² μg/l - OIV · Visto el párrafo 2 iv del artículo 2 del Acuerdo por el que se crea la...

Certificado conforme Izmir, 22 de junio de 2012

El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general

Federico CASTELLUCCI

© OIV 2012 1

RESOLUCIÓN OIV-OENO 461-2012

MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE NATAMICINA EN EL VINO

LA ASAMBLEA GENERAL,

Visto el párrafo 2 iv del artículo 2 del Acuerdo por el que se crea la Organización

Internacional de la Viña y el Vino;

A propuesta de la subcomisión de Métodos de análisis de mostos y vinos;

Considerando que las actividades de la OIV deben contribuir a la seguridad de los

alimentos;

Reconoce que no se han prescrito métodos oficiales concretos de determinación de

natamicina en el vino y que pueden aplicarse métodos ya disponibles.

DECIDE adoptar los dos métodos de tipo IV expuestos a continuación para la

determinación de la natamicina en el vino:

1. INTRODUCCIÓN

Para la determinación de la natamicina se utilizan diversos métodos, basados

primordialmente en HPLC en combinación con detección DAD (matriz de diodos) o MS

(espectrofotometría de masas). La estimación de los límites de rendimiento —límites de

detección y cuantificación— se basa en la responsabilidad de los laboratorios en

conformidad con sistemas de acreditación (p. ej. ISO/EN 17025/2005) que utilicen la

recomendación de la OIV (OENO 7/2000, E-AS1-10-LIMDET) u otras directrices

normativas.

Como falta una estimación fiable entre laboratorios del nivel crítico, se adopta

temporalmente un límite de decisión de 5 μg/l hasta disponer de una estimación fiable

intralaboratorios o de otros indicadores sólidos.

2.1 MÉTODOS

Determinación de natamicina (pimaricina) en el vino por cromatografía de líquidos

combinada con espectrometría de masas de alta resolución.




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2.1.1 OBJETO

Este método describe un procedimiento analítico de determinación de natamicina

(pimaricina) en el vino. La concentración de natamicina se expresa en

microgramos por litro (μg/l) de vino. Se ha realizado una validación interna con

soluciones disolventes, vino tinto y vino blanco en un intervalo de concentraciones

comprendido entre 5 y 2.600 μg/l.

2.1.2 FUNDAMENTO

La concentración de natamicina en el vino se determina mediante inyección directa de la muestra en un cromatógrafo de líquidos con un sistema de detección de espectrometría de masas de alta resolución (LC-HR/MS). La cuantificación se basa en el método de adición de patrones. Primero se analiza la muestra por primera vez para obtener una concentración estimada de natamicina. A continuación se repite el análisis añadiendo los patrones de calibración normalizados más adecuados para la concentración de natamicina de la muestra.

2.1.3 REACTIVOS

2.1.3.1 Analitos

2.1.3.1.1 Natamicina (Pimaricina) >95%

2.1.3.2 Compuestos químicos:

2.1.3.2.1 Metanol, calidad HPLC de fluorescencia (núm. CAS 67-56-1).

2.1.3.2.2 Agua purificada para laboratorio, por ejemplo, de calidad EN ISO 3696 (Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de ensayo [ISO 3696:1987]).

2.1.3.2.3 Ácido acético 100% (núm. CAS 64-19-7).

2.1.3.3 Soluciones

2.1.3.3.1 Solución madre de natamicina (1.000 μg/ml)

Pesar con una exactitud de 0,1 mg alrededor de 10 mg de natamicina (2.1.3.1.1) en un matraz aforado de vidrio topacio de 10 ml y enrasar con una mezcla de metanol agua: ácido acético (2.1.3.3.4). Cerrar y tratar con ultrasonidos. Calcular la concentración real en microgramos de natamicina por mililitro de solución.

2.1.3.3.2 Solución de trabajo uno: natamicina (10 μg/ml)

Pipetear 100 μl de solución (2.1.3.3.1) en un matraz aforado de vidrio topacio de 10 ml y enrasar con metanol: agua: ácido acético (2.1.3.3.4).

