
población. Atendiendo a esta necesidad se han venido desarrollando diferentes normas y
reglamentos establecidos por instituciones internacionales, tales como la FDA y la OMS
(1,2), normas recogidas por las diferentes Farmacopeas a nivel mundial(USP; BP y EP), para
lograr así la mejor calidad de los distintos productos farmacéuticos. La aplicación de un sistema
integral de garantía de la calidad en una empresa farmacéutica, incide en la aplicación de las
buenas prácticas de laboratorio (BPL), como también en las buenas prácticas de manufactura
(GMP) (3-5)
Una de las herramientas con las que se cuenta para asegurar la calidad de los productos
farmacéuticos es la validación de los procedimientos de manufactura y la validación de las
metodologías analíticas, por lo cual, la adopción de un nuevo método analítico debe estar
soportado en suficientes datos de laboratorio, lo que se traduce finalmente en una validación
bien documentada, que cumpla con los requisitos establecidos, para que un método sea
reproducible y confiable (6-8)
Hoy en día la validación de los métodos analíticos es más que una necesidad: es una exigencia y
una práctica necesaria en todos los laboratorios de producción farmacéuticos, que pretendan
garantizar la calidad de los productos que elaboran (1,6,7)
La validación es el proceso que permite verificar que un método es adecuado, para resolver un
problema analítico particular, incluso se recomienda la validación de métodos considerados
oficiales, ya sea en forma parcial o completa, como única forma de conocer los parámetros
exigidos en una validación analítica(7)
El único modo de tener resultados analíticos confiables es mediante la validación de las
metodologías, sumado a otras actividades, tales como: mantención y calibración de los
7
instrumentos, uso de estándares, todas estas actividades están englobadas en lo que se denomina
“ Aseguramiento o garantía de la Calidad”(6,7)
Los resultados obtenidos de los métodos analíticos validados, confieren un elevado grado de
confianza y sus valores son comparables entre sí.
El desarrollo y la validación de métodos analíticos para fármacos peptídicos, como son la
insulina humana, insulina lispro, calcitonina y desmopresina, representa un gran desafío. Por sus
características peptídicas, son más inestables que la mayoría de los fármacos de naturaleza no
peptídica y además son difíciles de separar. El fármaco activo presenta características muy
similares a la de los productos de degradación y en general presentan una limitada absorbancia
al detector ultravioleta.
Es conocido que la mayoría de las proteínas tienen una absorción aceptable a longitudes de onda
UV bajas, normalmente entre 200 y 220 nm, debido justamente al enlace peptídico, que ellas
presentan. ( Figura Nº1) (9-11)
Figura Nº1 Enlace peptídico
Enlace peptídico absorbe luz UV entre 200 y 220 nm (215nm)
Proteínas y péptidos, con un contenido variable de los aminoácidos, tales como: : Tirosina,
Triptofano y Fenilalanina tienen además, absorción UV entre 250 y 280 nm (270 nm)Por otro
lado, en las publicaciones internacionales evaluadas, se encontraron metodologías por HPLC
para este grupo de fármacos polipeptídicos, entre las cuales destaca la cromatografía líquida de
alta resolución, asociada a detectores distintos al comúnmente utilizado en las técnicas estándar,
como es el detector UV. En las publicaciones encontramos el empleo de detectores tan variados
como: espectrofotometría de masa, radioinmunoensayo, fluorometría (12-22)
8
También en las publicaciones revisadas se encontró que el empaque en la mayoría de las
columnas que permiten la separación de proteínas es sobre la base del tamaño molecular: Gel de
permeación o cromatografía de exclusión (23-25)
Tradicionalmente para la separación de polipéptidos y proteínas se han utilizado soportes con una
resistencia mecánica relativamente baja, por lo que generalmente las separaciones se realizan a
velocidades de flujo muy pequeñas y por lo tanto, el tiempo empleado en estos procedimientos es
muy prolongado, para las necesidades analíticas diarias de un moderno laboratorio de Control de
Calidad.
La forma y el tamaño del material activo de la fase estacionaria, en cromatografía es importante
para la separación de las sustancias químicas semejantes. A mayor superficie del material activo,
es más fácil separar las sustancias químicas que interactúan con el material cromatográfico (2)
Como se puede observar en la Figura Nº2,el sistema HPLC consta normalmente de:
Una o dos bombas
Un mezclador
Un inyector
Una precolumna
Una columna
Un detector
Un registrador
9
Figura Nº2, Esquema de un HPLC
Cuando la elución es isocrática se usa una sóla bomba, mientras que en la elución por gradiente se
utilizan las dos bombas.
El tampón seleccionado para una buena cromatografía de los derivados peptídicos debe ser
compatible con la estabilidad de la columna y de la muestra. La solubilidad de la muestra debe
permitir la interacción adecuada entre la muestra y el soporte. Normalmente esto se logra con
soluciones acuosas salinas o tampones (sulfato de amonio, acetato de amonio, citrato de sodio,
tampón tris acetato, dihidrógenofosfato de potasio, etc.) a concentraciones por debajo de 0,5 M,
para disminuir altas viscosidades, para evitar un aumento de la presión en el instrumento y la
precipitación salina, por cambios de temperatura. Se debe evitar el uso de iones halógenos (NaCl,
KCl, etc.), los cuales pueden afectar la estabilidad de los polipéptidos, degradándose la proteína
(15,24,26,27)
El rango de pH de trabajo debe ser entre 2,5 y 7,5, pues los pH altos o bajos afectan la estabilidad
de la fase estacionaria de la columna, como también la integridad del polipéptido en estudio (24)
La velocidad de flujo debe ser baja al inicio y se aumenta gradualmente hasta obtener la línea base
y el flujo deseado, el que debe ser seleccionado con respecto a la resolución, tiempo de separación,
vida de la columna y la viscosidad, entre otros. Se recomiendan normalmente flujos más bien
10
bajos, para aumentar la eficiencia de la separación, sobre todo para moléculas grandes como las
proteínas, y para prolongar la vida de la columna.
Cuando se cambia la concentración del solvente orgánico de uno de los solventes ( gradiente de
flujo), se debe hacer por un gradiente lineal, ya que los cambios rápidos pueden causar una
disminución en la eficiencia de la columna (11,13,28,29)
Las columnas usadas con soluciones acuosas de clorhidrato de guanidina o urea (normalmente
efectivas para separar muestras con pobre solubilidad en soluciones acuosas, como las proteínas de
alto peso molecular ) por lo general tienen un tiempo de vida más corto. Se debe evitar el uso de
columnas usadas con estos sistemas y preferir siempre trabajar con soluciones acuosas (12,13,24)
La temperatura recomendada en las publicaciones para cromatografía de péptidos señala que debe
estar entre 10 y 45 ºC. Se plantea que temperaturas por debajo de 10 ºC tienden a deteriorar la
eficiencia de la columna y por encima de 45 ºC, se altera el soporte de sílica de la columna
cromatográfica (8,9)
Siempre se debe usar una precolumna adecuada, con características de retención similares a la
columna de separación, para eliminar las impurezas presentes en la muestra, las cuales son
adsorbidas en la entrada de la columna y se acumulan gradualmente causando reducción del
número de platos teóricos y deterioro de la eficiencia de la columna analítica (2,3,23,24)
Siguiendo el esquema señalado en la USP 27 del 2004, considerando los productos
farmacéuticos en la categoría I, para validar las metodologías analíticas fue necesario determinar
solamente la exactitud, precisión, selectividad, linealidad e intervalos de aplicación (1,3,6).
El método que se usó corresponde a la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa,
para todos los productos, con características polipeptídicas o proteicas, tal como: insulina
humana, insulina lispro, desmopresina y salcatonina(2,8,9,11,12,14)
Se consideraron también otros parámetros como límite de detección y cuantificación que
enriquecen el método validado, pero que no son una exigencia, según la USP 27 Ed del año 2004
(3)
11
Fundamento del trabajo efectuado y objetivos del estudio
En este estudio se consideró un grupo de fármacos de naturaleza polipeptídica y proteica, tales
como: desmopresina, insulinas (insulina humana e insulina lispro), y calcitonina. Como modelo
de estudio de los polipéptidos en general, que presentan características especiales y son un
grupo de fármacos con muchas perspectivas futuras, gracias al exitoso desarrollo de la
biotecnología y la creciente capacidad de obtener fármacos de esta naturaleza, en grandes
cantidades (11,23,24)
El medio nacional, que día a día recibe en el mercado estos nuevos medicamentos,
desarrollados en países que cuentan con los avances y el equipamiento tecnológico, debe
desarrollar las metodologías analíticas que permitan hacer el control de calidad de las formas
farmacéuticas que se comercializan. Es frecuente, incluso en los laboratorios de organismos
contralores no encontrar el equipamiento necesario, muchas veces sofisticado, que permita la
rápida solución de estos problemas analíticos.
Los fármacos polipeptídicos escogidos para este trabajo son un modelo de estudio y entre ellos
presentan diferencias notables, tanto en su aplicación terapéutica como en las unidades de
aminoácidos que los forman, las que fluctúan entre la desmopresina con 9 aminoácidos hasta las
insulinas con 51 aminoácidos (3-5,30)
En el último tiempo se ha producido un fuerte desarrollo de un variado tipo de columnas
cromatográficas. La fase estacionaria generalmente es una matriz inerte recubierta con
componentes no polares, tales como los alcanos de cadena larga (3-5), cadenas hidrocarbonadas de
hasta 18 átomos de carbono (C-18) enlazadas covalentemente a partículas de sílica esférica,
constituyen los soportes y son ampliamente usadas; así la retención de los componentes
hidrófobos estará grandemente influida por el espesor de la capa. Una capa C-18 puede acomodar
más material que una C-8 o una C-2 (9)
Para polipéptidos y proteínas se recomiendan cadenas no muy largas, porque se logra una buena
retención y normalmente se usan cadenas C-8 (11,17,24)
12
El tamaño pequeño de las partículas del soporte hidrocarbonado, típicamente de 5-10 µm y de
tamaño de poro superior a 100 Aº hacen a esta cromatografía un método viable, rápido y de alta
resolución para el análisis y la purificación de polipéptidos y también de proteínas (9)
La fase móvil para estos casos se ha descrito como una solución acuosa y un solvente orgánico (de
alta pureza), cuyo tipo y concentración determinará el poder de separación. Los solventes
orgánicos de uso común en orden de polaridad decreciente para estos casos son: metanol, propanol,
acetonitrilo y tetrahidrofurano. Por la naturaleza de los eluyentes empleados, esta cromatografía,
como en el caso de los polipéptidos y las proteínas, es usada sólo con fines analíticos, ya que
pueden ocurrir pérdidas de actividad biológica (11)
Se ha estudiado que a concentraciones por debajo de 0,1 % v/v, de alcohol y otros solventes
orgánicos, de polaridad intermedia, se puede estabilizar la estructura de algunas proteínas, mientras
que a altas concentraciones de estos solventes se producen deformaciones estructurales que pueden
ser reversibles o irreversibles (10,24)
La separación de los polipéptidos en fase reversa ocurre debido a la interacción entre la fase
estacionaria no polar y los sitios no polares de los polipéptidos y el solvente orgánico en la fase
móvil, el que generalmente tiene un carácter más polar (9)
La retención de los polipéptidos en la fase sólida depende tanto del efecto hidrofóbico
(solvofóbico) como del efecto silanofílico. Este último debe ser bajo para disminuir así la
interacción de aminoácidos polares con los grupos silanoles y evitar que afecten la separación y la
resolución cromatográfica (9,11,13)
El tamaño de la columna puede ser variable y las dimensiones dependerán del problema analítico a
resolver.
La composición de la fase móvil dependerá del tipo de péptido, pero se basa en una mezcla de
agua, con un solvente orgánico miscible, tampones y sales disueltas. Se probó, en la fase móvil,
componentes menos volátiles como el ácido trifluoroacético (TFA) el cual ayuda normalmente a la
solubilización de los péptidos en solventes orgánicos (17,25,28,29).
13
Por ejemplo el TFA protona los grupos carboxílicos, incrementando así la afinidad del polipéptido
o proteína por la fase estacionaria.
