Post on 30-Jun-2018
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS
RELACIONADAS CON EL ESTRÉS OXIDATIVO DEL TOMATE
DE ÁRBOL (Solanum betaceum CAV.) CULTIVADO EN DOS
ZONAS CON DIFERENTES ALTURAS (m.s.n.m.)
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO DE
ALIMENTOS
CARLOS ROBERTO CEVALLOS NAVARRETE
DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE CUVI
Quito, Mayo 2013
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2013
Reservados todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo CARLOS ROBERTO CEVALLOS NAVARRETE, declaro que el trabajo aquí
descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún
grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias
bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad
Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.
____________________________
Carlos Roberto Cevallos Navarrete
1724014327
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “DETERMINACIÓN DE LA
ACTIVIDAD DE ENZIMAS RELACIONADAS CON EL ESTRÉS OXIDATIVO
DEL TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum CAV.) CULTIVADO EN DOS
ZONAS CON DIFERENTES ALTURAS (m.s.n.m.)”, que, para aspirar al título
de Ingeniero de Alimentos fue desarrollado por Carlos Cevallos, bajo mi
dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple
con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación
artículos 18 y 25.
____________________________
Bioq. María José Andrade Cuvi
DIRECTORA DEL TRABAJO
1712338373
AGRADECIMIENTOS
A mi madre, por darme la oportunidad de estudiar y por proporcionarme los
medios para llegar a ser una persona exitosa.
A mi directora María José y a Nubia por reconocer mi talento, tomarme en
cuenta y apoyarme a lo largo de toda la carrera y por las palabras de aliento
que me brindaron al final.
Al programa de investigación en tratamiento poscosecha de frutos Ecuatorianos
de la facultad de ciencias de la ingeniería de la Universidad Tecnológica
Equinoccial por brindarme la oportunidad de hacer de un proyecto de
investigación mi trabajo de titulación.
Gracias en especial a Michelle, por toda la ayuda que me brindo en las largas
jornadas que tomó la realización de la parte práctica de este trabajo y por todo
el cariño que me da cada día.
A mis compañeros y amigos de la carrera por todos los momentos que
compartimos a lo largo de todos los años de estudio. Un agradecimiento
especial a Lore Cuesta, mi compañera de proyecto por su serenidad, paciencia,
responsabilidad y compromiso, que nos llevaron a formar un excelente equipo
de investigación.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN viii
ABSTRACT x
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 4
2.1 TOMATE DE ÁRBOL 4
2.1.1 ORIGEN 4
2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Y CLASIFICACIÓN
TAXONÓMICA 4
2.1.3 VARIEDADES DE TOMATE DE ÁRBOL 5
2.1.4 COSECHA 7
2.1.4.1 Índices de cosecha 7
2.1.4.2 Recolección del fruto 8
2.1.5 POSCOSECHA 9
2.1.5.1 Operaciones poscosecha 9
2.2 ESTRÉS OXIDATIVO 11
2.2.1 RADICALES LIBRES 12
2.2.1.1 Especies reactivas de oxígeno (EROs) 13
2.2.1.2 Especies reactivas de nitrógeno (ERNs) 14
ii
PÁGINA
2.2.2 TIPOS DE ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS
RELACIONADOS CON EL ESTRÉS OXIDATIVO 16
2.2.2.1 Estrés hídrico 16
2.2.2.2 Estrés por alta y baja temperatura 17
2.2.2.3 Estrés por salinidad 18
2.2.3.4 Estrés por alta o baja irradiancia 19
2.2.3 LA ALTURA DE CULTIVO (m.s.n.m.) COMO FACTOR
ABIÓTICO CAUSANTE DE ESTRÉS OXIDATIVO 20
2.3 SISTEMAS ANTIOXIDANTES 22
2.3.1 ANTIOXIDANTES NO ENZIMÁTICOS 23
2.3.2 ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS 24
2.3.2.1 Peroxidasa (POX) 24
2.3.2.2 Ascorbato peroxidasa (APX) 25
2.3.2.3 Catalasa (CAT) 27
2.3.2.4 Superóxido dismutasa (SOD) 30
3. METODOLOGÍA 32
3.1 MATERIAL VEGETAL 32
3.1.1 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS 32
3.2 MEDIDA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 34
3.2.1 PEROXIDASA (POX) 34
3.2.1.1 Preparación del extracto enzimático 34
3.2.1.2 Determinación de las condiciones óptimas de
reacción 34
iii
PÁGINA
3.2.1.3 Medida de actividad de peroxidasa 35
3.2.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX) 36
3.2.2.1 Preparación del extracto enzimático 36
3.2.2.2 Determinación de las condiciones óptimas de
reacción 36
3.2.2.3 Medida de actividad de ascorbato peroxidasa 37
3.2.3 CATALASA (CAT) 38
3.2.3.1 Preparación del extracto enzimático 38
3.2.3.2 Determinación de las condiciones óptimas de
reacción 38
3.2.3.3 Medida de actividad de catalasa 39
3.2.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD) 39
3.2.4.1 Preparación del extracto enzimático 39
3.2.4.2 Determinación de las condiciones óptimas de
reacción 40
3.2.4.3 Medida de actividad de superóxido dismutasa 40
3.2.5 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA 41
3.2.6 ANALISIS ESTADÍSTICO 42
3.3 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN HOJAS 43
3.3.1 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO 43
3.3.2 TITULACIÓN Y CÁLCULO DE LA CANTIDAD DE
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 44
3.3.3 ANALISIS ESTADÍSTICO 45
iv
PÁGINA
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS 46
4.1 ACTIVIDAD DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES 46
4.1.1 PEROXIDASA (POX) 46
4.1.1.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 46
4.1.1.2 Medida de actividad enzimática de POX 49
4.1.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX) 53
4.1.2.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 53
4.1.2.2 Medida de actividad enzimática de APX 55
4.1.3 CATALASA (CAT) 57
4.1.3.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 57
4.1.3.2 Medida de actividad enzimática de CAT 59
4.1.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD) 63
4.1.4.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 63
4.1.4.2 Medida de actividad enzimática de SOD 67
4.2 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN HOJAS 70
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 71
5.1 CONCLUSIONES 71
5.2 RECOMENDACIONES 73
BIBLIOGRAFÍA 75
v
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1. Principales variedades de tomate de árbol 6
Figura 2. Corte y recolección del tomate de árbol 8
Figura 3. Daños en tomate de árbol por plagas y daño mecánico 10
Figura 4. Centro de acopio de una plantación y la clasificación de tomates
de árbol 10
Figura 5. Formación de principales especies reactivas de oxígeno 14
Figura 6. Principales especies reactivas de nitrógeno y su formación 15
Figura 7. Incremento de la radiación UV-B con la altitud en latitud 33°S 21
Figura 8. Reacción catalizada por peroxidasa 24
Figura 9. Reacción catalizada por POX, donde se oxida el guayacol a
tetrahidroguayacol 25
Figura 10. Reacción catalizada por ascorbato peroxidasa 26
Figura 11. Ciclo del Ascorbato-Glutatión ó ciclo de Halliwell-Asada 27
Figura 12. Reacción catalizada por catalasa 28
Figura 13. Actuación de la enzima catalasa. Acción catalítica y acción
oxidativa 29
Figura 14. Reacción catalizada por superóxido dismutasa 30
Figura 15. Congelación de las hojas con nitrógeno líquido y trituración en
mortero 33
Figura 16. Separación del endocarpio del tomate de árbol 33
Figura 17. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio y
mesocarpio de tomate de árbol en la mezcla de reacción de
POX 47
Figura 18. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla
de reacción de POX con extracto enzimático del endocarpio y
mesocarpio de tomate de árbol 48
vi
PÁGINA
Figura 19. Ensayo de variación de la concentración de guayacol en la
reacción con extracto enzimático del mesocarpio de tomate de
árbol en reacción de POX 49
Figura 20. Actividad de la enzima peroxidasa (POX) en el endocarpio y
mesocarpio del tomate de árbol 51
Figura 21. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio de
tomate de árbol en reacción de APX 53
Figura 22. Ensayo de variación de concentración de H2O2 realizado con
extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de
APX 54
Figura 23. Ensayo de variación de concentración de Asc-Na realizado con
extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de
APX 54
Figura 24. Actividad de la enzima ascorbato peroxidasa (APX) en el
endocarpio del tomate de árbol 56
Figura 25. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio y
mesocarpio de tomate de árbol en la mezcla de reacción de
CAT 58
Figura 26. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla
de reacción de CAT con extracto enzimático del endocarpio y
mesocarpio de tomate de árbol 59
Figura 27. Actividad de la enzima catalasa (CAT) en el endocarpio y en el
mesocarpio del tomate de árbol 61
Figura 28. Actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) en el
endocarpio y mesocarpio del tomate de árbol 68
vii
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Clasificación taxonómica del tomate de árbol 5
Tabla 2. Características del fruto de las variedades más cultivadas de
tomate de árbol en Ecuador 6
Tabla 3. Resultados del ensayo de variación de concentración de
riboflavina para ensayo de SOD 64
Tabla 4. Resultados del ensayo de variación de tiempo de incubación para
ensayo de SOD 64
Tabla 5. Resultados del ensayo de variación de concentración de
metionina para ensayo de SOD 65
Tabla 6. Resultados del ensayo de variación de la intensidad lumínica
para ensayo de SOD 66
Tabla 7. Resultados del ensayo de variación de volumen de extracto para
ensayo de SOD 67
Tabla 8. Porcentaje de peróxido de hidrógeno (H2O2) en hojas de tomate
de árbol 70
viii
RESUMEN
El estrés oxidativo se produce en la célula cuando se pierde el equilibro entre la
producción/eliminación de especies reactivos de oxígeno (EROs) que son
producidos normalmente por el metabolismo celular o se induce su síntesis
cuando el tejido es afectado por estrés de tipo biótico o abiótico. Uno de los
factores abióticos que influyen en el estrés oxidativo de las plantas es la altitud
de cultivo, que se manifiesta con el incremento en la incidencia de radiación
UV-B. Para retrasar o controlar la concentración de EROs la célula utiliza
sistemas antioxidantes de tipo enzimático (como las enzimas peroxidasa - POX,
ascorbato peroxidasa - APX, catalasa - CAT y superóxido dismutasa - SOD) y
no enzimático (como compuestos fenólicos, entre otros). Se ha comprobado
que cualquier tipo de estrés induce cambios en estos sistemas con el fin de
evitar la muerte celular. En este sentido, son escasos los estudios que
relacionen la altura como factor abiótico y la actividad enzimática antioxidante
en frutos. Para el presente estudio, se recolectaron tomates de árbol de
variedad “mora”, de dos localidades con diferente altitud, Pelileo (2660
m.s.n.m.) y Chiquicha (2440 m.s.n.m.) y en diferente estado de madurez
(inmaduro y maduro). También se recolectaron hojas de tomate de árbol de las
dos localidades. Parte de los frutos maduros se mantuvieron a temperatura
ambiente durante 17 días para su sobremaduración. A demás se separó el
endocarpio y el mesocarpio de los frutos y se congelaron a -20°C. Las hojas se
congelaron en nitrógeno líquido, se trituraron en un mortero y se almacenaron a
-20°C. Se determinó la actividad enzimática de POX, APX, CAT y SOD con
técnicas espectrofométricas UV-VIS. La proteína se determinó por el método de
Lowry. Se determinó la concentración de H2O2 en las hojas con una titulación
permanganométrica. Los resultados mostraron diferencia significativa entre las
dos alturas de cultivo y entre las dos partes del fruto para todas las enzimas y
ix
se observó que la actividad de POX, APX, CAT y SOD disminuye durante la
maduración del fruto. Se encontró una mayor concentración de peróxido de
hidrógeno (H2O2) en las hojas de tomate de árbol provenientes de la localidad
de Pelileo (2660 m.s.n.m.) que en las de Chiquicha (2440 m.s.n.m.). Se
determinó una relación negativa en relación a la altura de cultivo con la
actividad enzimática antioxidante (POX, APX, CAT y SOD) dado que los frutos
de la localidad de Chiquicha, de inferior altura (2440 m.s.n.m.) y por tanto
expuestos a menor incidencia de radiación UV-B presentaron mayor actividad
en las enzimas analizadas que en los frutos provenientes de Pelileo (2660
m.s.n.m.). Estas diferencias podrían deberse, entre otros factores bióticos y
abióticos, al tiempo de producción del cultivo y a las condiciones más idóneas
del suelo. Son necesarios más estudios para elucidar la relación de la altura de
cultivo con la producción de EROs y la actividad enzimática antioxidante en los
frutos de tomate de árbol.
x
ABSTRACT
Oxidative stress is produced in the cell when the balance between
production/elimination of reactive oxygen species (ROS) is tainted. ROS are
normally produced by the cell metabolism or its synthesis is induced when the
tissue is affected by biotic and abiotic types of stress. One of the abiotic factors
that influences in oxidative stress in plants is the culture altitude, directly linked
with the increase of UV-B radiation incidence. In order to delay or control the
ROS concentration, the cell uses enzymatic antioxidant systems (enzymes like
peroxidase - POX, ascorbate peroxidase - APX, catalase - CAT and superoxide
dismutase - SOD) and non-enzymatic antioxidant systems (like phenolic
compounds, among others). It has been proved that any kind of stress induces
changes in these systems in order to avoid cell death. In this line, studies that
relate the highness as an abiotic factor and the antioxidant enzyme activity in
fruits are scarce. For the present study, tree tomatoes from “blackberry” variety,
were collected from two locations with different altitudes Pelileo (2660 m.s.n.m.)
and Chiquicha (2440 m.s.n.m.) and in two different stages of ripening (immature
and ripe). Tree tomato leaves were also collected from the two locations. Some
of the ripe fruits were kept at room temperature during 17 days for over ripening.
The endocarp and the mesocarp of the fruits were separated and stored at
-20°C. The leaves were frozen with liquid nitrogen, then crushed in a mortar and
stored at -20°C. Enzymatic activity of POX, APX, CAT and SOD was determined
using UV-VIS spectrophotometric techniques. Protein content in the enzyme
extracts was determined using Lowry’s method. The H2O2 concentration in the
leaves was determined using permanganometric titration. The results showed a
significant difference between the two culture altitudes and between the two
parts of the fruit for all the enzymes. The results also showed that the enzymatic
activity of POX, APX, CAT and SOD decreases during fruit ripening. A higher
xi
concentration of hydrogen peroxide (H2O2) was found in Pelileo leaves (2660
m.s.n.m.) compared to the concentration found in Chiquicha (2440 m.s.n.m.)
leaves. A negative relation was determined between the culture highness and
the antioxidant enzymes activity (POX, APX, CAT and SOD), given that the
fruits from Chiquicha of lower altitude (2440 m.s.n.m.), and consequently
exposed to a lower UV-B radiation incidence showed a higher activity of the
analyzed enzymes than the fruits of Pelileo (2660 m.s.n.m).These differences
could be due to, among other biotic and abiotic factors, to the culture’s
production time and the soil conditions. Further studies are necessary to
determine the relation between the culture highness, the ROS production and
the antioxidant enzymes activity in tree tomato fruits.
1
1. INTRODUCCIÓN
El tomate de árbol es uno de los principales cultivos permanentes en la sierra
ecuatoriana. Se cultiva en las provincias de Carchi, Imbabura, Pichincha,
Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Bolívar, Cañar, Azuay y Loja (Revelo,
Pérez y Maila, 2011). En total en el país se cultivan 14748 hectáreas, siendo la
provincia de Tungurahua la mayor productora, con 8300 hectáreas (CORPEI,
2008).