2.1.3.3.3 Solución de trabajo dos: natamicina (0,5 μg/ml)

Pipetear 500 μl de solución de trabajo uno (2.1.3.3.2) en un matraz aforado de vidrio topacio de 10 ml y enrasar con metanol: agua: ácido acético (2.1.3.3.4).

2.1.3.3.4 Solución de metanol: agua: ácido acético (50:47:3, v/v)




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Medir con una probeta 500 ml de metanol (2.1.3.2.1) y verterlos en un matraz aforado

de 1 l. Añadir 470 ml de agua (2.1.3.2.2) y agitar para mezclar. Añadir 30 ml de ácido

acético (2.1.3.2.3) y agitar bien.

2.1.3.3.5 Metanol, ácido acético al 3%

Verter con una probeta 30 ml de ácido acético (2.1.3.2.3) en un matraz aforado de 1 l.

Enrasar con metanol (2.1.3.2.1) y agitar bien.

2.1.3.3.6 Agua, ácido acético al 3%

Verter con una probeta 30 ml de ácido acético (2.1.3.2.3) en un matraz aforado de 1 l.

Enrasar con agua (2.1.3.2.2) y agitar bien.

2.1.4 EQUIPO

NOTA: los instrumentos se indican sólo cuando son especializados o de

especificaciones determinadas; se supone que se cuenta con el material de vidrio y el

equipamiento habitual de laboratorio.

2.1.4.1 Cromatógrafo de líquidos (LC)

Provisto de inyector automático, con bucle de inyección de 100 μl y espectrómetro

de masas de alta resolución.

2.1.4.1.1 Columna de LC

Capaz de conseguir picos reproducibles de natamicina y de separarlos de los picos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra o de los disolventes utilizados.

NOTA: las condiciones operativas deben optimizarse en función del equipo

utilizado para el análisis.

2.1.4.1.2 Análisis HPLC

Se ha observado que la columna y los parámetros siguientes son adecuados:

Columna: Waters Sunfire C18, 150 x 2,1 mm, 3,5 µm

Temperatura de la columna: 30 °C

Velocidad de flujo: 0,25 ml/min

Volumen de inyección: 20 µl

Fase móvil A: agua:ácido acético, 97:3 (v/v) (2.1.3.3.6)

Fase móvil B: metanol:ácido acético, 97:3 (v/v) (2.1.3.3.5)

Tiempo de elución: 30 min

Cubeta del muestreador automático: 8 °C




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Gradiente:

Tiempo (min) Fase móvil A (%) Fase móvil B (%)

0 90 10

25 10 90

27 10 90

27,1 90 10

30 90 10

2.1.4.2 Detección por espectrometría de masas (LC-HR/MS)

Modo de ionización: electrospray positivo

Resolución de masa: m/z/m/z

Diana AGC: intervalo dinámico elevado

Tiempo máx. de inyección: 50 ms

Intervalo de exploración: m/z 480-670

Gas de barrido: 60 l/min

Gas auxiliar: 5 l/min

Tensión del spray: 3,75 V

Natamicina: m/z 666,31069 [M+H]+. m/z de confirmación

del ion 503,22672

Tiempo de retención: 16,5 min

2.1.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Las muestras deben agitarse para garantizar la homogeneidad antes de obtener

submuestras.

2.1.5.1 Análisis de cribado

Pipetear 2 ml de muestra de cada vino en viales eppendorf de 2 ml para centrífuga.

Añadir 0 μl y 20 μl, respectivamente, de la solución de trabajo dos de natamicina de

0,5 μg/ml (2.1.3.3.3) a los viales. Esto equivale a añadir 0 μg/l l y 5 μg/l de natamicina.

Agitar los viales durante un minuto y a continuación centrifugar durante 10 min a

14.000 rpm. Filtrar una alícuota a través de un filtro PTFE de 0,2 μm en un vial topacio




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de 2 ml. Analizar mediante LC-HR/MS (apartado 6) y calcular la concentración de

natamicina de la muestra (apartado 7).

Si la concentración de natamicina calculada es inferior a 5 μg/l, informar como <5 μg/l.

Si es superior a 5 μg/l, pasar al apartado 5.2.

