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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE INGENIERIA AMBIENTAL
TRABAJO DE TITULACIÓN
PREVIO A LA OBTENCION DE TITULO DE INGENIERO AMBIENTAL
TEMA:
DETECCIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL DE BIORREMEDIACIÓN DE
SUELOS CONTAMINADOS CON ACEITE USADO DE MOTOR
AUTOR: Yamil Javier Franco Alarcón
TUTOR: MSc. Miriam Salvador Brito
GUAYAQUIL, ABRIL 2019
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE INGENIERIA AMBIENTAL
TRABAJO DE TITULACIÓN
PREVIO A LA OBTENCION DE TITULO DE INGENIERO AMBIENTAL
TEMA:
DETECCIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL DE BIORREMEDIACIÓN DE
SUELOS CONTAMINADOS CON ACEITE USADO DE MOTOR
AUTOR: Yamil Javier Franco Alarcón
TUTOR: MSc. Miriam Salvador Brito
GUAYAQUIL, ABRIL 2019
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD CIENCIAS NATURALES
CARRERA INGENIERIA AMBIENTAL
UNIDAD DE TITULACIÓN
DETECCIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL DE
BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON ACEITE
USADO DE MOTOR
Autor: Yamil Javier Franco Alarcón
Tutor: Msc. Miriam Salvador Brito
RESUMEN
El presente estudio se basó en detectar bacterias con potencial de
biorremediación en suelos contaminados con aceite usado de motor. La muestra
fue obtenida del Cantón Milagro en una lubricadora artesanal. La muestra de tierra
fue sometida a análisis para identificar que bacteria se encontraba, procediendo a
sembrarla en Agar Cetrimide, se logró determinar la presencia de la bacteria
Pseudomona aeruginosa, para determinar los niveles de tolerancia, se realizaron
ensayos y de esta manera verificar la resistencia de la bacteria en porcentajes de
aceite. Para los bioensayos se tomó tierra; tres muestras de control blanco sin
bacterias con aceite usado de motor y tres con bacteria con aceite usado de
motor, el ensayo duro 35 días. Por el método del uso del soxhlet se puedo
determinar el potencial de biorremediación, demostrando que hubo un rango entre
85% a 97% de descontaminación en los 3 biodigestores con bacterias.
Palabras claves: Biorremediación, Pseudomona Aeruginosa, Suelo,
Contaminación, Aceite quemado.
ANEXO 13
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD CIENCIAS NATURALES
CARRERA INGENIERIA AMBIENTAL
UNIDAD DE TITULACIÓN
DETECTION OF BACTERIA WITH BIOREMEDIATION POTENTIAL OF
CONTAMINATED SOILS WITH USED ENGINE OIL
Author: Yamil Javier Franco Alarcón
Advisor: Msc. Miriam Salvador Brito
ABSTRACT
The present study was based on detecting bacteria with bioremediation potential in
soils contaminated with used motor oil. The sample was obtained from Cantón
Milagro in an artisanal lubricator. The soil sample was analyzed to identify which
bacterium was found, proceeding to plant it in Cetrimide Agar, it was possible to
determine the presence of the bacterium Pseudomonas aeruginosa, to determine
tolerance levels, tests were performed and in this way verify the resistance of the
bacteria in percentages of oil. For the bioassays, soil was taken; three samples of
white control without bacteria with used motor oil and three with bacteria with used
motor oil, the test lasts 35 days. By the method of the use of soxhlet we can
determine the bioremediation potential, showing that there was a range between
85% and 97% of decontamination in the 3 biodigesters with bacteria
Keywords: Bioremediation, Pseudomonas aeruginosa, Soil, Contamination,
Burned oil.
ANEXO 14
i
DEDICATORIA
Primero a Dios por ser camino y por ser luz.
A mi madre NANCY DE JESÚS ALARCÓN
MOREIRA, que con su carácter y su manera de
amar supo hacerme una mejor persona.
A mi padre EUGENIO MÁXIMO FRANCO
RIERA, guerrero sin igual, ejemplo de nunca
rendirse.
A mi hermano ALVARO KEVIN FRANCO
ALARCÓN, por su motivación a lograr las
cosas.
Gracias por sus valores y su apoyo
incondicional en este largo camino.
ii
AGRADECIMIENTO
A Dios principalmente, sin él nada es posible, a mis padres que con sacrificio
lograron hacerme un hombre de bien.
A los amigos que están y a los que no, que hicieron esta etapa de mi vida un
aprendizaje diario.
A mí enamorada por su apoyo.
A las Biólogas del IIRN, por su apoyo y por su conocimiento, haciendo de amigas
y tutoras.
-Rosa Siguencia
-María Fernanda Arroyo
-Mariuxi Mero
A mi tutor externo
-Robert León Suarez
A mis socios
-Steffano Espinosa
-Jessid Varela
iii
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1
CAPITULO I ....................................................................................................................................... 3
1.1. Planteamiento del problema ........................................................................................... 3
1.2. Objetivos ............................................................................................................................ 3
1.2.1. Objetivo general ........................................................................................................ 3
1.2.2. Objetivos específicos ............................................................................................... 3
1.3. Justificación ....................................................................................................................... 3
1.4. Hipótesis ............................................................................................................................ 4
CAPITULO II ..................................................................................................................................... 5
2.1. Antecedentes .................................................................................................................... 5
2.2. Marco teórico ..................................................................................................................... 6
2.2.1. Contaminación de los suelos .................................................................................. 6
2.2.2. Hidrocarburos totales de petróleo (TPH) .............................................................. 6
2.2.3. TPH en el medio ambiente ...................................................................................... 7
2.2.4. Aceite lubricantes ..................................................................................................... 7
2.2.5. Contaminación del suelo por aceite usado de motor .......................................... 7
2.2.6. Contaminación por aceites en ecuador................................................................. 8
2.2.7. Biorremediación ........................................................................................................ 9
2.2.8. Mecanismo de las bacterias para descontaminar el suelo .............................. 10
2.2.9. Mecanismos para biorremediación de suelos .................................................... 10
2.2.9.1. Biodegradación asistida................................................................................. 12
2.2.9.2. Biotransformación de metales ...................................................................... 12
2.2.9.3. Fitorecuperación ............................................................................................. 12
2.2.9.4. Bioventing ........................................................................................................ 13
2.2.9.5. Landfarming ..................................................................................................... 13
iv
2.2.9.6. Biopilas ............................................................................................................. 13
2.2.9.7. Compostaje ...................................................................................................... 14
2.2.9.8. Lodos biológicos ............................................................................................. 14
2.3.1. Pseudomonas Aeruginosa .................................................................................... 14
2.3.1.1. Efectos en la salud ......................................................................................... 15
2.3.1.2. Mecanismos en los que actúa ...................................................................... 16
2.3.2. Extractor Soxhlet .................................................................................................... 16
2.3. Marco legal ...................................................................................................................... 18
2.3.1. Constitución de la República del Ecuador en el Año 2008 .............................. 18
2.3.2. Código Orgánico Integral Penal en el año 2014 ................................................ 22
CAPITULO III .................................................................................................................................. 23
3.1. Materiales y métodos ..................................................................................................... 23
3.1.1. Área de estudio ....................................................................................................... 23
3.1.2. Muestreo .................................................................................................................. 24
3.1.3. Determinación de bacterias .................................................................................. 24
3.1.4. Identificación morfológica. ......................................................................................... 25
3.1.4.1. Tinción de Gram ............................................................................................. 25
3.1.4.2. Prueba de Motilidad ....................................................................................... 26
3.1.4.3. Prueba de oxidasa .......................................................................................... 26
3.1.4. Determinación de niveles de tolerancia .......................................................... 27
3.1.5. Bioensayo ................................................................................................................ 28
3.1.6. Separación por el método de Soxhlet ................................................................. 29
3.1.7. Extracción mediante evaporación ........................................................................ 29