En la provincia de Tungurahua, se cultivan distintas variedades de tomate de
árbol en las localidades de los diferentes cantones. Debido a que la provincia
presenta una accidentada geografía, los cultivos del fruto varían en altitudes
desde cerca de los 1000 m.s.n.m. hasta casi los 3000 m.s.n.m. Dos de las
principales zonas productoras de tomate de árbol variedad mora son Chiquicha
y los alrededores de Pelileo.
El tomate de árbol resalta por sus cualidades nutricionales, especialmente sus
propiedades de reducción de colesterol, su alto contenido de fibra, vitaminas A
y C, y su bajo nivel de calorías. Es rico en minerales, especialmente calcio,
hierro y fósforo; contiene niveles importantes de proteína, carotenos y pectina.
Fortalece el sistema inmunológico y la visión, además de funcionar como
antioxidante (Lucas, Maggi y Yagual, 2011).
En el Ecuador, el tomate de árbol se consume en forma de jugo, mermelada,
jaleas y postres. Tradicionalmente, a este fruto también se le han atribuido
propiedades medicinales, éstas están relacionadas con las afecciones de
garganta y gripe. Por ejemplo, es común aplicar el fruto o las hojas previamente
calentadas o soasadas, en forma tópica contra la inflamación de amígdalas o
anginas.
2
En fruto terapia el tomate de árbol es muy apreciado por la variedad de
aplicaciones y excelentes resultados. El consumo de la fruta fortalece el cerebro
y la memoria, contribuye al tratamiento de migrañas y cefaleas severas, a
controlar la rinitis y beneficia el sistema circulatorio (Albuja y Miño, 2005). Todas
estas características han hecho que el tomate de árbol haya llegado a
convertirse en una fruta de exportación (CORPEI, 2008).
Muchos de estos efectos beneficiosos del tomate de árbol tienen relación con
los antioxidantes que posee el fruto. La cantidad de antioxidantes que existen
en un fruto depende de la producción de radicales libres dentro de él originados
ya sea por el metabolismo propio del tejido o por respuesta a condiciones de
estrés causados por factores bióticos (insectos y microorganismos que afecten
al desarrollo de la planta) ó por factores abióticos (condiciones
medioambientales adversas para la planta) (Carrillo y Valle, 2005).
Estas condiciones adversas producen un incremento de radicales libres en las
células vegetales. Las plantas han desarrollado sistemas antioxidantes que
previenen que estos radicales libres dañen a la célula, destruyéndolos ó
inactivándolos (Miranda y Castro, 2007). Estos sistemas se dividen en
antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. Los antioxidantes no enzimáticos
son compuestos que donan potencial reductor a los radicales libres
inactivándolos, mientras que los antioxidantes enzimáticos es un grupo de
enzimas que eliminan a los radicales libres (Loscos, 2007). Entre las principales
enzimas antioxidantes se encuentran las catalasas, superoxido dismutasas y la
ascorbato peroxidasa (Montoliu, 2010). La peroxidasa, aunque se encuentre
ligada con el pardeamiento enzimático, también tiene propiedades antioxidantes
(Miranda, 2003).
La cuantificación de compuestos antioxidantes y la determinación de la
actividad de enzimas antioxidantes es importante, debido al valor nutricional
3
agregado que le dan estas al fruto, y la influencia de estos compuestos en la
vida útil poscosecha (Navarro, et. al., 2006; Ndidi y Akeem, 2011).
Dado que la altitud modifica de alguna forma las condiciones en cada cultivo, se
la podría considerar como un factor abiótico que incide en el desarrollo de las
plantas y sus frutos. Siendo así, la cantidad de antioxidantes y la actividad de
enzimas antioxidantes se podrían ver afectada por este factor. Estudiar la altitud
de cultivo como factor abiótico podría proporcionar información de en cuáles
cultivos este fruto presenta las mejores características antioxidantes, de manera
que beneficien al consumidor.
El principal propósito de del presente trabajo de investigación fue determinar la
actividad de enzimas antioxidantes relacionadas con el estrés oxidativo del
tomate de árbol (Solanum betaceum cav.) cultivado en dos zonas con diferente
altitud (m.s.n.m.), para determinar cuál de las dos zonas produce frutos con
mejores características antioxidantes.
Los resultados del presente trabajo forman parte del PROGRAMA DE
INVESTIGACIÓN EN TRATAMIENTO POSCOSECHA DE FRUTOS
ECUATORIANOS y son antecedentes para futuros trabajos de investigación.
Los objetivos del presente trabajo de investigación fueron:
Determinar la actividad enzimática de peroxidasa, ascorbato peroxidasa,
catalasa y superóxido dismutasa en el endocarpio y mesocarpio de frutos
de tomate de árbol cultivado en dos zonas con diferente altitud (m.s.n.m.)
y en tres estados de madurez.
Cuantificar la cantidad de peróxido de hidrógeno (H2O2) en hojas de
tomate de árbol cultivado en dos zonas con diferente altitud (m.s.n.m.).
4
2. MARCO TEÓRICO
2.1 TOMATE DE ÁRBOL
2.1.1 ORIGEN
El tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) también conocido como tamarillo,
es una fruta exótica originaria de la parte oriental de los Andes, específicamente
Perú, Ecuador y Colombia. Investigaciones recientes sostienen que según
evidencias moleculares, estudios morfológicos y datos de campo; el tomate de
árbol se habría originado en Bolivia. (Del Cisne, 2011).
2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Y CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA
El tomate de árbol es una planta arbustiva con tallos semileñosos, de follaje
grande, alcanzando una altura de 2 a 3 m. El sistema radical de la planta de
tomate de árbol posee una raíz principal y raíces secundarias que salen de esta
y a su vez se ramifican. (Pilco, 2009). Las hojas son cordiformes (forma de
corazón), carnosas, levemente pubescentes y muy grandes. Posee flores son
de color rosa y lavanda, agrupadas en racimos terminales, las cuales florecen
de manera escalonada (Calvo, 2009). Los frutos son solitarios ó se encuentran
agrupados, de colores variables, del amarillo al rojo, dependiendo de la
variedad (Jibaja, 2010), de forma ovoidal con ápices puntiagudos, contienen
muchas semillas pequeñas en cantidades de 120 a 150. (Revelo, et. al, 2011).
La clasificación taxonómica del tomate de árbol se describe en la Tabla 1.
5
Tabla 1. Clasificación taxonómica del tomate de árbol.
Reino: Vegetal
División Fanerógamas
Subdivisión: Angiospermas
Clase: Dicotiledóneas
Subclase: Simpétalas
Orden: Tubifloras
Familia: Solanaceae
Género: Solanum
Especie: betaceum (Cav.)
Nombre Común: Tomate de Árbol
(Pilco, 2009)
2.1.3 VARIEDADES DE TOMATE DE ÁRBOL
Existen en la actualidad 8 genotipos de tomate de árbol que se cultivan en
Ecuador, según Revelo, et. al. (2011):
Amarillo
Negro
Redondo
Puntón (común)
Rojo
Anaranjado ó Amarillo gigante
Mora (Neozelandés)
Mora (Ecuatoriano)
Varios de estos genotipos resultan del cruce de una variedad con otra. Los
principales cultivos de tomate de árbol comprenden las variedades puntón,
redondo, anaranjado ó amarillo gigante y mora (Ecuatoriano ó Neozelandés), se
muestran en la figura 1.
6
Figura 1. Principales variedades de tomate de árbol (Ávila, 2009).
En la tabla 2, se puede observar una comparación entre valores promedio de
las características del fruto de cada una de estas variedades.
Tabla 2. Características del fruto de las variedades más cultivadas de tomate
de árbol en Ecuador.
Variedades
Parámetros Puntón Redondo Gigante Mora
N° de frutos maduros / Inflorescencia
2,4 3,0 4,0 4,0
Peso (g) 75 75 118 117
Longitud (cm) 6,8 5,5 7,0 8,0
Firmeza (N) 25 15 23 18
Semillas (N°) 196 243 308 296
Color
Piel anaranjado Rojizo oscuro
Pulpa anaranjado Anaranjado
Mucílago anaranjado Rojo oscuro -
morado
(León y Viteri, 2004)
7
2.1.4 COSECHA
Dependiendo de la localidad, la cosecha se inicia aproximadamente desde los
10 a los 14 meses después del trasplante, siendo más temprana a altitudes de
1500 m.s.n.m. con clima templado y más tardía a altitudes de 2600 m.s.n.m.
con clima frío. Dependiendo de la altitud y el manejo de la plantación, puede
producir de 3 a 4 años. La producción es permanente en zonas con clima
templado y es estacionaria en zonas frías (Revelo, et. al, 2011).
2.1.4.1 Índices de cosecha
La madurez del tomate de árbol puede medirse visualmente a partir de su
coloración externa y confirmada al examinar el contenido de pulpa, así como
por medio de la prueba de yodo (Codex Alimentarius, 2011).
Otros índices, son el cambio en la firmeza, contenido de jugo y sólidos solubles
en la fruta. Para especies de color rojo (puntón), el cambio de color de la
cáscara se da desde un color verde en la primera etapa, pasando por un
morado oscuro (debido a la clorofila y antocianinas) en su segunda etapa,
aproximadamente a los 120 días, y que llega finalmente a tener su color rojo en
su madurez completa en la tercera etapa aproximadamente a los 140 días
(FAO, 2006). Es recomendable su cosecha entre la segunda y tercera etapa
para asegurar mayor vida útil (Cantwell, 2005).
8
2.1.4.2 Recolección del fruto
La recolección se hace a lo largo del día, utilizando unas varas con una cuchilla
en el extremo para facilitar el corte del tomate. La recolección se divide en dos
etapas (figura 2), la primera de corte del tomate con la vara, el cual dejan caer
directamente al suelo, y la segunda de recolección de toda la fruta que está en
el suelo, producto de la anterior práctica (Reinel, Brito y García, 2008).
Figura 2. Corte y recolección del tomate de árbol (Reinel, et. al, 2008).
La recolección en la mayoría de plantaciones de tomate de árbol se realiza con
una frecuencia de 15 días, dejando el pedúnculo adherido a la fruta para evitar
su deshidratación, el ingreso de patógenos por la base del fruto, retrasar la
maduración y mejorar su aspecto (Revelo et. al, 2011).
El tomate es recolectado en diferentes recipientes, desde carretillas hasta
bolsas de lona, pasando por canecas, baldes y canastillas (Reinel, et. al, 2008).
9
2.1.5 POSCOSECHA
La poscosecha de la fruta parte desde el momento en que se separa el fruto del
árbol. Cualquier golpe, roce o lastimadura que se provoque al fruto en el
momento de la cosecha y durante su transporte afectará la calidad de la fruta y
por lo tanto su precio (Revelo, et. al., 2011).
2.1.5.1 Operaciones poscosecha
Los productores de tomate de árbol emplean generalmente solo 4 operaciones
básicas de poscosecha: selección de frutos sanos, clasificación por color,
tamaño y forma, almacenamiento y transporte (Revelo, et. al, 2011).
2.1.5.1.1 Selección
El tomate de árbol es seleccionado durante su recolección. La selección
consiste en separar los productos malos, es decir, aquellos que presenten
defectos que impidan su venta o procesamiento (Pinto y Mozo, 2006). Las
causas más frecuentes para descartar un tomate son el ataque de plagas y
enfermedades o el daño mecánico (figura 3).
10
Figura 3. Daños en tomate de árbol por plagas y daño mecánico (Reinel, et. al,
2008).
2.1.5.1.2 Clasificación
Es la separación de los frutos según propiedades escogidas por el comprador o
consumidor. En el caso del tomate de árbol, se clasifican por color, forma y
tamaño (Pinto y Mozo, 2006). Esta operación se hace en los centros de acopio
de las plantaciones (figura 4).
Figura 4. Centro de acopio de una plantación y la clasificación de tomates de
árbol (Reinel, et. al, 2008).
11
2.1.5.1.3 Almacenamiento
Debido a que el proceso de poscosecha es seguido inmediatamente por la
comercialización, el almacenamiento se lo hace por períodos máximos de 1 a 2
días, en bodegas rústicas cuya temperatura oscila alrededor de 25°C (Revelo
et. al, 2011).
2.1.5.1.4 Transporte
El tomate de árbol es transportado a los centros de comercialización y
distribución en algunos casos en los mismos vehículos de los productores.
También se da el caso en el que los intermediarios recogen los frutos en
camiones de estaca con carpa en lona oscura (Reinel, et. al, 2008).
2.2 ESTRÉS OXIDATIVO
El estrés se identifica como una desviación significativa de las condiciones
óptimas para la vida. Dichas condiciones ocasionan cambios en todos los
niveles funcionales de los organismos. Desde un punto de vista biológico,
según Larcher (1995): “el estrés tiene una connotación más amplia, refiriéndose
a los cambios ambientales que alteran al estado fisiológico de los organismos
vivos”. Dentro de la fisiología vegetal, el término estrés se lo define como
cualquier factor ambiental, biótico ó abiótico, que reduce la tasa de algún
proceso fisiológico por debajo de la tasa máxima que puede alcanzar (Lambers,
12
Stuart-Chapin III y Pons, 1998). Miranda y Castro (2007), establecen que la
duración, severidad y velocidad de un estrés al que se ven sometidas las
plantas, influyen directamente en sus respuestas fisiológicas.
Dadas las condiciones adversas para la planta, independientemente de su
causa, esta tiende a la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno,
conocidas como EROs (ROS, por sus siglas en inglés: Reactive Oxigen
Species) (Inze y Van Montagu, 1995). El estrés oxidativo, según Simontacchi
(2001), es un estado alterado de la homeostasis de óxido-reducción intracelular,
es decir, el balance entre oxidantes y antioxidantes. La susceptibilidad a estrés
oxidativo depende en general de éste balance (Cafaro, 2005).
Dada su gran reactividad y en ausencia de mecanismos que las depuren, las
EROs y otros radicales producen daños en membranas, lípidos, proteínas,
ácidos nucléicos y otros componentes celulares, llevando finalmente a la muerte
celular y a la aparición de lesiones necróticas (Foyer y Noctor, 2005).
2.2.1 RADICALES LIBRES
Se define a un radical libre como una molécula o fragmento molecular que
contiene uno o más electrones desapareados en el orbital más externo. Una
molécula puede convertirse en radical libre tanto por ganancia como por pérdida
de electrones. Al romperse un enlace covalente en forma simétrica, ambos
fragmentos retienen un electrón, y por tanto, se convierten en radical libre. Este
electrón desapareado le confiere al radical libre inestabilidad, tanto energética
como cinética, lo que los hace compuestos altamente reactivos (Cabrera y
Robles, 2010). Para conseguir la estabilidad modifican a moléculas de su
alrededor provocando la aparición de nuevos radicales, por lo que se crea una
13
reacción en cadena que daña a muchas células y puede ser indefinida si los
sistemas antioxidantes no intervienen (FEC, 2008).
2.2.1.1 Especies reactivas de oxígeno (EROs)
Las EROs, son compuestos altamente reactivos, que se producen durante los
procesos de respiración y fotosíntesis bajo condiciones fisiológicas normales,
en mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas de las células vegetales (Gilll y
Tuteja, 2010). Estos compuestos se incrementan cuando la planta está
expuesta a un medio ambiente desfavorable y son eliminados por complejos
sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos (Airaki, 2012).