En la literatura publicada , encontramos que la selección de los parámetros cromatográficos para
las separaciones de polipéptidos generalmente ha sido empírica (15,17,25,29)
Las condiciones típicas para la separación en un soporte macroporoso como el octil- u octadecil-
silica son:
-Combinación con solvente orgánico a bajo pH (usualmente 0-50 % v/v del solvente). Cuando no
existe experiencia previa se comienza con TFA/acetonitrilo o propanol.
-Fuerza iónica relativamente baja (usualmente de 0,01- 0,1 M).
-Velocidad de flujo entre 0,5 – 2,0 ml/minuto.
-Temperatura ambiente. Cuando la fase móvil tiene muy alta viscosidad (Ej. agua/metanol) y
levanta mucha presión se recomienda incrementar la temperatura, así disminuye la viscosidad y
por tanto hay menos resistencia al flujo y disminuye el tiempo de retención (15,17,25,29)
Los métodos estándares publicados para este grupo de fármacos polipeptídicos se caracterizan
por usar generalmente columnas de una longitud poco usual en nuestro país, más largas, de 0,25
m, con fases estacionarias formadas comúnmente por matrices poliméricas (Gel) adsortivamente
recubiertas con componentes no polares: cadenas hidrocarbonadas (C 8 -C18) y temperaturas
altas que alcanzan incluso los 40°C.
Debido a la complejidad cromatográfica y molecular interrelacionada normalmente en la
separación de polipéptidos y proteínas por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa,
se utilizó una resolución por gradiente de solventes (se recomienda iniciar los estudios con una
variación entre un 20 - 60 % de acetonitrilo, durante la separación de proteínas) (2,11,12,14,16,22)
El desarrollo de los métodos analíticos empleados se basó en la literatura disponible para cada
uno de los fármacos que son parte del estudio. La validación consideró la clasificación de la
USP 27 y se llevó a efecto siguiendo el procedimiento establecido en la guía ICH (International
Conference on Harmonization) de 1996 y lo señalado por la Asociación Española de
Farmacéuticos de la Industria, Comisión de Normas de Buena Fabricación y Control de Calidad,
Sección Catalana de Validación de métodos analíticos”, 1996 (6)
14
El método aplicado en la validación de las metodologías analíticas consideró los parámetros para
los productos de clase I, según la USP, que incluye la determinación de exactitud, precisión,
selectividad, linealidad e intervalos de aplicación, a continuación se define cada uno de los
parámetros involucrados en la validación, con una descripción amplia(3)
La exactitud representa la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximos
al valor verdadero. Matemáticamente la exactitud se expresa a través del porcentaje de
recuperación de la cantidad de analito presente en la muestra. Se debe considerar su evaluación
según el test de Student, para determinar si el valor medio encontrado y el valor considerado
verdadero no difieren significativamente, para un grado de probabilidad determinado(6)
Para la determinación de este parámetro se realiza un análisis repetitivo de varias muestras de
concentraciones diferentes y conocidas. Se utilizan como mínimo 6 concentraciones dentro del
rango de linealidad. (Se analiza cada una por triplicado). La exactitud se calcula con los
resultados obtenidos en el parámetro de linealidad.
La validación del método analítico requiere que el estudio de exactitud sea riguroso. Se usa
como valor de referencia la cantidad declarada en el producto farmacéutico terminado.
La exactitud se determina con las concentraciones de los valores recuperados del principio
activo, de concentración de referencia y los obtenidos en la evaluación del parámetro linealidad,
para un mínimo de 6 muestras. Se usa como valor de referencia el 100% (6,7)
La exactitud de un método analítico se mide como el porcentaje de analito recuperado por cada
análisis efectuado y representa el error del método con respecto a la magnitud real(1,6,8,13)
La precisión es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos
analíticos efectuados sobre una muestra homogénea, o expresado de otra forma, corresponde a
la distribución de los valores analíticos alrededor de su media.
También se puede decir que la precisión es una medida de la reproducibilidad del método. La
precisión de un método analítico se determina mediante los ensayos de un número suficiente de
15
alícuotas de una muestra homogénea, tales que sean suficientes para calcular estadísticamente la
desviación estándar relativa (coeficiente de variación).
La determinación de la precisión se basa en el principio de la repetibilidad, que corresponde a la
medida de la precisión de un método, efectuado en las mismas condiciones.
La precisión de un método analítico se expresa como el coeficiente de variación (CV). Para que
el análisis tenga validez la cantidad de datos óptimos es de a lo menos seis valores. El valor
recomendado por la ICH es de un 2% (1)
En los ensayos de repetibilidad se considerarán adecuados los coeficientes de variación (CV)
inferiores al 1,9%, para un rango aceptable de 95 a 105% de lo declarado y de 3,9%, para un
rango aceptable de 90 a 110% de lo declarado. En general se acepta un CV de 1,9% para
insulinas y de 3,9% para los otros polipéptidos ( ver tabla N° 2 en los anexos). En caso que el
CV obtenido experimentalmente sea superior al indicado, la serie de análisis deberá ser repetida,
tomando en cuenta todos los datos obtenidos, en cada una de las determinaciones de la serie. El
CV deberá ser menor al indicado, según el número de repeticiones de los ensayos realizados(6)
Se usa como referencia un estándar de concentración 100% respecto a lo declarado en el
producto farmacéutico y se analiza por triplicado, luego se cuantifica y se promedian las áreas,
obteniendo así el valor de área de referencia.
Se debe analizar como mínimo 6 veces una misma muestra, utilizando la misma técnica analítica
propuesta para cada uno de los polipéptidos objeto del estudio y montada para su validación y el
mismo equipo, registrando la respuesta obtenida en cada una de las inyecciones.
El valor del coeficiente de variación correspondiente al porcentaje de recuperación es indicativo
de la precisión del método. Se debe informar si el método analítico es preciso para el principio
activo ( polipéptido)(1,6,8)
16
La selectividad es la habilidad de un método para medir en forma exacta y especifica, el grado de
interferencia que producen sobre el analito de interés, otros componentes activos, excipientes,
impurezas y productos de degradación que pudieran estar presentes en la matriz de las muestras.
La selectividad será determinada mediante la evaluación de la posible interferencia de excipientes y
de la degradación de la muestra.
Por otro lado la especificidad o selectividad, se consideran términos equivalentes y es la
capacidad que tiene un método analítico para medir exacta y específicamente una señal, debido
sólo a la presencia de un analito, sin interferencias de productos de degradación, impurezas,
compuestos relacionados o excipientes que pueden estar presentes en la matriz de la muestra
(31-35)
La especificidad es una condición esencial para conseguir una buena exactitud, por lo que es, en
todos los casos, un criterio clave en la validación de este tipo de métodos.
Para determinar la especificidad y para asegurar que la señal medida con el método analítico se
debe únicamente a la sustancia a analizar se debe descartar previamente la interferencia de los
excipientes y de los productos de degradación en el análisis.
Se debe informar en el certificado de validación si el método analítico es específico, indicando si
se detectó degradación en los distintos cromatogramas y si existe evidencia de interferencias con
la señal del principio activo. En los casos que corresponda, puede ser necesario incluir análogos
de estos polipéptidos (cuando existan) con el fin de asegurar que el método también es selectivo
respecto a estos análogos (1,6,8,15,16,28)
La linealidad es la capacidad del método para obtener resultados que son directamente
proporcionales a las concentraciones del analito, en un rango determinado. La linealidad se expresa
como el coeficiente de regresión lineal (r) de la curva de calibración.
17
Es decir, la linealidad es la capacidad de un método analítico para obtener resultados linealmente
proporcionales a la concentración de analito en la muestra, dentro de un intervalo de confianza
determinado.
El rango de aplicación será aquél en el que se evalúa este parámetro, es decir, entre un 50% y un
150% del valor declarado en el producto farmacéutico comercial y se considerará definido a
partir de los criterios de linealidad, precisión y exactitud (1,6,8)
18
Hipótesis Aplicando cromatografía líquida de alta resolución con detector UV y seleccionando
adecuadamente las columnas cromatográficas, es posible desarrollar metodologías analíticas
sencillas, rápidas y específicas para cuantificar fármacos de naturaleza polipeptídica en formas
farmacéuticas, que cumplan con los estándares de validación requeridos por las farmacopeas
oficiales.
Objetivos del Estudio Objetivo general: Desarrollar métodos analíticos, sencillos, rápidos y confiables, para fármacos de naturaleza
polipeptídica en sus formas farmacéuticas comerciales, mediante HPLC.
Objetivos específicos -Estudiar las variables que influyen en la obtención de un método específico y reproducible para:
insulinas( insulina humana e insulina lispro), salcatonina y, desmopresina.
-Aplicar los criterios de validación sugeridos por las farmacopeas oficiales, para estos fármacos
en sus respectivas formas farmacéuticas.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Vasos precipitados, pipetas volumétricas y aforadas, matraces kitasato, probetas, agitador
magnético y materiales básicos para las técnicas de laboratorio químico.
Baño Termorregulado MGW Lauda, Thermo-Temp.
Baño Ultrasonido P Selecta, Ultrasons-H
Bomba de vacío GAST.
Crisol filtrante con vaso y pinza sujetadora Millipore.
Papel filtro Whatman Nº 42 y 54
pHmetro Orion 370
Balanza analítica Mettler ab-204;sensibilidad 0,1 mg.
Agua purificada Milli-Q
Fase móvil: Agua/Acetona 95:5
Fase móvil: Agua/Metanol 50:50
Columna: Octadecilsilano (Symetry C18; 5 µm ;15 cm).
Estándares primarios con potencia igual o mayor que 99%
Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 2 Merck.
Modelo: Bomba binaria D 7000 serie: 0703-152
Modelo: Autosampler L7400 serie: 0709-054
Modelo: Detector L-7200 serie: 0711-019
Modelo: Horno L-7100 serie: 0707-173
Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 3 Waters.
Modelo: Bomba binaria1525 serie: E0125P
Modelo: Autosampler 717 plus serie: B0271 P
Modelo: Detector 2487 serie: E01487
Modelo: Horno 5 CH serie: J005CH
20
PROTOCOLO PARA LA VALIDACIÓN ANALÍTICA DE PROTEINAS Y PÉPTIDOS
A continuación se describe el esquema de trabajo llevado a cabo para la validación analítica de
los métodos de análisis
1. OBJETIVO
Establecer una metodología analítica confiable para la determinación de distintas proteínas y
péptidos que lo requieran por su empleo como medicamentos.. Esta determinación se realizará
mediante el método de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa(HPLC). Esta
metodología debe tener las características adecuadas para validar los métodos de análisis en el
rango de evaluación normal de este tipo de medicamentos.
EQUIPOS UTILIZADOS
TODOS LOS EQUIPOS EMPLEADOS DEBEN ESTAR EN UN PROGRAMA DE
MANTENCIÓN Y CALIBRACIÓN EXTERNO Y EN LO POSIBLE, TAMBIÉN CONTAR
CON SU CALIFICACIÓN.
A) Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 2 Merck, Certificado Nº 030624/3
Modelo: Bomba binaria D 7000 serie: 0703-152
Modelo: Autosampler L7400 serie: 0709-054
Modelo: Detector L-7200 serie: 0711-019
Modelo: Horno L-7100 serie: 0707-173
B) Cromatógrafo líquido de alta eficiencia Nº 3 Waters, Certificado Nº II-016/03
Modelo: Bomba binaria1525 serie: E0125P
Modelo: Autosampler 717 plus serie: B0271 P
Modelo: Detector 2487 serie: E01487
Modelo: Horno 5 CH serie: J005CH
21
C) Nombre: Balanza analítica
Marca : Mettler
Sensibilidad: 0,1 mg
Modelo: AB-204
N°serie: 1113483418
Certificado de calibración: 9560
D) Nombre: pHMETRO
Marca: Orion
Modelo: 370
N°serie: 3327
Certificado de calibración: SMF – 11485
E) Nombre: Baño termorregulado
Marca: Mgw- Lauda
Modelo: Thermo – Temp
N°serie: A17080
Certificado de calibración: 9479
2. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
Utilizar el método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) considerando las
condiciones experimentales establecidas previamente para el análisis de cada proteína o péptido.
3. PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD.
a) Interferencia de los excipientes
Utilizando la técnica de fabricación del producto, se preparó una solución base con los
excipientes de la fórmula, exceptuando el principio activo. Se analizó la muestra según la
metodología analítica correspondiente, de manera tal de identificar los picos respuesta del
principio activo.