CAPITULO IV .................................................................................................................................. 30
4.1. Resultados ....................................................................................................................... 30
4.2. Discusión ......................................................................................................................... 31
4.3. Conclusiones ................................................................................................................... 33
4.4. Recomendaciones .......................................................................................................... 34
4.5. Bibliografía ....................................................................................................................... 35
4.6. Anexos ............................................................................................................................. 40
v
INDICE DE TABLAS
Tabla 1: Técnicas de recuperación de suelos ................................................................. 11
Tabla 2: Coordenadas de muestreo ................................................................................ 24
vi
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Pseudomona Aeruginosa (A luz Ultravioleta) ................................................... 15
Figura 2: Extracción en Soxhlet ...................................................................................... 17
Figura 3: Punto de recolección de la muestra ................................................................. 23
Figura 4: Porcentaje de remoción ................................................................................... 30
Figura 5: Recolección de muestras ................................................................................. 41
Figura 6: Muestra en medio de enriquecimiento (Agua de Peptona) ............................... 41
Figura 7: Muestra en agar Cetrimide después de 24 horas ............................................. 41
Figura 8: Pseudomona Aeruginosa ................................................................................. 41
Figura 9: Preparación de emulsión para la determinación de niveles de tolerancia ........ 41
Figura 10: Emulsión para los niveles de tolerancia ......................................................... 41
Figura 11: Niveles de tolerancia por triplicado................................................................. 41
Figura 12: Bacteria en medio de enriquecimiento para su reproducción en agitación
constante ......................................................................................................................... 41
Figura 13: Lugar donde se tomó tierra para ensayos ...................................................... 41
Figura 14: Tamizaje de tierra .......................................................................................... 41
Figura 15: Pesaje de tierra 800 Gr ................................................................................. 41
Figura 16: Separación de la tierra previamente esterilizada en seis recipientes .............. 41
Figura 17: Recipientes con bacterias .............................................................................. 41
Figura 18: Recipientes sin bacterias ............................................................................... 41
Figura 19: Preparación de fosfato diamónico .................................................................. 41
Figura 20: Adición de fosfato diamónico pasado los 20 días ........................................... 41
Figura 21: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet .......................................... 41
Figura 22: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet pasada las 4 horas ........... 41
Figura 23: Separación de tierra y aceite finalizada lista para la extracción ...................... 41
Figura 24: Extracción del solvente mediante evaporación .............................................. 41
Figura 25: Extracción después de una hora .................................................................... 41
1
INTRODUCCIÓN
La contaminación de suelos por aceite usado tiene efecto negativo en él, se
produce muchas veces por derrames al momento del cambio de aceite, que el
vehículo necesita en su motor y por el mal manejo de las lubricadoras no
convencionales que aplican en este proceso, sin las medidas correspondientes.
El aceite usado tiene como base el petróleo, mismo que ha sido contaminado con
algún químico o metal pesado en un proceso previo el que puede ser el uso de
maquinarias en sus motores que lubrica sus piezas de manera más óptima y
mediante un proceso de quemado, este será cambiado (Torres, 2013).
El aceite usado y el aceite negro no es lo mismo, el aceite negro o llamado aceite
virgen, es todo aceite que se ha quedado depositado en tanques, y el aceite usado
o lubricante de desecho es el que ya cumplió la función para el que fue destinado
(Torres, 2013).
El aceite usado tiene variedad de metales pesados, como: cadmio, arsénico,
plomo, cromo, entre otros, e hidrocarburos aromáticos, como: el benceno y
algunos solventes clorados. Estos compuestos pueden ser perjudicial para la
salud humana ya que son altamente cancerígenos, la contaminación del suelo por
aceite no solo es perjudicial para el hombre sino para las demás formas de vida en
el ecosistema (Silva, Quiñonez, & Tovar, 2017).
La EPA (Environmental Protection Agency) en estudios realizados sobre los
aceites y lubricantes usados afirma que alrededor de 3.000 tipos de cáncer
diferentes son causados por la absorción de Cromo durante la quema que se
realiza al usarlo como combustible (US EPA, OCFO,OTS, 2017).
Las consecuencias negativas al suelo por aceite usado, son:
La alteración de las propiedades físicas del suelo
Aumentar la sensibilidad para infecciones de plantas
Influencia para crecimiento de vegetación
Disminución de la calidad de suelo para cultivos (CENAPRED, 2015).
2
Existen diversas técnicas biológicas para descontaminación de suelos, aire, agua,
una de ellas es la Biorremediación, que consiste en el uso de plantas, hongos,
bacterias naturales o modificadas, con la finalidad de descontaminar sustancias
toxicas o que han sido contaminadas por otro factor y hacerlas viables para el
ambiente y para la salud de todo ser vivo (López et al., 2006).
3
CAPITULO I
1.1. Planteamiento del problema
El suelo contaminado por aceite usado de vehículos se da en lubricadoras
artesanales, ya que no existe la manipulación correcta, lo que causa deterioro a la
salud humana y al medio ambiente, se debe tener en cuenta su uso, manejo y
disposición final de manera segura, para evitar un impacto ambiental.
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo general
Detectar bacterias en suelos contaminados con aceite usado de motor capaces de
degradar aceites y grasas.
1.2.2. Objetivos específicos
Establecerlas bacterias existentes en un suelo contaminado con aceite
usado de motor.
Seleccionar bacterias con capacidad de crecer en un medio selectivo con
2%, 4% y 5% de aceite usado de motor como única fuente de carbono y
energía.
Realizar bioensayos para demostrar cuantitativamente la capacidad de las
bacterias para degradar aceites y grasas.
1.3. Justificación
El suelo constituye uno de los medios en los que se vierten residuos de origen
antropogénico, los cuales son parte de procesos físicos, químicos y biológicos lo
que provoca transformaciones, las cuales alteran el funcionamiento de los
ecosistemas, considerándolos contaminantes, los mismos que afectan no solo al
ambiente sino a la salud humana (Peña, Carter y Ayala, 2001).
4
En Ecuador la investigación sobre la biorremediación de suelos contaminados por
aceites se ha detenido por la falta de presupuestos.
En el presente estudio se utiliza el petróleo y sus derivados para diversas
actividades, se es necesario prestar atención a los impactos que estos ocasionan
al medio ambiente, que pueden llegar a ser perjudiciales a la salud pública
(Rodriguez, 2011).
En este estudio investigativo, se implementará biorremediacion para la
descontaminación de aceite usado de motor de vehículos, mediante el uso de
bacterias previamente seleccionadas.
1.4. Hipótesis
Existen bacterias con potencial de degradar aceites y grasas en suelos
contaminados con aceite usado de motor de vehículos.
5
CAPITULO II
2.1. Antecedentes
El negocio de aceite globalmente es un negocio rentable por su demanda, para los
diversos usos que recibe en la industria automovilística. 7.6 millones de Tm/año de
lubricantes son consumidos en Estados Unidos, 2.2 millones en Japón, 4.7
millones lo que es la Unión Europea y 500.000 Tm en España, dando que en el
planeta hay un requerimiento aproximado de 40 millones de toneladas año
(Depuroil S.A., 2010).
Se recomienda que el cambio de aceite de un vehículo se realice en un centro
automovilístico autorizado y en condiciones óptimas, ya que estos deben
manipular, almacenar y gestionar el aceite usado. Si este proceso se lo realiza
personalmente en condiciones no adecuadas, puede que se produzca derrames al
suelo lo cual llevará a contaminación, de esta manera deberá recogerlo y
depositarlo adecuadamente (Plantel Mexicali, 2012).
Estudios realizados en Long Beach (California) en el año 2006 se realizó
biorremediación a suelos contaminados con aceite mediante el uso de
microorganismos. A la muestra contaminada de suelo se le adiciono nutrientes y
oxígeno, a esta técnica se la conoce como: Bioestimulación y Bioaumentación, lo
que permitió encontrar microorganismos degradadores de hidrocarburos,
identificando la presencia de Bacillus sphaericus, Bacilus fusiformis, Bacilus
pumilis, Acinetobacter junii y Pseudomonas sp. (López et al., 2006).
La Biorremediación de suelos contaminados en Ecuador específicamente en la
Amazonía, que es donde se encuentra la mayor parte de nuestro crudo, se ha
venido trabajando desde la década de 1990, hasta derrames que ocurren en la
actualidad. Se recoge parte del suelo contaminado con palas mecánicas y llevada
en volquetas para ser transportadas y luego explanadas para su biorremediación.
