Vías de muerte

caspase

cysteine-dependent aspartate specific protease

Especificidad dominante para sustratos conteniendo Asp (específico de caspasas)Excepción: Granzima B: activador de caspasas

Contienen un pentapéptido conservado: QACXG

conteniendo la cisteína del sitio activo (común en cisteína proteasas)

Horvitz y cols.: Caenorhabditis elegans

CED 3 CED4 CED9

CED 3: proteína pro-apoptótica con homología de secuencia con:

interleukin-1-converting enzyme (ICE)-like proteasas

pro-IL-1 IL-1

por clivaje entre Asp 116-Ala 117.

Para unificar la nomenclatura: CASPASAS

Caspasa 1: primera caspasa identificada (la numeración de los aácidos de todas las caspasas se refiere a ella)

Procesamiento de caspasasProcesamiento de caspasas

* Residuos esenciales para la catálisis Residuos para reconocimiento de sustrato

Interrogantes acerca de la función de algunas caspasas

* Caspasa 2: iniciadora vía TNFR

* Caspasas 4,5 y 13: rol desconocido

Se las agrupa como activadoras de Citoquinas por susimilitud con la secuencia con caspasa 1

Pero: caspasa 13 es activada por caspasa 8??Significado fisiológico desconocido

Estructura primaria de las caspasas

Estructura primaria de caspasas

La familia de las caspasas

Activación de las pro-caspasas 7 y 9

Sustratos de caspasas

Caspasas activ. de citoquinas (1, 4 y 5):(W/Y)EHD

Caspasas iniciadoras (8, 9 y 10): (I/L/V)EHD

Caspasas ejecutoras (3 y 7) y caspasa 2: DEXD

Uso de sustratos selectivos en mezclas de caspasas

Es complicado

La actividad y abundancia de cada caspasa, determina el resultado. La estructura ternaria es relevante

Sustratos de CaspasasElementos del citoesqueleto: actina, fodrina,

proteína tau y cateninaEnzimas encargadas de reparar (PARP) o degradar (DNAasa) el DNA

Factores de transcripción: Rb, MDM2

Proteínas quinasa y fosfatasas: PKC, fosfatasas 2-alfa, Akt

Productos de la familia Bcl-2

CAD-ICAD

Sustratos de caspasas

Sustratos e inhibidores de caspasas

Estructura de las caspasas

Heterodímeros: cada uno contiene un sitio catalíticocompuesto por residuos de ambas subunidades

Cada sitio activo contiene un S1 (+)(altamente conservado) para unir el Aspartato P1 (-) del sustrato

P2 y P3 tienen un efecto limitado sobre el clivaje del sustrato

P4 y S4 son relevantes en la especificidad por sustrato

Sustratos sintéticos

Secuencia tetrapeptídica de preferencia de caspasas

Sustratos sintéticos: tetrapéptidos conjugados a:

1) un cromóforo pNA (espectrofotometría)

2) un fluorocromo: AMC (7-amino-4-metilcumarina)

AFC (7-amino-4- trifluorometil- cumarina)

(espectrofluorometría)

La secuencia tetrapeptídica es una secuencia de “preferencia” y no absoluta

Muchas caspasas pueden clivar el mismo sustrato“in vitro” aunque con distinta eficiencia.

La elección depende de la concentración, tiempo dereacción y accesibilidad

Inhibidores Sintéticos

Se unen al sitio activo de las caspasas en forma reversible o irreversible

Algunos forman uniones covalentes con la cisteína del sitio activo

Bloquean o retrasan la muerte

Pueden ser tóxicos para la célula (incub. t largos)

Como ocurre con los sustratos de caspasas, los inhibidores no son específicos para una caspasa

Otros roles de las caspasas

• Regulación de la diferenciación celular: FADD es un regulador clave del desarrollo de células T

• Proliferación celular ( de células T) y progresión del ciclo celular

• Motilidad celular

• Internalización de receptores (FAS R)

Mecanismos de activación de caspasas

Homoactivación: requiere del reclutamiento de zimógenos a proteínas adaptadoras:

caspasas iniciadoras 8 y 10: DISC, mediado por R de muerte

caspasa iniciadora 9: Apoptosoma, compuesto por Apaf1, citocromo c, dATP/ATP y caspasa 9

Heteroactivación: ocurre por acción de otras proteínassobre los zimógenos caspasas

Dominios de Apaf-1

Card: se une al Card de caspasa 9NBD: dominio de unión a nucleótidos, involucrado en la oligomerizaciónWD40: involucrados en interacciones proteína-proteína

* El dominio CARD no está normalmente expuestoy no se une a procaspasa 9 a menos que Apaf1 seaactivado por dATP y citocromo c

