1 Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes...

1

Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante

de sus Genes Represores en la Leucemia Mieloblástica Aguda

Ana Belén Valencia MartínezServicio de Hematología

Hospital Universitario La Fe

Valencia, 28 Septiembre 2010

2

IntroducciónLeucemia Mieloide Aguda

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad

neoplásica en la que se produce una proliferación anómala

de células inmaduras (blastos) de estirpe mieloide.

Las células blásticas proceden de un único progenitor

hematopoyético defectuoso que presenta un bloqueo en el

proceso normal de maduración así como un aumento de su

capacidad de proliferación.

Definición

3

Progenitores mieloidesCMH

Eritrocitos

Plaquetas

Granulocitos

Macrófagos

Mutación Mutación Expansión clonal

Hematopoyesis normal

Leucemia Mieloide Aguda


4


Clasificación OMS 2008 LMA con anomalías genéticas recurrentes t(8;21)(q22;q22)

inv(16)(p13q22) o t(16;16)(p13;q22)

t(15;17)(q22;q12)

t(9;11)(p22;q23)

t(6;9)(p23;q34)

inv(3)(q21q26) o t(3;3)(q21;26)

t(1;22)(p13;q13)

LMA con mutaciones génicas específicas

LMA con displasia multilineal Con síndrome mielodisplásico previo

Sin síndrome mielodisplásico previo

Neoplasias mieloides relacionados con la terapia Agentes alquilantes / Radiaciones ionizantes

Inhibidores de la topoisomerasa II

Otras LMA LMA mínimamente diferenciada

LMA sin maduración

LMA con maduración

Leucemia aguda mielomonocítica

Leucemia aguda monoblástica o monocítica

Leucemia aguda eritroide

Leucemia aguda megacarioblástica

Leucemia aguda basofílica

Panmielosis aguda con mielofibrosis

Sarcoma mieloide

5

Favorable t(8;21); inv(16), t(15;17)

Intermedio Normal, +8, +21, +22, abn(11q23), del(9q), otras

Desfavorable -5/del(5q), -7/del(7q), abn(3q), 20q, 21q, 17p, t(6;9), t(9;22),

cariotipos complejos con 3(5) anomalías

RC (%) RR (%) SG (%)

84 - 91 21 - 35 55 - 65

76 - 86 51 - 67 24 - 41

63 - 22 63 - 22

Extraído de Grimwade et al. Blood 1998

40 - 50%

Citogenética


6

Alteraciones moleculares


Gen Alteración Pronóstico

FLT3 Duplicaciones en tándem Adverso

NPM1 Mutación Favorable

CEBPA Mutación Favorable

MLL Duplicaciones en tándem Adverso

EVI1 Sobreexpresión Adverso

BAALC Sobreexpresión Adverso

WT1 Sobreexpresión Adverso

ERG Sobreexpresión Adverso

MN1 Sobreexpresión Adverso

ABCG2 Sobreexpresión Adverso

8

N

NH2

N

O1

2

34

5

6

N

NH2

N

O1

2

34

5

6

citosina 5-metilcitosina

DNMTCH3

• En el inicio y la progresión del cáncer intervienen tanto

alteraciones genéticas como epigenéticas.

• Asociadas a silenciamiento génico.

• Las alteraciones epigenéticas son reversibles.

S-adenosil-methionine

IntroducciónMetilación del ADN

9

• Los dinucleótidos CpG se agrupan en las regiones

promotoras de algunos genes (islas CpG).

• Islas CpG no metiladas en regiones promotoras de

algunos genes.

