Post on 06-Feb-2018
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 2
Índice
1. ¿Por qué validar un método de análisis?
2. ¿Cuándo validar un método de análisis?
3. Validación de métodos de análisis.
3.1. Selectividad
3.2. Linealidad
3.3. Exactitud
3.4. Precisión
3.5. Límites de detección y cuantificación
3.6. Intervalo de trabajo
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 3
Sólo la utilización de un método validado permite al
analista dar una respuesta fiable al problema analítico
inicialmente planteado
Todas las operaciones de un procedimiento de medida
suponen introducir errores aleatorios y puede que también
sistemáticos, debido a defectos en la instrumentación,
defectos en el operador y defectos en el método de análisis
¿POR QUÉ VALIDAR UN MÉTODO DE ANÁLISIS?
La validación de un método de medida garantiza:
La calidad de la información analítica
La trazabilidad de las medidas
La comparabilidad de los resultados
Facilitar la transferencia de métodos de análisis entre laboratorios.
Apoyar la armonización entre laboratorios.
Reconocimiento mutuo de resultados entre laboratorios.
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Un laboratorio DEBE validar los métodos no normalizados, los métodos desarrollados
en el laboratorio, los métodos normalizados utilizados fuera de su campo de
aplicación previsto, y las ampliaciones o modificaciones de métodos normalizados.
Norma UNE-EN ISO 17025
Un laboratorio NO debe validar los métodos normalizados (ISO, CEN, AENOR)
siempre que su aplicación sea bajo las condiciones estrictamente descritas por
mismos, comprobando que lo aplica correctamente (evaluando la exactitud y la precisión
de sus medidas, u otras propiedades analíticas de interés para la aplicación prevista).
Norma UNE-EN ISO 17025
Métodos oficiales (directivas europeas, BOE, EPA, FDA,…)
Métodos de referencia (ASTM, AOAC, Farmacopeas, …).
¿CUÁNDO VALIDAR UN MÉTODO DE ANÁLISIS?
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Siete parámetros de calidad en una validación:
• Selectividad
• Linealidad
• Exactitud
• Precisión
• Límite de detección
• Límite de cuantificación
• Intervalo de trabajo
Establecer la evidencia documental de que un método conducirá a la obtención de
resultados aceptables dentro de las especificaciones de calidad previamente
establecidas, demostrando ser útil para el fin deseado
Validar un método analítico es documentar su calidad
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
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Parámetros a ser validados según el tipo de ensayo a realizar
TIPO DE ENSAYO PARÁMETROS
Identificación Selectividad
Selectividad Linealidad Exactitud
Precisión Límite de detección
Determinación cuantitativa
Límite de cuantificación
Selectividad Determinación cualitativa
Límite de detección
Intervalo de trabajo
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 7
Capacidad que tiene un método para medir y/o identificar simultáneamente o
separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otros
componentes que puedan estar presentes en la muestra analizada
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
SELECTIVIDAD
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La selectividad es una medida del grado de interferencias que producen los compuestos que acompañan al analito en la muestra
Errores sistemáticos
Error constante
Sustancias presentes en la matriz de la muestra o añadidas durante el proceso analítico.
Se pueden evitar:
- Uso de técnicas de separación (cromatográficas)
- Optimización de las condiciones de operación (interferentes)
- Reacciones de enmascaramiento (interferentes)
- Herramientas quimiométricas
Error proporcional a la concentración del analito
Efectos inespecíficos: efecto de matriz
Se pueden evitar:
- Calibración por adiciones patrón
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
SELECTIVIDAD
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 9
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
SELECTIVIDAD
EVALUACIÓN
DE LA SELECTIVIDAD
Análisis de muestras con
interferencias adicionadas o presentes
Comparación con otros
métodos de referencia
Análisis de
materiales de referencia
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Capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente
proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un
intervalo de trabajo (una respuesta lineal facilita el trazado, interpolación e
interpretación)
Procedimiento para determinar la linealidad
Estudio a partir de disoluciones patrón según el método de la recta
de calibrado. La linealidad se debe establecer a partir de al menos cinco
niveles de concentración que abarquen todo el intervalo de trabajo y
analizarlos por triplicado
(p.e., tres rectas de calibrado en días distintos para el mismo grupo de patrones )
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
LINEALIDAD
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1. Visualización gráfica de la recta de calibrado y de los puntos que la generan.
2. Ecuación de la recta por el método de mínimos cuadrados, coeficiente de correlación (r) y errores de los distintos parámetros de la recta.
3. Análisis gráfico de los residuos.
Criterios de aceptación
• Los puntos de la recta muestran una linealidad adecuada.
El límite de linealidad: punto en que la diferencia entre la señal predicha por el modelo lineal (ŷ) y la señal medida (y) representa el 3% de la señal medida.
• r 0.999 compuestos mayoritarios; r 0.99 compuestos minoritarios.
• Gráfico de residuos muestra una distribución de puntos sin ninguna tendencia
• Test de linealidad: b t sb (intervalo de confianza no debe incluir el cero).
• Test de proporcionalidad: a t sa (intervalo de confianza debe incluir el cero).