* El acceso al dominio CARD está normalmente bloqueado por las WD40

* ATP y cit.c hacen que Apaf-1 sufra un cambio con-formacional que expone el dominio CARD uniendo luego la pro-caspasa 9

Apoptosoma: la rueda de la muerte

El sitio de unión para Cit. c con Apaf-1 no ha sido caracterizadoWD-40 regulan el sitio de uniónLa unión de Cit. C expone los sitios de unión para dATP

La homodimerización parece ser la clave para la activación de la procaspasa 9

Un evento único es que sólo uno de los dos polipép-tidos se vuelve activo

Probablemente los monómeros de procaspasa 9 unidos al apoptosoma recluten nuevos monómerosde procaspasa 9 para formar la holoenzima

El apoptosoma permitiría la interacción antiparalela de dos monómeros inactivos para formar el dímeroasimétrico activo

Interacciones caspasa 9-apoptosoma

Caspasa 9 libre: actividad mínima el apoptosoma actúa como holoenzima

La actividad del zimógeno y la forma procesada aumentan 2000 veces por unión al apoptosomaEstequiometría Apaf-1/caspasa 9: 1:1

El procesamiento proteolítico en el linker no es necesario para la activación de caspasa 9

El dominio N-terminal no se corta, la caspasa puede permanecer asociada al apoptosoma y activar casp. ejecutoras

Vias de muerte

Niveles de regulación de las caspasas

Hay precursores de caspasas expresados en forma

constitutiva deben estar estrechamente reguladas

1) Los precursores de caspasas están presentes en

una conformación que previene la autocatálisis

2) Necesitan de proteínas adaptadoras y cofactores

que cambien su conformación y las vuelvan activas

3) Compartimentalización de caspasas y cofactores

Niveles de regulación de caspasas

4) Unión específica de inhibidores naturales:

FLIP

IAPs

A diferencia de la familia Bcl-2, IAPs bloqueantanto la vía mitocondrial como la del R por unión a caspasas iniciadoras y efectoras

Localización de las caspasas

* Normalmente citosólica

* También se han encontrado en: núcleo RE

mitocondria

Algunas caspasas pueden traslocarse de un compar-timiento celular a otro en presencia de un estímulo apoptótico

Caspasas 2 y 9: de la mitocondria al citosolCaspasa 7: del citosol a la mitocondria

Las dos vías de muerte y sus Las dos vías de muerte y sus inhibidores naturalesinhibidores naturales

Miembros de la familia IAP

Para oponerse a la destrucción celular mediada por caspasas se cuenta con dos clases de inhibidores

* Miembros de la familia Bcl-2: bloquean la vía mitocon- drial

* Miembros de la familia IAP: bloquean la vía mitocon- drial y la vía del receptor

Se unen a caspasas iniciadoras y efectoras e inhiben su actividad

Miembros de la familia IAPMiembros de la familia IAPNIAP:atrofia muscular espinalBIR: Cys/His

RING, UBC: ubiquitin ligasa

Degradación decaspasas unidasvía proteasoma

Inhibición de caspasas por IAPs

XIAP

Es el más potente inhibidor de caspasas 3, 7 y 9

Aún no se conoce la función del dominio BIR 1

La región que circunda BIR 2 une específicamentecaspasas 3 y 7

BIR 3 une caspasa 9

BIR 2 no tiene rol directo en la inhibición de caspa-sas

XIAP es una proteína modular

BIR3 de XIAP se une a la caspasa 9 clivada

BIR 3 reconoce un tetra-péptido Ala-Thr-Pro-Phe

Este tetrapéptido también se encuentra en SMAC/DIABLO

La caspasa 3 cliva a la procaspasa 9

Posibles funciones de BIR 1

* Puede actuar estabilizando XIAP

* Puede interactuar e inhibir caspasas aún no identificadas

* Puede proveer una interfase para la unión de proteínas que interactúan con XIAP, modificando su actividad

¿Porqué tener una proteína con diferentes dominios que inhiban distintas caspasas?

