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Cinética enzimática de reacciones multisustratos

2013

Curva de progreso de una reacción enzimática

Vi o Vo; estado estacionario; equilibrio

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Gráfico de Michaelis-MentenLineweaver-Burk

Vm; Km; eficiencia catalítica

Reacción enzimática es una caja negra

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Ecuaciones cinéticas

f:forward, r: reverse

Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland

1.- Reacción Ordenada o secuencial

Formación de complejo ternario

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Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland

Formación de complejo ternario2.- Reacción al azar o desordenada

Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland

Formación de un intermediarioReacción ping pong o con doble desplazamiento

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Objetivo de estas clases es distinguir cinéticamente los tres tipos de esquemas cinéticos

1.- Reacción Ordenada o secuencial

Formación de un intermediarioReacción ping pong o con desplazamiento

2.- Reacción al azar o desordenada

Formación de complejo ternario

¿Cómo distinguir si la catálisis de la enzima en estudio transcurre con la unión primero de todos los sustratos para formar un complejo ternario o

cuaternario o bien se forma un intermediario entre la enzima y uno

de los sustratos?

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Ecuaciones que representa una reacción ordenada con dos Sustratos

(a y b) y dos Productos (p y q)

vi

Trabajando en vi, poco producto ¿simplificación?

Ecuación simplificada de una reacción ordenada

Reordenación a curva hiperbólica

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Ecuación simplificada de una reacción ordenada

Graficación de 1/Vapp(intercepto) vs 1/B

Kmapp/ Vapp(pendiente) vs 1/B

Gráfico de Lineweaver-Burk a distintas concentraciones de sustrato B

Líneas que se cruzan en 2° o 3er cuadrante o eje X al varias sustrato fijo

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Graficos representativos de una reacción ordenada o al azar

Igual patrón de líneas que se cruzan al variar uno u otro de los S

Gráficos secundarios

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Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland

Formación de un intermediarioReacción ping pong o con desplazamiento

Grafico Lineweaver-Burk de una reacción ping pong o de doble desplazamiento

Líneas paralelas al varias el sustrato fijo

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Reacción ping-pong

Sólo gráfico secundario Intercepto vs 1/B o 1/A

Gráfico secundario para una reacción ping pong: Intercepto vs 1/B

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RESUMEN DE ESTUDIOS EN VELOCIDADES INICIALES

Líneas que se cruzan: ⇒ Reacciones que transcurrencon la formación de un complejo ternario (Reacción Ordenada y Reacción al azar)

En gráfico de 1/vi en función de 1/S se pueden distinguir:

Líneas paralelas: ⇒ Reacciones que transcurren con la formación de un intermediario (Covalente)

Reacción Ping Pong

¿Cómo distinguir entre una reacción ordenada de una al azar?

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Estudios de inhibición por producto: secuencia entrada de sustrato y salida de productos

En ausencia de P y adicionando Q

Estudios de inhibición por producto: secuencia entrada de sustrato y salida de productos

En ausencia de Q y adicionando P

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Efecto de la adición de productos sobre los parámetros cinéticos

• Si Producto y Sustrato se unen a la misma forma enzimática se espera que sea inhibidor competitivo

• Si Producto y Sustrato se unen a formas enzimáticas distintas se espera que sea un inhibidor no competitivo mixto (Inh Mixto)

Inhibidor competitivo

Inhibidor (I) se une a la misma forma enzimática que el S (sustrato), pero no implica necesariamente que la unión sea en el sitio activo. Hay competencia por la misma forma enzimática E (enzima libre)

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Inhibidor competitivo

A conc altas de sustrato se alcanza la misma Vm, pero aumenta Km (mayor cantidad de S para semisaturar a la E)

Inhibidor no competitivo mixto

El inhibidor (I) se une a la E libre y al complejo ES

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Inhibidor no competitivo mixto

Tipos de inhibición esperables por presencia de producto: Reacción ordenada

Inhibidor competitivo:Competencia por la misma forma enzimática que el S (último P con primer S)

Inhibidor no competitivo mixto:Se une a una distinta formaEnzimática que el S

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Tipos de inhibición por productoReacción ordenada

Producto S variableP AP BQ AQ B

Tipo inhibiciónMixtaMixtaCompetitivaMixta

Tipos de inhibición por producto:Reacción al azar/desordenada

Sustrato var Sustrato Fijo Prod adicionado Tipo Inhibición

Todas las inhibiciones son competitivas

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Tipos de inhibición por producto:Reacción ping pong/intermediario covalente

Producto S variableP AP BQ AQ B

Tipo inhibiciónMixtaCompetitivaCompetitivaMixta

RESUMEN DE ESTUDIOS EN PRESENCIA DE UNO DE LOS PRODUCTOS

- Siempre se observa inhibición competitiva entre elprimer Sustrato (A) y último producto (Q).

- Hay inhibición competitiva cuando el Producto compite por la misma forma enzimàtica.

- Hay inhibición no competitiva mixta cuando elProducto y el Sustrato se unen a distintas formas enzimáticas.

- Patrón de inhibición característico de cada tipo de mecanismo cinético.

- Permite demostrar secuencia de entrada de Sustratosy salida de Productos.

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Graficaciones lineales de la Hipérbola equiláteraGráfico de Hanes-Woolf

Graficaciones lineales de la Hipérbola equilátera: Grafico de Eadie-Hofstee

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Tarea para Laboratorio de Cinética multisustratos

• Traer individualmente para este jueves 14 los cambios en los lugares donde se determinan Km y Vm al graficar según

• Hanes-Woolf• Eadie-Hofstee

al agregar a) un inhibidor competitivo y b) un no competitivo mixto

BIBLIOGRAFIA• Voet y Voet. Bioquimica

• A. Cornish-Bowden. Fundamentals of Enzyme kinetics

• Cleland, W. W. (1963) The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. Biochim. Biophys. Acta 67, 104–137.