Exón 1 Exón 2 Exón 3


10



Región promotora

X

Célula tumoral

Célula normal


11

AngiogénesisTransd. señalAdhesiónApoptosisReparaciónCiclo celular

p15, p16, p14, p73, p21, p57,

Rb

hMLH1hMLH2MGMTBRCA1

DAPKTMS1APAFCasp8

E-CADTIMP3

MASPINFAT

APC, PTENER, SOCS1

RASSF1HIC1

THBS1

Diferenciación

Apoptosis

Proliferación

Inestabilidad genómica

Genes hipermetilados en cáncer


12

DNMT

Azacitidina

Decitabina

Agentes hipometilantes

ACGTCACGA

AAzGTCAAzGA

DNMT


CH3 CH3

13

Vías de señalización

IntroducciónLa vía de señalización Wnt

JAK/STAT

PI3K/AKT

PI3K/AKT

WNT

14

Descripción de la vía Wnt

• Embriones: Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos.


• Adultos: Mecanismos de renovación, diferenciación y

proliferación de las células madre.

• Implicada en distintos tumores.

15


β-Catenina

β-cateninaLEF

TCF

ciclina D1 / c-myc

Groucho

GSK-3β

CKLα

APC

axina

P P P

Fz

Lrp

GSK-3β

CKLα

APC

axina

β-Catenina

LEF

TCF

ciclina D1 / c-myc

Groucho

Proteosoma

DKK

sFRP

Vía Wnt inactiva

LrpWnt

Fz

Vía Wnt activa

Citoplasma Citoplasma

16

Vía Wnt activaVía Wnt inactiva


P P P

Fz

Lrp

GSK-3β

CKLα

APC

axina

β-Catenina

LEF

TCF

ciclina D1 / c-myc

Groucho

Proteosoma

DKK

sFRP

Vía Wnt inactiva

LrpWnt

FzFzGSK-3β

CKLα

APC

axina

P P P

β-Catenina

LEF

TCF

ciclina D1 / c-myc

Groucho

Proteosoma

GSK-3β

CKLα

APC

axina

Citoplasma Citoplasma

17


β-Catenina

β-cateninaLEF

TCF

Groucho

GSK-3β

CKLα

APC

axina

DKK

sFRP

LrpWnt

FzCáncer de colon

Carcinomas hepatocelulares

Cáncer de colonMelanomas

Leucemias

Cáncer de colonNeoplasias hematológicas

Desregulación de la vía Wnt

18

Hypothesis

Alterations of different components of the Wnt pathway have

been found in some hematological malignances providing

evidence for the involvement of the Wnt pathway in

leukemogenesis.

We hypothesize that the functional loss of Wnt antagonists

by promoter hypermethylation is a possible mechanism

contributing to activation of the Wnt pathway in AML and that

this loss may be involved in the pathogenesis and prognosis

of this disease.

19

Objectives

1. To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1,

sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of

myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients

diagnosed with de novo non-M3 AML.

3. To demonstrate the association between aberrant methylation

of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML,

analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1,

TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures

treated with DAC.

2. To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt

antagonists in gene expression using the hypomethylating

agent decitabine (DAC).

20

4. To analyse the association of any individual gene and the

methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated

genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the

clinical and biological characteristics of the AML patients.

Objectives

5. To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation

of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients.

21

Líneas celulares

Metodología Líneas celulares y pacientes

• Kasumi-1

• KG-1a

• HL-60

• THP-1

Pacientes

• 184 pacientes con LMA

• 110 hombres, 74 mujeres

• Mediana edad: 60 años

• Citogenética:

• FLT3-ITD (n = 159): 31

• NPM1 mutado (n = 105): 27

Favorable = 15

Intermedio = 111

Adverso = 38

22





Objectives





treated with DAC.




23

Métodos Estudio del estado de metilación

PCR específica de metilación

CpGBisulfito sódico

UpG

CpG

CH3

CpG

CH3

MSPCebadores M Cebadores U

P15 - case P15 + case P15 - controlP15 - case P15 + case P15 - control P15 - case P15 + case P15 - controlP15 - case P15 + case P15 - control

M U M U

24

Resultados Estudio del estado de metilación

Líneas celulares

Metilación genes antagonistas Wnt

Pacientes, n = 184

Genes n Frecuencia (%)

sFRP1 75 41

DKK1 58 32

sFRP2 56 31

sFRP5 40 22

DKK3 27 16

sFRP4 7 4

Grupo A (0-1 genes metilados): 57%

Grupo B (2-6 genes metilados): 43%

25





Objectives





treated with DAC.