2.1.5.2 Cuantificación

Determinación de la natamicina en muestras con una concentración estimada superior

a 5 μg/l. Pipetear 2 ml de vino en cinco viales eppendorf de 2 ml para centrífuga y

añadir 0 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl y 50 μl, respectivamente, de solución de trabajo de

natamicina uno (2.1.3.3.2) a los viales. Esto equivale a añadir 0 μg/l, 25 μg/l, 50 μg/l,

100 μg/l y 250 μg/l de natamicina. Agitar los viales durante un minuto y a continuación

centrifugar durante 10 min a 14.000 rpm. Filtrar una alícuota a través de un filtro PTFE

de 0,2 μm en un vial topacio de 2 ml. Analizar mediante LC-HR/MS (apartado 6) y

calcular la concentración de natamicina de la muestra (apartado 7).

2.1.6 ANÁLISIS

NOTA: al iniciar las medidas hay que examinar la estabilidad de la línea base y la

linealidad de la respuesta del detector, junto con la verificación del límite de detección.

Mantener las mismas condiciones operativas durante las medidas de todas las

muestras y los patrones de calibración. Identificar los picos de la natamicina a partir

del tiempo de retención y de su canal de masa exacto y medir las áreas de los picos.

Inyectar en la columna de LC cada una de las soluciones preparadas. Medir el área

del pico de la natamicina en cada una de las cuantificaciones y de los canales de

confirmación. En la figura 1 se presenta un ejemplo de cromatograma típico.




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Figura 1. Cromatograma LC-HR/MS típico y espectro de masa de natamicina añadida

en vino blanco a un equivalente de 50 μg/l en la muestra. C:\Xcalibur\...\data\10043_039 1/28/2010 4:12:34 AM white wine 100 rep 1

RT: 10.00 - 25.00 SM: 7B

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Time (min)

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Rela

tive A

bundance

RT: 16.04

MA: 497798

15.49 17.7912.76

RT: 16.05

AA: 261679

NL:

4.94E4

m/z=

666.30069-

666.32069

MS

10043_039

NL:

2.78E4

m/z=

503.21672-

503.23672

MS ICIS

10043_039

10043_039 #1976-2020 RT: 15.89-16.24 AV: 45 SB: 188 13.82-14.55 , 16.88-17.64 NL: 2.22E4

T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [480.00-670.00]

480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rela

tive A

bundance

666.3119

607.2148 648.3018503.2275

495.2213 533.8832

521.9441485.2170

537.9169 565.9105512.9292 573.2158 587.2675 613.9032

605.1528

504.9311

527.9621 651.3326489.0634

668.3177

547.9008

540.9152

555.2775 577.9591 629.3513

622.9182

661.4067643.2388

Representar gráficamente el área del pico del canal de cuantificación principal frente a la

concentración en microgramos por litro (μg/l) de natamicina añadida. Determinar la

pendiente, la ordenada en el origen y el coeficiente de correlación de la recta de

regresión. La curva de calibrado debe ser rectilínea y el coeficiente de correlación ha de

ser 0,99 o mayor.

2.1.7 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

2.1.7.1 Cálculo de la concentración del analito

La concentración de natamicina en la muestra en microgramos por litro (μg/l) se

calcula según la siguiente fórmula:

C = b/a

siendo C = concentración de natamicina en el vino (μg/l); a = pendiente de la recta

de regresión; b = y - ordenada en el origen de la recta de regresión.

2.1.8 CONFIRMACIÓN

La presencia de natamicina en las muestras debe confirmarse aplicando los criterios siguientes: Presencia de un pico en los dos canales de masa exactos m/z 666,31069 y m/z 503,22672 al mismo tiempo de retención. Calcular el cociente del área del pico para el principal canal de masa de cuantificación con respecto al área del pico del canal de confirmación. El criterio es que los cocientes




© OIV 2012 7

deben estar dentro del ± 25% de los obtenidos añadiendo patrones de calibración.

2.1.9 DATOS DE RENDIMIENTO DEL MÉTODO

2.1.9.1 Linealidad

El método es lineal en el intervalo de calibración de 1 a 2.640 μg/l en matrices de disolvente, vino blanco y vino tinto (figuras 2, 3 y 4).

Figura 2. Gráfico de calibración de diez puntos de natamicina añadida en

disolvente en el intervalo de 1 a 2.600 μg/l.