Se usan dos tipos de formas para la remediación del suelo la primera es el
compostaje, que se hacen grandes pilas de tierra que son removidas con
maquinarias para su oxigenación, y la segunda técnica es el landfarming que son
6
pilas más pequeñas y la aireación es estática. En ambos casos se les adiciona
cantidades grandes de microorganismos como: bacterias, hongos, levaduras para
que la degradación de los hidrocarburos se más rápida (Cuvi, 2015).
2.2. Marco teórico
2.2.1. Contaminación de los suelos
Es la alteración de la superficie terrestre por sustancias que degradan el suelo y
haciéndola perjudicial para su uso, y para todo ser vivo. La agricultura es uno de
usos que se ve afectado por la contaminación perdiendo el equilibrio en el
ecosistema. Lamentablemente no siempre puede tratarse el suelo y en ocasiones
solo se puede recuperar un porcentaje de este (Ecología Verde, 2015).
La implementación de normativas y leyes por la contaminación del suelo ha sido
baja en la mayoría de países de Latinoamérica, aquí una de las razones:
Falta de acceso rápido de las evidencias para acción política
Responsabilidad para tratar los derechos del ecosistema
Compromiso político, dejando de lado las leyes ambientales, ya que
los cambios de suelos ocurren durante décadas y pueden ser difícil
detectar (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación
y la Agricultura, 2016).
2.2.2. Hidrocarburos totales de petróleo (TPH)
En ingles TPH, que significa hidrocarburos totales de petróleo, las cuales se
utilizan para reconocer una serie de compuestos derivado del petróleo crudo, el
cual puede ser muy perjudicial al ambiente con un mal uso, debido que el mismo
posee diferentes compuestos químicos tales como hidrogeno y carbono. Se ha
probado científicamente que los TPH se comportan distintos en el suelo que en el
agua (ATSDR, 2016).
7
2.2.3. TPH en el medio ambiente
Los TPH pueden entrar al suelo o a cuerpos hídricos mediante derrame, en los
cuerpos de agua unos se podrían formar una capa superficial y otros podrían
sedimentarse en el fondo, mientras que en el suelo hay una probabilidad que dure
más tiempo. Existen bacterias o microrganismos capaces de degradar TPH, tanto
en el suelo como en el agua (ATSDR, 2016)
2.2.4. Aceite lubricantes
El aceite en un motor cumple la función de lubricar todas las piezas que causan
movimiento, para su mayor duración. Estos lubricantes están constituidos con
aditivos que pueden ser sintéticos o minerales y son derivados del petróleo los
cuales ayudan a dar mayor rendimiento en la lubricación(Tayán, 2018).
Las características principales del aceite lubricante en el motor son la viscosidad,
resistencia de oxidación, punto de fluidez y sus funciones básicas son: reducción
de fricción, disipación del calor y dispersión de los contaminantes. La función de
un lubricante en un motor es un tema muy complejo, que debe ser una
combinación entre balance de propiedades tanto del aceite de base como los
aditivos que la componen (El Comercio, 2017).
2.2.5. Contaminación del suelo por aceite usado de motor
El aceite usado de motor de vehículos contiene, diversas sustancias que causan
daños a la capa de suelo, convirtiéndola en inerte, el aceite por lo consiguiente
causa mal olores que al hacer contacto con la luz y el aire se desprenden toxinas
al ambiente siendo contraproducente a la salud humana. El mayor problema de las
contaminaciones de los suelos por aceite, ocurre en lubricadoras artesanales, ya
que estas no cuentan con una zona de almacenamiento de aceite, por lo que
optan desechando directamente al suelo (Gallegos & Vlecela, 2015).
8
El aceite usado es una combinación de base mineral y otra sintética con aditivos
(1-20%) en su proceso el automóvil contamina el aceite de diversas maneras; las
piezas en su desgaste producto del movimiento se mezcla con este aceite;
compuestos oraganometálicos que contienen metales pesados, producto de la
gasolina o lubricantes (SerCampo, 2011).
La contaminación de suelos por aceite quemado suele ocurrir principalmente a
causa del hombre y a su mala manipulación, no ocurre naturalmente como lo es
con el petróleo, ya que, el aceite quemado es cambiado en lubricadoras, donde en
el proceso de cambio de aceite ocurre la contaminación (ATSDR, 2016).
2.2.6. Contaminación por aceites en ecuador
El 11 de octubre del 2018 en Guayaquil un tanque de petróleo de una estación
eléctrica, contaminó una ribera del manglar, a la altura del noroeste de Guayaquil,
dando una corriente de petróleo en el estero. El Ministerio de Obras Públicas en
conjunto con el Ministerio del Ambiente horas más tarde llegaron al sector para
evitar que se siga propagando el derrame, cabe recalcar que este lugar es hábitat
de aves y crustáceos (El Telégrafo, 2018).
El 21 de junio del 2016, se reportó que a la altura del Km 21 de la vía a Daule
hubo un derrame de material aceitoso, tipo combustible, que poco después fue
confirmado que fue derramado accidentalmente por la empresa Balsasud (Balsera
Sudamericana). Uno de los calderos utilizados como parte del proceso de
fabricación que ahí realizan, se había llenado en exceso y estaba rebosando de
aceite que sale de la producción, llegando hasta el rio Daule (Secretaria de
Gestión de Riesgos, 2016).
9
2.2.7. Biorremediación
Es una técnica que se ha usado por muchos años, sirve para descontaminar,
suelos mediante microorganismos que habitan en el mismo y en el subsuelo, los
cuales están formados por materia orgánica, agua, aire y principalmente
microorganismos (ya que en un gramo de suelo se pueden encontrar de miles a
millones de ellos) (Argüelles, 2010).
Los hongos, plantas o enzimas para la descontaminación del suelo en el medio
ambiente, pueden ser físicas, químicas y biológicas, muchas veces causada
antropológicamente. Busca restaurar el medio contaminado para sus diversos
usos (Rodríguez, 2012).
El uso de microrganismos es óptimo para la biorremediación debido que se
alimentan de algunos compuestos tóxicos para el ambiente, tales como: el
petróleo y gasolina. Para que ocurra la descontaminación, el medio ambiente
donde se encuentra la bacteria, hongo o protozoos debe cumplir ciertas
condiciones como; la temperatura optima, agua suficiente, y debe existir un
porcentaje adecuado de nutrientes, esto favorece la degradación del compuesto
toxico a agua y bióxido de carbono (Argüelles, 2010).
Entre los microorganismos sobresalen las bacterias que son seres vivos con
mayor capacidad metabólica del planeta y que pueden degradar casi toda
sustancia orgánica, además las bacterias pueden descontaminar ambientes donde
no hay oxígeno(anaeróbicos), así como también en ambientes con oxígeno
(aeróbicos) (Rodríguez, 2012).
La Micorremediación es una rama de la biorremediación por la cual se
descontamina el medio ambiente mediante hongos, los cuales en cierta cantidad
son capaces de absorber metales pesados (Stamets, 2017).
10
2.2.8. Mecanismo de las bacterias para descontaminar el suelo
Los tratamientos biológicos se caracterizan porque pueden ser in situ o ex situ lo
cual es un tratamiento económico, pero que si conllevará mayor tiempo y su
eficiencia es más difícil de verificar porque son procesos largos e
2.2.9. Mecanismos para biorremediación de suelos
Existe una amplia manera de recuperación de suelos contaminados, algunas que
ya han sido usadas y otras están en proceso de experimentación, con el propósito
de descontaminar los suelos con aquello que fue alterado, esto dependerá de las
propiedades del suelo y de su contaminante, que tan viable económicamente
podría ser, y el tiempo optimo que podría ser usado (Bernard, Sanz, Garcia, &
Valiño, 2007).