- Ordenada en el origen ≤ 2-5 % de la señal media en la recta de calibrado.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
LINEALIDAD: EVALUACIÓN
y = a + bx
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La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado de una medida y el
valor real del mesurado
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EXACTITUD
¿Conocemos el valor
verdadero? No, por eso
utilizamos el valor que consideramos como verdadero 100(%)
v
vir
vi
x
xxE
xxE
- Valor certificado de un MRC - Valor obtenido por un
método de referencia - Valor obtenido
por un método alternativo
- Valor añadido a muestras
problema
F
I
A
B
I
L
I
D
A
D
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Una prueba de hipótesis (prueba t de dos muestras) o un análisis de regresión, determina
con un cierto nivel de confianza (95%) que no existen diferencias significativas entre ambos.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
EXACTITUD: EVALUACIÓN
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La precisión indica el grado de concordancia entre los valores de
ensayos independientes obtenidos en unas condiciones bien definidas
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PRECISIÓN
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Repetibilidad
Dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes, utilizando el mismo
método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el
mismo operador, usando el mismo equipamiento en un intervalo corto de tiempo. Esta
es una medida de la variabilidad del método y un reflejo de la máxima precisión que el
método puede alcanzar.
Precisión intermedia
Dispersión de resultados entre ensayos mutuamente independientes utilizando el
mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio
en diferentes condiciones: distintos operadores, diferente equipamiento o distintos días.
Cabe distinguir: entre días, entre equipamiento y entre operadores.
Reproducibilidad
Dispersión de resultados entre ensayos mutuamente independientes utilizando el
mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra en diferentes laboratorios.
Cabe distinguir: entre días, entre operadores y entre laboratorios. Implica la máxima
dispersión de un mismo proceso analítico.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
PRECISIÓN
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Muestra (s, N<30)
Población (m, N>30)
Desviación estándar
Varianza
Desviación estándar
relativa
Coeficiente de
variación (RSD en %)
xi = valor individual; x = media; N = número de medidas; N-1 = grados de libertad; m = media poblacional
1
1
2
N
xx
s
N
ii
1
1
2
N
xN
ii
m
1
1
2
2
N
xx
s
N
ii
11
2
2
N
xN
i
i m
xsRSD mRSD
100x
sCV 100
m
CV
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
PRECISIÓN: EVALUACIÓN
Este parámetro deberá evaluarse en todo el intervalo de trabajo definido para el método de ensayo: - Un mínimo de 3 muestras a 3 niveles de concentración cubriendo el intervalo especificado (9 muestras en total) - Un mínimo de 6 muestras a la concentración nominal * Introducir los intervalos de confianza para cada nivel de concentración
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 17
Uno de los factores que más pueden influir en la precisión de un método
analítico es la concentración del analito, ya que la desviación estándar de
las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentración del analito
Límites de la DER según la AOAC (1993) y Hortwitz
MétodoIntermediaPrecisión 2 DERDER
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
PRECISIÓN: EVALUACIÓN
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 18
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
LÍMITE DE DETECCIÓN
El límite de detección de un método analítico es la mínima cantidad de
analito presente en la muestra que se puede detectar aunque no
cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas para dicho método
0
CLD
0
XLD
XB
XB+3σB
Concentración
Analito
Señal
Analito
Señal
Blanco
Límite de
detección
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 19
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
LÍMITE DE DETECCIÓN
b
σ3LOD B
PROCEDIMIENTOS
PARA DETERMINAR
EL LOD
MÉTODO BASADO EN EL EXAMEN VISUAL
de la mínima concentración detectable
MÉTODO BASADO
EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR
DE LA RESPUESTA
Y LA PENDIENTE DE LA
RECTA DE CALIBRADO 3
Ruido
SeñalLOD
MÉTODO BASADO
EN LA RELACIÓN
SEÑAL/RUIDO
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 20
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
LÍMITE DE DETECCIÓN vs LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
El límite de cuantificación de un método analítico es la mínima cantidad de analito
presente en la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones experimentales
descritas para dicho método, con una adecuada exactitud y precisión
0
CLD
CLC
0
XLD
XLC
XB
XB+3σB
XB+10σB
Concentración
Analito
Señal
Analito
Señal
Blanco
Límite de
detección
Límite de
cuantificación
VALIDACIÓN DE MÉTODOS 21
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
b
σLOD B10
PROCEDIMIENTOS
PARA DETERMINAR
EL LOQ
MÉTODO BASADO EN EL EXAMEN VISUAL
de la mínima concentración detectable
MÉTODO BASADO
EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR
DE LA RESPUESTA
Y LA PENDIENTE DE LA
RECTA DE CALIBRADO 10
Ruido
SeñalLOD
MÉTODO BASADO
EN LA RELACIÓN
SEÑAL/RUIDO
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Intervalo de concentraciones de analito en el que puede obtenerse una exactitud, precisión y linealidad adecuadas al objetivo del método
Concentración
Señal
LOQ
LL
Intervalo de linealidad, intervalo de concentraciones en el que el método presenta una sensibilidad constante.
Intervalo dinámico, intervalo de concentraciones en el que el método proporciona una respuesta que varía con la concentración.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
INTERVALO DE TRABAJO
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BIBLIOGRAFÍA BÁSICA
1. Miller, J.N., Millar, J.C., Estadística y
Quimiometría para Química
Analítica. Prentice Hall, Madrid, 2002.
2. Compañó Beltrán, R., Ríos Castro, A., Garantía de calidad en los
laboratorios analíticos, Editoriall
Síntesis, 2002.
3. Bell, S. Forensic Chemistry, Pearson
International Edition, New Jersey, 2006.