Tabla 1. Residuales del patrón de calibración en el disolvente.

Natamicina Conc. prevista

(µg/l) (µg/l) Residuales Residuales patrón

0 6,4 -6,4 -0,4

1,056 6,8 -5,7 -0,3

5,28 10,9 -5,6 -0,3

10,56 16,8 -6,3 -0,4

52,8 58,9 -6,1 -0,3

105,6 108,3 -2,7 -0,2

211,2 200,1 11,1 0,6

1056 1029,8 26,2 1,5

2112 2084,8 27,2 1,6

2640 2671,8 -31,8 -1,8




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Figura 3. Gráfico de calibración de diez puntos de natamicina añadida en vino blanco en

el intervalo de 1 a 2.600 μg/l.

Tabla 2. Residuales del patrón de calibración en matriz de vino blanco



0 15,5 -15,5 -0,3

1,056 15,6 -14,6 -0,3

5,28 18,8 -13,5 -0,2

10,56 23,9 -13,3 -0,2

52,8 63,6 -10,8 -0,2

105,6 109,3 -3,7 -0,1

211,2 212,8 -1,6 0,0

1056 989,0 67,0 1,2

2112 2003,2 108,8 2,0

2640 2742,7 -102,7 -1,8




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Figura 4. Gráfico de calibración de diez puntos de natamicina añadida en vino tinto en el

intervalo de 1 a 2.600 μg/l.

Tabla 3. Residuales del patrón de calibración en matriz de vino tinto



0 7,2 -7,2 -0,3

1,056 8,2 -7,1 -0,3

5,28 10,9 -5,7 -0,3

10,56 16,8 -6,2 -0,3

52,8 52,1 0,7 0,0

105,6 102,1 3,5 0,2

211,2 199,8 11,4 0,5

1056 1055,2 0,8 0,0

2112 2063,7 48,3 2,3

2640 2678,4 -38,4 -1,8

2.1.9.2 Exactitud y precisión

La repetibilidad del método se evaluó en el límite de intervención de 5 μg/l y a 200 μg/l en

matrices de disolvente, vino blanco y vino tinto (tablas 4, 5 y 6). La exactitud se evaluó

añadiendo una cantidad conocida a dos niveles distintos en vino blanco y vino tinto. A

continuación realizó el análisis un segundo analista sin conocer la concentración de

natamicina con que se había añadido. Los resultados se recogen en la tabla 7.




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Tabla 4. Repetibilidad de natamicina añadida en disolvente (metanol:agua:ácido acético

50:47:3, v/v) a dos concentraciones: 5 y 200 μg/l.

Conc.

Natamicina

Recuperaci

ón

μg/l (%)

Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 1 5,3 99,7








Media 5,8 108,5

Desviación estándar 0,3 6,2

RSD (%) 5,7 5,7









Media 235,1 111,4


RSD (%) 4,2 4,2

Tabla 5. Repetibilidad de natamicina añadida en vino blanco a dos concentraciones: 5 y

200 μg/l.

Conc.

Natamicina

Recuperaci

ón

μg/l (%)

Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 1 5,3 99,1





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Media 4,9 92,0


RSD (%) 5,9 5,9

Vino blanco 211 ng/ml rep. 1 217,6 103,1








Media 213,7 101,3


RSD (%) 2,7 2,7

Tabla 6. Repetibilidad de natamicina añadida en vino tinto a dos concentraciones: 5 y

200 μg/l.

Conc.

Natamicina

Recuperaci

ón

μg/l (%)

Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 1 5,3 99,7








Media 4,9 91,6




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RSD (%) 11,1 11,1

Vino tinto 211 ng/ml rep. 1 183,9 87,1








Media 182,0 86,2


RSD (%) 4,1 4,1

Tabla 7. Exactitud de natamicina añadida en vinos blanco y tinto a dos concentraciones:

125 y 220 μg/l.