El oxígeno molecular (O2), se encuentra en su estado basal como triplete; esto
quiere decir que sus dos electrones ligantes poseen spins paralelos (figura 5),
de modo que solo puede reaccionar a velocidades apreciables con compuestos
provistos de electrones paralelos en sus orbitales de valencia, lo cual es
infrecuente (Boveris, 1984). Se conoce a este fenómeno como restricción de
spin e impone barreras cinéticas insalvables para la reacción bivalente con
biomoléculas y favorece los intercambios de un electrón (Carrillo y Valle, 2005).
Se considera al O2 un radical libre, ya que no tiene completamente apareados
sus electrones. Sus dos electrones tienen el mismo número cuántico de spin, es
decir, sus spins son paralelos; de aquí su gran capacidad para reaccionar con la
mayoría de las moléculas que no son radicales (Halliwell, 2006).
Existen numerosos procesos biológicos capaces de provocar reducciones
monoelectrónicas, generando sucesivamente, como se muestra en la figura 5,
superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (OH)-. Por
otra parte, fenómenos de transferencia de energía pueden lograr la inversión de
spin con producción de oxígeno singlete (1O2). Todos estos compuestos, las
14
EROs, son más reactivos que el O2 y en consecuencia, más tóxicos (Fridovich,
1998).
Figura 5. Formación de principales especies reactivas de oxígeno (Miranda y
Castro, 2007).
2.2.1.2 Especies reactivas de nitrógeno (ERNs)
Las especies reactivas de nitrógeno, se forman por la interacción del óxido
nítrico (NO) con otros radicales y con el oxígeno. El óxido nítrico puede existir
como tres especies distintas, ya que puede adoptar estructuras más
energéticas, ganando o perdiendo un electrón. Estas tres especies son el propio
radical (NO), el anión nitroxilo (NO-) y el catión nitrosonio (NO+), las cuales
difieren en sus propiedades y su reactividad (Wojtaszek, 2000). Las ERNs
pueden o no ser radicales libres.
15
Las principales especies reactivas de nitrógeno son las 3 especies de NO, y las
moléculas relacionadas con estas, como el peroxinitrito (ONOO-), el trióxido de
dinitrógeno (N2O3), la 3-nitrotirosina (n-Tyr), el dióxido de nitrógeno (NO2) y el S-
nitrosoglutation (GSNO) (Haillwell, 2006). La formación de estos compuestos se
puede apreciar en la figura 6.
Figura 6. Principales especies reactivas de nitrógeno y su formación (Airaki,
2012).
Los ERNs pueden perjudicar a las células por distintos mecanismos, entre ellos,
la inactivación de distintos complejos en la cadena respiratoria, daño a
proteínas y lípidos e inhibición de la síntesis proteica o de ADN (Airaki, 2012).
El aumento de las ERNs debido a factores a varios tipos de estreses, tanto
bióticos como abióticos, genera un desequilibrio, conocido como estrés
nitrosátivo (Valderrama, et. al., 2008).
16
2.2.2 TIPOS DE ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS RELACIONADOS CON
EL ESTRÉS OXIDATIVO
Existen variadas clasificaciones de los factores de estrés. En general, estos
pueden ser clasificados en físicos, químicos y bióticos, siendo los dos primeros
agrupados bajo el término de ‘estreses abióticos’ (ITESCAM, 2012). Son
múltiples los factores ambientales o abióticos que pueden inducir el estrés en
plantas, como son el déficit hídrico, la salinidad, las temperaturas extremas, la
excesiva o insuficiente radiación luminosa y los factores mecánicos como las
lesiones, que en muchos casos pueden estar asociados a un estrés biótico
(Montoliu, 2010). Todos estos tipos de estrés pueden generar a su vez un
estrés oxidativo en la planta (García, 1998; Carrillo y Valle, 2005; Miranda y
Castro, 2007).
A continuación se describen las condiciones de estrés generadas por factores
abióticos más relevantes, que pueden a su vez generar condiciones de estrés
oxidativo en plantas.
2.2.2.1 Estrés hídrico
El estrés hídrico incluye en realidad dos tipos de estrés contrapuestos: por
déficit o por exceso de agua en el suelo. El déficit hídrico limita la producción
vegetal en el planeta más que ningún otro factor ambiental, y generalmente la
tasa de crecimiento de una comunidad vegetal ó un cultivo es proporcional a la
disponibilidad de agua (Boyer, 1982).
Es bastante frecuente que dos o más factores de estrés coexistan, pudiendo su
interacción ser sinérgica (Nilsen y Orcutt, 1996). El término sequía denota en
muchos casos esta interacción entre baja disponibilidad hídrica, alta
17
temperatura y alta irradiación. La sequía es un concepto meteorológico más que
fisiológico, ya que se refiere a un período en el cual las precipitaciones no
compensan el agua perdida por evapotranspiración (Passioura, 1996).
A causa de su papel esencial en el metabolismo de las plantas, el déficit de
agua afecta rápidamente los procesos que van desde la fotosíntesis hasta la
respiración (Basurto, et. al, 2008). Dentro de los procesos biofísicos más
afectados por la carencia de agua se encuentran la expansión celular y el
crecimiento (Benavides, 2002).
2.2.2.2 Estrés por alta y baja temperatura
Las plantas son organismos poiquilotémicos, es decir cuya temperatura
depende de la del ambiente (Kratsch y Wise 2000). La temperatura tiene una
influencia directa en casi todos los procesos de la planta como la fotosíntesis,
respiración, transpiración, germinación de la semilla, floración y maduración del
fruto (Nilsen y Orcutt, 1996; Benavides, 2002).
De acuerdo a Tambussi (2000), el término ‘bajas temperaturas’ se utiliza para
designar aquellas temperaturas por encima (‘chilling’) o por debajo de 0 ºC
(‘freezing’) que causan algún tipo de daño a las plantas. Uno de los efectos
mejor caracterizados de las bajas temperaturas es la disminución de la fluidez
de las membranas, que si se prolonga en el tiempo, impide a la biomembrana
mantener los gradientes iónicos y el metabolismo comienza a sufrir alteraciones
(Nishida y Murata, 1996).
A menudo se relaciona la exposición a bajas temperaturas con el déficit hídrico
de la planta. Esto podría deberse, según Allen y Ort (2001), a la disminución de
la conductividad hidráulica de las raíces y alteraciones en el grado de control
18
estomático conduciendo a un desbalance entre captación de agua y
transpiración.
Por otra parte, las altas temperaturas pueden dañar la planta rápidamente por la
desnaturalización de las proteínas, ó lentamente por desecación, quemaduras
solares (por abrasión) y el aumento de la tasa respiratoria hasta superar a la
tasa fotosintética, con lo cual la planta agota sus subsistencias de reserva
(Benavides, 2002). Las altas temperaturas en algunos casos también están
ligadas a un déficit de hídrico.
El nivel de afectación de la planta por altas o bajas temperaturas, depende de la
especie. Pero, generalmente, una desviación del rango de temperatura óptimo
para la planta genera una sobreproducción de EROs y puede inducir a la planta
a un estrés oxidativo (García, 1998; Carrillo y Valle, 2005; Miranda y Castro,
2007).
2.2.2.3 Estrés por salinidad
Un hábitat salino se define por la presencia de un contenido normalmente muy
alto de sales solubles (Basurto, et. al, 2008). Durante la temporada de
crecimiento, las sales se acumulan en el dosel de las plantas, después de que
las hojas mueren y caen al suelo para descomponerse. Las sales que contenían
se acumulan en el suelo, y su cantidad porcentual se ve incrementada muy
fuertemente en las áreas desérticas, donde la tasa anual de evaporación del
suelo supera la cantidad de agua proveniente de las precipitaciones
(Benavides, 2002). La acumulación de sales básicas eleva el pH del suelo
(Basurto, et. al, 2008).
El principal efecto fisiológico de la salinidad sobre las plantas es la reducción
del crecimiento. Los sistemas enzimáticos de la glicólisis, ciclo de Krebs y la
19
fotofosforilación son especialmente sensibles a las soluciones salinas, y dan
como resultado una menor disponibilidad de energía y adquisición de nutrientes
(Larcher, 1995).
La reducción del crecimiento también se debe a tres factores: a un efecto
osmótico inducido por la disminución del potencial osmótico del medio, una
toxicidad específica típicamente asociada con la absorción excesiva de iones
Na+ y Cl- y a un desequilibrio nutricional debido a la interferencia de los iones
salinos con los nutrientes esenciales. Muchas veces estos tres efectos se
combinan. Como consecuencia de estos efectos primarios también se produce
un daño oxidativo (Zhu, 2001).
2.2.3.4 Estrés por alta o baja irradiancia
La irradiancia, es la potencia incidente por unidad de superficie, en este caso,
de radiación solar. Las plantas están separadas en 3 grupos: las que están
adaptadas a poca irradiancia llamadas “plantas de sombra”, las que están
adaptadas a alta irradiancia llamadas “plantas de sol” y las que poseen un
amplio rango de adaptación a una cantidad variable de irradiancia (García,
1998). Cada una posee características físicas y fisiológicas adaptadas para la
cantidad de luz que reciben.
Una cantidad irradiancia que sobrepase el nivel de adaptación de las plantas
causa reducción de la actividad fotosintética de la planta. Si la energía que llega
a los centros de reacción, excede la cantidad de energía que puede utilizarse,
se puede generar daños en el aparato fotosintético (Lucinski y Jackowski,
2006).
La flexibilidad del metabolismo celular y su rápida aclimatación a los cambios de
las condiciones ambientales es el paso esencial para evitar el estrés. Las
20
plantas con baja tolerancia a cambios en la irradiancia, alcanzan muy
rápidamente estados de daño agudo y estrés (García, 1998).
2.2.3 LA ALTURA DE CULTIVO (m.s.n.m.) COMO FACTOR ABIÓTICO
CAUSANTE DE ESTRÉS OXIDATIVO
La altura se define como la distancia vertical de un cuerpo hacia una superficie
tomada como referencia. El termino altitud, en geografía, se conoce como la
distancia vertical de un punto en la superficie terrestre hasta el nivel medio del
mar. La altitud, junto con la latitud son los factores abióticos de un ecosistema
que causan cambios térmicos, y consecuentemente cambian los climas y la
distribución de los seres vivos (Manzano, 2009).
La altitud está asociada a varios factores abióticos que pueden influir en el
desarrollo y el comportamiento de los seres vivos. Entre los factores más
importantes que cambian con la altitud están: temperatura, presión atmosférica
(Muñoz, 2003) e incidencia de radiación UV-B (Rubio, et. al., 2002; Rivas, et.al,
2002; Rivas et, al., 2008).
De todos estos factores, el más estudiado es la influencia de la radiación UV-B.
Según el estudio de Rubio y colaboradores (2002) en zonas andinas de Chile,
la radiación UV-B aumenta de forma proporcional con la altura en un estudio
realizado entre altitudes de 850 y 2650 m.s.n.m. en una latitud de 33° Sur. El
resultado del estudio se presenta en la figura 7.
21
Figura 7. Incremento de la radiación UV-B con la altitud en latitud 33°S (Rubio,
et. al., 2002)
Dado que a medida que las latitudes se alejan de la línea equinoccial la
radiación solar debe atravesar una mayor cantidad de atmósfera, es probable
que en el territorio ecuatoriano, específicamente en la provincia de Tungurahua
ubicada entre las latitudes 1°S y 1°30’S la radiación y su tasa de variación con
la altitud sean mayores.
El espectro de radiación UV, abarca longitudes de onda entre 200nm y 400nm.
Este se divide en UV-C (100nm – 280nm), UV-B (280nm – 315nm) y UV-A
(315nm – 400nm). De estas, la UV-A llega con mayor intensidad a la superficie
terrestre, mientras que la UV-B lo hace en cantidad 15 veces menor, y la UV-C
tiene una incidencia casi nula (Casal, 2008). Las plantas se han adaptado a las
distintas incidencias de la radiación UV-B. Por lo general las plantas de altura
más expuestas a la incidencia de esta radiación son pequeñas y poseen
internudos más cortos (Kakani, et. al., 2003).
22
Distintos estudios han relacionado el aumento de radiación UV-B con la
generación de EROs, dando cuenta además de la activación de mecanismos de
defensa similares a los desarrollados en ataque de patógenos, lo que sugiere
que la radiación UV-B activaría procesos de lipoperoxidación en la membrana
plasmática (Foyer, et. al., 1994; Izaguirre, et. al., 2003).
Las investigación de Casati y Walbot (2003) en plantas de maíz expuestas a
radiación UV-B, revelaron el aumento de la expresión de genes de proteínas
antioxidantes como la ascorbato peroxidasa. La radiación UV-B provoca una
explosión oxidativa a nivel celular e induce cambios significativos en un grupo
importante de proteínas como lo son las enzimas antioxidantes superóxido
dismutasa, catalasa, peroxidasa, glutatión reductasa y ascorbato peroxidasa,
además de las moléculas antioxidantes como el glutatión, ascorbato, α-tocoferol
y carotenoides, lo que demuestra la participación de especies reactivas de
oxígeno (EROs) en la respuesta a UV-B (Rao, Paliyath y Ormrod, 1996).
Las EROs por efecto de la radiación UV-B actuarían no tan solo como radicales
destructivos a nivel celular sino también como señales moleculares esenciales
para gatillar modificaciones en la expresión de genes y así contrarrestar el
efecto de la radiación UV-B sobre las plantas. Las ERNs también estarían
implicadas en la activación de genes involucrados en la respuesta a UV-B (A-H-
Mackerness, et.al., 2001).
2.3 SISTEMAS ANTIOXIDANTES
Las plantas han desarrollado estrategias para eliminar el exceso de EROs.
Estos mecanismos celulares son diversos, y tienen complejas relaciones entre
ellos, dependiendo de los compartimentos celulares en los que se encuentran.
23
Existen mecanismos de protección enzimáticos y no enzimáticos que atrapan e
inactivan eficientemente las EROs (Miranda y Castro, 2007). El principal
objetivo de estos mecanismos es disminuir el riesgo de estrés oxidativo,
manteniendo el estado redox a nivel celular en niveles estables (Loscos, 2007).
2.3.1 ANTIOXIDANTES NO ENZIMÁTICOS
Los antioxidantes no enzimáticos son también conocidos como antioxidantes
estequiométricos por su capacidad de neutralizar de forma equimolar un radical
libre por molécula (Halliwell y Gutteridge, 2007). La función química de los
antioxidantes es ceder potencial reductor a los compuestos oxidantes capaces
de dañar a los componentes celulares. Los productos finales de esta reacción
de disipación energética antioxidante-oxidante son comúnmente el O2 y el H2O,
acompañados de liberación de calor (Miranda y Castro, 2007).
Existen varias sustancias de las que se describe actividad antioxidante y que
están presentes en los tejidos vegetales. Sin embargo, en muchos casos, en los
tejidos muchas veces no se encuentran en las concentraciones necesarias para
manifestar esta capacidad (Airaki, 2012). Es por eso que se dice que los
compuestos antioxidantes actúan normalmente a concentraciones altas
(Halliwell y Gutteridge, 2007). Los compuestos antioxidantes son generalmente
de baja masa molecular y pueden ser de naturaleza liposoluble (como
carotenoides, flavonoies, poliaminas, entre otros) e hidrosoluble (como
ascorbato y glutatión) (Loscos, 2007).