22
b) Interferencia de los productos de degradación
Para el ensayo de la muestra degradada se prepararon las siguientes soluciones:
Solución de NaOH 0.5 N para hidrólisis básica.
Solución de HCl 0.5 N para hidrólisis ácida.
Se realizaron tres soluciones:
a) Excipientes ( placebo)
b) Excipientes + péptido
c) Péptido.
A cada una de ellas se les realizó una hidrólisis respectiva, a cada solución se adicionó 5 ml de
ácido o base según corresponda, para posteriormente calentar en un baño termorregulado a 70°C
por 25 minutos. Luego se neutralizó según corresponda con ácido o base y se llevó a
concentración establecida, aforando con fase móvil.
Finalmente se cuantificaron las muestras según el método analítico establecido para cada uno de
los péptidos.
3.2 LINEALIDAD
El parámetro que se evaluó es según la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 27 Ed),
Para demostrar que este procedimiento es lineal deberá cumplir con los siguientes parámetros:
r > 0.9990
Factor de respuesta: CV menor al 5%.
PROCEDIMIENTO
Se pesó con precisión, la cantidad de proteína o péptido estándar, señalado en cada metodología
individual, se disolvió con fase móvil ( o con el solvente indicado en cada metodología
individual) en un matraz aforado, se colocó el matraz en un baño de ultrasonido durante 10
minuto, terminado este proceso se aforó con fase móvil( o con el solvente indicado en la
metodología individual).
23
Luego se realizaron las diluciones para obtener las concentraciones, entre un 50% y 150% de lo
declarado. Se inyectó cada una de las diluciones preparadas, registrándose para cada una los
siguientes parámetros.
Se señala esta tabla a modo de ejemplo.
Conc. UI/ml Área lectura % Conc.
Recuper.
Factor
respuesta
80%
85%
90%
100%
110%
115%
Ecuación de la recta : Y = a + bX, en donde X es la concentración de analito y en
donde Y es el área bajo la curva. Siendo b la pendiente
de la recta.
Promedio X :
Desviación Estándar S :
Coeficiente de variación CV : %
Adicionalmente se calculo r2 que indica la proporción de la varianza total de la variable
independiente Y y se denomina coeficiente de determinación.
3.3 EXACTITUD
Para la determinación del parámetro EXACTITUD, se realizó un análisis repetitivo de varias
muestras diferentes de concentraciones conocidas. Se utilizaron 6 concentraciones (por
triplicado) como mínimo, dentro del rango de linealidad.
Comentario [cv1]:
24
Procedimiento:
Se pesó con precisión, lo indicado en cada metodología analítica, se disolvió con fase móvil ( o
el solvente indicado en la metodología individual) en un matraz aforado, se colocó el matraz en
un baño de ultrasonido durante 10 minuto, terminado este proceso se aforó con fase móvil (o
con el solvente de la metodología).
Luego se realizaron las diluciones necesarias para obtener como mínimo 6 concentraciones
distintas, en el rango entre 50% y 150%:
Se inyectó cada una de las diluciones, registrándose para cada una los siguientes parámetros,
por ejemplo:
Se menciona esta tabla , con un rango de porcentaje(%) a modo de ejemplo.
Conc Área lectura % Conc.
Recuperación
%
Recuperación
80%
90%
100%
110%
115%
120%
Promedio (X) :
Desviación Estándar (S) :
Coeficiente de variación (CV) : %
Con respecto a la tabla de student para pruebas unilaterales para un riesgo (p: 0.05) y a 5 grados
de libertad el t corresponde a: t.95 : 2,571
Al calcular “t obs” o experimental tenemos que :
t obs = ([100 – X]* √ N° muestras) / CV =
t obs ≤ t.95
Por lo tanto para que exista una buena exactitud en el método de análisis que se está evaluando
para el ensayo de péptidos o proteínas, el t obs debe ser menor al t.95.
25
3.4 PRECISIÓN
El parámetro evaluado corresponde a una concentración del 100% de lo declarado, la que debe
ser analizada 10 veces.
Procedimiento:
Se pesó con precisión, lo indicado en cada metodología analítica, se disolvió con fase móvil (o el
solvente indicado en la metodología individual) en un matraz aforado, se dejó el matraz en un
baño de ultrasonido durante 10 minuto, terminado este proceso se aforó con Fase Móvil (o con
el solvente de la metodología).
Luego se realizaron las diluciones necesarias para obtener como mínimo 10 concentraciones
iguales, cercanas al 100%.
N°análisis Conc. Área Conc. Encont. % Recuperac.
1 100%
2 100%
3 100%
4 100%
5 100%
6 100%
7 100%
8 100%
9 100%
10 100%
Promedio X % :
Desviación Estándar S :
Coeficiente de Variación CV : %
En los ensayos de repetibilidad se consideraron adecuados los coeficientes de variación
inferiores al 2 %.
26
Límites de confianza.
Estadísticamente es la expresión más correcta para establecer la precisión de un método, ya que
tiene en cuenta la distribución de t de Student, cuando el número de réplicas es inferior a 30. El
valor de t de Student se halla en las tablas de student, para n – 1 grados de libertad y una
significación, generalmente del 95 %, también se le suele denominar: error del método(6,7)
t.95 : 2,262 (10 valores) (X ± tS)
Límite de confianza % : X% ± tS
Con respecto a la cantidad encontrada :
Límite de confianza :
Todo lo incluido en el punto 3 (3.1 a 3.4) es lo exigido por la USP 27 Ed , para validar una
metodología analítica.
Los límites de detección y cuantificación que se calculan a continuación, no son indispensables y
más bien vienen a complementar la información que caracterizó al método analítico
4.0 LÍMITE DE DETECCIÓN (Ld) Y CUANTIFICACIÓN (Lc)
Determinación por extrapolación a concentración cero de muestras conteniendo concentraciones
bajas de analito.
Conc. Área 1 Área 2 Área 3 Área media Desv. Est.
50%
65%
70%
Para los cálculos de Ld y Lc se utilizaron los datos de menor concentación, proporcionados por
la curva de calibración en el rango establecido ( 50% a 150%).
27
Límite de detección ( Ld )
LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) =
Límite de cuantificación ( Lc )
LC ( K=10) = ( (Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) =
En donde:
Ybl corresponde a la respuesta a concentraciones cero.
Sbl corresponde a la desviación estándar de la respuesta a concentración cero.
B corresponde a la pendiente de la curva obtenida en procedimiento de linealidad.
n corresponde al número de puntos de la curva.
Los valores de las constantes K en las fórmulas son los aceptados por la A.E.F.I (Asociación
Española de Farmacéuticos de la Industria) y su comisión de buena fabricación y control de
calidad, en su referencia “Validación de Métodos Analíticos”(6).
1° Respuesta a concentraciones cero.
Se obtiene por extrapolación a cero en la recta calculada, tomando como “Y” las áreas medias y
como “X” las concentraciones.
X Y Área media
50%
65%
70%
Se obtiene la ecuación de la curva.
Entonces para X = 0 el valor de Y =Ybl.
28
2° Desviación estándar de la respuesta a concentración cero
Se obtiene por extrapolación a cero en la recta calculada tomando como “Y” las desviaciones
estándar de las respuestas y como “X” las concentraciones.
X Y Desv. Est
50%
65%
70%
Se obtiene la ecuación de la curva.
Entonces para X = 0 el valor de Y = Sbl
INSULINAS
La insulina es un polipéptido de doble cadena, formado por 51 aminoácidos, con un peso
molecular aproximado de 6000, este producto como insulina humana está incluido en sus
diferentes presentaciones, como metodología analítica en la Farmacopea Británica(BP),
farmacopea Europea( EP) y en la Farmacopea de los Estados Unidos(USP.) (3,4,6,30)
Insulina Humana Insulina Lispro
29
Esquema tridimensional de la Insulina Humana
Cromatogramas de las insulinas, con detector arreglo de diodo, obtenidas en el laboratorio de
Control de Calidad planta Recalcine, se aprecia que para ambas insulinas, su máxima absorción
es cercana a los 215 nm
30
Insulina humana
Insulina Lispro
31
CALCITONINA
Es un Polipéptido de 32 aminoácidos, con un peso molecular aproximado de 4.500, este
producto se encuentra incluido como metodología analítica en la Farmacopea Británica
(BP)(4,30). La metodología analítica del producto empleando este principio activo se muestra
en los resultados.
Representación tridimensional de Calcitonina
32
Cromatogramas de la Calcitonina, con detector de arreglo de diodos, obtenidos en el laboratorio
de Control de Calidad planta Recalcine, se aprecia que su máxima absorción es cercana a los
215 nm
DESMOPRESINA
Es un Polipéptido de 9 aminoácidos, con un peso molecular de 1.069, este producto se encuentra
incluido en alguna de sus formas farmacéuticas en la Farmacopea Británica( BP) y en la
Farmacopea Europea(EP) (4,5,30)
33
Esquema tridimensional de la Desmopresina
Cromatograma de la Desmopresina, con detector de arreglo de diodos, obtenidas en el
laboratorio de Control de Calidad planta Recalcine, se aprecia que su máxima absorcióna los
215nm.
34
RESULTADOS
VALIDACION INSULINA HUMANA
( Primer ensayo, siguiendo la técnica de la USP 27 )
I. COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO
Cada ml de suspensión contiene:
Insulina Humana, origen DNA recombinante 100 UI
m-Cresol 1,600 mg.
Fenol 0,650 mg.
Glicerina 16,000 mg.
Sulfato de Protamina 0,348 mg.
Fosfato dibásico de sodio 3,780 mg.
Agua para inyectables CSP 1,000 ml.
Ácido clorhídrico al 10% y/o hidróxido de sodio al 10%, para ajustar pH entre 6,9 y 7,5.
II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN DE LA USP PARA EL PRINCIPIO
ACTIVO, EN EL PRODUCTO TERMINADO, ENTRE UN 95,0% A UN 105,0%
III.- METODOLOGÍA EMPLEADA SEGÚN LO ESPECIFICADO .
Se consideró su validación, ya que es la metodología oficial incluida en la USP y la empleada
por el fabricante de las insulinas.
35
1. Preparación de la solución de principio activo.
Solución estándar:
Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de Insulina Humana, calidad estándar de referencia,
con una potencia declarada de 189,21 UI USP en 6,57 mg de insulina por vial, para obtener una
solución de 37,84 UI/ml.
De la solución anterior, se tomó una alícuota de 1 ml, se trasladó a una matraz aforado de 10 ml,
se diluyó y aforó con HCl 0,01N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial, la
solución estándar final tiene 3,784 UI/ml.
Solución Muestra:
Se agregó gota a gota HCl 1N al vial con el producto muestra, hasta disolución total de la
suspensión, de esta solución se tomó 2 ml y se transfirío a un matraz de 50 ml, se diluyó y aforó
con HCl 0,01N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial de HPLC.
PROCEDIMIENTO
Cromatografía líquida de alta resolución.
Condiciones cromatograficas
Columna : Symmetry (C-18; 25cm; 4,6 um)
Fase Móvil : Solución acuosa /Acetonitrilo( 72/28 )
Solución Tampón : 28,4 g de Na2S04 + 2,7 ml de H3PO4
En 1 L de agua y llevar a pH=2,3 con etanolamina.
Flujo : 1,2 ml/minuto
Detector : Ultravioleta a 214 nm.
Temperatura del horno : 40°C
Volumen inyectado : 10 ul
36
EQUIPOS UTILIZADOS
Cromatógrafo líquido de alta resolución menor certificado de calibración N°030624/3.
Bomba binaria D 7000 Serie 0703-152 Autosampler L7400 Serie: 0709-054, detector L-7200,
serie 0711-019, horno L-7100, serie 0707-173.
pH Metro Orion
Modelo 370, serie 3327, certificado de calibración: SMF 10949
Calificación de columna cromatográfica.
Marca Waters; Modelo Symmetry, empaque C-18, N° interno 25
N° Platos teóricos evaluados 18.364, fecha de calificación 24/07/2003.