Concentración

teórica

Concentración

obtenida

Exactitud Valor Z

(µg/l) (µg/l) (%) Vino blanco A rep. 1 125 135 108 0,50

Vino blanco A rep. 2 125 142 114 0,85

Vino blanco A rep. 3 125 138 110 0,65

Vino blanco B rep. 1 220 230 105 0,28

Vino blanco B rep. 2 220 230 105 0,28

Vino blanco B rep. 3 220 239 109 0,54

Vino tinto A rep. 1 220 213 97 -0,20

Vino tinto A rep. 2 220 234 106 0,40

Vino tinto A rep. 3 220 223 101 0,09

Vino tinto B rep. 1 125 129 103 0,20

Vino tinto B rep. 2 125 129 103 0,20

Vino tinto B rep. 3 125 120 96 -0,25

Cálculos

Cálculo del valor Z:

= (concentración obtenida - concentración téorica) / desviación estándar objetivo

Siendo:

Desviación estándar objetivo = 0,16 x concentración añadida

según Horwitz




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2.2 Determinación de natamicina (pimaricina) en el vino mediante HPLC/DAD

2.2.1 Objeto

Este método describe un procedimiento analítico de determinación de natamicina

(pimaricina) en el vino mediante HPLC. La concentración de natamicina se expresa en

microgramos por litro (μg/l) de vino.

El método descrito se ha validado internamente en el laboratorio teniendo en cuenta la

influencia de la matriz de vino (vino blanco o vino tinto, por ejemplo).

2.2.2 Fundamento

Las muestras de vino no espumoso se inyectan directamente en el sistema HPLC. Las

muestras de vino espumoso se desgasifican primero por filtración o en un baño de

ultrasonidos. El analito se separa de la matriz en una columna C8. La fracción que

contiene el analito se transfiere automáticamente a una columna C18 para mejorar la

separación. La natamicina se detecta a 304 y 319 nm. Además, se utiliza el espectro de

DAD para la identificación. La cuantificación se hace con ayuda de patrones de referencia

externos.

2.2.3 Reactivos y materiales

2.2.3.1 Reactivos

2.2.3.1.1 Agua desionizada

2.2.3.1.2 Metanol, calidad HPLC (núm. CAS 67-56-1).

2.2.3.1.3 Ácido fórmico para análisis (núm. CAS 64-18-6).

2.2.3.1.4 Ácido acético para análisis (núm. CAS 64-19-7).

2.2.3.1.5 Ácido clorhídrico 0,1 N para análisis (núm. CAS 7647-01-0).

2.2.3.1.6 Matriz de vino sin natamicina detectable

2.2.3.1.7 Natamicina >95% (núm. CAS 7681-93-8).

La pureza se verifica mediante determinación fotométrica a 291 nm, 304 nm y

319 nm en una solución de natamicina en ácido clorhídrico 0,1 N frente a un

blanco de ácido clorhídrico 0,1 N:

Datos de referencia tomados de la

bibliografía

291 nm 304 nm 319 nm

Extinción (1 Gew. % natamicina, cubeta de

1 cm)

758 1173 1070




© OIV 2012 14

Método alternativo:

Después de la dilución (p. ej., factor de dilución 20), la solución madre (2.1.3.3.1)

puede utilizarse también para la medida fotométrica; por ejemplo, pipetear 1,0 ml

de solución madre en un matraz aforado de 20 ml y enrasar con ácido clorhídrico

0,1 N. Medir contra un blanco con la misma composición de disolventes que la

solución madre diluida.

2.2.3.2 Preparación de la fase móvil

2.2.3.2.1 Soluciones para la fase móvil:

2.2.3.2.1.1 5 ml de ácido acético añadidos a 2 l de metanol

2.2.3.2.1.2 5 ml de ácido acético añadidos a 2 l de agua desionizada

2.2.3.2.2 Eluyente 1: metanol-ácido acético / agua desionizada-ácido acético (65 /

35)

2.2.3.2.3 Eluyente 2: metanol-ácido acético / agua desionizada-ácido acético (80 /

20)

2.2.3.3 Preparación de las soluciones madre y patrón

Todas las soluciones tienen una estabilidad limitada y deben conservarse en la oscuridad

y en refrigerador. La solución madre (2.1.3.3.1.1) tiene un periodo de validez de varias

semanas, pero la concentración debe comprobarse poco antes de usarla (véase, por

ejemplo, Método alternativo, 2.2.3.1.7). Las diluciones I (2.2.3.3.1.2) y II (2.2.3.3.1.3) y las

soluciones patrón (2.2.3.3.2) deben prepararse a diario.