24
2.3.2 ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS
Los sistemas antioxidantes enzimáticos constituyen un grupo variado de
enzimas con la propiedad común de ser capaces de eliminar, suprimir o
neutralizar a los radicales libres y a las especies activas de oxigeno (De Paula,
1994; Loscos, 2007). Las principales enzimas que componen este sistema son
las superóxido dismutasas (SOD), catalasas (CAT) y las enzimas del ciclo
ascorbato-glutation (ASC-GSH) (Loscos, 2007; Montoliu, 2010).
2.3.2.1 Peroxidasa (POX)
La peroxidasa (E.C., 1.11.1.7, POX) es una hemoproteína monomérica que
cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos donadores (fenoles,
aminas aromáticas e hidroquinonas) utilizando el peróxido de hidrógeno (H2O2)
como cofactor, y consecuentemente, reduciéndolo a H2O (Wellinder, 1991;
Hernández, 2006). Su mecanismo de acción se ilustra en la figura 8, donde A
es un agente reductor ó donador.
Figura 8. Reacción catalizada por peroxidasa (Welinder, 1991).
Para el caso puntual de la guayacol peroxidasa, la reacción de oxido-reducción
con el guayacol y el peróxido de hidrógeno se muestra en la figura 9.
25
Figura 9. Reacción catalizada por POX, donde se oxida el guayacol a
tetrahidroguayacol (Rodríguez, et. al., 2001).
Las peroxidasas en la célula vegetal se ubican en los peroxisomas,
cloroplastos, vacuolas y pared celular (Narváez, 2002). Su característica de
oxidar compuestos fenólicos, la relaciona con el grupo de enzimas
responsables del pardeamiento, pero la característica de reducir el H2O2 a H2O
es lo que la ubica dentro del sistema enzimático antioxidante (Miranda, 2003).
Un incremento en la actividad y/o expresión de isoenzimas de peroxidasas es
característico de la defensa de las plantas ante condiciones de estrés biótico u
abiótico (Hernández, 2006). La POX también participa en varios procesos
celulares como el desarrollo y organogénesis de la planta y la senescencia
(Gechev, et. al, 2003).
2.3.2.2 Ascorbato peroxidasa (APX)
La ascorbato peroxidasa (E.C., 1.11.1.11; APX) es una enzima hemínica y que
requiere la presencia de ascorbato en cantidades considerables para su
estabilidad y funcionalidad (Montoliu, 2010). Esta enzima reduce el H2O2 a H2O
26
utilizando ascorbato como agente reductor, el cual después de la reacción se
oxida a monodehidroascorbato (MDA), como se observa en la figura 10. La APX
se encuentra ligada al ciclo del ascorbato-glutatión ó ciclo de Halliwell-Asada,
donde lleva a cabo la primera reacción (De Paula, 1994; Naya; 2007; Miranda y
Castro, 2007; Montoliu, 2010; Airaki, 2012).
Figura 10. Reacción catalizada por ascorbato peroxidasa (Airaki, 2012).
El ciclo Ascorbato-Glutatión (ASC-GSH) es un sistema antioxidante exclusivo
de las plantas muy importante para la eliminación de H2O2, especialmente en
los compartimentos celulares donde se produce este metabolito y no existe
catalasa, como en los cloroplastos y el citosol (Halliwell y Gutteridge, 2007). La
principal enzima de este sistema, y la más abundante es la ascorbato
peroxidasa (Naya, 2007). Una vez reducido el ascorbato a
monodehidroascorbato (MDA), como se muestra en la figura 14, este es
reducido por la enzima Monodehidroascorbato reductasa (MR) de nuevo a
ascorbato, requiriendo de NADH. Dos moléculas de MDA pueden
desproporcionarse convirtiéndose en ASC y Dehidroascorbato (DHA). El DHA
se regenera a ASC con la enzima Dehidroascorbato reductasa, que usa
glutatión (GSH) como reductor. El ciclo se completa con la reducción del
glutatión oxidado (GSSG) por la enzima Glutation reductasa (GR) utilizando
NADPH (Carrillo y Valle, 2005; Naya, 2007; Miranda y Castro, 2007; Airaki,
2012). El ciclo ASC-GSH completo se puede apreciar en el esquema de la
figura 11.
27
Figura 11. Ciclo del Ascorbato-Glutatión ó ciclo de Halliwell-Asada (Naya,
2007).
La ascorbato peroxidasa, a diferencia de la catalasa, tiene una gran afinidad por
el sustrato (H2O2), por lo que puede actuar a concentraciones muy bajas del
mismo (Shigeoka, et. al., 2002). Se ha descrito ampliamente que la expresión
de APX se incrementa bajo condiciones de sobreproducción de H2O2 como las
inducidas por diversos tipos de estrés, tanto bióticos como abióticos (Dat, et. al.,
2000).
2.3.2.3 Catalasa (CAT)
La catalasa (E.C., 1.11.1.6; CAT) es una enzima tetramérica, antioxidante que
contiene un grupo hemo, y se encuentra en todos los organismos aeróbicos
(Martínez, 2003). Las catalasas tienen una función clave en la protección de las
células contra el estrés oxidativo por la dismutación del H2O2 a O2 y H2O sin
necesidad de poder reductor. Su mecanismo de acción simplificado, se puede
observar en la figura 12. Esta ventaja energética frente a las peroxidasas es
contrarrestada por la baja afinidad de la enzima por el sustrato, por tanto, la
catalasa es activa tan sólo a altas concentraciones de H2O2 (Naya, 2007).
28
Figura 12. Reacción catalizada por catalasa (Marín y Roustan, 2000).
La catalasa actúa fundamentalmente sobre el peróxido de hidrógeno producido
en la β-oxidación de los ácidos grasos (glioxisomas) y en la fotorrespiración
(peroxisomas), que es donde se concentran altas cantidades de H2O2 (De
Paula, 1994; Kuk, et. al., 2003; Vuleta, et. al., 2010). La función de CAT sería la
de eliminar todo el exceso de H2O2 en situaciones de estrés oxidativo (Mittler,
2002), antes de que éste se difunda al citoplasma y pueda reaccionar con las
biomoléculas (Montoliu, 2010).
La catalasa puede presentar dos actividades: catalítica y peroxidativa, con
características cinéticas completamente distintas (Elstner, 1987). Ambas
actividades requieren la formación de un compuesto intermedio (Compuesto I)
entre la enzima y una molécula de peróxido de hidrógeno (figura 13), unidos a
través del hierro del grupo hemo, que pasa a tener estado de oxidación +5.
29
Figura 13. Actuación de la enzima catalasa. Acción catalítica y acción oxidativa
(De Paula, 1994).
El Compuesto I puede reaccionar con otra molécula de H2O2 (actividad
catalítica) liberando oxígeno molecular y agua o bien puede formar el
Compuesto II, inactivo. Así mismo, el Compuesto I puede actuar sobre otros
compuestos donadores de electrones (actividad peroxidativa) formando los
respectivos productos de oxidación (De Paula, 1994; Marín y Roustan, 2000;
Halliwell y Gutteridge, 2007).
La expresión de la enzima está regulada durante el desarrollo de la planta, pero
también responde a diversas señales ambientales como el exceso de luz y las
temperaturas extremas, ya que generalmente la enzima se inhibe tanto a
temperaturas bajas como ante un shock térmico (Dat, et. al., 2000).
30
2.3.2.4 Superóxido dismutasa (SOD)
La enzima superóxido dismutasa (E.C., 1.15.1.1; SOD) es una metaloproteína
que cataliza la dismutación del radical superóxido (O2-) para formar oxígeno
molecular (O2) y peróxido de hidrógeno (H2O2) (De Paula, 1994; Martínez, 2003;
Airaki, 2012), según la reacción en la figura 14. Las SOD son la primera
defensa contra los efectos tóxicos del radical superóxido producido en los
diferentes compartimientos celulares (Halliwell y Gutteridge, 2007).
Figura 14. Reacción catalizada por superóxido dismutasa (Airaki, 2012).
Se conocen tres familias principales de SOD que difieren en el metal
constituyente del grupo prostético: cobre/zinc (Cu/Zn-SOD), manganeso (Mn-
SOD) o hierro (Fe-SOD) (Martínez, 2003).
2.3.2.4.1 Cu/Zn-SOD
Las Cu/Zn-SODs son proteínas diméricas que presentan un átomo de Cu y otro
de Zn en cada subunidad. Esta enzima es la más abundante de las SODs en
plantas superiores, y se localiza en el citosol, cloroplasto y peroxisomas (Arines,
et. al., 1994; Del Rio, et. al., 2002).
31
Se ha descrito que las Cu/Zn-SODs catalizan la descomposición de S-
nitrosotioles de bajo pero molecular, generando óxido nítrico (Johnson, et. al.,
2001). Según Fridovich (1986), estas enzimas son inhibidas irreversiblemente
por la presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) y reversiblemente por la
presencia de cianuros (CN-).
2.3.2.4.2 Mn-SOD
Las Mn-SODs de plantas son proteínas homotetraméricas y se encuentran en
las mitocondrias y peroxisomas (Halliwell y Gutteridge, 2007). La actividad de la
Mn-SOD no es inhibida por la presencia de cianuros (CN-) ni de peróxido de
hidrógeno (H2O2) (Fridovich, 1986).
2.3.2.4.3 Fe-SOD
Las Fe-SODs son proteínas homodiméricas y se encuentran principalmente en
cloroplastos y Peroxisomas (Asada, 1994). Según fridovich (1986), la actividad
de la Fe-SOD no es inhibida por la presencia de cianuros (CN-), pero si por la
presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2).
32
3. METODOLOGÍA
3.1 MATERIAL VEGETAL
El material vegetal fue recolectado en la provincia de Tungurahua, en las
localidades de Pelileo (2660 m.s.n.m.) y Chiquicha (2440 m.s.n.m). Se
cosecharon tomates de árbol variedad “Mora”, con una madurez del 50% y del
75%. Además se recolectaron hojas de la planta, considerando que no se
encontraran en estado de senescencia, que no fueran nuevas y estuviesen
libres de defectos.
3.1.1 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El material vegetal fue trasladado al laboratorio el día de cosecha a °T ambiente
en canastas de plástico. Las hojas fueron cortadas en tiras, congeladas en
nitrógeno líquido (figura 15), trituradas en un mortero hasta obtener partículas
finas y almacenadas en frascos de polipropileno a -20°C.
33
Figura 15. Congelación de las hojas con nitrógeno líquido (a) y trituración en
mortero (b).
Los frutos fueron limpiados y clasificados según su estado de madurez en 2
grupos: inmaduros y maduros. El 50% de los frutos maduros, fue almacenado a
temperatura ambiente en bandejas plásticas durante 17 días para la
sobremaduración.
Los frutos fueron pelados y cortados en 4 cuartos y, de cada uno, se separó el
endocarpio con una cuchara (figura 16). Las muestras fueron conservadas en
congelación a -20°C para su posterior análisis enzimático.
Figura 16. Separación del endocarpio del tomate de árbol.
34
3.2 MEDIDA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
3.2.1 PEROXIDASA (POX)
3.2.1.1 Preparación del extracto enzimático
Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.
Aproximadamente, 5g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se
homogenizaron en 15mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH
6) conteniendo Tritón X-100 0,1%. La suspensión resultante fue sometida a
agitación durante 30 min y luego se centrifugó a 6000 rpm durante 30 min. Se
separó el sobrenadante y se lo distribuyó en alícuotas de 1,5mL. Las alícuotas
fueron almacenadas en congelación a -20°C hasta su análisis.
3.2.1.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción
Se obtuvo extractos enzimáticos de tejidos del mesocarpio y endocarpio de
tomate de árbol, por separado.
Para la determinación de condiciones óptimas de reacción del extracto
enzimático del endocarpio, se mantuvo un volumen constante de 500μL de
guayacol 0,25% (v/v) (0,0625% (v/v) en la mezcla de reacción), se varió la
cantidad de extracto entre 50μL y 350μL y la cantidad de H2O2 25mM entre
50μL y 140μL (entre 6,25μM y 17,5μM en la mezcla de reacción). El volumen
final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4
0,1M pH 6).
35
En el caso del extracto enzimático del mesocarpio, se varió la cantidad de
guayacol 0,25% (v/v) entre 100μL y 300μL (entre 0,0125% y 0,0375% (v/v) en la
mezcla de reacción), el extracto entre 100μL y 350μL y la cantidad de H2O2
25mM entre 50μL y 140μL (entre 6,25μM y 17,5μM en la mezcla de reacción).
El volumen final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y
KH2PO4 0,1M pH 6).
3.2.1.3 Medida de actividad de peroxidasa
La actividad POX fue estimada por la medida del incremento de la absorbancia
por formación del producto de dehidrogenación del guayacol a 470nm, durante
120s, según el método de Flurkey & Je (1978), con ligeras modificaciones en
las concentraciones de los componentes de la reacción.
Para medir la actividad de peroxidasa en el endocarpio, la mezcla de reacción
contenía 250μL de extracto enzimático, 0,0625% (v/v) de guayacol, H2O2 15μM
y buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 6) para completar un volumen final de
2mL. En la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla de reacción
contenía, 300μL de extracto enzimático, 0,025% (v/v) de guayacol, H2O2 15μM
y buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 6) para completar un volumen final de
2mL.
Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo
Scientific en una celda de vidrio de 10mm. Una unidad de actividad de POX fue
definida como el cambio de absorbancia por minuto (ΔA/min).
36
3.2.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX)
3.2.2.1 Preparación del extracto enzimático
Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.
Aproximadamente 4 g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se
homogenizaron en 20mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH
7) que contenía EDTA 0,1mM y ascorbato de sodio 2,5mM. La suspensión
resultante se sometió a agitación durante 30 min y luego se centrifugó a 6000
rpm durante 30 min. Se separó el sobrenadante y se lo distribuyó en alícuotas
de 1,5mL. Las alícuotas fueron almacenadas en congelación a -20°C hasta su
análisis.
3.2.2.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción
Se realizaron extractos enzimáticos de tejidos del mesocarpio y endocarpio de
tomate de árbol, por separado.
Para la determinación de condiciones óptimas de reacción del extracto
enzimático del endocarpio, se varió la cantidad de ascorbato de sodio 0,25 mM
entre 300μL y 600μL (entre 37,5μM y 75μM en la mezcla de reacción), la
cantidad de extracto entre 250μL y 500μL y la cantidad de H2O2 0,1M entre
450μL y 950μL (entre 22,5mM y 47,5mM en la mezcla de reacción). El volumen
final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4
0,1M pH 7).
En el caso del extracto enzimático del mesocarpio, se ensayaron 2 volúmenes
constantes de ascorbato de sodio 0,25mM (100μL y 500μL) (12,5μM y 62,5μM
37
en la mezcla de reacción). Se varió la cantidad de extracto entre 250μL y 600μL
y la cantidad de H2O2 0,1M entre 100μL y 450μL (5mM y 22,5mM en la mezcla
de reacción). El volumen final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer
(Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7).
3.2.2.3 Medida de actividad de ascorbato peroxidasa
La actividad de la enzima APX fue determinada según el método de Nakano &
Asada (1987) con ligeras modificaciones en las concentraciones de los
componentes de la reacción. Se cuantificó la variación en la absorbancia
medida a 290nm durante 120s, manifestada por la cantidad de ascorbato de
sodio que es oxidado por la enzima en presencia de H2O2.