Los tratamientos pueden ser; in situ que se realizan en la zona afectada o ex situ
que requerirá tomar una porción del suelo contaminado y llevarla a laboratorio
para su análisis y su próximo tratamiento. El tratamiento in situ, no necesitan tanto
manejo, pero son más complejos por la dificultad ya que se pondrá a contacto con
los agentes de descontaminación toda la masa de suelo contaminada. A diferencia
del ex situ, son más óptimos ya que, son económicos, rápidos y brinda una
completa recuperación de la zona afectada (Bernard et al., 2007).
Se puede identificar como descontaminación para disminuir los niveles de
concentración del contaminante del suelo, que pueden ser: Físico-químicos,
Biológicos, Térmicos y Mixtos.
11
Tabla 1: Técnicas de recuperación de suelos
Tipo de
tratamiento
Tratamiento Aplicación
Descontaminación Físico-químico Extracción
Lavado
Flushing
Electrocinética
Adición de enmiendas
Barreras permeables
activas
Pozos de recirculación
Oxidación ultravioleta
In situ
Ex situ
In situ
In situ
In situ
In situ
In situ
Ex situ
Biológico Biodegradación asistida
Biotransformación de
metales
Fitorecuperación
Bioventing
Landfarming
Biopilas
Compostaje
Lodos biológicos
In situ
In situ
In situ
In situ
Ex situ
Ex situ
Ex situ
Ex situ
Térmico Incineración
Desorción térmica
Ex situ
Ex situ
Mixto Extracción multifase
Atenuación natural
In situ
In situ
Fuente: Técnicas de recuperación de suelos contaminados (Bernad, Sanz, García, &
Valiño, 2016).
12
2.2.9.1. Biodegradación asistida
La Biodegradación, es el proceso por el cual microorganismos autóctonos o
inoculados (bacterias y hongos) metabolizan los contaminantes orgánicos que se
encuentran en suelos y/o el agua subterránea, convirtiéndolos en productos finales
inocuos. En este proceso, los contaminantes orgánicos son biotransformados
porque generalmente los microorganismos pueden utilizarlos para su propio
crecimiento como fuente de carbono y energía y, en el caso de que no sean
capaces de crecer a partir de ellos, pueden seguir transformándolos si se les
aporta un sustrato de crecimiento alternativo o cosustrato (Bernard et al., 2007).
2.2.9.2. Biotransformación de metales
Los microorganismos se encuentran expuestos a la presencia de metales
pesados, lo cual selecciona variantes capaces de tolerar sus efectos nocivos. El
estudio de estas interacciones, con sus mecanismos de tolerancia, expone el
potencial de éstos para ser utilizados en procesos biotecnológicos como la
Biorremediación de la contaminación ambiental por metales pesados. Mediante
experimentos de laboratorio, se logró extraer cepas por cultivo directo y
enriquecimiento selectivo y determinar su grado de compromiso en la
biotransformación y biodisponibilidad de metales como cromo, plomo y mercurio,
concluyendo que uno de los géneros más comprometidos es el Micrococos,
seguido por Pseudomonas (Bernard et al., 2007).
2.2.9.3. Fitorecuperación
Es una técnica que se usa para descontaminar suelos contaminados por metales
pesados mediante especies vegetales. Las plantas usadas en este método deben
representar tolerancia para resistir la elevada cantidad de metales en su rizosfera
y en sus tejidos. El fin de este tratamiento está en la selección de plantas
adecuadas para la descontaminación (Bernard et al., 2007).
13
2.2.9.4. Bioventing
Usa microorganismos para biodegradar compuestos orgánicos en los suelos en
zonas que no estén tan contaminadas, a diferencia del biosparging que en zonas
donde hay mayor contaminación. El Bioventing se parece al método de extracción
por vapor del suelo, pero, este se encarga de que en su mayoría biodegradar la
volatilización (Bernard et al., 2007).
2.2.9.5. Landfarming
Es mediante recuperación bilógica, que se trata de eliminar el exceso de
hidrocarburos de menor densidad, que el método de extracción de vapor no puede
eliminar y que, si pueden ser degradados por microrganismos, que funciona de
manera, que, se excava el suelo, para luego extender una capa fina en el lugar
donde se encuentra el contaminante y que se vaya a recuperar, para luego
comenzar con la estimulación microbiana aeróbica que consta de aire y la adición
de nutrientes (Bernard et al., 2007)
El ingreso de aire se consigue mediante remoción de suelo por arado, la adición
de bacterias capaces de degradar hidrocarburos. (Bernard et al., 2007).
2.2.9.6. Biopilas
Este es otro método para descontaminar suelos que han sido afectados por el
derrame de petróleo, para este método se acumula el suelo en pilas continua y
como el proceso de landfarming es mediante aireación y adicción de nutrientes
que sirve para que los microorganismos respiren. Estos métodos son muy
parecidos a diferencia que las biopilas es mediante la inyección de aire con
tuberías, que se las coloca a través de las pilas, esto permitirá que el compuesto
no se evapore ni se volatilice producto del sol. Es un tratamiento recomendable ya
que es muy corto plazo (Bernard et al., 2007).
14
2.2.9.7. Compostaje
Es unos de los procesos biológicos más conocidos y eficaces, este método es
mediante actividad microbiana que acelera la degradación del contaminante y
puede ser aeróbica y anaeróbica. El suelo contaminado es combinado con restos
de animales y vegetales, conocido como abono que proporciona equilibrio de
carbono y nitrógeno se tiene que verificar los parámetros como luz, oxigeno,
temperatura y humedad. Este tratamiento se puede ser in situ, con el material
contaminado apilado y aireado con bombas de vacío, o en reactores (Bernard et
al., 2007).
2.2.9.8. Lodos biológicos
Este método se trata de excavar y filtrar para eliminar materiales gruesos, es un
biorreactor controlado que mezcla el suelo con otros aditivos para la
descontaminación, en este método se controla pH, oxigeno, humedad,
temperatura, asimismo, para impedir la concentración de los contaminantes se
homogeniza el material contaminado. También existen diferentes mecanismos
como: de adsorción/desorción, disolución/precipitación, intercambio iónico,
complejación, transferencia de oxígeno, volatilización y reducción del tamaño de
partícula (Bernard et al., 2007).
2.3.1. Pseudomonas Aeruginosa
La Pseudomonas Aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonaceae se trata de
un bacilo recto o ligeramente curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-
1 micras, y móvil gracias a la presencia de un flagelo polar. En relación con su
metabolismo, es aerobio (aunque puede desarrollarse en condiciones anaerobias
utilizando nitrato), catalasa positiva y oxidasa positiva. Se caracteriza por producir
una variedad de pigmentos, como la piocianina (de color azul verdoso), la
pioverdina (pigmento fluorescente de color verde amarillento) y la piorrubina (de
color rojo) (figura 1) (INSHT, 2016).
15
Figura 1: Pseudomona Aeruginosa (A luz Ultravioleta)
Se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, en el agua (ríos, lagos,
depósitos, duchas, bañeras, piscinas y piscinas de hidromasaje, etc.), en los
suelos húmedos, en los vegetales y en los materiales húmedos, también puede
formar parte de la flora microbiana normal saprófita de las zonas húmedas de la
piel (axilas, conducto auditivo, región perineal y mucosas). Su temperatura óptima
de crecimiento es de 37ºC, pero puede tolerar temperaturas de hasta 45ºC-50ºC.
Puede sobrevivir durante al menos 70 días en agua destilada (INSHT, 2016).
2.3.1.1. Efectos en la salud
La Pseudomonas aeruginosa, es un patógeno oportunista que rara vez causa
enfermedad en individuos sanos; en el caso de producirse esta, suele
manifestarse como:
Infecciones dérmicas: puede causar foliculitis, que se caracteriza por la
aparición de pápulas pruriginosas en la zona lateral del tronco y/o en las
zonas axilar, inguinal, púbica, etc., estando asociada al contacto
prolongado con agua contaminada. También ocasiona el síndrome de la
uña verde (cloroniquia), causada por la exposición frecuente de las uñas
previamente dañadas a ambientes húmedos contaminados.
16
Neumonía: producida por la inhalación de bioaerosoles de agua o fluidos
contaminados. La infección en personas sanas es extremadamente rara,
siendo el pronóstico muy grave.