2.2.3.3.1 Preparación de la solución madre y de las diluciones

2.2.3.3.1.1 Solución madre (aproximadamente 100 mg/l)

Pesar unos 5 mg de natamicina (3.1.7) y transferirlos con metanol a un matraz

aforado de 50 ml. Añadir 0,5 ml de ácido fórmico, comprobar que la natamicina

esté completamente disuelta, atemperar a 20 °C y enrasar con metanol.

2.2.3.3.1.2 Dilución I (aproximadamente 5 mg/l)

Pipetear 2,5 ml de solución madre (2.1.3.3.1) en un matraz aforado de 50 ml y

enrasar con agua desionizada.

2.2.3.3.1.3 Dilución II (aproximadamente 1 mg/l)

Pipetear 4 ml de dilución I (2.2.3.3.1.2) en un matraz aforado de 20 ml y enrasar

con el vino que servirá de matriz (2.2.3.1.6).




© OIV 2012 15

2.2.3.3.2 Preparación de las soluciones patrón

Para preparar las soluciones patrón, diluir la dilución II (2.2.3.3.1.3) a las

concentraciones deseadas con la matriz de vino (2.2.3.1.6); por ejemplo, 50 μl en

un matraz aforado de 10 ml equivale a 5 μg/l:

Matraz aforado 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

Volumen de dilución II (μl) 50 100 200 400 500 1000 3700

Cantidad de natamicina

(μg/l)

5 10 20 40 50 100 370

2.2.4. Equipos

El material de laboratorio normal, y en particular:

2.2.4.1 Aparato para HPLC-DAD con una válvula HPLC de 6 tomas y dos bombas

isocráticas o una bomba de gradiente para permitir el fraccionamiento

2.2.4.2 Columna RP-8 para HPLC

2.2.4.3 Columna RP-18 para HPLC

2.2.4.4 Fotómetro

2.2.5 Muestreo

Las muestras de vino no espumoso se inyectan directamente en el sistema HPLC. Las

muestras de vino espumoso se desgasifican primero por filtración o en un baño de

ultrasonidos. Si las muestras deben guardarse, las condiciones de conservación

correctas son frío y oscuridad.

2.2.6. Procedimiento

2.2.6.1 Condiciones operativas de HPLC

Se ha observado que las columnas y los parámetros siguientes son adecuados:

Columna 1: columna C8 (p. ej. Select B 125 x 4 mm/5 μm de fase desactivada

[endcapped], Merck)

Fase móvil: eluyente 1 (2.2.3.2.2) a temperatura ambiente

Velocidad de flujo: 1 ml/min

Columna 2: columna C18 (p. ej. Lichrospher 125 x 4 mm/5 μm, Merck)

Fase móvil: eluyente 2 (2.2.3.2.3) a 30 °C

Velocidad de flujo: 1 ml/min




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Volumen de inyección: 500 µl

Detección UV: 304 y 319 nm

Ventana de fraccionamiento: la posición de la ventana de fraccionamiento debe

comprobarse antes del siguiente análisis (figura 1).

El intervalo de la ventana debe ajustarse a 0,5 min

antes y después de que eluya el pico deseado de la

columna C8.

Fig. 1 Columna 1 Fig. 2 Columna 2

Ventana de fraccionamiento Vino blanco marcado con natamicina (50 μg/l)

2.2.6.2 Identificación y confirmación

Los picos se identifican por comparación de los tiempos de retención de patrones y

muestras para las dos longitudes de onda medidas (304 y 319 nm). Con el sistema

cromatográfico y los parámetros de 2.2.6.1, el tiempo de retención de la natamicina es de

aproximadamente 12,9 min (fig. 2).

El espectro DAD se utiliza para confirmar los resultados positivos (figuras 3 y 4).




© OIV 2012 17

Fig. 3 Espectros 3D-DAD de la natamicina Fig. 4 Espectros DAD de la natamicina

2.2.7 Cálculo y expresión de los resultados

Se prepara una curva de calibrado con las soluciones patrón (2.2.3.3.2) utilizando los

cromatogramas medidos a 304 nm. La natamicina se cuantifica por el método del patrón

externo. Se genera una curva de calibrado lineal comparando las áreas de los picos y las

concentraciones correspondientes. El coeficiente de correlación debe ser de 0,99 como

mínimo.