Para medir la actividad de APX en el endocarpio, la mezcla de reacción
contenía 62,5μM de ascorbato de sodio, 450µL de extracto enzimático, 42,5mM
de H2O2 y buffer fosfato (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7) para completar un
volumen final de 2mL. En la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla
de reacción contenía 62,5μM de ascorbato de sodio 600µL de extracto
enzimático, 5mM de H2O2 y buffer fosfato (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7) para
completar un volumen final de 2mL.
Se realizaron dos controles de reacción: sin extracto (para considerar la
posibilidad de oxidación química debida a otros componentes de la mezcla de
reacción) y sin H2O2 (para considerar la oxidación del ascorbato dependiente
del extracto). La actividad de APX se corrigió por la substracción de la oxidación
del ácido ascórbico dependiente del H2O2 (Andrade, 2008).
Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo
Scientific en una celda de cuarzo de 10mm. Una unidad de actividad de APX
fue definida como el cambio de absorbancia por minuto (ΔA/min).
38
3.2.3 CATALASA (CAT)
3.2.3.1 Preparación del extracto enzimático
Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.
Aproximadamente 5g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se
homogenizaron en 15mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH
7). La suspensión resultante se sometió a agitación durante 30 min y luego se
centrifugó a 6000 rpm durante 30 min. Se separó el sobrenadante y se lo
distribuyó en alícuotas de 1,5mL. Las alícuotas fueron almacenadas en
congelación a -20°C hasta su análisis.
3.2.3.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción
Se realizaron extractos enzimáticos de tejidos del mesocarpio y endocarpio de
tomate de árbol, por separado.
Para la determinación de condiciones óptimas de reacción del extracto
enzimático del endocarpio, se varió la cantidad de extracto entre 50μL y 250μL
y la cantidad de H2O2 1M entre 20μL y 100μL (entre 10mM y 50mM en la
mezcla de reacción). El volumen final de reacción se completó hasta 2000μL
con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 7,75).
En el caso del extracto enzimático del mesocarpio, se varió la cantidad de
extracto entre 50μL y 400μL y la cantidad de H2O2 1M entre 40μL y 120μL
(entre 20mM y 60mM en la mezcla de reacción). El volumen final de reacción se
completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 7,75).
39
3.2.3.3 Medida de actividad de catalasa
La actividad de la enzima CAT se determinó según el método de Aebi (1984)
con ligeras modificaciones en las concentraciones de los componentes de la
reacción. Se cuantificó la variación de la absorbancia medida a 240nm durante
240s, debida a la degradación enzimática del H2O2.
Para medir la actividad de catalasa en el endocarpio, la mezcla de reacción
contenía 200µL de extracto enzimático, 30mM de H2O2 y buffer fosfato
(Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 7,75) para completar un volumen final de 2mL.
En la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla de reacción contenía,
300µL de extracto enzimático, 50mM de H2O2 y buffer fosfato (Na2HPO4 y
KH2PO4 0,05M pH 7,75) para completar un volumen final de 2mL.
Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo
Scientific en una celda de cuarzo de 10mm. Una unidad de actividad de CAT
fue definida como el cambio de absorbancia por minuto (ΔA/min).
3.2.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)
3.2.4.1 Preparación del extracto enzimático
Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.
Aproximadamente 4 g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se
homogenizaron en 20mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH
7) que contenía EDTA 0,1 mM. La suspensión resultante se sometió a agitación
durante 30 min y luego se centrifugó a 6000 rpm durante 30 min. Se separó el
40
sobrenadante y se lo distribuyó en alícuotas de 1,5mL. Las alícuotas fueron
almacenadas en congelación a -20°C hasta su análisis.
3.2.4.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción
Para la obtención de valores de absorbancia dentro del rango más sensible del
equipo, se ajustó una serie de condiciones que influyen en el desarrollo de la
reacción.
El volumen de riboflavina 0,029mM se varió entre 500μL y 1000μL (entre
4,83µM y 9,67µM en la mezcla de reacción), el tiempo de incubación entre 5min
y 18min, el volumen de metionina 13mM entre 50μL y 300μL (entre 0,216mM y
1,3mM en la mezcla de reacción) y la intensidad lumínica entre 30W y 120W. El
volumen final de reacción se completó hasta 3000μL con buffer (Na2HPO4 y
KH2PO4 0,1M pH 7,8). No se realizó un ensayo de variación de NBT, ya que no
tiene influencia significativa en la absorbancia de la mezcla de reacción
después de incubarse (Andrade, 2008).
Para elegir la cantidad de extracto a usar en la reacción, se ensayó por
separado usando extractos del endocarpio y mesocarpio. Para ambos casos el
volumen de extracto en la reacción se varió entre 25μL y 450μL, para
seleccionar la cantidad donde la mezcla de reacción diera una disminución de la
absorbancia aproximadamente del 50% que una reacción sin extracto.
3.2.4.3 Medida de actividad de superóxido dismutasa
La actividad de SOD fue determinada según la técnica de Giannopolitis & Ries
(1977), con ligeras modificaciones en las concentraciones de los componentes
41
de la reacción. Para medir la actividad de SOD en el endocarpio, la mezcla de
reacción contenía 0,86mM de metionina, 5µM de nitroblue tetrazolium (NBT),
5,8µM de riboflavina, 6,66µM de EDTA, 50µL de extracto enzimático y buffer
(Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7,8) para completar un volumen total de 3mL. En
la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla de reacción contenía
0,86mM de metionina, 5µM de nitroblue tetrazolium (NBT), 5,8µM de riboflavina,
6,66µM de EDTA y 150µL de extracto enzimático y buffer (Na2HPO4 y KH2PO4
0,1M pH 7,8) para completar un volumen total de 3mL.
La mezcla de reacción fue preparada en vasos de precipitación de 10mL, para
asegurar una exposición homogénea a la luz. Una vez homogenizadas, las
mezclas de reacción se colocaron bajo 4 lámparas fluorescentes de 30W, a una
distancia de 25cm, a temperatura ambiente por 18min. La reacción
empieza/termina con el encendido/apagado de las lámparas, respectivamente.
Una mezcla de reacción irradiada, sin extracto enzimático se utilizó como
control. Una mezcla completa de reacción no irradiada fue usada como blanco.
Finalmente, la absorbancia de la mezcla de reacción fue medida a 560nm.
Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo
Scientific en una celda de vidrio de 10mm. Una unidad de actividad de SOD se
definió como la cantidad de enzima que, bajo las condiciones de ensayo, causa
un 50% de inhibición de la reacción (o absorbancia) observada en ausencia de
enzima.
3.2.5 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA
La cantidad de proteína en cada extracto fue determinada por el método de
Lowry (1951). El método se inicia con la reacción de Biuret, en medio alcalino y
42
en presencia de tartrato para evitar la precipitación, donde los iones de Cu2+
forman un complejo con el nitrógeno proteico. Después, los complejos proteína-
Cu2+ reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau, el cual es reducido por la
presencia de grupos fenólicos de las proteínas, dando una coloración azul
oscura (Rodríguez, 2005). La absorbancia máxima de este compuesto fue
establecida en 650nm, por medio de un barrido del compuesto en el
espectrofotómetro.
Se cuantificó la proteína de todos los extractos enzimáticos. La mezcla de
reacción contenía 40μL de extracto para el caso de los pertenecientes al
endocarpio, y 150μL de extracto para los pertenecientes al mesocarpio, 1000μL
del reactivo de Lowry (98% v/v de carbonato sódico 2% en Na(OH) 0,1M + 1%
v/v de sulfato cúprico 1% + 1% v/v de tartrato sódico 2%) y 100μL de Folin-
Ciocalteau (diluido 1:5 en agua destilada). El volumen final de las mezclas fue
completado hasta 1300μL con agua destilada.
Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo
Scientific en una celda de plástico de 10mm. Se usó albúmina sérica bovina
(BSA) como proteína patrón (2mg/mL), se ensayó la reacción con volúmenes
entre 20μL y 100μL, por triplicado, para obtener una curva de calibración.
3.2.6 ANALISIS ESTADÍSTICO
Se trató por separado los análisis estadísticos de cada parte del fruto
(endocarpio y mesocarpio). Se aplicó a cada uno un diseño multifactorial AxB,
donde el primer factor fue la altura de cultivo y el segundo fue el estado de
madurez del fruto. Se realizó un análisis de varianza. Las medidas fueron
43
comparadas mediante test de Tukey con una significancia de 0,05 utilizando el
software STATGRAPHICS Centurion.
3.3 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN
HOJAS
La determinación del porcentaje de peróxido de hidrógeno (% H2O2) en las
hojas del tomate de árbol, se realizó mediante una titulación
permanganométrica del extracto de tejido congelado.
3.3.1 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO
El extracto se preparó según el método de Jana y Choundri (1981), con ligeras
modificaciones. Se pesó en la balanza analítica aproximadamente 2,5g de tejido
congelado y triturado de hojas de tomate de árbol en un tubo Falcon. Se añadió
25mL de buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 6,8) como solución extractora.
Se homogenizó, y se centrifugó a 4°C por 20min.
44
3.3.2 TITULACIÓN Y CÁLCULO DE LA CANTIDAD DE PERÓXIDO DE
HIDRÓGENO
Para la titulación permanganométrica, se vertió 20mL del sobrenadante del
extracto en un matraz erlenmeyer, se añadió 8mL de una solución de H2SO4
12,5% (v/v) y se tituló con KMnO4 0,1N hasta que la solución titulada adquiriera
una coloración rosa intensa (al menos 10 segundos de permanencia).
Para el cálculo del % H2O2 (p/p) se utilizó la ecuación 1.
[1]
Donde:
V1 = Mililitros de KMnO4 0,1N consumidos en la valoración
N = 0,1
Eq = Peso Equivalente del H2O2 = 17
V0 = Volumen al que se diluyó la muestra = 25mL
V = Volumen utilizado para la valoración = 20mL
a = Gramos de muestra pesados para el extracto
45
3.3.3 ANALISIS ESTADÍSTICO
Se aplicó un diseño unifactorial, donde el factor estudiado fue la altura de
cultivo. Los resultados se procesaron mediante un análisis de varianza. Las
medidas comparadas por el test de Tukey con una significancia de 0,05
utilizando el software STATGRAPHICS Centurion.
46
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
4.1 ACTIVIDAD DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES
4.1.1 PEROXIDASA (POX)
4.1.1.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción
Se ensayó la reacción de peroxidasa con distintas concentraciones de extracto,
se seleccionó la cantidad de 250μL de extracto enzimático del endocarpio
(figura 17a) del fruto y 300 uL para el mesocarpio (figura 17b), ya que a partir de
este volumen se encontró la actividad máxima de la enzima, es decir que ésta
se encontraba saturada. La diferencia de volúmenes utilizados en la mezcla de
reacción sugeriría que el endocarpio del tomate de árbol presenta mayor
actividad enzimática que el mesocarpio.
47
Figura 17. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio (A) y
mesocarpio (B) de tomate de árbol en la mezcla de reacción de POX.
Una vez fijada la concentración de la enzima se realizó la variación del sustrato
de la enzima (H2O2) en la reacción (figura 18). Se seleccionó la concentración
correspondiente a la saturación de la enzima, de 15μM de H2O2 tanto para los
extractos de mesocarpio y endocarpio del fruto.
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
50 150 250 350 Δ
Ab
s /
min
Extracto (µL)
0,7
0,9
1,1
1,3
1,5
1,7
1,9
2,1
50 150 250 350
Δ A
bs
/ m
in
Extracto (µL)
A
B
48
Figura 18. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla de
reacción de POX con extracto enzimático del endocarpio (A) y mesocarpio (B)
de tomate de árbol.
Se realizó también una variación de la concentración de guayacol (figura 19) y
se seleccionó aquella correspondiente al punto de saturación de la enzima, que
fue de 0,025% (v/v), utilizado para posteriores medidas.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
5 10 15 20 Δ
Ab
s /
min
H2O2 (µM)
2
2,2
2,4
2,6
2,8
3
3,2
3,4
3,6
5 10 15 20
Δ A
bs
/ m
in
H2O2 (µM)
B
A
49
Figura 19. Ensayo de variación de la concentración de guayacol en la reacción
con extracto enzimático del mesocarpio de tomate de árbol en reacción de
POX.
4.1.1.2 Medida de actividad enzimática de POX
Los resultados de la medida de la actividad de POX para el endocarpio del fruto
mostraron diferencia significativa entre las dos localidades para los frutos
inmaduros y los sobremaduros, como se aprecia en la figura 20a. En el
mesocarpio de los frutos la actividad de la enzima tuvo valores promedio 10,2
veces mayores a los medidos en el endocarpio. Se encontró diferencia
significativa entre las dos localidades, para los frutos inmaduros y los maduros,
(figura 20b). En las dos partes del fruto y en todos los estados de madurez, los
valores de actividad de la enzima para la localidad de Chiquicha (2440
m.s.n.m.) fueron superiores a los de Pelileo (2660 m.s.n.m.), lo que podría
relacionarse con la menor altura del cultivo y por lo tanto menor incidencia de
radiación UV-B. Considerando éste último factor, Alexieva y col. (2001),
obtuvieron un resultado similar en plantas de trigo, donde la actividad de POX
disminuía después de una exposición a mayor radiación UV-B a diferencia del
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1,05
1,1
1,15
0,01 0,02 0,03 0,04 Δ
Ab
s /
min
% Guayacol (v/v)
50
resultado que obtuvieron en plantas de guisante, en las que la actividad
enzimática de POX se incrementó por la mayor incidencia de radiación UV-B.
51
Figura 20. Actividad de la enzima peroxidasa (POX) en el endocarpio (A) y
mesocarpio (B) del tomate de árbol.
Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos
localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor
es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma
localidad con una p<0,05 Tukey=0,164 para (A) y una p<0,05 Tukey=1,287 para (B).
b A a A
b A
a A
a A
a A
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Inmaduro Maduro Sobremaduro
UA
E /
mg
pro
teín
a
Estado de Madurez
Pelileo
Chiquicha
b A b A a A
a A
a B a AB
0
1
2
3
4
5
6
Inmaduro Maduro Sobremaduro
UA
E /
mg
Pro
teín
a
Estado de Madurez
Pelileo
Chiquicha
B
A
52
La actividad de esta enzima en el endocarpio de los frutos de Pelileo se
mantuvo prácticamente constante durante la maduración, mientras que en los
frutos de Chiquicha, la actividad disminuyó en un 32% en los frutos maduros
con respecto a los inmaduros (aunque no se encontró diferencia significativa),
para luego aumentar ligeramente en los sobremaduros, como se muestra en la
figura 20a. Este aumento de actividad enzimática podría deberse por un lado, a
la concentración de la enzima por deshidratación de los frutos o bien al
aumento de la actividad de la enzima en frutos senescentes según sugieren los
resultados obtenidos por Quian y col. (2012) en pepino chino y por Baquero y
col. (2005) en pitaya amarilla sobremadurada por 15 días.
En el mesocarpio de los frutos de la localidad de Pelileo se mantuvo constante
en los tres estados de madurez, mientras que en los frutos cultivados en la
localidad de Chiquicha, se produjo una disminución de la actividad de la enzima
en un 19% de los frutos maduros con respecto a los inmaduros (se encontró
diferencia significativa entre las muestras), y se observó un ligero incremento en
frutos sobremaduros (figura 20b).