Otitis externa (otitis del nadador): infección del canal auditivo externo
ocasionada por contacto prolongado con agua contaminada.
Infección ocular: asociada principalmente a la contaminación del líquido
utilizado para la limpieza de las lentes de contacto, pudiendo causar una
queratitis que puede resultar en la perforación y derretimiento corneal, en
la infección de cicatrices o, incluso, en la pérdida de visión del ojo
infectado.
Es responsable de numerosos casos de infección nosocomial, afectando
principalmente a individuos inmunocomprometidos, con quemaduras graves,
heridas quirúrgicas, neutropenia o con infecciones pulmonares subyacentes.
Puede ocasionar, entre otros: neumonía, meningitis, sobreinfección de heridas,
ectima gangrenosa, infecciones urinarias, infecciones osteoarticulares,
endocarditis, infecciones oculares o septicemia (INSHT, 2016).
2.3.1.2. Mecanismos en los que actúa
La Pseudomona aeruginosa se ha demostrado en estudios que tiene la capacidad
de biodegradar tipos de compuestos que son usados para distintas labores
domésticos como detergente de lavandería que poseen un compuesto
alquilbenceno sulfonato, muy usado y que tiene problemas de contaminación de
ríos y lagos (Soberón, 2009).
2.3.2. Extractor Soxhlet
Creado en 1879 por el químico alemán Franz Ritter Von Soxhlet con la propuesta
de separar la grasa en los alimentos, que se ha venido desarrollando por décadas
que consiste en la extracción de sólidos. Las grasas se disuelven en disolventes
17
no polares, como: el hexano y el éter de petróleo, las grasas se separan de los
demás componentes conociéndolo como extracción solido-liquido. El equipo se
encuentra compuesto por; una parrilla que sería la fuente de calor que dará paso a
la evaporación, el matraz que contiene el disolvente, un sifón donde se encuentra
la muestra solida dentro de un papel filtro, y un refrigerante que se encargara de
aportar el frio para que haya condensación. (Figura 2).
Sifón donde se
encuentra la
muestra
Matraz donde se
encuentra el disolvente
Refrigerante que
aporta frío y ocurra
condensación
Parrilla que es fuente
de calor para que
ocurra la evaporación
Figura 2: Extracción en Soxhlet
18
2.3. Marco legal
Existen normativas vigentes, en la República del Ecuador que protegen al medio
ambiente de los desechos causados por las lubricadoras, y hay que hacer
mención sobre ellos
2.3.1. Constitución de la República del Ecuador en el Año 2008
TITULO II
CAPÍTULO SEGUNDO
Derechos del Buen Vivir
SECCIÓN SEGUNDA
Ambiente Sano
Art.14.- Se reconoce el derecho de la población a vivir en un ambiente sano y
ecológicamente equilibrado, que garantice la sostenibilidad y el buen vivir, sumak
kawsay.
Se declara de interés público la preservación del ambiente, la conservación de los
ecosistemas, la biodiversidad y la integridad del patrimonio genético del país, la
prevención del daño ambiental y la recuperación de los espacios naturales
degradados.
Art. 15.- El Estado promoverá, en el sector público y privado, el uso de
tecnologías ambientalmente limpias y de energías alternativas no contaminantes y
de bajo impacto. La soberanía energética no se alcanzará en detrimento de la
soberanía alimentaria, ni afectará el derecho al agua. Se prohíbe el desarrollo,
producción, tenencia, comercialización, importación, transporte, almacenamiento y
uso de armas químicas, biológicas y nucleares, de contaminantes orgánicos
persistentes altamente tóxicos, agroquímicos internacionalmente prohibidos, y las
tecnologías y agentes biológicos experimentales nocivos y organismos
genéticamente modificados perjudiciales para la salud humana o que atenten
19
contra la soberanía alimentaria o los ecosistemas, así como la introducción de
residuos nucleares y desechos tóxicos al territorio nacional.
CAPÍTULO SEPTIMO
Derechos de la naturaleza
Art. 71.- La naturaleza o Pacha Mama, donde se reproduce y realiza la vida, tiene
derecho a que se respete integralmente su existencia y el mantenimiento y
regeneración de sus ciclos vitales, estructura, funciones y procesos evolutivos.
Toda persona, comunidad, pueblo o nacionalidad podrá exigir a la autoridad
pública el cumplimiento de los derechos de la naturaleza. Para aplicar e interpretar
estos derechos se observarán los principios establecidos en la Constitución, en lo
que proceda. El Estado incentivará a las personas naturales y jurídicas, y a los
colectivos, para que protejan la naturaleza, y promoverá el respeto a todos los
elementos que forman un ecosistema.
CAPÍTULO NOVENO
Responsabilidades
Art. 83.- Son deberes y responsabilidades de las ecuatorianas y los ecuatorianos,
sin perjuicio de otros previstos en la Constitución y la ley:
6.Respetar los derechos de la naturaleza, preservar un ambiente sano y utilizar los
recursos naturales de modo racional, sustentable y sostenible.
TITULO VII
CAPÍTULO SEGUNDO
Biodiversidad y Recursos Naturales
SECCIÓN PRIMERA
Naturaleza y ambiente
Art. 395.- La Constitución reconoce los siguientes principios ambientales:
20
1. El Estado garantizará un modelo sustentable de desarrollo, ambientalmente
equilibrado y respetuoso de la diversidad cultural, que conserve la biodiversidad y
la capacidad de regeneración natural de los ecosistemas, y asegure la satisfacción
de las necesidades de las generaciones presentes y futuras.
2. Las políticas de gestión ambiental se aplicarán de manera transversal y serán
de obligatorio cumplimiento por parte del Estado en todos sus niveles y por todas
las personas naturales o jurídicas en el territorio nacional.
3. El Estado garantizará la participación activa y permanente de las personas,
comunidades, pueblos y nacionalidades afectadas, en la planificación, ejecución y
control de toda actividad que genere impactos ambientales.
4. En caso de duda sobre el alcance de las disposiciones legales en materia
ambiental, éstas se aplicarán en el sentido más favorable a la protección de la
naturaleza.
Art. 396.- El Estado adoptará las políticas y medidas oportunas que eviten los
impactos ambientales negativos, cuando exista certidumbre de daño. En caso de
duda sobre el impacto ambiental de alguna acción u omisión, aunque no exista
evidencia científica del daño, el Estado adoptará medidas protectoras eficaces y
oportunas.
La responsabilidad por daños ambientales es objetiva. Todo daño al ambiente,
además de las sanciones correspondientes, implicará también la obligación de
restaurar integralmente los ecosistemas e indemnizar a las personas y
comunidades afectadas.
Cada uno de los actores de los procesos de producción, distribución,
comercialización y uso de bienes o servicios asumirá la responsabilidad directa de
prevenir cualquier impacto ambiental, de mitigar y reparar los daños que ha
causado, y de mantener un sistema de control ambiental permanente.
Las acciones legales para perseguir y sancionar por daños ambientales serán
imprescriptibles.
21
Art. 398.- Toda decisión o autorización estatal que pueda afectar al ambiente
deberá ser consultada a la comunidad, a la cual se informará amplia y
oportunamente. El sujeto consultante será el Estado. La ley regulará la consulta
previa, la participación ciudadana, los plazos, el sujeto consultado y los criterios de
valoración y de objeción sobre la actividad sometida a consulta.
El Estado valorará la opinión de la comunidad según los criterios establecidos en
la ley y los instrumentos internacionales de derechos humanos. Si del referido
proceso de consulta resulta una oposición mayoritaria de la comunidad respectiva,
la decisión de ejecutar o no el proyecto será adoptado por resolución debidamente
motivada de la instancia administrativa superior correspondiente de acuerdo con la
ley.
Art. 399.- El ejercicio integral de la tutela estatal sobre el ambiente y la
corresponsabilidad de la ciudadanía en su preservación, se articulará a través de
un sistema nacional descentralizado de gestión ambiental, que tendrá a su cargo
la defensoría del ambiente y la naturaleza.