Permite la regulación simultánea de varias caspasas

XIAP se une al apoptosoma donde interactúa con caspasas 9 y 3 sugiriendo que previene:

* la activación de caspasa 3 por caspasa 9 * la liberación de la caspasa 3 del apoptosoma

XIAP se asocia con el apoptosoma

La proximidad deXIAP a caspasas 3 y 9 y el hecho de que distintos dominios inhiban caspasas 3 y 9 justificarían la altaeficiencia y potenteinhibición de estas caspasas por XIAP

Inhibiendo a los inhibidores SMAC/DIABLO

Second Mitochondria derived Activator of CaspaseConecta a los IAPs con la MC controlada por la M

Se sintetiza como un precursor que se trasloca a la mitocondria

Allí se remueve un N-term de 55 aácidos (sec. de targeting) y se expone un tetrapéptido Ala-Val-Pro-Ile esencial para su unión a IAPs

Interactúa con: XIAP, c-IAP ½ y survivina

Activación de caspasas por SMAC/DIABLO

El linkerNH2-t deBIR2 ocupael sitio deunión del sustrato decaspasas

XAF1: una proteína de interacción con XIAP XIAP- Asociator Factor I

Antagoniza la habilidad de XIAP para inhibir la actividad de caspasas “in vitro”

A diferencia de SMAC/DIABLO no necesita serprocesado

Está localizado en el núcleo y no se conoce el mecanismo de inhibición. Se propone que ocurre en el núcleo

Los dos mecanismos posibles de regulación de XIAP

Smac/Diablo:No tendría efectoSobre la vía delReceptor

XAF-1: su locali-zación nuclearsugiere que puede interceptarambas víasapoptóticas

Miembros de la familia Bcl-2

Proteínas anti-apoptóticas

• BH1-BH4: son indispensables para su actividad de supervivencia

• BH1-BH4: no tienen actividad catalítica pero intervie- nen en la interacción con otras proteínas

• BH1-BH3: forman un surco hidrofóbico en la parte funcional; BH4 interviene en la estabilización del bol- sillo hidrofóbico

• Si se remueve BH4 la proteína se transforma en pro- apoptótica

Miembros pro-apoptóticos

* Ante un estímulo apoptótico exponen su dominio BH3mediante un cambio conformacional (Bcl-2 no puede hacerlo)

* Este dominio BH3 es el que va a interaccionar con el bolsillo hidrofóbico de las proteínas anti-apoptóticas

* El cambio conformacional puede ocurrir por:defosforilación: Badclivaje: Bid

* La consecuencia del cambio conformacional es la traslocación a la mitocondria

Bax: targeting, inserción, oligomerización y

formación del canal

No haycanal

canal

Modo de acción de Bcl-2-like y Bax-like factors

El casposoma de C.Elegans Modo de acción de una proteína BH3-only

BH3-only

Sensores y

Mediadores

de las res-puestas

apoptóticas

Targeting de Bid y Bad a la mitocondria

(A): t-Bid se puede unir a Bax o Bcl-Xl

(B): independientede caspasas

(C): un aumento en la conc. de Ca++

induce la calcineurina fosfatasaque defosforila Bad

Traslocación de proteínas en la apoptosis

Traslocación de proteínas durante la apoptosis

Fases en la decisión de la muerte celularFases en la decisión de la muerte celular

Cambios mitocondriales durante la apoptosis

Mecanismos de liberación de Citocromo c

Redistribución celular de la mitocondria Cambios morfológicos

a) Teñido de la mitocondria normalb) Mitoc. transfectadas con Bax e inhibidor general de

caspasas: la mitocondria se condensac) La mitocondria forma clusters alrededor del núcleo

Mecanismos de liberación de citocromo c

Se han postulado dos teorías:

1) Teoría de la ruptura no específica de la MME

PTP

2) Teoría de formación de canales conductores de

citocromo c

Posibles componentes del PTP

BPR: receptorbenzodiazepinas

CK: creatina quinasa

HK: hexoquinasa

Cph. D: ciclofilina D

Canal no selectivo

La apertura del PTP puede dispararse por efectoresfisiológicos como iones Ca, ROS, variaciones de pH,Bax

Consecuencia: repentino incremento de la permeabilidadde MMI ( 1,5 kDa), disipación del potencial dependien-te de protones y desequilibrio químico entre citoplasmay matriz mitocondrial

Estos eventos causarían un swelling de la matriz debidoa su alta concentración de solutos conduciendo a la disrupción de la MME

La ruptura de la MME ha sido raramente descripta y no explicaría la salida de proteínas del espacio intermembrana

Formación de canales conductores de cit. c

• Las estructuras de Bcl-XL y Bid se asemejan a las de algunas toxinas que pueden formar canales para iones y proteínas

• Bcl-XL, Bcl-2, Bax y tBid forman canales funcionales en vesículas sintéticas

• Las propiedades intrínsecas de los canales formados por proteínas pro y anti-apoptóticas difieren significati- vamente. Esto explicaría sus influencias opuestas so- bre la liberación de citocromo c

Liberación del Cyt c de la mitocondria

c) Bax se oligomeriza y forma megacanalesd) Bax coopera con VDAC para formar un gran canale) Bax o tBid forman un poro lipídico o un complejo proteína- lípido

Otras moléculas involucradas en al apoptosis

Traslocación de proteínas durante la apoptosis