Los resultados se expresan en μg/l.

2.2.8 Datos de rendimiento del método

Límites de detección y de cuantificación

Los límites de detección y de cuantificación se determinaron según DIN 32645

(determinación directa: medida múltiple de una muestra de matriz de blanco, n = 10, y

una curva de calibración que cubra todo el intervalo de trabajo).

Límite de detección: 2,5 µg/l

Límite de cuantificación: 8,5 µg/l

Linealidad

La linealidad en la matriz de vino se ha confirmado en el intervalo de calibración de 5 μg/l

a 100 μg/l (fig. 5).




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Fig. 5 Gráfico de calibración de seis puntos de natamicina añadida en una matriz de vino blanco en el

intervalo de 5 a 100 μg/l, R2 = 0,9999.

2.2.9 Exactitud y precisión

La exactitud y la repetibilidad se han evaluado añadiendo una cantidad conocida de

natamicina en vinos blanco, rosado y tinto y midiendo cada muestra cinco veces. Los

resultados se recogen en la tabla 1.

Matriz Contenido de

natamicina en la

matriz (μg/l)

Contenido de

natamicina añadida

(μg/l)

Contenido de

natamicina

medida (μg/l)

Tasa de

recuperación

(%)

Valor Z

Vino blanco n. d. 5,02

5,04 100,4 0,0

4,70 93,6 -0,2

5,12 102,0 0,1

5,29 105,4 0,2

4,97 99,0 0,0

Media 5,02 100,1

Desviación estándar 0,22

RSD (%) 4,3

Repetibilidad r 0,85

Vino rosado n. d. 5,02

4,79 95,4 -0,1

4,83 96,2 -0,1

4,76 94,8 -0,1

4,79 95,4 -0,1

4,73 94,2 -0,2

Media 4,78 95,2




© OIV 2012 19


RSD (%) 0,78


Vino tinto n. d. 5,02

4,61 91,8 -0,2

4,65 92,6 -0,2

4,89 97,4 -0,1

4,67 93,0 -0,2

4,34 86,5 -0,4

Media 4,63 92,3


RSD (%) 4,2


Vino tinto n. d. 21,2

19,73 93,1 -0,2

20,66 97,5 -0,1

21,16 99,8 0,0

19,73 93,1 -0,2

19,58 92,4 -0,3

Media 20,17 95,2


RSD (%) 3,5

Repetibilidad r 2,7

Vino tinto n.d. 53,2

51,84 97,4 -0,1

51,91 97,6 -0,1

51,42 96,7 -0,1

50,12 94,2 -0,2

50,62 95,2 -0,2

Media 51,18 96,2


RSD (%) 1,5

Repetibilidad r 3,1

Tabla 1. Exactitud de natamicina añadida en vinos blanco, rosado y tinto; n. d. = no detectado; límite de

detección de 2,5 μg/l

Cálculos (Tabla 1):

Repetibilidad r = desviación estándar * t 4;0,95 * 2 1/2

Valor Z = (cantidad medida - cantidad añadida) / desviación estándar objetivo *

* según Horwitz

desviación estándar objetivo = 1/100 * cantidad añadida * 2(1 - 0,5 log de la cantidad añadida)




© OIV 2012 20

Bibliografía

DIN 32645:2008-11

UV- und IR-Spektren wichtiger pharmazeutischer Wirkstoffe, Editio Cantor Aulendorf, 1978, Herausgeber/ Editior Hans-Werner Dibbern in Zusammenarbeit mit E. Wirbitzki

Macarthur R, Feinberg M, Bertheau Y, 2010, Construction of measurement uncertainty

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interlaboratory validation data, Journal of the Association of Official Analytical Chemists,

93(3), 1046 – 1056.

FV 1351. Dominic Roberts and Adrian Charlton. Determination of natamycin in wine by

liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry: standard operating

procedure and method performance data. OIV SCMA marzo 2010.

FV 1355. Tomasz Brzezina. Natamycin in Wein. OIV SCMA marzo 2010.

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