Tanto en el endocarpio como en el mesocarpio de los frutos de las dos
localidades se pudo observar una disminución de la actividad de POX durante
la maduración. Resultados similares fueron reportados por Mondal y col. (2004)
en 2 variedades de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), donde la actividad
enzimática disminuye a medida que el fruto se desarrolla en la planta, debido al
incremento progresivo del estrés oxidativo durante la madurez.
53
4.1.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX)
4.1.2.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción
Se realizó la reacción de ascorbato peroxidasa con distintas concentraciones de
enzima (figura 21), se seleccionó la cantidad de 500μL de extracto enzimático
del endocarpio del fruto, concentración utilizada en ensayos posteriores.
Figura 21. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio de
tomate de árbol en reacción de APX.
Una vez fijada la concentración de la enzima se realizó la variación de
concentración de H2O2 en la reacción (figura 22). Se seleccionó la
concentración de 42,5mM de H2O2 en la mezcla de reacción.
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
200 300 400 500
|Δ A
bs|
/ m
in
Extracto (µL)
54
Figura 22. Ensayo de variación de concentración de H2O2 realizado con
extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de APX.
Así mismo, se varió la concentración de ascorbato de sodio (Asc-Na) en la
mezcla de reacción (figura 23). La concentración de Asc-Na se fijó en 62,5μM.
Figura 23. Ensayo de variación de concentración de Asc-Na realizado con
extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de APX.
2,5
3
3,5
4
4,5
5
20 30 40 50 1
/|Δ
Ab
s|/
min
H2O2 (mM)
3,2
3,4
3,6
3,8
4
4,2
4,4
45 55 65 75 85
1 /
|Δ
Ab
s| /
min
Asc-Na (μM)
55
Las medidas cinéticas efectuadas a la mezcla de reacción que contenía
extractos de mesocarpio, mostraban un incremento en la absorbancia a lo largo
del tiempo, contrario a la disminución de la absorbancia esperada por la acción
de la enzima por el consumo del sustrato, por lo que se consideró que el
mesocarpio no presentaba actividad enzimática de APX. La APX es una enzima
que utiliza el ácido ascórbico (AsA) como intermediario de sus reacciones;
probablemente la concentración de AsA en el mesocarpio, 4,5 veces menor a la
del endocarpio (Gordon, et. al., 2007), esté relacionada con la prácticamente
nula (o pudiéndose considerar no detectable por el método analítico utilizado)
actividad de APX en el mesocarpio del fruto.
4.1.2.2 Medida de actividad enzimática de APX
En el endocarpio de los frutos, la actividad de APX mostró diferencias
significativas entre las dos localidades para los frutos inmaduros y los maduros,
siendo la localidad de Chiquicha la que presentó valores de actividad
enzimática 40% y 15% mayores respectivamente (figura 24). Ren y col. (2007),
Hassan y col. (2012) y Golbaz y col. (2012) reportaron un resultado contrario en
hojas de dos diferentes especies de álamos en China, en guisantes y en brotes
de girasol respectivamente, donde la actividad de la enzima aumentaba con la
altura del cultivo.
56
Figura 24. Actividad de la enzima ascorbato peroxidasa (APX) en el endocarpio
del tomate de árbol.
Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos
localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor
es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma
localidad con un HSD=0,064.
La actividad de APX en el endocarpio de frutos de Pelileo permaneció
prácticamente constante durante la maduración, sin embargo mostró una
disminución en los frutos sobremaduros, existiendo diferencia significativa. Los
frutos de la localidad de Chiquicha presentaron una disminución progresiva de
la actividad de la enzima a lo largo de sus estados de madurez, existiendo
diferencia significativa entre los frutos inmaduros y los sobremaduros que
mostraban un 36% inferior de actividad con respecto a los frutos inmaduros
(figura 24). Oliveira, et. al. (2012) registraron un incremento progresivo de la
actividad de APX durante la sobremaduración de la papaya dorada, sin
embargo, la actividad de la enzima decayó abruptamente después de los ocho
días de sobremaduración. Es posible que el endocarpio del tomate también
b A b A
a B
a A
a AB
a B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Inmaduro Maduro Sobremaduro
UA
E /
mg
Pro
teín
a
Estado de Madurez
Pelileo
Chiquicha
57
sufriera un incremento en la actividad de APX y luego una caída brusca que se
prolongó hasta el día 17 de sobremaduracíon cuando se efectuaron las
medidas. Por otro lado, el endocarpio del tomate de árbol mostró un descenso
en la actividad de APX a lo largo de sus estados de madurez, que concuerda
con lo observado por Mondal y col. (2004) en dos especies de tomate, pero
contrasta a los resultados obtenidos por Mondal y col. (2009) en guaba, donde
la actividad de la enzima aumentaba con la madurez del fruto en la planta y
poscosecha, mientras que estudios en pepino chino (Quian, et. al., 2012),
muestran un descenso en la actividad de la enzima durante la madurez en el
fruto, seguido por un aumento brusco durante la sobremaduración.
4.1.3 CATALASA (CAT)
4.1.3.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción
Se ensayó la reacción de catalasa con distintas concentraciones de enzima, se
seleccionó la cantidad de 200μL de extracto enzimático del endocarpio (figura
25a) del fruto y 300 uL para el mesocarpio (figura 25b), ya que a partir de este
volumen se encontró la actividad máxima de la enzima.
58
Figura 25. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio (A) y
mesocarpio (B) de tomate de árbol en la mezcla de reacción de CAT.
Una vez fijada la concentración de la enzima, se realizó la variación de sustrato
(concentración de H2O2) en la reacción, seleccionando la concentración
(correspondiente a la saturación de la enzima) de 30mM de H2O2 en la mezcla
de reacción con extractos del endocarpio del fruto (figura 26a) y 50mM de H2O2
en la mezcla de reacción con extractos del mesocarpio (figura 26b) para
medidas posteriores.
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0 100 200 300 |Δ
Ab
s|/
min
Extracto (µL)
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0,009
0 100 200 300 400
|Δ A
bs|
/ m
in
Extracto (µL)
B
A
59
Figura 26. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla de
reacción de CAT con extracto enzimático del endocarpio (A) y mesocarpio (B)
de tomate de árbol.
4.1.3.2 Medida de actividad enzimática de CAT
La actividad de CAT en el endocarpio de los frutos inmaduros y maduros fue
mayor en la localidad de Pelileo, de mayor altitud (2660 m.s.n.m.), que en la
localidad de Chiquicha, de menor altitud (2440 m.s.n.m.), presentando
diferencias significativas (figura 27a). En el mesocarpio de los frutos se observó
lo contrario, siendo la localidad de Chiquicha la que registró mayor actividad
25
30
35
40
45
50
55
15 25 35 45 55 1
/ |Δ
Ab
s| /
t
H2O2 (mM)
130
140
150
160
170
180
190
200
210
25 35 45 55 65
1 /
|Δ
Ab
s| /
min
mM H2O2
B
A
60
enzimática de CAT en los tres estados de madurez (figura 27b). Sin embargo,
únicamente se registró diferencia significativa entre los resultados en los frutos
inmaduros de las dos localidades. Los resultados obtenidos en el endocarpio de
los frutos son similares a los reportados por Alexieva y col. (2001) y por Hassan
y col. (2012) en guisante y por Ren y col. (2007) en una especie de álamo
(Populus kangdingensis), donde la actividad de la enzima aumentaba en
plantas expuestas a mayor radiación UV-B, en contraste estos resultados son
opuestos en el caso del mesocarpio donde la enzima presenta menor actividad
en frutos expuestos a mayores dosis de radiación UV-B.
61
Figura 27. Actividad de la enzima catalasa (CAT) en el endocarpio (A) y en el
mesocarpio (B) del tomate de árbol.
Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos
localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor
es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma
localidad con p<0,05 Tukey=0,0067 para (A) y un p<0,05 Tukey=0,0075 para (B).
a A a A
a A
b A b A
a A
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
Inmaduro Maduro Sobremaduro
UA
E /
mg
Pro
teín
a
Estado de Madurez
Pelileo
Chiquicha
b A
a A
a B
a A
a B
a B
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
Inmaduro Maduro Sobremaduro
UA
E /
mg
Pro
teín
a
Estado de Madurez
Pelileo
Chiquicha
A
B
62
En el endocarpio de los frutos inmaduros y maduros de la localidad de
Chiquicha, la actividad de la enzima permaneció prácticamente constante para
luego aumentar en un 18% en los frutos sobremaduros respecto a la actividad
de los frutos inmaduros (sin encontrarse diferencia significativa), como se indica
en la figura 27a. Existió un ligero aumento de la actividad de CAT de los frutos
inmaduros a los maduros para las dos localidades, de forma similar a los
resultados obtenido por Mondal y col. (2004) en frutos de tomate y por Abbasi y
col. (2010) en manzana. En las dos localidades, la actividad de CAT en el
endocarpio no varió durante la maduración (de frutos maduros a
sobremaduros), sin decaer bruscamente como en el caso del mesocarpio, al
igual que en pitaya amarilla (Baquero y col., 2005).
Mientras que en el mesocarpio, para los frutos de las dos localidades, la
actividad de CAT tuvo la tendencia a disminuir a lo largo de los tres estados de
madurez analizados. La actividad de la enzima en el mesocarpio de los frutos
inmaduros de Chiquicha fue significativamente diferente a la de los frutos
maduros y sobremaduros, llegando a disminuirse en un 53% en la
sobremaduración. En los frutos de Pelileo, se encontró diferencia significativa
entre los frutos sobremaduros y los frutos maduros e inmaduros. La actividad
enzimática de CAT en estos frutos se redujo en un 52% con respecto a la
actividad en el mesocarpio de los frutos inmaduros (figura 27b). Resultados
similares se han encontrado en pitaya amarilla, donde se encontró una
reducción brusca de la actividad de esta enzima después del máximo
climatérico poscosecha de los frutos (Baquero y col., 2005). Estudios en uva
caimarona (Narváez y Restrepo, 2003) han obtenido resultados semejantes. El
descenso en la actividad de CAT después del máximo climatérico podría
deberse a un desbalance entre la producción y eliminación de EROs, iniciando
así el proceso de degradación de los tejidos del fruto.
63
4.1.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)
4.1.4.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción
La reacción de determinación de SOD que genera un compuesto de color (azul
formazan a partir de NBT y riboflavina en presencia de metionina), depende de
la concentración de sus componentes, del tiempo de exposición a la luz, y de la
intensidad de la luz. Para ajustar las condiciones óptimas de reacción de SOD,
primero se ajustaron estas condiciones de la reacción en ausencia de enzima,
de tal manera que se alcanzara una absorbancia cercana a 0,8. Posteriormente,
se ensayó la reacción con diferentes cantidades de los dos extractos
enzimáticos (endocarpio y mesocarpio) para evaluar qué concentración de la
enzima causaba aproximadamente el 50% de inhibición de la reacción de
formación del compuesto de color.
4.1.4.1.1 Concentración de riboflavina
En primer lugar se varió la concentración de riboflavina en la reacción (tabla 3).
Se seleccionó la concentración de 5,8μM, ya que presentó un valor de
absorbancia cercano a 0,8.
64
Tabla 3. Resultados del ensayo de variación de concentración de riboflavina
para ensayo de SOD.
Riboflavina (μM)
Absorbancia (560nm)
4,83 0,79
5,8 0,83
6,77 0,905
7,73 0,963
8,7 1,016
9,67 1,087
4.1.4.1.2 Determinación del tiempo de reacción
Se sometió la mezcla de reacción a 6 diferentes tiempos de incubación (tabla
4). Se seleccionó el tiempo de incubación de 18 minutos, ya que para este
tiempo de reacción, presentó un valor de absorbancia cercano a 0,8.
Tabla 4. Resultados del ensayo de variación de tiempo de incubación para
ensayo de SOD.
Tiempo de incubación
(min)
Absorbancia (560nm)
5 0,327
8 0,457
10 0,539
12 0,608
15 0,747
18 0,830
65
4.1.4.1.3 Variación de la concentración de metionina
Se varió la concentración de metionina en la reacción (tabla 5). Se seleccionó la
concentración de 0,867mM, con la que la mezcla de reacción presentó un valor
de absorbancia cercano a 0,8.
Tabla 5. Resultados del ensayo de variación de concentración de metionina
para ensayo de SOD.
Metionina (mM)
Absorbancia (560nm)
0,217 0,67
0,433 0,776
0,65 0,831
0,867 0,846
1,083 0,854
1,3 0,883
4.1.4.1.4 Variación de la intensidad lumínica
Se realizó un ensayo de variación de la intensidad lumínica a la cual se
sometería la mezcla de reacción en ensayos posteriores (tabla 6). Se
seleccionó la intensidad lumínica de 120W, ya que las mezclas de reacción
presentaban valores de absorbancia cercanos a 0,8.
66
Tabla 6. Resultados del ensayo de variación de la intensidad lumínica para
ensayo de SOD.
Intensidad (W)
Absorbancia (560nm)
120 0,848
90 0,782
60 0,656
30 0,432
4.1.4.1.5 Variación de volumen de extracto
Se realizaron dos ensayos con extractos del endocarpio y del mesocarpio del
fruto respectivamente (tabla 7). Para cada ensayo se realizó un control,
incubado sin extracto y un blanco, que contenía 200μL de extracto enzimático y
no fue incubado. Se seleccionó la cantidad de 50μL de extracto enzimático del
endocarpio, y 150μL de extracto enzimático del mesocarpio del fruto. Para
ambos casos, la absorbancia de la mezcla de reacción elegida mostraba
aproximadamente un 50% de inhibición con respecto a la absorbancia de la
mezcla control menos la absorbancia de la mezcla blanco.
67
Tabla 7. Resultados del ensayo de variación de volumen de extracto para
ensayo de SOD.
Extracto (μL)
Absorbancia (560nm)
Endocarpio Mesocarpio
25 0,585 0,739
50 0,225 0,66
100 0,21 0,507
150 0,219 0,369
200 0,146 0,325
250 0,164 0,249
300 0,193 0,169
350 0,133 0,165
400 0,15 0,115
450 0,192 0,162
Control 0 0,74 0,902
Blanco 200 0,212 0,016
4.1.4.2 Medida de actividad enzimática de SOD
La actividad de SOD en el endocarpio fue superior para la localidad de
Chiquicha en los todos los estados de madurez de los frutos. Sin embargo, solo
existió diferencia significativa entre las dos localidades en los frutos inmaduros
(figura 28a). En el mesocarpio, a pesar de que la actividad de SOD de los frutos
maduros e inmaduros muestra valores mayores para la localidad de Pelileo, no
se encontró diferencia significativa (figura 28b). Estudios en trigo (Alexieva y
col., 2001) y guisante (Alexieva y col., 2001; Hassan y col., 2012), muestran el
incremento de la actividad de SOD en plantas expuestas a mayor radiación UV-
B, como ocurre en el mesocarpio del fruto, pero contrario a los resultados
obtenidos en el endocarpio. Otros estudios similares en árboles de álamo
realizados por Ren y col. (2007), coinciden con los resultados de Alexieva y col.
(2001), mostrando un ligero aumento de la actividad de la enzima en plantas
expuestas a una mayor radiación UV-B.