SECCIÓN QUINTA
Suelo
Art. 409.- Es de interés público y prioridad nacional la conservación del suelo, en
especial su capa fértil. Se establecerá un marco normativo para su protección y
uso sustentable que prevenga su degradación, en particular la provocada por la
contaminación, la desertificación y la erosión.
En áreas afectadas por procesos de degradación y desertificación, el Estado
desarrollará y estimulará proyectos de forestación, reforestación y revegetación
que eviten el monocultivo y utilicen, de manera preferente, especies nativas y
adaptadas a la zona (Asamblea Nacional constituyente de la Republica del
Ecuador, 2008).
22
2.3.2. Código Orgánico Integral Penal en el año 2014
SECCIÓN SEGUNDA
Delitos contra los recursos naturales
Art. 252.- Delitos contra suelo. - La persona que, contraviniendo la normativa
vigente, en relación con los planes de ordenamiento territorial y ambiental, cambie
el uso del suelo forestal o el suelo destinado al mantenimiento y conservación de
ecosistemas nativos y sus funciones ecológicas, afecte o dañe su capa fértil,
cause erosión o desertificación, provocando daños graves, será sancionada con
pena privativa de libertad de tres a cinco años.
Se impondrá el máximo de la pena si la infracción es perpetrada en un espacio del
Sistema Nacional de Áreas Protegidas o si la infracción es perpetrada con ánimo
de lucro o con métodos, instrumentos o medios que resulten en daños extensos y
permanentes(Ministerio de Derechos Justicia y Derechos Humanos, 2014).
23
CAPITULO III
3.1. Materiales y métodos
3.1.1. Área de estudio
La muestra de suelo contaminado fue recolectada en la vía Milagro - La Troncal
que forma parte del cantón de Milagro, Provincia del Guayas, es la tercera ciudad
más poblada de la provincia del Guayas.
Figura 3: Punto de recolección de la muestra
Fuente: Google earth
Figure 3: Punto de recolección de la muestra
Fuente: Google Earth 2018
Elaborado: Franco. J
24
La muestra fue recolectada de un taller de automóviles no convencional donde
se descarga aceite directamente al suelo sin ningún tipo de control.
Los datos generales por el medio de coordenadas UTM WGS84 Zona 17S de
la zona Punto de recolección de la muestra de suelo:
Tabla 2: Coordenadas de muestreo
Fuente: Franco. J
3.1.2. Muestreo
Las muestras fueron tomadas al azar en diferentes puntos de una lubricadora
artesanal NN, por triplicado para obtener una muestra representativa; Las
muestras fueron recolectadas superficialmente abarcando un volumen de 10 cm3,
y se obtuvo una muestra de 100 gramos; las muestras durante su transporte hacia
el laboratorio de microbiología en el Instituto de Investigaciones de Recursos
Naturales (IIRN) ubicado en la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad
de Guayaquil fueron conservadas en una hielera para evitar la alteración
microbiana (Hernandez, Bojaca, & Duque, 2007).
3.1.3. Determinación de bacterias
Se tomó 10gr de la muestra de suelo contaminado con aceite usado de motor, se
homogenizo y se diluyó en 90 mL de un medio de enriquecimiento (agua de
peptona).
Previo a la determinación de niveles de tolerancia se comprobó en la muestra la
existencia de bacterias Pseudomonas, para ello se empleó un medio selectivo
para Pseudomonas, agar Cetrimide, se aplicó el método de extendido superficial
empleando un asa de drigalsky luego se inoculó la placa con 200 µL de la muestra
para luego incubarla por 24 horas a 35°C de luego se repico la muestra en placa
X Y
Muestra 655242.90 9761535.33
25
sucesiva para ir purificando la muestra y a la misma temperatura de incubación a
37°C por 18-24 horas (Hernandez et al., 2007)
3.1.4. Identificación morfológica.
3.1.4.1. Tinción de Gram
La tinción de Gram es una técnica que se desarrolló por el Bacteriólogo Danés
Hans Christian Gram en el año 1884, técnica que se divide a las bacterias en dos
tipos: Gram positivas y Gram negativas. Se tomó una pequeña muestra y se la
colocó en el portaobjeto con una gota de solución salina, luego de mezclar se la
dejó secar tres veces cerca del mechero de Bunsen y se continuó con los
siguientes pasos mencionados:
La muestra secada al calor se cubrió por el lapso de un minuto con Cristal
Violeta
Luego el tinte purpura (tinción primaria) se lavó con agua destilada
Se cubrió la muestra con Yodo (mordante) por un minuto
La placa con el Yodo se procedió a lavar con agua destilada
Consiguiente, el portaobjeto se lavó con 95% de etanol
El alcohol se lavó con agua destilada
A continuación, se la porta objeto es teñido con Safranina (contra-tinción)
en tiempo de 5 minutos
Se lavó la muestra una vez más con agua destilada y se dejó secar
Luego se observó en el microscopio con el objetivo de 100X usando aceite
de inmersión (Gram, 1884)
El tinte purpura y el Yodo se combinan con la bacteria se colorean de purpura o
violeta oscura. Son clasificadas como Gram positivas aquellas que mantienen ese
color una vez el alcohol intento decolorarlas, mientras tanto las que pierden el
color violeta obscuro y purpura son clasificadas como Gram negativas (Gram,
1884).
26
En el inventario de plantas recomendadas para fitorremediación de coliformes
fecales en aguas negras se usó la tinción de Gram se puedo determinar que la
bacteria E. coli es gran negativa ya que hubo decoloración (León, 2017).
3.1.4.2. Prueba de Motilidad
El test se enfoca en el movimiento de la bacteria mediante sus flagelos se lo
conoce como motilidad, el fin de esta prueba es para verificar si la bacteria es
móvil o inmóvil, y el método empleado para observar es usando una lámina
excavada de Koch por la técnica de gota pendiente, se agregó una gota de agua
destilada, se colocó el cubreobjetos y se observó a en el microscopio después de
agregar aceite de inmersión. También se realizó una preparación en freso en 2 µL
a 2.5% de salinidad para revisar motilidad usando objetivos de 40, 60 o 100x
(Villafañe, 2008).
3.1.4.3. Prueba de oxidasa
Esta prueba se detecta la presencia de enzima citromono oxidasa, se recomienda
el asa de platino, debido a que el asa de nicrón cromada da un resultado falso
positivo. Para esta prueba existe el papel impregnado con el reactivo el mismo que
se debe humedecer con agua destilada, tomar el inoculo bacteriano y frotarlo
sobre el papel reactivo. El desarrollo de un color violeta fuerte dentro de 1 o 2
minutos es positivo (Villafañe, 2008).
27
3.1.4. Determinación de niveles de tolerancia
Los ensayos se realizaron por triplicado con una concentración del 2%, 4% y 5%
de aceite usado de motor. En medio mínimo, donde la fuente de carbono fue el
aceite.
Para el presente ensayo se emplearon tres emulsiones; una compuesta de 10ml
de alcohol cetona, 2 µL de tween 20 y 2 mL de aceite usado de motor; que
representan una concentración al 2% de aceite usado de motor.
La segunda emulsión se preparó con 10ml de alcohol cetona, 2 µL de tween 20 y
4 mL de aceite usado de motor; que representan una concentración al 4% de
aceite usado de motor.
Y la tercera emulsión compuesta de 10 ml de alcohol cetona, 2 µL de tween 20 y 5
mL de aceite usado de motor; que representa una concentración al 5% de aceite
usado de motor.
Luego se preparó el medio mínimo a base de agar de 11.1 gr de agar TSA (Agar
Soya Triptona) en 300 mL de agua destilada.
Luego se separaron 100 mL del agar TSA y se mezcló con la emulsión al 2%, 100
mL con la del 4%, y los otros 100 mL con la del 5% homogenizando
vigorosamente, ahí se procedió a verter en las placas; una vez solidificadas se
aplicó el método de extendido superficial empleando un asa de drigalsky y se
inoculó la placa con 200 µL de la muestra de bacterias previamente aisladas que
se tenían en reserva en un cryobank y se las incubó por 24 horas a 37°C
A los cultivos se les realizaron observaciones diarias por ocho días desde 23 Julio
del 2018 hasta el 30 de Julio del 2018 durante sus repiques. Se estableció como
placas positivas aquellas que presentaron crecimiento por disgregación del aceite
usado; luego las placas positivas fueron reservadas en cryobank para
posteriormente realizar el ensayo de biorremediacion (Hernandez et al., 2007).