26

Métodos Reactivación de la expresión con DAC

Tratamientos con DAC

Día 0

Día 4

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Extracción ARN

Control

Control

RNA

RNA RNA

DAC 2µM

DAC 2µM

RNAKasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

27

Métodos Reactivación de la expresión con DAC

Tratamientos con DAC

Día 0

Día 4

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Extracción ARN

Control

Control

RNA

RNA RNA

DAC 2µM

DAC 2µM

RNAKasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

RNA cDNA

Genes antagonistas

28

Resultados Reactivación de la expresión con DAC

DAC 2µMDía 4

Con

trol

DAC

ttxo

Los

inte

rval

os m

uest

ran

un lC

de

la m

edia

al 9

5,0%

Las

barr

as m

uest

ran

Med

ias

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00

25,0

0

50,0

0

75,0

0

sF

RP

1

sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1

DK

K3

Ratio Normalizado de Expresión %

Con

trol

DAC

ttxo

Los

inte

rval

os m

uest

ran

un lC

de

la m

edia

al 9

5,0%

Las

barr

as m

uest

ran

Med

ias

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00

25,0

0

50,0

0

75,0

0

sF

RP

1

sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1

DK

K3


Control

Control

DA

C

ttxo

Los in

tervalo

s m

uestran un lC

de la

m

edia

al 95,0%

Las barras m

uestran M

edia

s

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,0

0

25

,00

50

,00

75

,00

sF

RP

1 sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1 D

KK

3


Control

DA

C

ttxo

Los in

tervalo

s m

uestran un lC

de la

m

edia

al 95,0%

Las barras m

uestran M

edia

s

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,0

0

25

,00

50

,00

75

,00

sF

RP

1 sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1 D

KK

3


DAC 2µM

Expresión genes antagonistas Wnt

Control

DAC

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,000,00

25,00

50,00

75,00

Rat

io N

orm

aliz

ado

de la

Exp

resi

ón (

%)

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,000,00

25,00

50,00

75,00

Rat

io N

orm

aliz

ado

de la

Exp

resi

ón (

%)

Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

%

sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3

Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

%

Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

%

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,000,00

25,00

50,00

75,00

100,00

Rat

io N

orm

aliz

ado

de la

Exp

resi

ón (

%)

Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

%Control

DAC

ttxo

Los intervalos muestran un lC de la media al 95,0%

Las barras muestran Medias

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,000,00

25,00

50,00

75,00

Rat

io N

orm

aliz

ado

de la

Exp

resi

ón (

%)


Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

%


Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

%Kasumi-1 KG-1a

HL-60 TPH-1

sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3

29





Objectives





treated with DAC.