Balanza analítica Metter
Sensibilidad 0,1 mg
Modelo: AB-204 N°Serie: 1113483418
Certificado de Calibración N°560
PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD
Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes, utilizando la técnica de
fabricación del producto se preparó una solución base con los excipientes de la fórmula
exceptuando el principio activo:
m-Cresol 1,600 mg.
Fenol 0,650 mg.
Glicerina 16,000 mg.
Sulfato de Protamina 0,348 mg.
Fosfato dibásico de Sodio 3,780 mg.
Agua para inyectables csp 1,000 ml.
37
Se analizó esta muestra según la metodología analítica correspondiente de manera tal de
identificar los picos respuesta de los excipientes.
Al igual que lo realizado con el estándar de insulina, a la muestra se agregaron 5,0 ml de HCl
0,01N a un vial de insulina humana, muestra, se diluyó 1 ml, con 10 ml, HCl 0,01N, se analizó
según la metodología analítica correspondiente de tal manera de identificar los picos respuesta
del principio activo.
Interferencia de los productos de degradación: la hidrólisis básica y ácida se realizó con las tres
soluciones patrones:
a) Excipientes (placebo)
b) Excipientes + péptido (estándar)
c) Péptido estándar
Se consideró también el efecto de la temperatura sobre la degradación de la insulina
sin hidrólisis ácida o básica.
Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01N a un vial de insulina estándar, se agitó fuertemente por 5
minutos (solución A), se diluyó 1ml de esta solución y se llevó a un matraz con HCl 0,01N.
Efecto de la temperatura sobre la insulina.
Se tomó 1 ml de la solución (A), se mantuvo en baño maría por 25 minutos a 70°C y se enrasó
posteriormente a 10 ml con HCl 0,01N.
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución A, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño maría por 25
minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01N y se
agitó.
38
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución A, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a
70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N se enrasó con HCl 0,01N y se
agitó.
Excipiente + péptido (muestra):
Se tomó 2 ml del vial muestra previamente analizada y de potencia conocida, se transfirió a un
matraz de 50 ml, se diluyó y aforó con HCl 0,01N (B)
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución anterior (B), se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó en un baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución base (B), se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría
a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml. de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N.
Excipientes:
Se tomó 2 ml del matraz solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 50 ml, se diluyó
y aforó con HCl 0,01 N (C).
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución concentrada (C) , se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
39
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución concentrada, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N , se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD.
Interferencia de los productos de degradación o de los excipientes en la resolución
cromatográfica de la insulina. En el pico cromatográfico de la insulina se apreciaron cambios
en los tiempos de retención y por ende no se pudo descartar la no interferencia de excipientes o
productos de degradación, siendo los tiempos de retención diferentes en cada inyección de
estándar de insulina humana
Con temperatura: se produjo degradación de la insulina humana, pero no se pudo descartar
interferencia con la señal del principio activo.
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de Insulina, pero no fue posible descartar la falta de interferencias entre
estos productos de degradación con la señal del principio activo.
Estándar de insulina + excipientes muestra
Con temperatura: se produjo degradación de la insulina, pero no fue posible descartar la
interferencia con la señal del principio activo.
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de insulina, pero no fue posible descartar la no interferencia entre los
picos del producto de degradación con la señal del principio activo.
40
Hidrólisis básica:
Se produjo degradación de insulina, pero no fue posible descartar la interferencia entre los picos
del producto de degradación con la señal del principio activo.
Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método no es específico para insulina,
ya que existe evidencia que el tiempo de retención es variable y existen interferencias en los
análisis. En algunos cromatogramas( Figuras 4,6 y 8) se aprecia otro pico, también con un
tiempo de retención variable con cada inyección: 8,5 minutos ; 6,25 minutos y 7,25 minutos, por
lo que no se puede asegurar que no se superponen en algun momento con el pico de la insulina.
No se pudo descartar la superposición de los picos correspondientes a insulina de los productos
de degradación y/o excipientes.
Los tiempos de retención de insulina determinados en el análisis de selectividad son:
5,25 minutos; 5,27 minutos; 4,33minutos; 4,32minutos; 6,20 minutos y 6,22 minutos.
Estos resultados no son satisfactorios para validar el metodo de análisis incluido en la USP 27
para Insulina humana.
41
Figura Nº3. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC
Tiempo de retención para Insulina: 5,25 minutos
Figura Nº 4. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.
Tiempo de retención para Insulina: 5,27 minutos
42
Figura Nº 5 Análisis de Insulina Humana , primer ensayo HPLC.
Tiempo de retención para Insulina: 4,33 minutos
Figura Nº6. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.
Tiempo de retención para Insulina: 4,32 minutos
43
Figura Nº 7. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.
Tiempo de retención para Insulina: 6,20 minutos.
Figura Nº8. Análisis de insulina humana , primer ensayo HPLC.Tiempo de retención para Insulina:
6,22 minutos.
44
3.2 LINEALIDAD
Concentración UI/ml Área
1,8921 189,21/10*1/10 494.234
2,2705 189,21/10*4/10*3/10 625.184
3,7842 189,21/10*4/10*5/10 1.086.071
4,7303 189,21/10*5/10*5/10 1.377.873
5,6763 189,21/10*5/10*3/5 1.682.226
7,5684 189,21/10*4/10 2.209.783
9,4605 189,21/10*5/10 2.878.763
LINEALIDAD
0,010,020,030,040,0
0,0 5,0 10,0CONCENTRACIÓN UI/ml
ÁREA x105
45
Ecuación de la recta Y = a + bx
Y= -9,01*104 + 3,10*105 X
Intercepto -9,01*104
Pendiente 3,10*105
r (coeficiente de correlación) 0,9996
Factor de Respuesta
Concentración UI/ml Area
Factor de
respuesta
1,8921 189,21/10*1/10 494.234 261209,24
2,2705 189,21/10*4/10*3/10 625.184 275350,80
3,7842 189,21/10*4/10*5/10 1.086.071 287001,48
4,7303 189,21/10*5/10*5/10 1.377.873 291289,68
5,6763 189,21/10*5/10*3/5 1.682.226 296359,60
7,5684 189,21/10*4/10 2.209.783 291974,92
9,4605 189,21/10*5/10 2.878.763 304292,90
PROMEDIO 28678266,07
CV 4,99%
El procedimiento analítico es lineal, r es mayor a 0.9990(0,9996)
Y en el factor de repuesta CV es menor a 5%; 4.99%
Además el coeficiente de determinación r 2 es 0,9991
46
3.3 EXACTITUD
Concentración
UI/ml ÁREA
Cantidad encontrada
UI/ml % p.a. Encontrado
1,892 499.274 1,708 90,28%
2,270 635.383 2,174 95,74%
3,784 1.106.071 3,784 100,00%
4,730 1.297.878 4,440 93,87%
5,676 1.679.259 5,745 101,00%
7,568 2.199.487 7,525 99,43%
9,460 2.888.261 9,882 104,45%
Promedio 97,86%
CV 4,93%
tobservado 0,0424
ttabla 2,447
El t tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p:0.05) y a 6 grados de libertad
t95 :2,447
Como el t observado es menor al t tabla el método cumplió con la exigencia de exactitud, según los
análisis efectuados
47
3.4 PRECISIÓN
En este ensayo de repetitividad se consideró adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%,
según la norma ICH o de 1,9% según AEFI
El método implementado es preciso, ya que cumplió con un CV inferior a 2%, el valor
encontrado fue de 0,85%
Límite de Confianza 97,02% ± 1,86%
Conclusiones: De acuerdo al protocolo establecido y los parámetros evaluados según la USP 27
Ed, se pudo establecer que la metodología implementada no cumplió con los parámetros
exigidos para su validación, por lo tanto no es apta y confiable para el análisis rutinario de
insulina humana, en el producto inyectable, formulado según lo descrito en la composición del
producto.
N°
análisis
Concentración
UI/ml área
UI encontradas
%
Recuperación
1 4 1.258.052 3,926 98,15%
2 4 1.245.673 3,887 97,18%
3 4 1.232.333 3,846 96,14%
4 4 1.240.342 3,871 96,77%
5 4 1.237.374 3,861 96,54%
6 4 1.236.462 3,859 96,47%
7 4 1.233.511 3,849 96,23%
8 4 1.236.188 3,858 96,44%
9 4 1.254.887 3,916 97,90%
10 4 1.260.670 3,934 98,35%
Promedio 97,02%
CV 0,85%
48
4.0 LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
Conc. UI/ml Área1 Área2 Área2
Área
promedio
Desviación
estandar
1,8921 494.242 494.246 494.244 494.244 2,0
2,2705 625.182 625.186 625.189 625.185 3,5
3,7842 1.086.069 1.086.066 1.086.078 1.086.071 6,2
YbI=87.098 SbI=1,65 B=310.467
Límite de detección ( Ld ) LD ( K=3) = (( Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) = 0,16 UI/ml
Límite de cuantificación ( Lc ) LC ( K=10) = (( Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) = 0,16 UI/ml
49
VALIDACIÓN INSULINA HUMANA (Segundo ensayo, TFA-gradiente)
I. COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO
Cada ml de suspensión contiene:
Insulina Humana origen DNA recombinante 100,000 UI
m-Cresol 1,600 mg.
Fenol 0,650 mg.
Glicerina 16,000 mg.
Sulfato de Protamina 0,348 mg.
Fosfato dibásico de sodio 3,780 mg.
Agua para inyectables CSP 1,000 ml
• Acido clorhídrico al 10% y/o hidróxido de sodio al 10%, para ajustar pH :
entre 6,9 y 7,5.
II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN DE LA USP PARA EL PRINCIPIO ACTIVO
EN EL PRODUCTO TERMINADO, ENTRE UN 95,0% A UN 105,0%
III.- METODOLOGÍA EMPLEADA SEGÚN LO ESPECIFICADO.
Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que la descrita en la USP presentó diferencias
en los tiempos de retención.
1. Preparación de la solución de principio activos.
Soluciones estándar:
Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de Insulina Humana, calidad estándar de referencia,
con una potencia declarada de 189,21 UI USP en 6,57 mg de insulina por vial, para obtener una
solución de 37,84 UI/ml.
De la solución anterior, se tomó una alícuota de 1 ml, se trasladó a una matraz aforado de 10 ml,
se diluyó y aforó con HCl 0,01N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial, la
solución estándar final tiene 3,784 UI/ml.
50
Solución Muestra:
Se agregó gota a gota solución de HCl 1 N al vial con el producto muestra, hasta disolución
total de la suspensión, de esta solución se tomó 2 ml y se transfirió a un matraz de 50 ml, se
diluyó y aforó con HCL 0,01 N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial de
HPLC.
PROCEDIMIENTO
Cromatografía líquida de alta resolución.
Condiciones cromatográficas
Columna : Jupiter (C-18; 25 cm; 5 um ;300 A° )
Fase Móvil Solución : A : TFA 0.1%en agua/ TFA 0.1% Acetonitrilo
( 71%/29%)
B: TFA 0.1% en agua / TFA 0.1% Acetonitrilo
( 68%/32%)
Comienzo con A y cambio a 100% B en 30 minutos; gradiente 0%-100%
TFA : Ácido trifluoracético
Flujo : 0,8 ml/minuto
Detector : Ultravioleta: a 215 nm.
Temperatura del horno : 30°C
Volumen inyectado : 50 ul
51
EQUIPOS UTILIZADOS
Cromatógrafo líquido de alta resolución, certificado de calibración N°030624/3.
Bomba binaria D 7000 Serie 0703-152 Autosampler L7400 Serie: 0709-054, detector L-7200,
serie 0711-019, horno L-7100, serie 0707-173.
pH Metro Orion
Modelo 370, serie 3327, certificado de calibración: SMF 10949
Calificación de columna cromatográfica.
Marca Phenomenex; Modelo Júpiter , empaque C-18, N° interno 26
N° Platos teóricos evaluados 12.341, fecha de calificación 28/03/2003.
Balanza analítica Mettler
Sensibilidad 0,1 mg
Modelo: AB-204 N°Serie: 1113483418
Certificado de Calibración N°560
PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes utilizando la técnica de
fabricación del producto. Se preparó una solución base con los excipientes, de la fórmula,
exceptuando el principio activo:
m-Cresol 1,600 mg.
Fenol 0,650 mg.