28
3.1.5. Bioensayo
Se preparó 200 mL de agua de peptona, a la cual se le inoculó la Pseudomona
aeruginosa que fueron aisladas y reservadas en el cryobank, para su reproducción
se las incubó a 37°C en medio de enriquecimiento con agitación constante por 24
horas.
Posteriormente se tomó tierra de un lote vacío la que luego se tamizó para obtener
un granulaje homogéneo y optimo; de ahí se la llevó al laboratorio para su pesaje
obteniendo 800 gr de tierra, y se empleó el autoclave para esterilizar y eliminar así
bacterias y hongos oportunistas que puedan tener influencia en el resultado del
ensayo, se llevó la tierra esterilizada al horno por 24 horas para eliminar todo
rastro de humedad que se encontrara, la que luego se separó en seis recipientes
con un peso de 100 gr en cada uno.
Se preparó una emulsión de 35.6 mL al 5%, de aceite quemado, para cada uno de
los recipientes misma concentración que previamente se había determinado era la
óptima tanto para que las bacterias se desarrollen y se produzca la
biorremediación del aceite quemado, la misma que está compuesta por los 5 mL
de aceite usado de motor, 30 mL de alcohol cetona y 0.6 mL de tween 20, luego
se mezcló la emulsión con los 100 gr de tierra de cada recipiente. Una vez
preparado los recipientes de bioensayo con la tierra y la emulsión de aceite se le
agregó 10 mL a cada biodigestor del medio de enriquecimiento con la
Pseudomona aeruginosa con una concentración de 1.32𝑥108 mL (Hernandez et
al., 2007).
El bioensayo de remediación se compone por: tres recipientes de muestras en
blanco sin bacterias y tres recipientes con bacterias, la duración del ensayo fue de
35 días. A los 20 días se agregó 10mL de fosfato diamónico a cada recipiente para
nutrir a la bacteria (Hernandez et al., 2007).
29
3.1.6. Separación por el método de Soxhlet
Se tomó la tierra de los 6 biodigestores de forma separada que previamente se
había sometido a biorremediación por un periodo de 35 días con la bacteria y el
aceite para su tratamiento, para luego colocarla en el Soxhlet con el papel filtro. se
pesó el balón vacío y se procedió a agregar 250 mL de alcohol cetona como
solvente, mediante el proceso de evaporación y condensación que emplea el
soxhlet, se logró separar la mezcla de tierra-aceite dicho tratamiento fue por el
lapso de 4 horas (Hernandez et al., 2007).
3.1.7. Extracción mediante evaporación
Una vez que el aceite se disolvió en el alcohol cetona, el balón se colocó en un
plato caliente para proceder a la evaporación del solvente y su posterior
recuperación, operación se repitió con los balones restantes procedentes del
procesamiento del contenido de los 6 recipiente como resultado solo quedó el
aceite en el balón (Hernandez et al., 2007).
30
CAPITULO IV
4.1. Resultados
Se aislaron bacterias del suelo contaminado con aceite usado de motor, donde
prevaleció la especie que se identificó como Pseudomona Aeruginosa.
La única bacteria capaz de crecer en el medio de cultivo en 2%, 4%, 5% de aceite
usado fue Pseudomona Aeruginosa.
Figura 4: Porcentaje de remoción
En el bioensayo con suelo contaminado se observó un porcentaje de remoción de
TPH 89.84± 11.84% en el tratamiento con Pseudomona Aeruginosa, mayor que el
control abiótico donde se apreció una remoción de 55.11± 0.16% de TPH
(F=15.47; P=0.029). En el bioensayo se determinó un valor máximo de
degradación del 97%, confirmando que esta bacteria es eficiente para la
degradación de aceite usado se confirma la hipótesis, demostrando que existen
bacterias capaces de degradar hidrocarburos totales de petróleo de un suelo
contaminado con aceite usado de motor de vehículos.
a
b
0
20
40
60
80
100
120
Control Tratamiento
Rem
oció
n d
e T
PH
(%
)
31
4.2. Discusión
Se seleccionó tierra contaminada con aceites usados de motor para proceder a
aislar bacterias que tengan el potencial para eliminar (Biorremediar) los
componentes hidrocarburíferos del aceite usado de motor.
Posteriormente se verificó su capacidad para eliminar el aceite quemado en una
concentración de 45gr/kg de tierra. En trabajos como el de Sabate, Solanas, Viñas
y Sabaté (2005) se realizaron ensayos en una concentración de TPH’s de 8gr/kg,
en el que sugirieron que a lo largo de los 200 días de su ensayo parte de los
compuestos se volatilizaron lo cual pudo haber obtenido una incidencia en sus
resultados, al igual que en los ensayos realizados por Ruberto, Vazquez y Mac
Cormack (2003) en el que usaron una concentración de TPH’s 2.5gr/kg de tierra
en el que concluyeron que el aceite se volatilizó debido a los compuestos de
cadenas policíclicas y otros compuestos volátiles, aunque su ensayo duró 51 días.
Para el presente estudio se empleó para la biorremediación el organismo conocido
como Pseudomona aeruginosa, ya que la misma fue aislada del suelo
contaminado con aceite y porque se encuentran descritas sus propiedades de
biorremediación de hidrocarburos; en trabajos como el de Ruberto et al. (2003) en
donde emplean a varios individuos de la Acinetobacter sp. miembros del orden de
las Pseudomonadales, las que mayormente son empleadas para la remediación
de combustibles como en los trabajos de Adeyi, Adeyi, Giwa y Solomon (2017) y
Striebich et al. (2014) y generalmente se emplean bacterias para biorremediación
que procedan de medios contaminados.
En el trabajo de Ruberto et al. (2003), se empleó bioestimulación al suelo que fue
extraído de la Antártida y alejado de las actividades antropogénicas ya que el
mismo posee una baja concentración de Nitrógeno (N) y Fosforo (P) de forma
natural, como estimulación empleó NaNO3 como fuente de nitrógeno y como
fuente de fosforo Na2HPO4 en tanto el presente trabajo empleó (NH4)2HPO4 como
fuente tanto de N y P.
32
En el caso de Ruberto et al. (2003) difiere en lo que sugiere Sabate et al. (2005)
ya que hay una incidencia en la biorremediación debido a la incorporación de
bioestimulantes; además no se observa que tenga algún efecto que coadyuve a la
biorremediación de los hidrocarburos, por lo que en sus resultados no refleja
alguna diferencia significativa para establecer aquello.
Se compararon los resultados de los ensayos realizados por Sabate et al. (2005)
con bioestimulación y sin bioestimulación, y se observó una ligera pero
significativa reducción de la contaminación, este hallazgo no se lo podría
cuantificar en el presente trabajo ya que, aunque se les adicionó nutrientes a los
biodigestores no se tuvo un control sin Bioestimulación para hacer la comparación
post ensayo; y determinar si hubo o no algún grado de incidencia en la
biorremediación.
La concentración de bacterias para el ensayo fue la misma empleada por Topp
(2001), el cual utilizó una concentración de 0.5 McFarland equivalente a un
densidad celular de 1𝑥108 la cual fue ajustada con un espectrómetro a λ 200nm,
con la diferencia que en el presente trabajo se empleó otro organismo
(Pseudomona aeruginosa).
En cuanto a los resultados de la eficiencia de la biorremediación tenemos que la
Pseudomona aeruginosa tuvo una eficiencia promedio del 89.84± 11.84% en
eliminar el aceite quemado de motor, mientras que en trabajos como el de Adeyi
et al. (2017) la Pseudomona aeruginosa tiene una eficiencia del 99% sin la adición
de bioestimulación y con ella una del 98%; y dentro del mismo estudio se probó a
otro microorganismos del orden Pseudomonadales; la Pseudomona fluorecence
con una eficiencia del 95% y 43% respectivamente con y sin Bioestimulación; cabe
señalar que esta gran variación en la eficiencia de biorremediación puede deberse
a la naturaleza del compuesto pudiendo ser el aceite quemado de más difícil o
prolongada degradación con respecto a los combustibles que una gran parte de
sus componentes se volatilizan.