68
Figura 28. Actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) en el
endocarpio (A) y mesocarpio (B) del tomate de árbol.
Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos
localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor
es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma
localidad con un p<0,05 Tukey=2,152 para (A) y p<0,05 Tukey=3,561 para (B).
b A
a A a A
a A
a AB
a B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Inmaduro Maduro Sobremaduro
UA
E /
mg
Pro
teín
a
Estado de Madurez
Pelileo
Chiquicha
a A a A
a A
a A a A a A
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Inmaduro Maduro Sobremaduro
UA
E /
mg
Pro
teín
a
Estado de Madurez
Pelileo
Chiquicha
A
B
69
En los frutos provenientes de Pelileo, la actividad de SOD en el endocarpio
permaneció prácticamente constante, se observó mayor actividad en los frutos
maduros, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre los
estados de madurez. En el endocarpio de los frutos de Chiquicha, la actividad
de la enzima fue disminuyendo a medida que la madurez de los frutos
aumentaba. Se encontró diferencia significativa entre los frutos inmaduros y los
sobremaduros, los cuales presentaron una disminución de 35% de la actividad
con respecto a los frutos inmaduros (figura 28b). En las dos localidades el
endocarpio de los frutos presentó un descenso en la actividad de SOD de los
frutos maduros a los sobremaduros, contrario a lo reportado por Abbasi, et. al.
(2010) en manzana y por Sis et. al. (2012) en durazno Iraní, donde la actividad
de la enzima sufre se incrementa constantemente incluso hasta 20 días
poscosecha.
En el mesocarpio de los frutos de la localidad de Chiquicha la actividad de SOD
permaneció constante a lo largo de la maduración. En el caso de Pelileo (2660
m.s.n.m.), la actividad de SOD fue similar en los frutos inmaduros y maduros y
luego disminuyó en los sobremaduros (figura 28b). No existieron diferencias
significativas entre los estados de madurez.
En las dos partes del fruto y en las dos localidades (excepto en el endocarpio
de los frutos de Pelileo) se pudo observar un descenso en la actividad de SOD
de los frutos inmaduros a los maduros, al igual que lo reportado por Mondal y
col. (2004) en dos tipos de tomate, pero contrario a lo reportado por Quian, et.
al. (2012) en pepinos chinos, donde la actividad de SOD aumentaba con la
maduración.
70
4.2 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN
HOJAS
Las medidas del porcentaje de H2O2 presentaron diferencia significativa entre
las localidades e indicaron una mayor concentración de éste compuesto en las
hojas de tomate de árbol de la localidad de Pelileo (2660 m.s.n.m.) en
comparación con las hojas de la localidad de Chiquicha (2440 m.s.n.m.) que
contenían 40% menos de este compuesto, según se observa en la tabla 8.
Tabla 8. Porcentaje de peróxido de hidrógeno (H2O2) en hojas de tomate de
árbol.
% H2O2 (p/p)
Localidad
Pelileo Chiquicha
1,6136 0,956
En los resultados se observó que la exposición a la radiación UV-B genera una
mayor producción de EROs en las plantas, entre ellas de H2O2. Varios autores
han reportado resultados similares, entre ellos Rybus-Zając y Kubiś (2010),
quienes comprobaron un aumento de la cantidad de peróxido de hidrógeno en
cotiledones de pepino al igual que Alexieva y col. (2001) quienes reportaron un
aumento de este compuesto reactivo en plantas de trigo y guisante, en ambos
estudios, tras ser expuesta la planta a radiación UV-B. Como se observa en los
estudios citados, las actividades de las enzimas antioxidantes aumentan por
acción de la radiación UV-B, lo cual podría ser una respuesta frente a la mayor
cantidad de EROs que se producen debido a este tipo de estrés, y como se
mencionó anteriormente, la radiación UV-B está directamente relacionada con
la altura convirtiéndose en un factor abiótico que genera una respuesta de
adaptación del tejido para el control del consumo/producción de EROs en la
célula.
71
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Se encontró diferencia en la actividad de enzimas antioxidantes
relacionadas con el estrés oxidativo entre el mesocarpio y el
endocarpio del tomate de árbol, por lo que se cuantificó la
actividad de estas enzimas en forma separada. Esta diferencia se
podría deber a la distinta composición de sistemas antioxidantes
enzimáticos y no enzimáticos de cada una de las partes del fruto.
La enzima APX (ascorbato peroxidasa) se midió únicamente en el
endocarpio del fruto, ya que no se encontró actividad enzimática
en el mesocarpio, mientras que las enzimas POX, CAT y SOD se
cuantificaron tanto en el endocarpio como en el mesocarpio. Esta
diferencia probablemente se deba a que la APX es dependiente
de AsA (ácido ascórbico), y existe una menor concentración de
éste compuesto en el mesocarpio del fruto.
Se encontró diferencia significativa en la actividad de las enzimas
antioxidantes (POX, APX, CAT y SOD) entre las dos alturas de
cultivo (Pelileo 2660 m.s.n.m. y Chiquicha 2440 m.s.n.m.), en las
dos partes del fruto analizadas (endocarpio y mesocarpio) y en
sus distintos estados de madurez (inmaduros, maduros y
sobremaduros). Contrario a lo indicado por varios autores, la
localidad de Chiquicha, de inferior altura (2440 m.s.n.m.) y por
tanto expuesta a menor incidencia de radiación UV-B fue la que
presentó mayor actividad de POX, APX, CAT y SOD. Lo que
72
podría deberse, entre otros factores bióticos y abióticos, al tiempo
de producción del cultivo (6 veces superior al de Pelileo) y/ó a las
condiciones más idóneas del suelo.
Se encontró mayor concentración de peróxido de hidrógeno en las
hojas de tomate de árbol provenientes de la plantación de Pelileo
(2660 m.s.n.m.), lo que podría relacionarse con el incremento en
la radiación UV-B causado por una mayor altitud de cultivo que
genera estrés y promueve la creación de EROs en las hojas de la
planta.
73
5.2 RECOMENDACIONES
Si bien las medidas se realizaron de plantaciones de una misma
variedad de tomate de árbol en plantaciones ubicadas en dos
distintas altitudes, no se tomó en cuenta la edad de los cultivos.
Los cultivos de Pelileo llevaban seis veces menos tiempo
produciendo que los cultivos de Chiquicha. Este factor podría
haber influido en el resultado final, por lo que en próximos
estudios se debe tomar en cuenta.
Son escasos los estudios sobre la altitud como factor abiótico que
influye en el estrés oxidativo en plantas. Los estudios más
cercanos tienen que ver con la incidencia de la radiación UV-B
como factor influyente en el estrés y los análisis en su mayoría
son realizados en las hojas de las plantas. Para futuras
investigaciones se debería analizar cómo afecta la altitud o la
incidencia de radiación UV-B en las propiedades antioxidantes de
los frutos.
Para investigaciones posteriores se podría realizar una
comparación entre las características antioxidantes de varios
fenotipos de tomate de árbol cultivados en el Ecuador, con el fin
de conocer si se presentan las mismas diferencias en las
características antioxidantes entre el endocarpio y mesocarpio del
fruto como ocurrió en la variedad “Mora” utilizada en esta
investigación.
74
Con el fin de realizar una mejor comparación de resultados, se
debería evaluar la concentración del peróxido de hidrógeno en los
frutos con técnicas más precisas, de tal manera que se pueda
comparar este resultado con la actividad de las enzimas
antioxidantes y la cantidad de compuestos antioxidantes y poder
observar qué altitud de cultivo presenta el mayor desbalance
oxidativo.
75
BIBLIOGRAFÍA
Abbasi, N., Singh, Z., Khan, A. (2010). Dynamics of anti-oxidant levels and
activities of reactive oxygen-scavenging enzymes in ‘pink lady’ apple fruit
during maturation and ripening. Pak. J. Bot. Vol.42 (4): 2605-2620.
Aebi, H. (1984).Catalase in vitro. Methods in Enzymology. Vol.105: 121-126.
A-H-Mackerness, S., John, C., Jordan, B., Thomas, B. (2001). Early signaling in
ultraviolet-B reponses: distinct roles for different reactive oxygen species
and nitric oxide. FEBS Lett. Vol.489: 237-242.
Airaki, M. (2012). Función de las especies de Oxígeno y Nitrógeno reactivo
(ROS y RNS) en plantas de pimiento (Capsicum annuum L.) durante el
desarrollo y en estrés por baja temperatura. Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC). Universidad de Granada. Granada,
España.
Albuja, L., Miño, C. (2005). Estudio de conservación de alimentos. Estudio de
caso: tomate de árbol (Chyphomandra betacea), pepinillos (Cucumis
sativus). Facultad de turismo, hotelería y gastronomía. Universidad
tecnológica equinoccial. Quito-Ecuador.
Alexieva, V., Sergiev, I., Mapelli, M., Karanov, E. (2001). The effect of drought
and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat.
Plant, Cell and Environment. Vol.24: 1337-1344.
Allen, D.J., Ort, D.R. (2001) Impact of chilling temperatures on photosynthesis in
warm-climate plants. Trends Plant Sci. Vol.6: 36-42.
Andrade, M.J. (2008). Relación entre la capacidad antioxidante y el desarrollo
del daño por frio en pimientos. Efectos de la radiación UV-C. Universidad
Nacional de la Plata. Facultad de ciencias exactas. La plata, Argentina.
76
Arines, J., Quintela, M., Vilariño, A., Palma, J.M. (1994). Protein patterns and
superoxide dismutase activity in non-mycorrhizal and arbuscular
mycorrhizal Pisum sativum L. plants. Plant and Soil. Vol.166: 37-45.
Ávila, J. (2009). Caracterización de 4 Genotipos de Tomate de Árbol (Solanum
betaceum Cav.) cultivados en Ecuador y estudio del efecto del estrés
hídrico y luminoso sobre las propiedades físico-químicas en la
poscosecha y estimación de la actividad antioxidante de los compuestos
fenólicos del genotipo Anaranjado gigante. EPN. Quito, Ecuador.
Baquero, L., Castro, J., Narvaez, C. (2005). Catalasa, peroxidasa y
polifenoloxidasa en Pitaya Amarilla (Acanthocereus pitajaya): Maduración
y Senescencia. Acta biológica Colombiana. Vol.10 (2): 49-59.
Benavides, A. (2002). Ecofisiología y química del estrés en plantas.
Departamento de agricultura. Universidad Autónoma Agraria Antonio
Narro. Coahuila, México.
Borrás, J., Gonzáles, M., Alzuet, G. (2004). Complejos de cobre (II) con
flavonoides. Actividad biológica. Resúmenes de comunicaciones 12-16
Septiembre del 2004. Universidade de Santiago de Compostela. Madrid,
España.
Boveris A. (1984). Determination of the production of superoxide radicals and
hydrogen peroxide in mitochondria. Methods Enzymol. Vol.105: 429-435
Cabrera, C., Robles, E. (2010). Evaluación del Efecto antioxidante del ejercicio
moderado y continuo en individuos con entrenamiento físico regular.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Departamento académico
de bioquímica. Lima, Perú.
Cafaro, M.J. (2005). Las Tesinas de Belgrano. Inducción de la senescencia en
plantas de trigo y arroz. Facultad de ciencias Exactas y Naturales.
77
Departamento de investigación. Universidad de Belgrano. Buenos Aires,
Argentina.
Calvo, I. (2009). Cultivo De Tomate De Arbol (Cyphomandra betaceae) Área:
Manejo integrado de cultivos / frutales de altura. Proyecto Microcuenca
Plantón – Pacayas. Boletín técnico No. 8. San José, Costa Rica.
Cantwell, M. (2005). Tamarillo. Department of Vegetable Crops. University of
California. Davis, California, EEUU.
Carrillo, N., Valle, E. (2005). El Lado Oscuro del Oxígeno. Instituto de Biología
Molecular y Celular de Rosario (IBR). Facultad de Ciencias Bioquímicas y
Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Rosario, Argentina.
Casal, C. (2008). Caracterización de la radiación ultravioleta en la provincia de
Huelva e incidencia en la productividad y el valor biotecnológico de
cultivos de interés comercial. Universidad de Huelva. Departamento de
Química y Ciencia de los Materiales. Huelva, España.
Casati, P., Walbot, V. (2003). Gene expression profiling in response to
ultraviolet radiation in maize genotypes with varying flavonoid content.
Plant Physiol. Vol.132 (4): 1739-1754.
Codex Alimentarius. (2011). “Norma del Codex para Tomate de Árbol (CODEX
STAN 303-2011)”. Requisitos e Índices de Madurez del Tomate de Árbol.
En línea. Recuperado de:
<www.codexalimentarius.net/download/standards/.../CXS_303s.pdf>
CORPEI. (2009). Perfiles de Producto: Tomate de Árbol”. Cultivo de Tomate de
Árbol en Ecuador. CICO (Centro de Información e Inteligencia
Comercial).
78
Dalton, D.A. (1995). Antioxidant defenses of plants and fungi. In: Ahmad, S., ed,
Oxidative Stress and Antioxidants Defenses in Biology. Chapman and
Hall. New York, USA. Pp 298-355.
Dat, J., Vandenabeele, S., Vranova, E., Van Montagu, M., Inze, D., Van
Breuseguem, F. (2000). Dual actions of the active oxygen species during
plant stress responses. Cell mol life Sci. Vol.57: 779-795.
De Paula, M.M. (1994). Alteraciones bioquímicas en semillas envejecidas de
Girasol (Heliantlws annaus L. cv. Peredovik) relacionadas con la
viabilidad, funcionalidad de membranas y cambios asociados con la
capacidad antioxidante. Universidad Complutense de Madrid.
Departamento de bioquímica y biología molecular II. Madrid, España.
Del Cisne, K. (2011). Cuantificación Química Del Fruto De Tomate De Árbol
(Solanum sp.). Áreas de cultivo del Tomate de Árbol. UTPL. Loja,
Ecuador.
Del Río, L., Corpas, F., Sandalio, L., Palma, J., Gómez, M., Barroso, J.B.
(2002). Reactive oxygen species, antioxidant systems and nitric oxyde in
peroxisomes. Journal of Experimental Botany. Vol.53: 1255-1272.
Elstner, E.F. (1987). Metabolism of activated oxygen species. En: The
biochemistty of Plants. Vol. II, (Davies, D.D., ed.). Academic Press.
Londres, UK. pp. 253-313.
FAO. (2006). Tomate de Árbol (Cyphomandra betacea). Fichas Técnicas de
Productos Frescos y Procesados. Poscosecha del Tomate de Árbol.
Disponible en:
<http://www.fao.org/inpho_archive/content/documents/vlibrary/AE620s/Pf
rescos/TOMATEDEARBOL.HTM>
79
Federación Española del Café (FEC). (2008). Radicales Libres y Antioxidantes.
En Línea. Recuperado de:
<http://www.federacioncafe.com/Documentos/CafeYSalud/CafeYAntioxid
antes/Radicales%20libres.pdf>
Flurkey, W.H., Jen, J.J. (1978) Peroxidase and polyphenoloxidase activities in
developing peaches. J. of Food Sc. No. 43; 1826–1828
Foyer C.H., Noctor, G. (2005). Oxidant and Antioxidant signaling in plants: a re-
evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context.
Plant, cell and environment. Vol.28: 1056-1071.
Foyer, C., Lelandais, M., Kunert, K. (1994). Photooxidative stress in plants.