Glicerina 16,000 mg
Sulfato de Protamina 0,348 mg
Fosfato dibásico de Sodio 3,780 mg
Agua para inyectables CSP 1,000 ml
52
Se analizó esta muestra según la metodología analítica correspondiente de manera tal de
identificar los picos respuesta de los excipientes.
Lo mismo se realizó con el estándar de insulina se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de
insulina humana estándar, se diluyó 1 ml con 10 ml de HCl 0,01 N, se analizó según la
metodología analítica correspondiente de tal manera de identificar los picos respuesta del
principio activo.
Interferencia de los productos de degradación, la hidrólisis básica y ácida se realizó con las tres
soluciones patrones:
a) Excipientes (placebo)
b) Excipientes + péptido (estándar)
c) Péptido estándar
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1ml de la solución A, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño maría por 25
minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N y se
agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución A, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a
70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N y
se agitó.
EXCIPIENTE + PÉPTIDO (muestra):
Se tomó 2 ml del vial muestra previamente analizado y de potencia conocida, se transfirió a un
matraz de 50 ml, se diluyó y aforó con HCl 0,01 N (B)
53
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución anterior (B), se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó en un baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución base (B), se adicionó 2 ml de Na HO 0,5 N y se calentó a baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCL 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N.
EXCIPIENTES:
Se tomó 2 ml del matraz solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 50 ml, se diluyó
y aforó con HCL 0,01N (C).
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución concentrada (C) , se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución concentrada, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCL 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD.
Interferencia de los productos de degradación o de los excipientes en la resolución
cromatográfica de la insulina
54
En el pico cromatográfico de la insulina no se apreció la interferencia de los picos
cromatográficos de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención fueron
diferentes.
Estándar de insulina humana.
Con temperatura: se produjo la degradación de la insulina humana, pero no se evidenció
interferencia con la señal del principio activo.
Tiempos de retención de insulina humana determinados en el análisis de selectividad: 23,70
minutos; 23,80 minutos; 23,70 minutos; 23,71 minutos; 23,74 minutos; 23,63 minutos; 23,70
minutos; 23,68 minutos; 23,70 minutos y 23,72 minutos.
Valor promedio: 23,70 minutos y S:0,041.
Figura Nº 9. Cromatograma insulina humana HPLC
Tanto los productos de degradación como los excipientes aparecen a tiempos de retención
inferiores a 15 minutos, de tal manera que no interfieren en los análisis, los más característicos
aparecen a los 7,77 minutos y 12,49 minutos.
55
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de insulina, pero no existió evidencia de interferencias entre estos
productos de degradación con la señal del principio activo.
ESTÁNDAR DE INSULINA + EXCIPIENTES MUESTRA
Con temperatura: se produjo degradación de la insulina, pero no se evidenció interferencia con la
señal del principio activo.
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de la Insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del
producto de degradación con la señal del principio activo.
Hidrólisis básica:
Se produjo degradación de insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del
producto de degradación con la señal del principio activo.
Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método es específico para insulina, ya
que no existió evidencia de alguna interferencia en los análisis.
56
3.2 LINEALIDAD
Concentración
UI/ml Área
1,00 1.995.221
2,00 4.069.962
3,00 6.034.724
4,00 8.429.450
6,00 12.640.290
8,00 16.928.606
10,00 21.020.548
LINEALIDAD INSULINA HUMANA
0
50
100
150
200
250
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
CONCENTRACIÓN UI/ml
Coeficiente de
Correlación 0,9999
Pendiente 2,12*106
Intersección eje -1,75*105
ÁREA x 105
57
Factor de Respuesta
Concentración UI/ml Área Concentración
encontrada Factor de respuesta
1,00 1.995.221 0,98 2025193,86
2,00 4.069.962 1,93 2034981,00
3,00 6.034.724 2,86 2011574,67
4,00 8.429.450 4,00 2107362,50
6,00 12.640.290 5,99 2106715,00
8,00 16.928.606 8,03 2116075,75
10,00 21.020.548 9,97 2102054,80
Promedio 2079793,95
CV 2,15%
El procedimiento analítico es lineal, r es mayor a 0,9990(0,9999)
Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% ; 2,15%
Además el coeficiente de determinación r2 es 0,9998
58
3.3 EXACTITUD
Concentración UI/ml Área Concentración
encontrada UI/ml
Porcentaje de
recuperación
1,000 1.992.929 0,949 94,94%
2,000 4.207.603 2,004 100,22%
3,000 6.056.866 2,885 96,18%
4,000 8.396.681 4,000 100,00%
6,000 13.042.760 6,213 103,55%
8,000 16.965.513 8,082 101,03%
10,000 21.190.415 10,095 100,95%
Promedio 99,55%
tobservado 0,400
ttabla
2,447 CV 3,00%
El t tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0,05) y a 6 grados de libertad t.95
=2,447
Como el t observado es menor al t tabla el método cumplió con la exigencia de exactitud, según los
análisis efectuados.
59
3.4 PRECISIÓN
N° Análisis Área UI/ml Encontrados % Recuperación
1 18.066.651 8,03 100,44%
2 18.005.168 8,00 100,10%
3 18.001.460 8,00 100,08%
4 18.119.340 8,05 100,74%
5 17.998.865 8,00 100,07%
6 18.054.529 8,03 100,38%
7 17.969.457 7,99 99,90%
8 18.038.532 8,02 100,29%
9 18.126.059 8,06 100,77%
10 17.875.481 7,95 99,38%
Promedio 8,01 100,22%
CV 0,41%
En este ensayo de repetitividad se consideró adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%
, según la norma ICH o de 1,9% según AEFI.
El método implementado es preciso, ya que cumplió con un CV inferior a 2%, el valor
encontrado fue de 0,41%
Límite de Confianza 100,2% ± 0,929%
Conclusiones: De acuerdo al protocolo establecido y los parámetros evaluados según la USP 27
Ed, se pudo establecer que la metodología implementada cumplió con los parámetros exigidos
para su validación, por lo tanto es apta y confiable para el análisis rutinario de insulina humana,
en el producto inyectable, formulado según lo descrito en la composición del producto.
60
4.0 Límites de Detección y Cuantificación
Conc.
UI Área1 Área2 Área3
Área
promedio
Desviación
estandar
1,00 1.995.221 1.995.224 1.995.225 1.995.223,33 2,08
2,00 4.137.681 4.137.669 4.137.683 4.137.677,67 7,57
3,00 6.061.260 6.061.240 6.061.252 6.061.250,67 10,06
YbI=1310,3 SbI=1,41 B=2.127.738
Límite de detección ( Ld )
LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl )/ B) * ( 1/√ n ) = 3,56*10-4 UI/ml
Límite de cuantificación ( Lc )
LC ( K=10) = ( (Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) = 3,59*10-4 UI/ml
61
VALIDACIÓN INSULINA LISPRO I. COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO
Cada ml de suspensión contiene:
Insulina Lispro origen DNA recombinante 100,000 UI
m-Cresol 3,150 mg
Glicerina 16,000 mg
Fosfato dibásico de sodio 1,880 mg
Oxido de Zinc 0,024 mg
Agua para inyectables CSP 1,000 ml
Acido clorhídrico al 10% y/o hidróxido de sodio al 10%, para ajustar pH:
entre 7,0 y 7,8.
II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN ENTREGADA POR EL FABRICANTE DEL
PRODUCTO, PARA EL PRINCIPIO ACTIVO EN EL PRODUCTO TERMINADO, ENTRE
UN 95,0% A UN 105,0%
III.- METODOLOGÍA EMPLEADA SEGÚN LO ESPECIFICADO.
Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que no existia una metodología oficial y la
metodología enviada por el fabricante de las insulinas presentaba diferencias en los tiempos de
retención.
1. Preparación de la solución de principio activos.
Soluciones estándar:
Se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de Insulina lispro, calidad estándar de referencia, con
una potencia declarada de 173,5 UI USP en 6,014 mg de insulina por vial, para obtener una
solución de 33,7 UI/ml.
De la solución anterior, se tomó una alícuota de 1 ml, se trasladó a una matraz aforado de 10 ml,
se diluyó y aforó con HCl 0,01N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial, la
solución estándar final tiene 3,470 UI/ml.
62
Solución Muestra:
Se agregó gota a gota una solución de HCl 1 N al vial con el producto muestra, hasta disolución
total de la suspensión, de esta solución se tomó 2 ml y se transfirió a un matraz de 50 ml, se
diluyó y aforó con HCl 0,01 N, se filtró por membrana y se depositó la solución en un vial de
HPLC.
PROCEDIMIENTO
Cromatografía líquida de alta resolución.
Condiciones cromatograficas
Columna : Jupiter (C-18; 25 cm; 5 um ; 300 A° )
Fase Móvil Solución :
A: TFA 0,1% en agua / TFA 0,1% Acetonitrilo ( 71% / 29% )
B: TFA 0,1% en agua / TFA 0,1% Acetonitrilo ( 68% / 32% )
Comienzo con A y cambio a 100% B en 30 minutos; gradiente 0%-100%
TFA : Ácido trifluoracético
Flujo : 0,8 ml/minuto
Detector : Ultravioleta: a 215 nm.
Temperatura del horno : 30°C
Volumen inyectado : 50 ul
EQUIPOS UTILIZADOS
Cromatógrafo líquido de alta resolución. Certificado de calibración N°030624/3.
Bomba binaria D 7000 Serie 0703-152 Autosampler L7400 Serie: 0709-054, detector L-7200,
serie 0711-019, horno L-7100, serie 0707-173.
pH Metro Orion
Modelo 370, serie 3327, certificado de calibración: SMF 10949
63
Calificación de columna cromatográfica
Marca Phenomenex; Modelo Júpiter , empaque C-18, N° interno 26
N° Platos teóricos evaluados 12.341, fecha de calificación 28/03/2003.
Balanza analítica Mettler
Sensibilidad 0,1 mg
Modelo: AB-204 N°Serie: 1113483418
Certificado de Calibración N°560
PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD
Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes utilizando la técnica de
fabricación del producto. Se preparó una solución base con los excipientes de la fórmula
exceptuando el principio activo:
m-Cresol 3,150 mg.
Glicerina 16,000 mg.
Fosfato dibásico de Sodio 1,880 mg.
Oxido de Zinc 0,024 mg
Agua para inyectables CSP 1,000 ml.
Se analizó esta muestra según la metodología analítica correspondiente de manera tal de
identificar los picos respuesta de los excipientes.
Lo mismo se realizó con el estándar de insulina ,se agregó 5,0 ml de HCl 0,01 N a un vial de
insulina lispro estándar, se diluyó 1 ml, con 10 ml de HCl 0,01 N, se analizó según la
metodología analítica correspondiente de tal manera de identificar los picos respuesta del
principio activo.
64
La evaluación de la interferencia de los productos de degradación de la hidrólisis básica y ácida
se realizó con las tres soluciones patrones:
a) Excipientes (placebo)
b) Excipientes + péptido (estándar)
c) Péptido estándar
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1ml de la solución A, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño maría por 25
minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N y se
agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución A , se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a
70°C por 25 minutos, se enfrió y se neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N , se enrasó con HCL 0,01
N y se agitó.
EXCIPIENTE + PÉPTIDO (muestra):
Se tomó 2 ml del vial muestra previamente analizado y de potencia conocida, se transfirió a un
matraz de 50 ml, se diluyó y aforó con HCl 0,01 N (B)
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución anterior (B), se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó en un baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución base (B), se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría
a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl 0,01 N.
65
Excipientes:
Se tomó 2 ml del matraz solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 50ml., se diluyó
y aforó con HCl 0,01 N (C).
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución concentrada (C) , se adicionó 2 ml de HCL 0,5 N y se calentó a
baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó
con HCl 0,01 N y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución concentrada, se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño
maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl 0,5 N, se enrasó con HCl
0,01 N y se agitó.
RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD.
Interferencia de los productos de degradación o de los excipientes en la resolución
cromatográfica de la insulina
En el pico cromatográfico de la insulina no se apreció interferencia de los picos cromatográficos
de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención fueron muy diferentes.
Estándar de insulina lispro
Con temperatura: se produjo la degradación de la insulina humana, pero no se evidenció
interferencia con la señal del principio activo.
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de insulina, pero no existió evidencia de interferencias entre estos
productos de degradación con la señal del principio activo.