30

Resultados Activación aberrante de la vía Wnt

DAC 2µMDía 4

Con

trol

DAC

ttxo

Los

inte

rval

os m

uest

ran

un lC

de

la m

edia

al 9

5,0%

Las

barr

as m

uest

ran

Med

ias

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00

25,0

0

50,0

0

75,0

0

sF

RP

1

sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1

DK

K3


Con

trol

DAC

ttxo

Los

inte

rval

os m

uest

ran

un lC

de

la m

edia

al 9

5,0%

Las

barr

as m

uest

ran

Med

ias

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00

25,0

0

50,0

0

75,0

0

sF

RP

1

sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1

DK

K3


Control

Control

DA

C

ttxo

Los in

tervalo

s m

uestran un lC

de la

m

edia

al 95,0%

Las barras m

uestran M

edia

s

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,0

0

25

,00

50

,00

75

,00

sF

RP

1 sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1 D

KK

3


Control

DA

C

ttxo

Los in

tervalo

s m

uestran un lC

de la

m

edia

al 95,0%

Las barras m

uestran M

edia

s

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,0

0

25

,00

50

,00

75

,00

sF

RP

1 sF

RP

2

sF

RP

4sF

RP

5D

KK

1 D

KK

3


DAC 2µM

1,00 2,00 3,000,00

4,00

8,00

12,00

1,00 2,00 3,000,00

4,00

8,00

12,00

1,00 2,00 3,000,00

4,00

8,00

12,00

1,00 2,00 3,000,00

4,00

8,00

12,00R

atio

Nor

mal

izad

o de

Exp

resi

ón %

Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

%R

atio

Nor

mal

izad

o de

Exp

resi

ón %

ciclina D1 TCF LEF

Rat

io N

orm

aliz

ado

de E

xpre

sión

% Kasumi-1 KG-1a

HL-60 TPH-1

ciclina D1 TCF LEF

ciclina D1 TCF LEF ciclina D1 TCF LEF

Expresión genes activadores Wnt

31

Métodos Activación aberrante de la vía Wnt

Día 0Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Control

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

Control

Proteínas

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

DAC 2µM

Kasumi-1 KG-1a

HL-60 THP-1

DAC 2µM

ProteínasDía 4

Localización β-catenina

32

Métodos Activación aberrante de la vía Wnt

Western blot

Extracción de proteínas

Fracción CITOPLASMÁTICA Fracción NUCLEAR

β-cateninaTOTALβ-tubulina

β-cateninaTOTAL

Lamin A

33


Localización β-catenina

CITOPLASMA NUCLEO

ß-catenina ß-catenina

ß-tubulina Lamin-A

-DAC +DAC -DAC +DAC

´

34


Wnt

Fz

Lrp

CH

3

CH

3

DKK

sFRP

X

X LMA+ DAC

GSK-3β

β-catenina

CKLα

APC

axina

β-cateninaLEF

TCF

ciclina D1

GSK-3β

CKLα

APC

axina

β-catenina

P P P

LEF

TCF

ciclina D1

Groucho

X

35


Wnt

Fz

Lrp

CH

3

CH

3

DKK

sFRP

X

X LMA+ DAC

GSK-3β

β-catenina

CKLα

APC

axina

β-cateninaLEF

TCF

ciclina D1

GSK-3β

CKLα

APC

axina

β-catenina

P P P

LEF

TCF

ciclina D1

Groucho

XProteosoma

36


Expresión genes activadores Wnt

Pacientes

MetiladoNo Metilado

Rat

io N

orm

aliz

ado

IC 9

5%

500

400

300

200

100

0

ciclina-D1

MetiladoNo Metilado

Rat

io N

orm

aliz

ado

95%

300

200

100

0

MetiladoNo Metilado

Rat

io N

orm

aliz

ado

IC 9

5%

300

200

100

0

-100

TCF LEF

Rat

io N

orm

aliz

ado

IC 9

5%

Rat

io N

orm

aliz

ado

IC 9

5%

Rat

io N

orm

aliz

ado

IC 9

5%

Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B

P = 0,045 P = 0,023 P = 0,021

37





Objectives



38

Resultados Asociación con características clínicas

Variable sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 Pérfil

Edad n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Sexo n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Leucocitos n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Hemoglobina n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Plaquetas n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Citogenética n.s n.s n.s 0,015 n.s n.s n.s

FLT3-ITD n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

NPM1 n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

sFRP5

No metilado Metilado

n(%) n(%) P

Citogenética

Favorable 11 (9) 4 (11)

Intermedio 91 (73) 18 (49) 0,015

Adverso 23 (18) 15 (40)