Physiol Plant. Vol.92 (4): 696-717.
Fridovich, I. (1986). Superoxide dismutases. Adv Enzymol. Vol.58: 61-97.
García, M.D. (1998). Estrés Vegetal. Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias
Agrarias, Universidad Nacional de Lomas de Zamora. Buenos Aires,
Argentina.
Gechev, T., Willekens, H., Van Montagu, M., Inze, D. (2003). Different
responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress.
Journal of Plant Physiology. Vol.160 (5): 509-515.
Giannopolitis, C.N., Ries, S.K. (1977). Superoxide dismutase I. Occurrence in
higher plants. Plant Physiol. No. 59; 309–314
Gill, S.S., Tuteja N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery
in abiotic stress tolerance in crop plants. Plants Physiology and
Biochemistry. Vol.48: 909-930.
80
Golbaz, A., Khara, J., Darvishzadeh, R. (2012). Effect of UV-B radiation on
activity of antioxidant enzymes in four sunflower cultivars. International
Journal of Agriculture: Research and Review. Vol.2 (5): 528-534.
Gordon, A., Rodrigues, R., Marx, F., Papagiannopoulos, M. (2007). Antioxidant
capacity of tamarillo fruit (Cyphomandra betacea). University of Bonn.
Institute of nutrition and food sciences. Bonn, Germany.
Haillwell B., Gutteridge J. (2007). In: Free radicals in Biology and Medicine.
Oxford University Press. 4th Ed. Oxford, UK.
Hassan, I., Basahi, J., Kadi, M., Abou Zeid, H. (2012). Physiological and
biochemical impairment in bean plants due to supplementary Ultraviolet
radiation and water stress: Possible protective roles of secondary
metabolites. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, Vol.6 (9):
552-561.
Hernandez, A. (2006). Evaluación de la actividad enzimática de peroxidasa y
polifenoloxidasa en dos variedades de fresa (Fragaria x ananassa var.
Chandler y Sweet Charlie) durante estrés por bajas temperaturas.
Pontificia Univercidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá,
Colombia.
Instituto Tecnológico Superior de Calkiní en el Estado de Campeche
(ITESCAM). (2012). Estrés Oxidativo en plantas. Recuperado de:
<www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r24219.DOC>.
Inze D., Van Montagu, M., (1995). Oxidative stress in plants. Curr. Opin.
Biotechnol. Vol.6: 153-158.
Izaguirre, M.M., Scopel, A.L., Baldwin, I.T.; Ballaré, C.L. (2003). Convergent
responses to stress. Solar ultraviolet-B radiation and Manduca sexta
81
herbivory elicit overlapping transcriptional responses in field-grownplants
of Nicotiana longiflora. Plant Physiol. Vol.132 (4): 1755-1767.
Jana, S., Choudhuri, M. (1981). Glycolate metabolism of three submerged
aquatic angiosperms during aging. Aquat. Bot. Vol.12: 345-354.
Jibaja, H. (2010). Modelado de la Cinética de Absorción de Aceite durante el
proceso de Fritura al Vacío de Hojuelas de Tomate de Árbol (Solanum
betaceum Cav.). Altitud de Cultivos de Tomate de Árbol en Ecuador.
EPN, Quito, Ecuador.
Johnson, M., Macdonald, T., Mannick, J., Conaway, M., Gaston, B. (2001).
Accelerated S-nitrosothiol breakdown by amyotrophic lateral sclerosis
mutant Cu/Zn Superoxide Dismutase. Journal of Biological Chemistry.
Vol.276: 39872-39878.
Kakani, V.G., Reddy, K.R., Zhao, D., Sailaja, K. (2003). Field crop responses to
Ultraviolet-B radiation: a review. Agr Forest Meteorol. Vol.120 (1-4): 191-
218.
Kratsch H.A., Wise R.R. (2001). The ultrastructure of chilling stress. Plant, cell &
environment. Vol.23: 337-350.
Kuk, Y.I., Shin, J.S., Burgos, N.R., Hwang, T.E., Han, O., Cho, B.H., Jung, S.,
Guh, J.O. (2003). Antioxidative enzymes offer protection from chilling
damage in rice plants. Crop Science. Vol.43: 2109-2117.
Lambers, H., Stuart-Chapin III, F., Pons, T. (1998). Plant Physiological Ecology.
Springer-Verlag, New York, USA.
Larcher, W. (1995). Physiological Plant Ecology, Berlin, Heidelberg, Springer-
Verlang, p. 506.
León, J. y Viteri, P. (2004). Manual de Cultivo del Tomate de Árbol. INIAP,
Tecnigrava. Quito, Ecuador.
82
Loscos, J. (2007). Metabolismo de ascorbato y tioles en leguminosas. Consejo
Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Departamento de
Nutrición Vegetal. Estación experimental de Aula Dei. Zaragoza, España.
Lowry, O., Rosebrough, N., Farr, A., Randall, U. (1951). Protein measurement
with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. Vol.193: 265-275
Lucas, K., Maggi, J., Yagual, M.J. (2011). Creación de una empresa de
producción, comercialización y exportación de tomate de árbol en el área
de Sangolquí, provincia de Pichincha. Facultad de economía y negocios.
Universidad politécnica del litoral (ESPOL). Guayaquil-Ecuador.
Lucinski, R., Jackowski G. (2006). The structure, functions, and degradation of
pigment-binding proteins of Photosystem II. Acta Biochim. Pol. Vol.534:
693-708.
Manzano, H. (2009). La tierra como planeta vivo. Ecosistema. Recuperado de:
<http://www.oocities.org/mx/h_manzano10/ambiente/ecosistema.doc>
Marín, I., Roustan, I. (2000). Purificación y determinación de actividad
enzimática de la catalasa en Staphylococcus aureus. Encuentro Año
XXXII, Vol.52: 56-64.
Martínez, L. (2003). Respuesta Bioquímica y molecular de la simbiosis
Phaseolus vulgaris – Glomus intraradices al estrés de agua. Universidad
de Colima. Facultad de ciencias biológicas y agropecuarias. Tecomán,
Colombia.
Matamoros M.A., Dalton D.A., Ramos J., Clemente M.R., Rubio M.C., Becana
M. (2003). Biochemistry and molecular biology of antioxidants in the
rhizobia-legume symbiosis. Plant Physiol. Vol.133: 499-509.
Meyer, A.J., Hell, R. (2005). Glutathiones homeostasis and redox-regulation by
slfhydryl groups. Photosynth Res. 86: 435-457.
83
Miranda, A.K. (2003). Medicion de la cinetica enzimatica de la peroxidasa en la
hoja del piracantos. Facultad de Estudios Superiores Iztacal.
Tlalnepantla, México.
Miranda, M., Castro, L. (2007). El estrés oxidativo en plantas. Unidad de
Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación
Científica de Yucatán. Calle 43 # 130, Chuburná de Hidalgo, Mérida,
Yucatán, México. 97200.
Mittler, R. (2002). Oxidative Stress, antioxidants and stress tolerance. Trends
Plant Sci. Vol.7: 405-410.
Mondal, K., Malhotra, S., Jain, V., Singh, R. (2009). Oxidative stress and
antioxidant systems in guava (Psidium guajava L.) fruits during ripening.
Physiol. Mol. Biol. Plants. Vol.15: 327-334.
Mondal, K., Sharma, N., Malhotra, S., Dhawan, K., Singh, R. (2004). Antioxidant
systems in ripening tomato fruits. Biologia Plantarum. Vol.48 (1): 49-53.
Montoliu, A. (2010). Respuestas fisiológicas de los cítricos sometidos a
condiciones de estrés biótico y abiótico. Aspectos comunes y específicos.
Universitat Jaume I. Departament de Ciències Agràries i del Medi
Natural. Castellón de la Plana, España.
Muñoz, M.A. (2003). Manual de Vuelo. La atmósfera. Recuperado de:
<http://www.manualvuelo.com/PBV/PBV11.html>
Nakano, Y. and K. Asada. (1987). Purification of ascorbate peroxidase in
spinach chloroplasts; its inactivation in Ascorbate-depleted medium and
reactivation by monodehydroascorbate radical. Plant cell physiol. Vol.28
(1): 131-140
Narvaez, C., Restrepo, P. (2003). Efecto del almacenamiento de uva caimarona
(Pourouma cecropiifolia) a diferentes temperaturas sobre los sólidos
84
solubles y la actividad de catalasa. Revista Colombiana De Quimica.
Vol.32 (2): 81-92.
Narváez, C.E. (2002). Estudio de la maduración y evolución de los daños por
frío del fruto de uva caimarona (Pouruma cecropiifolia). Universidad
Nacional de Colombia. Facultad de ciencias. Departamento de Química.
Bogotá, Colombia.
Navarro, J., Garrido, C., Carvajal, M., Martínez, V. (2006). Changes in the
contents of antioxidant compounds in pepper fruits at different ripening
stages, as affected by salinity. Food Chem. Vol.96: 66-73.
Naya, L. (2007). Respuesta fisiológica, bioquímica y molecular de las
leguminosas a estreses abióticos. Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC). Departamento de Nutrición Vegetal. Estación
experimental de Aula Dei. Zaragoza, España.
Ndidi, E., Akeem, O. (2011). Antioxidant enzyme activity during postharvest
deterioration of cassava (Manihot esculenta) root tubers. International
journal of agriculture & biology. Vol.13 (3): 455-457.
Nielsen, E.T., Orcutt D.M. (1996). Physiology of plants under stress. Abiotic
factors. John Wiley and Sons, Inc. 605 Third Avenue, New York. Pp. 486-
511.
Nishida, I. and Murata, N. (1996) Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria:
the crucial contribution of membrane lipids. Annu. Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Biol. Vol.47: 541–568.
Oliveira, E., Martins, P., Antunes, P., Jacomino, A., Urbano, I. (2012). Oxidative
processes during ‘Golden’ papaya fruit ripening. Brazilian society of plant
physiology. Vol.24 (2): 85-94.
85
Passioura, J.B. (1996). Simulation models: Science, snake oil, education or
engineering. Agronomy Journal. Vol.88: 690-694.
Pilco, J. (2009). Evaluación de Dos formulaciones Químicas de N-P-K para el
crecimiento y Desarrollo del Tomate de Árbol (Solanum betaceum).
Identificación Botánica del Tomate de árbol. ESPOCH. Riobamba,
Ecuador.
Pinto, M. y Mozo A. (2006). Modulo de Manejo de Cosecha y Poscosecha de
Frutas. CORPOICA. Bogotá, Colombia.
Quian, C., Zhao, Y., Mi, H., Chen, X., Mao, L. (2012). Oxidative stress and
antioxidative activities involved in the development of cucumber fruit.
Escuela de Ingeniería en Biosistemas y ciencia de los Alimentos.
Universidad de Zhejiang. HangZhou, China. Recuperado de:
<http://www.paper.edu.cn>.
Rao, M.V., Paliyath, G., Ormrod, D.P. (1996). Ultraviolet-B and ozone-induced
biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thaliana.
Plant Physiol. Vol.110 (1): 125-136.
Reinel H., Brito, B. y García M. (2008). Desarrollo tecnológico para el
fortalecimiento del manejo postcosecha de frutales exóticos exportables
de interés para los países andinos: uchuva (Physalis peruviana L.),
granadilla (Passiflora ligularis L.), y tomate de árbol (Cyphomandra
betacea (Cav) Sendt). CORPOICA, INIAP, CIAT, PROEXANT, CIRAD.
PROYECTO FTG 14-03.
Ren, J., Dai W., Xuan, Z., Yao, Y., Korpelainen, H., Li, C. (2007). The effect of
drought and enhanced UV-B radiation on the growth and physiological
traits of two contrasting poplar species. Forest Ecology and Management.
Vol.239: 112-119.
86
Revelo, J.; Pérez, E. y Maila, M. (2011). El Cultivo de Tomate de Árbol.
Ecología del Cultivo de Tomate de Árbol. Variedades de Tomate de
Árbol. INIAP. Quito, Ecuador.
Rivas, M., Rojas, E., Cortés, J., Santander, E. (2002). Efecto de la altura en la
radiación solar ultravioleta en Crica norte de Chile. revista facultad de
ingeniería, U.T.A. (Chile), Vol.10: 59-62.
Rivas, M., Rojas, E., Mandronich, S. (2008). Aumento del índice solar
ultravioleta con la altura. Ingeniare. Revista chilena de ingeniería. Vol.16
(2): 383-388.
Rodriguez, A. (2005). Determinación de proteínas por el método de lowry.
Departamento de bioquímica y biología molecular. Universidad de la
laguna. Tenerife, España. Disponible en:
<http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf>
Rodríguez, A., Tinoco, R., Vazquez-Duhalt, R. (2001). Ingeniería molecular en
citrocromo c de Saccharomyces cerevisiae para el incremento de su
capacidad de oxidación de guayacol. Instituto de Biotecnología-UNAM.
Cuernavaca, Morelos, México.
Rubio, C., Fernández, E., Hidalgo, M.E., Quilhot, W. (2002). Effects of solar UV-
B radiation in the accumulation of rhizocarpic acid in a lichen species
from alpine zones of Chile. . Bol. Soc. Chil. Quím., Concepción, Vol.47
(1). Recuperado de:
<http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0366-
16442002000100012&lng=es&nrm=iso>
Rybus-Zając, M., Kubiś, J. (2010). Effect of uv-b radiation on antioxidative
enzyme activity in cucumber cotyledons. Acta Biologica Cracoviensia.
Series Botanica. Vol.52 (2): 97-102.
87
Simontacchi M., A. Galatro and S. Puntarulo, (2001). El estrés oxidativo en las
plantas. Rev. Ciencia Hoy [en línea]. Vol.10: 1-2.
Sis, S., Mostofi, Y., Boojar, A., Khalighi, A. (2012). Effect of nitric oxide on
ethylene biosynthesis and antioxidant enzymes on Iranian peach (Prunus
persica cv. Anjiri). Journal of Food, Agriculture & Environment. Vol.10 (2):
125-129.
Torel, J., Cillard, J., Cillard, P. (1986). Antioxidant activity of flavonoids and
reactivity with peroxy redicals. Phytochemistry. Vol.25: 383-385.
Valderrama, R., Carreras, A., Gómez-Rodriguez, M.V., Corpas, F.J., Fernandez-
Ocaña, A., Luque, F., Chaki, M., Pedrajas, J.R., Córdoba, E., Barroso,
J.B. (2008). La salinidad genera un estrés oxidativo y nitrosativo que
afecta al crecimiento y productividad del olivo. Grupo de investigación
“Bioquímica y señalización celular”. Universidad de Jaén. Andalucía,
España.
Vuleta, A., Jovanovic, S.M., Darka Seslija, D., Tucic, B. (2010). Seasonal
dynamics of foliar antioxidative enzymes and total anthocyanins in natural
populations of Iris pumila L. Journal of plant ecology. Vol.1 (3): 59-69.
Wallace, H.M., Fraser, A.V., Hughes, A. (2003). A perspective of polyamine
metabolism. Biochem J. Vol.376: 1-14.
Welinder K. (1991). In: Lobarzewiski, J., Greppin, H., Penel, C., Gasper Th.
Biochemical, molecular and physiological aspect of plant peroxidises. Pp.
3-13. University of Geneve, Switzerland.
Wojtaszek, P. (2000). Nitric oxide in plants: To NO or not to NO.
Phytochemistry. Vol.54: 1-4.