66
ESTÁNDAR DE INSULINA + EXCIPIENTES MUESTRA
Con temperatura: se produjo degradación de la insulina, pero no se evidenció interferencia con la
señal del principio activo.
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de Insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del
producto de degradación con la señal del principio activo.
Hidrólisis básica:
Se produjo degradación de insulina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del
producto de degradación con la señal del principio activo.
Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método es específico para insulina, ya
que no existió evidencia de alguna interferencia en los análisis.
Los tiempos de retención de insulina lispro determinados en el análisis de selectividad son:
22,10 minutos; 22,12 minutos; 22,49 minutos; 22,59 minutos; 22,56 minutos; 21,78 minutos;
22,75 minutos; 22,08 minutos; 22,18 minutos y 22,22 minutos.
Valor promedia: 22,18 minutos y S: 0,293.
Figura Nº 10. Cromatograma insulina lispro HPLC
67
Tanto los productos de degradación como los excipientes aparecieron a tiempos de retención
inferiores a 15 minutos, de tal manera que no interfirieron en los análisis, el más característico
apareció a los 12,44 minutos.
3.2 LINEALIDAD
Concentración UI/ml Área
1,00 1.725.232
2,00 4.069.992
3,00 6.035.724
4,00 8.429.450
6,00 12.640.290
8,00 16.928.606
10,00 21.120.548
LINEALIDAD INSULINA LISPRO
0
5
10
15
20
25
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
CONCENTRACIÓN UI/ml
ÁREA x 106
68
Coeficiente de
Correlación 0,9999
Pendiente 2,15*106
Intersección eje -3,15*105
Factor de respuesta
Concentración UI/ml Área Concentración
encontrada Factor de respuesta
1,00 1.725.232 0,81 2107362,50
2,00 4.069.992 1,93 2034996,00
3,00 6.035.724 2,86 2011908,00
4,00 8.429.450 4,00 2107362,50
6,00 12.640.290 5,99 2106715,00
8,00 16.928.606 8,03 2116075,75
10,00 21.120.548 10,02 2112054,80
Promedio 2085210,65
CV 2,05%
El procedimiento analítico es lineal r es mayor a 0,9990 (0,9999)
Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% ; 2,05%
Además el coeficiente de determinación r2 es 0,9998
69
3.3 EXACTITUD
Concentración
UI/mL Área Concentración encontrada
Porcentaje de
Recuperación
1,00 1.975.232 0,93 93,99%
2,00 4.137.681 1,96 98,44%
3,00 6.061.260 2,88 96,14%
4,00 8.406.155 4,00 100,00%
6,00 12.642.864 6,01 100,27%
8,00 17.051.502 8,11 101,42%
10,00 21.200.521 10,08 100,88%
Promedio 98,73%
CV 2,78%
tobservado 0,637
ttabla
2,447
El t de tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0,05) y a 6 grados de libertad
t.95=2,447
Como el t observado es menor al t tabla el método cumplió con la exigencia de exactitud, según los
análisis efectuados
70
3.4 PRECISIÓN
N° Análisis Área UI/ml
Encontrados % Recuperación
1 17.708.708 8,15 101,91%
2 17.813.480 8,20 102,51%
3 17.950.654 8,26 103,30%
4 17.803.883 8,19 102,46%
5 17.831.500 8,20 102,62%
6 17.903.651 8,24 103,03%
7 17.916.819 8,24 103,11%
8 17.927.004 8,25 103,17%
9 17.967.636 8,27 103,40%
10 17.990.403 8,28 103,53%
Promedio 8,23 102,91%
CV 0,50%
En este ensayo de repetitividad se consideró adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%,
según la norma ICH o de 1,9% según AEFI
El método implementado fue preciso, ya que cumplió con un CV inferior a 2%, el valor
encontrado fue de 0,50%
Límite de Confianza 102,91% ± 0,9294%
Conclusiones: De acuerdo al protocolo establecido y los parámetros evaluados según la USP 27
Ed, se pudo establecer que la metodología implementada cumplió con los parámetros exigidos
para su validación, por lo tanto, es apta y confiable para el análisis rutinario de insulina lispro, en
el producto inyectable, formulado según lo descrito en la composición del producto.
71
4.0 Límites de Detección y Cuantificación
Conc.mg/ml Área1 Área2 Área3 Área
promedio
Desviación
estandar
1 1.925.222 1.925.212 1.925.222 1.925.218,67 5,77
2 4.069.989 4069991 4.069.993 4.069.991 2,00
3 5.235.719 5.235.720 5.235.721 5.235.720 1,00
YbI=433.141 SbI=7,69 B=2.151.694
Límite de detección ( Ld )
LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) = 0,12 UI/ml
Límite de cuantificación ( Lc )
LC ( K=10) = (( Ybl +10Sbl )/ B)*( 1/√ n ) = 0,12 UI/ml
72
VALIDACION CALCITONINA
I. COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO
Cada ml contiene:
Calcitonina ( de Salmon) 100,00 UI
Edetato disódico 1,00 mg
Cloruro de sodio 7,50 mg
Cloruro de benzalconio 0,15 mg
Acido clorhídrico csp pH 3,70
Agua para inyectables csp 1,00 ml
II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN CONSIDERADA POR EL LABORATORIO, AL
NO EXISTIR OFICIALMENTE, PARA EL PRINCIPIO ACTIVO EN EL PRODUCTO
TERMINADO, ENTRE UN 90,0% A UN 110,0%
III.- METODOLOGÍA EMPLEADA SEGÚN LO ESPECIFICADO.
Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que no existia una metodología oficial para el
producto terminado y la metodología empleada en base a una fase movil con gradiende de
solución de hidroxido de tetrametilamonio no presentaba picos aceptables y los tiempos de
retención pqueños no permitian una separación con los excipientes y productos de degradación.
.
1. Preparación de la solución de principio activos.
Soluciones estándar:
Se pesó con precisión, alrededor de 10.000 UI de Salcatonina estándar, aproximadamente 2,0 mg
( se consideró un estándar de 5.000 UI/mg) , se disolvió y diluyó a 10 ml con agua.
Se diluyó 5,0 ml de esta solución a 10 ml con fase móvil
Solución Muestra:
Se mezcló 1,0 ml de muestra con 1,0 ml de fase móvil y se agitó.
73
PROCEDIMIENTO
Cromatografía líquida de alta resolución.
Condiciones cromatograficas
Columna : Symmetry (C-8;15 cm;4,6 um)
Fase Móvil
A Ácido trifluoracetico al 0,1% en agua / Acetonitrilo ( 75 % / 25 % )
B Ácido trifluoracetico al 0,1% en agua / Acetonitrilo ( 50 % / 50 % )
Gradiente en 20 minutos 0%-100% , inicio con A y termino con B
Flujo : 1,0 ml/minuto
Detector : Ultravioleta: a 220 nm.
Temperatura del horno : 30°C
Volumen inyectado : 20ul
EQUIPOS UTILIZADOS
Cromatógrafo líquido de alta resolución, certificado de calibración N°030624/3.
Bomba binaria D 7000 Serie 0703-152 Autosampler L7400 Serie: 0709-054, detector L-7200,
serie 0711-019, horno L-7100, serie 0707-173.
pH Metro Orion
Modelo 370, serie 3327, certificado de calibración: SMF 10949
74
Calificación de columna cromatográfica.
Marca Waters; Modelo Symmetry, empaque C-8, N° interno 1522
N° Platos teóricos evaluados 12.260, fecha de calificación 20/05/2004.
Balanza analítica Mettler
Sensibilidad 0,1 mg
Modelo: AB-204 N°Serie: 1113483418
Certificado de Calibración N°560
PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD
Edetato disódico 1,00 mg
Cloruro de sodio 7,50 mg
Cloruro de benzalconio 0,15 mg
Acido clorhídrico csp pH 3,70
Agua para inyectables csp 1,00 ml.
Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes, utilizando la técnica de
fabricación del producto se preparó una solución base con los excipientes de la fórmula
exceptuando el principio activo.
Se analizó esta muestra según la metodología analítica correspondiente de manera tal de
identificar los picos respuesta de los excipientes.
Lo mismo se realizó con el estándar de calcitonina se agrego 10,0 ml de agua a
10.000 UI estándar (solución A), se diluyó 5 ml, con 10 ml de fase móvil A, se analizó según la
metodología analítica correspondiente de tal manera de identificar los picos respuesta del
principio activo.
75
Interferencia de los productos de degradación, la hidrólisis básica y ácida se realizó con las tres
soluciones patrones:
a) Excipientes (placebo)
b) Excipientes + péptido (estándar)
c) Péptido estándar
Se agregó 10,0 ml de agua a 10.000UI de estándar ( solución A)
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1ml de la solución A, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N y se calentó a baño maría por 25
minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se
agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución A y se adicionó 2 ml de NaOH 0,5 N y se calentó a baño maría a
70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de HCl, 0,5 N , se enrasó con fase móvil A
y se agitó.
EXCIPIENTE + PÉPTIDO (muestra):
Se tomó un frasco del producto muestra previamente analizado y de potencia conocida.
Hidrólisis ácida:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml , se adicionó 2 ml de HCl
0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de
NaOH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml , se adicionó 2 ml de
NaOH 0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2
ml de HCl 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
76
EXCIPIENTES:
Se tomó la solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 10 ml., para cada hidrólisis.
Hidrólisis ácida:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl
0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de
Na OH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml , se adicionó 2 ml de
NaOH 0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2
ml de HCl 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD.
Interferencia de los productos de degradación o de los excipientes en la resolución
cromatográfica de la calcitonina
En el pico cromatográfico de la calcitonina no se apreció la interferencia de los picos
cromatográficos de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención son
diferentes
Estándar de calcitonina
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de calcitonina, pero no existió evidencia de la interferencia entre estos
productos de degradación con la señal del principio activo.
77
Hidrólisis básica:
Se produjo degradación de calcitonina, pero no se evidenció interferencia entre los picos del
producto de degradación con la señal del principio activo.
EXCIPIENTE + PÉPTIDO (muestra):
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de calcitonina y de los excipientes, pero no existió evidencia de
interferencias entre estos productos de degradación o de los excipientes con la señal del principio
activo.
Hidrólisis básica:
Se produjo degradación de calcitonina y de los excipientes, pero no se evidenció interferencia
entre los picos del producto de degradación o de los excipientes con la señal del principio activo.
Excipientes:
En los cromatogramas de los excipientes, tanto sin hidrolizar como hidrolizados fue evidente que
no aparecieron picos al tiempo de retención de la calcitonina.
Con los cromatogramas de respaldo se concluyó que el método es específico para calcitonina, ya
que no existió evidencia de alguna interferencia en los análisis.
Los tiempos de retención de calcitonina determinados en el análisis de selectividad son: 7,60
minutos; 7,59 minutos; 7,54 minutos; 7,59 minutos; 7,54 minutos; 7,58 minutos; 7,55 minutos;
7,58 minutos; 7,59 minutos y 7,60 minutos.
Valor promedio: 7,57 minutos y S:0,024.
78
Figura Nº 10. Cromatograma calcitonina ( salcatonina) HPLC
Tanto los productos de degradación como los excipientes aparecieron a tiempos de retención
distintos a los del pico principal de calcitonina , muy posterior a 15,97 minutos, o mucho antes, a
los 3,14 y 4,22 minutos, de tal manera que no interfirieron en los análisis.
3.2 LINEALIDAD
Concentración UI/ml Área
71,96 288.823
179,91 728.224
269,87 1.103.909
359,83 1.434.135
449,79 1.855.734
749,65 2.924.506
899,58 3.575.780
1349,37 5.261.635
79
LINEALIDAD CALCITONINA
0
10
20
30
40
50
60
0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0 1200,0 1400,0 1600,0
CONCENTRACIÓN UI/ml
Coef.de Correlación 0,9998
Pendiente 3.885,53
Intersección eje 43.564,26
Factor de Respuesta
Concentración UI/ml Área concentración
encontrada Factor de respuesta
71,96 288.823 73,90 4013,66
179,91 728.224 186,33 4047,58
269,87 1.103.909 282,46 4090,52
359,83 1.434.135 366,96 3985,52
449,79 1.855.734 474,84 4125,76
749,65 2.924.506 748,31 3901,16
899,58 3.575.780 914,96 3974,93
1349,37 5.261.635 1346,33 3899,31
Promedio 4004,80
CV 2,05%
ÁREA x 105
80
El procedimiento analítico es lineal, r es mayor a 0,9990(0,9998)
Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% ; 2,05
Además el coeficiente de determinación r2 es 0,9995
3.3 EXACTITUD
Concentración
UI/ml Área
Concentración
encontrada
UI/ml
Porcentaje de
recuperación
71,96 290.199 73,49 102,13%
179,91 699.788 177,22 98,50%
269,87 1.100.597 278,72 103,28%
359,83 1.394.129 353,06 98,12%
449,79 1.798.787 455,54 101,28%
749,65 2.895.795 733,36 97,83%
899,58 3.489.879 883,82 98,25%
Promedio 99,91%
CV 2,26%
tobservado 0,1051
ttabla 2,4470
El t de tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0.05) y a 6 grados de libertad
t.95=2,447
Como el t observado es menor al t tabla el método cumple con la exigencia de exactitud, según los
análisis efectuados.
81
3.4 PRECISIÓN
N°
Análisis Área UI/ml Encontrados % Recuperación
1 597.812 378,97 105,32%
2 589.535 373,72 103,86%
3 593.069 375,96 104,48%
4 595.412 377,45 104,90%
5 596.016 377,83 105,00%
6 595.522 377,52 104,92%
7 596.834 378,35 105,15%
8 594.938 377,15 104,81%
9 596.810 378,33 105,14%
10 598.420 379,35 105,43%
Promedio 377,46 104,90%
CV 0,43%
< 1.90
En este ensayo de repetitividad se consideró adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%,
según la norma ICH o de 3,9% según AEFI
El método implementado es preciso, ya que cumplió con un CV inferior a 2%, el valor
encontrado es de 0,43%
Límite de confianza 104,9% ± 1,020%
Conclusiones: De acuerdo al protocolo establecido y los parámetros evaluados según la USP 27
Ed, se pudo establecer que la metodología implementada cumplió con los parámetros exigidos
para su validación, por lo tanto es apta y confiable para el análisis rutinario de calcitonina, en el
producto terminado, formulado según lo descrito en la composición del producto.
82
4.0 Límites de Detección y Cuantificación
Conc.
UI Área1 Área2 Área2 Área promedio
Desviación
estandard
72 288.115 288.118 288.123 288.118,6 4,04
180 728.214 728.222 728.220 728.218,6 4,16
270 1.090.732 1.090.739 1.090.744 1.090.738,3 6,02
YbI=3.097,3 SbI=3,05 B=3.885,5
Límite de detección ( Ld )
LD ( K=3) = ( (Ybl +3Sbl) / B) * ( 1/√ n ) = 0,46 UI/ml
Límite de cuantificación ( Lc )
LC ( K=10) = ( (Ybl +10Sbl) / B)*( 1/√ n ) = 0,46 UI/ml
83
VALIDACIÓN DESMOPRESINA
I. COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO
Cada ml contiene:
Acetato de Desmopresina Trihidrato 0,100 mg
Equiv. a Desmopresina 0,089 mg
Clorobutanol 5,000 mg
Cloruro de sodio 9,000 mg
Acido clorhídrico csp pH 4,0
Agua para inyectables csp 1,000 ml.
II.- ESPECIFICACIÓN DE ACEPTACIÓN ENTREGADA POR EL FABRICANTE DEL
PRODUCTO PARA EL PRINCIPIO ACTIVO EN EL PRODUCTO TERMINADO,
ENTRE UN 90,0% A UN 110,0%
III.- METODOLOGÍA EMPLEADA SEGÚN LO ESPECIFICADO.
Se desarrolló y validó esta nueva metodología, ya que no existia una metodología oficial
de farmacopea para esta solución endonasal y la metodología enviada por el fabricante de
la desmopresina presentaba interferencias con los excipientes y los productos de
degradación.
1. Preparación de la solución de principio activos.
Soluciones estándar :
Se pesó con precisión, alrededor de 10 mg de Acetato de desmopresina trihidrato, calidad
estándar, se disolvió y diluyó a 100 ml con agua.
Solución muestra:
Muestra tal cual.
84
PROCEDIMIENTO
Cromatografía líquida de alta resolución.
Condiciones cromatográficas
Columna : Kromasil (C-8; 25 cm; 4,6 um)
Fase Móvil :
Tampón Fosfato pH 7.0 / Acetonitrilo (80/ 20)
Tampón : Mezclar 380,0 ml de KH2PO4 0,908 g % en agua con 611,0 ml
de Na2HPO4 2,38 g % en agua
Flujo : 1,5 ml./minuto
Detector : Ultravioleta: a 220 nm.
Temperatura del horno : 30°C
Volumen inyectado : 20 ul
EQUIPOS UTILIZADOS
Cromatógrafo líquido de alta resolución, certificado de calibración N°030624/3.
Bomba binaria D 7000 Serie 0703-152 Autosampler L7400 Serie: 0709-054, detector L-7200,
serie 0711-019, horno L-7100, serie 0707-173.
pH Metro Orion
Modelo 370, serie 3327, certificado de calibración: SMF 10949
Calificación de columna cromatográfica.
Marca: Akzo-nobel, modelo: Kromasil;, empaque C-8, N° interno 1858
N° Platos teóricos evaluados 23.882, fecha de calificación 22/10/2004.
Balanza analítica Mettler
Sensibilidad 0,1 mg
Modelo: AB-204 N°Serie: 1113483418
Certificado de Calibración N°560
85
PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD Clorobutanol 5,0 mg
Cloruro de sodio 9,0 mg
Ácido clorhídrico csp pH 4,0
Agua para inyectables CSP 1,00 ml.
Este ensayo sirvió para descartar la interferencia de los excipientes, utilizando la técnica de
fabricación del producto se preparó una solución base con los excipientes de la fórmula
exceptuando el principio activo.
Se analizó esta muestra según la metodología analítica correspondiente de manera tal de
identificar los picos respuesta de los excipientes.
Lo mismo se realizó con el estándar, se pesó con precisión , una cantidad cercana a 10 mg de
acetato de desmopresina trihidrato , calidad estándar, se disolvió y diluyó a 100 ml con agua, se
analizó según la metodología analítica correspondiente, de tal manera de identificar los picos
respuesta del principio activo.
Interferencia de los productos de degradación, la hidrólisis básica y ácida se realiza con las tres
soluciones patrones:
a) Excipientes (placebo)
b) Excipientes + péptido (estándar)
c) Péptido estándar
Se peso con precisión, alrededor de 10 mg de Acetato de desmopresina trihidrato, calidad
estándar, se disolvió y diluyo a 10 ml con agua.( solución A)
86
Hidrólisis ácida:
Se tomó 1 ml de la solución A, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl 0,5 N
y se calentó a baño maría por 25 minutos a 70°C, se enfrió y neutralizó con 2 ml de NaOH 0,5
N, se enrasó con Fase Móvil A , se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 1 ml de la solución A , se trasladó a un matraz aforado de 10 ml, se adicionó 2 ml de
NaOH 0,5 N y se calentó a baño María a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de
HCl 0,5 N , se enrasó con fase móvil A y se agitó.
EXCIPIENTE + PÉPTIDO (muestra):
Se tomó un frasco del producto muestra previamente analizado y de potencia conocida.
Hidrólisis ácida:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se traslado a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl
0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de
NaOH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
Hidrólisis básica:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de
NaOH 0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2
ml de HCl 0,5N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
EXCIPIENTES:
Se tomo la solución de excipientes y se transfirió a un matraz de 10 ml, para cada hidrólisis
Hidrólisis ácida:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de HCl
0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2 ml de
Na OH 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
87
Hidrólisis básica:
Se tomó 2 ml de la solución anterior, se trasladó a un matraz de 10 ml, se adicionó 2 ml de
NaOH 0,5 N y se calentó en un baño maría a 70°C por 25 minutos, se enfrió y neutralizó con 2
ml de HCl 0,5 N, se enrasó con fase móvil A y se agitó.
RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN
3.1 SELECTIVIDAD.
Interferencia de los productos de degradación o de los excipientes en la resolución
cromatográfica de la desmopresina.
En el pico cromatográfico de la Desmopresina no se aprecio la interferencia de los picos
cromatográficos de excipientes o productos de degradación, los tiempos de retención fueron muy
diferentes.
Estándar de desmopresina
Hidrólisis ácida:
Se produjo la degradación de la esmopresina, pero no existió evidencia de interferencias entre
estos productos de degradación con la señal del principio activo.
Hidrólisis básica:
Se produjo degradación de la desmopresina, pero no se evidencio interferencia entre los picos
del producto de degradación con la señal del principio activo.
88
EXCIPIENTE + PÉPTIDO (muestra):
Hidrólisis ácida:
Se produjo degradación de la desmopresina y de los excipientes, pero no existió evidencia de
interferencias entre estos productos de degradación o de los excipientes con la señal del principio
activo.
Hidrólisis básica:
Se produjo degradación de la desmopresina y de los excipientes, pero no se evidencio
interferencia entre los picos del producto de degradación o de los excipientes con la señal del
principio activo.
Excipientes:
En los cromatogramas de los excipientes, tanto sin hidrolizar como hidrolizados, es evidente que
no aparecieron picos al tiempo de retención de la Desmopresina.
Con los cromatogramas de respaldo se concluyo que el método es específico para, desmopresina
ya que no existió evidencia de alguna interferencia en los análisis.
Los tiempos de retención de desmopresina determinados en el análisis de selectividad son: 9,50
minutos; 9,51 minutos; 9,54 minutos; 9,53 minutos; 9,54 minutos; 9,58 minutos; 9,56 minutos;
9,50 minutos; 9,52 minutos y 9,60 minutos.
Valor promedio: 9,53 minutos y S:0,033.
89
Figura Nº 11. Cromatograma desmopresina HPLC
Tanto los productos de degradación como los excipientes aparecieron a tiempos de retención
distintos a los del pico principal de desmopresina , muy anteriores a 6,42 minutos, o mucho
antes 2,66 y 5,08 minutos, de tal manera que no interfirieron en los análisis.
3.2 LINEALIDAD
Concentración
mg/ml Área
0,0050 64.673
0,0100 126.787
0,0200 267.810
0,0400 488.230
0,0450 591.537
0,0500 655.216
0,1000 1.291.878
90
LINEALIDAD DESMOPRESINA
0
20
40
60
80
100
120
140
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12
CONCENTRACIÓN mg/ml
Coeficiente de
Correlación 0,9994
Pendiente 1,2*107
Intersección eje -410,23
ÁREA x 104
91
Factor de Respuesta
Concentración mg/ml Área Concentración
encontrada Factor de respuesta
0,005 64.673 0,0049 12934600,00
0,010 126.787 0,0090 12678700,00
0,020 267.810 0,0210 13390500,00
0,040 488.230 0,0040 12205750,00
0,045 591.537 0,0440 13145266,67
0,050 655.216 0,0499 13104320,00
0,100 1.291.878 0,0999 12918780,00
Promedio 12911130,95
CV 2,96%
El procedimiento analítico es lineal r es mayor a 0,9990(0,9994)
Y en el factor de repuesta CV es menor a 5% : 2,96%
Además el coeficiente de determinación r2 es 0,9989.
92
3.3 EXACTITUD
Concentración mg/ml Área Concentración
encontrada mg/ml
Porcentaje de
recuperación
0,0010 12.698 0,00101 101,00%
0,0025 27.987 0,00240 96,00%
0,0050 54.673 0,00477 95,49%
0,0100 116.787 0,01020 101,99%
0,0250 275.269 0,02404 96,15%
0,0500 569.339 0,04972 99,44%
0,1000 1.198.654 0,10468 104,68%
Promedio 99,25%
CV 3,55%
tobservado 0,558
ttabla 2,447
El t tabla corresponde a pruebas unilaterales para un riesgo ( p=0,05) y a 6 grados de libertad
t.95=2,447
Como el t observado es menor al t tabla el método cumplió con la exigencia de exactitud, según los
análisis efectuados
93
3.4 PRECISIÓN
N° Análisis Área mg/ml
Encontrados % Recuperación
1 1.291.878 0,1000 100,00%
2 1.271.878 0,0984 98,45%
3 1.292.878 0,1000 100,07%
4 1.291.778 0,0999 99,99%
5 1.291.870 0,1000 100,00%
6 1.291.868 0,0999 99,99%
7 1.291.848 0,0999 99,99%
8 1.290.878 0,0999 99,92%
9 1.291.378 0,0999 99,96%
10 1.281.878 0,0992 99,92%
Promedio 0,0997 99,83%
CV 0,49%
En este ensayo de repetitividad se considero adecuado un coeficiente de variación inferior al 2%,
según la norma ICH o de 3,9% según AEFI
El método implementado es preciso, ya que cumplió con un CV inferior a 2%, el valor
encontrado es de 0,49%
Límite de Confianza 99,83%% ± 1,1064%
Conclusiones: De acuerdo al protocolo establecido y los parámetros evaluados según la USP 27
Ed, se pudo establecer que la metodología implementada cumplió con los parámetros exigidos
para su validación, por lo tanto es apta y confiable para el análisis rutinario de desmopresina, en
el producto terminado, formulado según lo descrito en la composición del producto.
94
4.0 Límites de Detección y Cuantificación
Conc.mg/ml Área1 Área2 Área2 Área promedioDesviación
estandar
0,008 90.059 90.054 90.057 90.056,66 2,51
0,010 139.622 139.626 139.629 139.625,66 3,51
0,015 239.988 239.989 239.980 239.985,66 4,93
YbI=76.199 SbI=0,02 B=12.922.232
Límite de detección ( Ld )
LD ( K=3) = ( Ybl +3Sbl / B) * ( 1/√ n ) = 3,4*10-3 mg/ml
Límite de cuantificación ( Lc )
LC ( K=10) = ( Ybl +10Sbl / B)*( 1/√ n ) = 3,4*10-3 mg/ml
95
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
-Para dar inicio a la validación de este tipo de sustancias peptídicas, tales como: insulinas,
calcitonina y desmopresina, fue necesario contar de antemano con instrumentos calificados y
con un laboratorio con un Programa de Garantía de la Calidad, que dé la confianza y garantías
necesarias para emplear todos los instrumentos y equipos que se usaron en la validación de las
metodologías analíticas de estas sustancias peptídicas, por menores que estos fueran (6,7)
El lugar de trabajo tenía las condiciones de temperatura y humedad adecuadas (controladas) y
los equipos, especialmente los HPLC, contaban con los módulos necesarios para controlar
esencialmente la temperatura de las columnas y las bombas binarias para hacer gradientes,
condiciones que resultan fundamentales para el desarrollo de las metodologías (9)
-Previo a la validación fue importante conocer las características de cada péptido o proteína, su
labilidad (estabilidad en el medio en que se disolvió finalmente, para el desarrollo del análisis),
con el fin de tomar todas las precauciones necesarias durante los análisis (11)
- Las características peptídicas variadas de estas moléculas, de gran complejidad, fueron un buen
modelo de estudio, debiendo sortearse su inestabilidad, no sólo en soluciones extremas de pH,
sino también cuidando los solventes orgánicos y las soluciones salinas que se emplearon para
disolverlas (23,24)
-La mejor orientación en ese sentido, que constituyó un buen punto de partida para seleccionar el
solvente en que se disolvió o diluyeron las muestras a analizar fue la formulación en la cual
están preparadas estas proteínas, usadas como fármacos por su alta actividad como hormonas, el
pH y las características de las sales en las cuales viene preparado el producto (11,23)
-El solvente seleccionado para disolver las muestras fue de vital importancia, ya que por un lado
permitió mantener estable la proteína sin que se produjera degradación, durante el tiempo que
duró el ensayo y por otro lado permitió una buena resolución cromatográfica, sin mayores
alteraciones de la línea base, especialmente cuando se inyectan volúmenes mayores, para
mejorar la respuesta.
96
-Un aspecto importante y digno de destacar fue el largo de la cadena peptídica, esto conlleva
varias limitaciones se pudo comprobar que a un menor número de aminoácidos, péptidos de
cadena corta, se presentó un problema mayor: disminuye considerablemente la absorbilidad en
la longitud de onda de trabajo, se hace necesario trabajar con concentraciones altas Por ejemplo,
con la desmopresina péptido de tan solo 9 aminoácidos, se usó una concentración de 10 mg %.
Cuando se tiene un largo de cadena considerable, como en el caso de las insulinas que tienen 51
aminoácidos, se presentan otro tipo de problemas con las columnas tradicionales, la interacción
deforma los picos cromatográficos, lo que obligó a usar columnas de un mayor tamaño de poro,
por ejemplo 300 °A y reactivos que mejoraran la solubilidad de la proteína, como el ácido
trifluoracetico(TFA), con el fin de tener una adecuada resolución, de otra forma habría sido
imposible validar estos métodos analíticos(13)
-En el rango de péptidos estudiados no se encontraron grandes problemas de estabilidad, que
obligaran a tomar precauciones especiales en el manejo de las muestras, pero sin duda esto más
bien recae en las características particulares de cada péptido y no se puede generalizar, pero sí se
puede asegurar que para insulina humana, insulina lispro, calcitonina y desmopresina, se
mantienen las soluciones estables por varios días, incluso a temperatura ambiente, disueltas en
los solventes indicados en cada metodología (3-5)
-Se pudo comprobar la necesidad del uso de columnas apropiadas, para péptidos de alto peso
molecular, como calcitonina e insulina humana y lispro, preferentemente columnas largas y de
cadena corta C-4 o C-8 con un tamaño de poro sobre 100 Aº, idealmente de 300 ºA, no
descartando el empleo de columnas C-18 con un tamaño de poro de 300 ºA cuando se requiera
una mejor separación, debido a una mayor área superficial de la fase estacionaria. Esto permitió
montar técnicas analíticas, confiables, de buena resolución y rápido desarrollo, absolutamente
validadas, para su empleo en análisis de rutina, en productos farmacéuticos que las contengan
(9,13,18)
97
-En general, se pudo apreciar que los límites de detección y cuantificación fueron cercanos a
los valores inferiores de las curvas de calibración, lo que no sucede en general con otro tipo de
moléculas, donde los límites de cuantificación (Lc) y límites de detección (Ld) son varios
órdenes inferiores a los valores de la curva de calibración, en esto influye la baja absorbilidad,
que presenta este tipo de moléculas peptídicas, que depende del número de aminoácidos para
generar una buena respuesta en el detector UV. Esto no permite trabajar en concentraciones
muy por debajo de las concentraciones menores de las curvas de calibración.
La diferencia entre el límite de detección (Ld) y el límite de cuantificación (Lc) , en general, es
muy estrecha, esto se explica porque en la ecuación empleada para la determinación de estas
concentraciones límites, el valor del intercepto es muy alto, no es cercano a cero como en una
linea recta ideal y por lo tanto el factor K, que para el cálculo del Ld es de 3 y para el calculo de
Lc es de 10 no es un factor diferenciador para el resultado de estas concentraciones límites
(1,6,7)
En todos los análisis efectuados se encontró una sola excepción respecto a valores de Ld y Lc
por debajo de las concentraciones inferiores de la curva de calibración, que fue con la insulina
humana, el segundo ensayo con gradiente, donde coincide que se trata de una de las moléculas
estudiadas con mayor número de aminoácidos, con buena absorbilidad si se compara con
Calcitonina y Desmopresina y presenta además una de las mejores relaciones entre las
concentraciones bajas de la curva de calibración, respecto a la respuesta del equipo( área).
Por otro lado, no tiene una importancia analítica relevante el hecho de que los límites de
cuantificación(Lc) y detección(Ld) no tengan valores relativos muy bajos, ya que el rango de
trabajo (linealidad de las curvas) en los análisis de todos los péptidos involucrados en el estudio
están en un rango de concentraciones muy superior, totalmente distinto y por lo tanto no influye
en los análisis rutinarios.
Finalmente es importante destacar que en el primer ensayo de insulina humana, siguiendo la
técnica de la USP 27, no se logró cumplir con el requisito de selectividad. En este ensayo el
tiempo de retención de la insulina es variable con cada inyección y es imposible asegurar la no
interferencia de excipientes y/o productos de degradación en la determinación de insulina.
98
Una posible explicación a las variaciones en los tiempos de retención de la insulina, empleando
la fase móvil descrita en la farmacopea de los Estados Unidos, es que esta proteina tiene una
estructura secundaria y terciaria y eso permite que solo una pequeña proporción de la superficie
molecular tenga interacción con la fase estacionaria de la columna, el tiempo de retención estará
determinado por la composición molecular específica de contacto hidrofóbico de la insulina y
cómo influye cada vez la fase móvil con una alta concentración de sales en el ordenamiento
secundario y terciario de esta proteina (3,9)
Por otro lado, evidentemente la interacción de una proteina polipeptídica como la insulina con la
fase estacionaria de la columna no puede ser igual que con una molécula pequeña, la interacción
hidrofóba para este tipo de proteinas con la superficie del relleno será muy dependiente del
componente orgánico de la fase móvil, en este caso acetonitrilo (9,12,13)
La concentración del componente orgánico es crítica en los tiempos de retención de la insulina y
en esto puede influir la volatilidad de acetonitrilo, produciéndose variaciones por la forma de
preparación de la fase móvil y también la posible variación de la concentración del solvente en
la mezcla debido al tiempo de preparación de la fase móvil.
En el segundo ensayo para la determinación de insulina humana se logró montar un método
analítico no oficial, que cumple con todos los requisitos exigidos para una validación analítica,
que emplea una fase móvil con gradiente, donde no se producen estas variaciones en los tiempos
de retención de insulina (1,6,7)
En el caso de calcitonina no se contaba con un método oficial para el producto terminado y el
método para la materia prima, cuya fase móvil está formada principalmente por hidróxido de
tetrametilamonio, presentaba grandes deficiencias por la deformación de los picos
cromatográficos y por su deficiente selectividad entre el pico de calcitonina y los productos de
degradación y/o excipientes (4,6,7)
Finalmente en el caso de desmopresina sucede algo similar, no existe un metodo oficial para la
solución de uso endonasal y la metodología no cumplía con el requisito de selectividad. Tanto
para calcitonina como para desmopresina se logró montar un método analítico que cumple con
todos los requisitos para una validación analítica (1,4-7)
99
CONCLUSIONES
1.Se cumplió plenamente la hipótesis planteada, se logró demostrar que es posible trabajar
adecuadamente péptidos y proteínas de distintas características y efectuar análisis confiables con
métodos analíticos validados, para cada uno de ellos. Basándose en la selección adecuada de
columnas cromatográficas se logró montar técnicas analíticas confiables para una serie de
péptidos, con características disímiles, empleando para ello los equipos HPLC con detectores
UV.
2.Se comparó el método descrito en la USP 27 para insulina humana con un método
desarrollado en este estudio, encontrándose mejoras notables en el método que fue parte de este
estudio, especialmente por su reproducibilidad y ausencia de los problemas que producen las
fases móviles con un alto contenido de sales, como la precipitación de sales al interior de la
columna.
3. Se logró el objetivo general, pues se desarrollaron métodos analíticos adecuados para todos
los fármacos parte del estudio, se estableció un método confiable y validado para el análisis de
todos los péptidos: insulina humana, insulina lispro, calcitonina (salcatonina) y desmopresina,
para ser aplicada en su forma farmacéutica comercial.
4.Se cumplieron todos los objetivos específicos, estudiando las variables que influyen en los
métodos analíticos por HPLC para péptidos y se pudieron validar cada uno de los métodos
analíticos montados, siguiendo los criterios de la farmacopea, para cada uno de los péptidos
involucrados en el estudio.
El modelo de estudio seleccionado, péptidos entre 9 y 51 aminoácidos, unido a la experiencia
lograda, en el manejo de solventes adecuados, para disolver las muestras y para formar las fases
móviles como también el tipo de columna (relleno y largo), permitirá el desarrollo más rápido y
la validación de técnicas analíticas para otros péptidos que se deseen evaluar en el futuro, cuando
se incorporen al arsenal terapéutico nacional.
100
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104
ANEXOS
TABLA N° 1. Valores de t de Student
105
TABLA N° 2. Valores aceptables de CV según límites de aceptación