33
4.3. Conclusiones
Se detectaron bacterias en los suelos contaminados con aceite usado de motor
capaces de degradar aceites y grasas, pero solo las Pseudomonas sp. fueron las
más tolerantes a las altas concentraciones del aceite quemado por lo que se la
empleó para los distintos ensayos.
Se utilizó la bacteria Pseudomona sp. encontrada en el área de estudio y se la
mezclo en un medio selectivo con 2%, 4% y 5% de aceite usado de motor como
única fuente de carbono y energía para determinar el potencial de
biorremediación.
Se determinó que las Pseudomona aeruginosa eran las que poseían mayor
tolerancia a vivir en medios contaminados de aceite quemado en una
concentración del 5% de aceite usado de motor y se encontró que posee un
potencial de biorremediación promedio del 89.84± 11.84%.
Se concluye que el tratamiento con Pseudomona aeruginosa presentó un valor
máximo de degradación del 97% en uno de los tres bioensayos, concluyendo que
esta bacteria es capaz de degradar aceite usado de motor.
34
4.4. Recomendaciones
Se recomienda hacer más investigación sobre la biorremediación de suelos
contaminados por aceite usado de motor, ya que se podría encontrar más
microorganismos con la capacidad de biorremediar el suelo contaminado.
Evitar la contaminación por descargas de aceite al suelo debido que es
perjudicial al ambiente.
Generar normativas que regulen a las lubricadoras artesanales debido a
que ellos no poseen una Gestión ambiental, por producto de los derrames y
descargas del aceite usado de motor y que podría infiltrarse en el suelo y
llegar a la capa freática, produciendo una mayor contaminación al medio
ambiente.
Implementar que todas las lubricadoras tenga un sitio para depósito de
aceites usados y/o trabajen con Gestores de aceite calificados y siguiendo
la normativa legal vigente.
Impartir charlas con personal preparado a trabajadores y dueños de
lubricadoras y lavadoras con respecto a qué hacer con los desperdicios de
aceite.
Se debe aplicar las normativas legales vigentes en el País y hacer una
mejor Gestión de Calidad Ambiental en estas pequeñas lubricadoras.
35
4.5. Bibliografía
Adeyi, V. A., Adeyi, A. A., Giwa, A., & Solomon, B. O. (2017). Comparative
Bioremediation of Diesel Oil Bearing Soil by <i>Pseudomonas
aeruginosa</i> and <i>Pseudomonas fluorescence</i>
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40
4.6. Anexos
Bienvenido a Minitab, presione F1 para obtener ayuda.
ANOVA unidireccional: Control; Biorremediado
Método
Hipótesis nula Todas las medias son iguales
Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente
Nivel de significancia α = 0,05
Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis.
Información del factor
Factor Niveles Valores
Factor 2 Control; Biorremediado
Análisis de Varianza
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Factor 1 1,431 1,4308 3,03 0,157
Error 4 1,887 0,4717
Total 5 3,318
Resumen del modelo
R-cuad. R-cuad.
S R-cuad. (ajustado) (pred)
0,686828 43,13% 28,91% 0,00%
Medias
Factor N Media Desv.Est. IC de 95%
Control 3 1,403 0,834 ( 0,302; 2,504)
Biorremediado 3 0,427 0,497 (-0,674; 1,528)
Desv.Est. agrupada = 0,686828
Comparaciones múltiples de Dunnet con un control
Agrupar información utilizando el método de Dunnett y una confianza de 95%
Factor N Media Agrupación
Control (control) 3 1,403 A
Biorremediado 3 0,427 A
Las medias no etiquetadas con la letra A son significativamente diferentes de la
media del
nivel de control.
41
ICs simultáneos de 95% de Dunnett
Gráfica de intervalos de Control; Biorremediad
ANOVA unidireccional: Control; Biorremediado
Método
Hipótesis nula Todas las medias son iguales
Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente
Nivel de significancia α = 0,05
Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis.
Información del factor
Factor Niveles Valores
Factor 2 Control; Biorremediado
Análisis de Varianza
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Factor 1 2,5521 2,5521 15,47 0,029
Error 3 0,4949 0,1650
Total 4 3,0470
Resumen del modelo
R-cuad. R-cuad.
S R-cuad. (ajustado) (pred)
0,406168 83,76% 78,34% 63,45%
Medias
Factor N Media Desv.Est. IC de 95%
Control 2 1,88500 0,00707 (0,97099; 2,79901)
Biorremediado 3 0,427 0,497 ( -0,320; 1,173)
Desv.Est. agrupada = 0,406168
Comparaciones múltiples de Dunnet con un control
Agrupar información utilizando el método de Dunnett y una confianza de 95%
Factor N Media Agrupación
Control (control) 2 1,88500 A
Biorremediado 3 0,427
Las medias no etiquetadas con la letra A son significativamente diferentes de la
media del
nivel de control.
42
ICs simultáneos de 95% de Dunnett
Gráfica de intervalos de Control; Biorremediad
ANOVA unidireccional: Control; Biorremediado
Método
Hipótesis nula Todas las medias son iguales
Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente
Nivel de significancia α = 0,05
Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis.
Información del factor
Factor Niveles Valores
Factor 2 Control; Biorremediado
Análisis de Varianza
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Factor 1 2,5521 2,5521 15,47 0,029
Error 3 0,4949 0,1650
Total 4 3,0470
Resumen del modelo
R-cuad. R-cuad.
S R-cuad. (ajustado) (pred)
0,406168 83,76% 78,34% 63,45%
Medias
Factor N Media Desv.Est. IC de 95%
Control 2 1,88500 0,00707 (0,97099; 2,79901)
Biorremediado 3 0,427 0,497 ( -0,320; 1,173)
Desv.Est. agrupada = 0,406168
Comparaciones en parejas de Tukey
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95%
Factor N Media Agrupación
Control 2 1,88500 A
Biorremediado 3 0,427 B
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
43
ICs simultáneos de 95% de Tukey
Comparaciones múltiples de Dunnet con un control
Agrupar información utilizando el método de Dunnett y una confianza de 95%
Factor N Media Agrupación
Control (control) 2 1,88500 A
Biorremediado 3 0,427
Las medias no etiquetadas con la letra A son significativamente diferentes de la
media del
nivel de control.
ICs simultáneos de 95% de Dunnett
Gráfica de intervalos de Control; Biorremediad
Gráfica de caja de Control; Biorremediado
————— 20/12/2018 11:37:48 ————————————————————
Bienvenido a Minitab, presione F1 para obtener ayuda.
Recuperando proyecto desde el archivo:
‘C:\Users\Usuario\Documents\Resultados Biorremediación.MPJ’
44
Figura 5: Recolección de muestras
Figura 6: Muestra en medio de
enriquecimiento (Agua de Peptona)
45
Figura 7: Muestra en agar Cetrimide después de 24 horas
Figura 8: Pseudomona Aeruginosa
46
Figura 9: Preparación de emulsión para la
determinación de niveles de tolerancia
Figura 10: Emulsión para los niveles de
tolerancia
47
Figura 11: Niveles de tolerancia por triplicado
Figura 12: Bacteria en medio de enriquecimiento para su
reproducción en agitación constante
48
Figura 13: Lugar donde se tomó tierra para ensayos
Figura 14: Tamizaje de tierra
49
Figura 15: Pesaje de tierra 800 Gr
Figura 16: Separación de la tierra previamente esterilizada en seis recipientes
50
Figura 17: Recipientes con bacterias
Figura 18: Recipientes sin bacterias
51
Figura 19: Preparación de fosfato diamónico
Figura 20: Adición de fosfato diamónico pasado los 20 días
52
Figura 21: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet
53
Figura 22: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet pasada las 4 horas
54
Figura 23: Separación de tierra y aceite finalizada lista para la extracción
55
Figura 24: Extracción del solvente mediante evaporación
Figura 25: Extracción después de una hora