Características clínico-biológicas

39


Respuesta a la inducción

Remisión completa

Resistencia

Muerte

n.s

n.s

n.s

0,015

n.s

n.s

n.s

Resultados Asociación con características clínicas

sFRP5

No metilado Metilado

n(%) n(%) P


Remisión completa

Resistencia

Muerte

76 (62)

21 (17)

25 (21)

17 (49)

14 (40)

4 (11)

0,015


40





Objectives



41



n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Sexo n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Leucocitos n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Hemoglobina n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Plaquetas n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

Citogenética n.s n.s n.s 0,015 n.s n.s n.s

FLT3-ITD n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

NPM1 n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s

ResultadosAnálisis de supervivencia

Serie global

Características SG HR* SLE HR* SLR HR*

Edad < 0,001 2,9 < 0,001 3 0,034 2,6

Leucocitos - - -

Citogenética < 0,001 2,1 0,020 2,5 -

FLT3-ITD 0,002 2,4 0,006 2,6 0,002 3,8

sFRP1 - - -

sFRP5 0,009 2,5

DKK3 - - -

Perfil metilación - - -

* HR: Hazard Ratio

42


Pacientes ≤ 60 años Grupo citogenético INTERMEDIO

Meses

100806040200

Sup

ervi

venc

ia a

cum

1,0

,8

,6

,4

,2

,0

Meses

100806040200

Su

pe

rviv

en

cia

acu

m

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

Meses

120100806040200

Su

pe

rviv

en

cia

acu

m

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

SG

Sup

ervi

venc

ia a

cum

Meses

P = 0,035 P = 0,046

SLE SLR

P = 0,026

Meses Meses

Sup

ervi

venc

ia a

cum

Sup

ervi

venc

ia a

cum-----

FLT3-ITD Negativo

FLT3-ITD Positivo

43



Months

120100806040200

Ove

rall

Su

rviv

al

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

Months

120100806040200

Dis

ea

se-F

ree

Su

rviv

al

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

Months

120100806040200

Re

lap

se-F

ree

Su

rviv

al

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

SG

Sup

ervi

venc

ia a

cum

Meses

P = 0,011 P = 0,020

SLE SLRP = 0,032

Meses Meses

Sup

ervi

venc

ia a

cum

Sup

ervi

venc

ia a

cum

-----Grupo A (0-1 genes metilados)

Grupo B (2-6 genes metilados)

44



* HR: Hazard Ratio

Características SG HR* SLE HR* SLR HR*

FLT3-ITD 0,006 2,8 - - 0,014 4,1

Perfil metilación - - - - 0,035 3,4

45

Conclusions

1. Aberrant methylation of the Wnt antagonists is a frequent event

in cell lines of myeloid lineage and in patients diagnosed with

AML. Indeed, we have found concurrent methylation of two or

more genes in 43% of the AML patients.

2. Aberrant promoter methylation results in gene silencing of Wnt

antagonists.

46

Conclusions

3. Treatment with DAC of the AML cell lines permit the re-

expression of the Wnt antagonists and therefore, induce a

reduction of β-catenin in the nuclear localization and

downregulate the expression of the Wnt downstream genes. In

concordance, the transcription levels of cyclin D1, TCF and LEF

are significantly higher in patients showing more that two Wnt

antagonist methylated genes. This is a strong evidence that

epigenetic regulation contributes at least in part to the activation

of the Wnt pathway in AML.

47

Conclusions

4. Aberrant methylation of any individual gene and the methylation

profile are not associated with clinical and biological

characteristics of the AML patients in our series. The exception

is for aberrant methylation of sFRP5, which is detected more

frequently in patients with an adverse prognosis. Therefore,

methylation of sFRP5 might provide valuable information about

poor outcome in AML.

5. Methylation of two or more Wnt antagonistic genes is a new

adverse prognostic factor in the subgroup of patients ≤ 60 years

with intermediate-risk cytogenetics.

1 Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes...

Documents

Transcript of 1 Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes...