CINÉTICA ENZIMÁTICA Enzimología

CINÉTICA

Los experimentos de cinética examinan la relación que existe entre la cantidad de producto (P) Formado en la unidad de tiempo, Δ[P]/Δt (donde Δ es el símbolo universal de cambio), de acuerdo a las condiciones experimentales bajo las cuales se realiza la reacción.

La base de la mayoría de las determinaciones cinéticas es la observación de como la velocidad (v), de una reacción varía directamente con la concentración de cada una de las sustancias que actúan como reactivos para producir el producto.

Esta observación es expresada por medio de una ecuación de velocidad.

Por ejemplo, la ecuación de velocidad para la conversión, no enzimática, de un sustrato (S) a un producto por una reacción de isomerización sería:

Constante de Velocidad • La ecuación anterior refleja el hecho de que la

velocidad de la reacción depende de la concentración de sustrato [S]

• El símbolo k es llamada constante de velocidad e indica la relación proporcional entre [S] y la cantidad de producto producido por unidad de tiempo, es decir indica la relación que existe entre la [S] y la velocidad de la reacción.

• Cada reacción, bajo determinadas condiciones, presenta una constante de velocidad característica.

• Las unidades en que se expresa la constante de velocidad (k) serán s-1

Estado de Transición

Virtualmente todas las reacciones químicas, incluyendo las catalizadas por enzimas, se desarrollan contra una barrera energética que separa los reactivos de los productos.

Esta barrera, llamada Energía Libre de Activación, esta constituida por la diferencia entre la energía de los reactivos y un intermediario de alta-energía cuya formación es requerida para la transformación de reactivos a productos. Por ejemplo en la reacción:

A ↔ T* → B

La conversión del reactivo A al producto B requiere suficiente energía para que el reactivo A adquiera una conformación intermedia de alta energía que precede a su conversión en producto y que se ha denominado Estado Activado o Estado de Transición T*

Energía Libre de Activación

El punto máximo en esta figura expresa el valor de la Energía Libre de Activación, es decir, la diferencia en energía libre entre el(los) reactivo(s) y el estado de transición en donde se ha formado el intermediario de alta energía necesario durante la conversión de reactivos a productos. El alto valor de esta energía libre de transición, para la formación de este estado de alta energía, es lo que propicia que las reacciones químicas no catalizadas sean frecuentemente demasiado lentas.

Velocidad de la Reacción Para que puedan reaccionar, las moléculas deben

contener suficiente energía para sobrepasar la barrera que impone el alcanzar el estado de transición.

En ausencia de un catalizador, en nuestro caso en ausencia de una enzima, la cantidad de moléculas en una población de reactivos que pueden poseer esta energía es muy pequeña y la capacidad de formar producto es igualmente demasiado pequeña.

Por lo tanto la velocidad de la reacción esta determinada por el número de moléculas con energía suficiente para alcanzar el estado de transición.

En general, mientras menor sea la energía de activación y más moléculas puedan alcanzarla, la velocidad de la reacción será mayor. De esto depende el enorme valor que tienen las enzimas en los sistemas biológicos.

Las enzimas permiten que las reacciones se realicen a la velocidad adecuada dentro de las condiciones que prevalecen dentro de la célula, estableciendo una vía de reacción alternativa con una energía de activación bastante más pequeña que la requerida en la vía no catalizada de reacción.

Las enzimas no cambian las energías libres de los reactivos ni de los productos, ni tampoco cambian el punto de equilibrio de la reacción.

Las enzimas aceleran notablemente la velocidad con la cual dicho equilibrio de reacción será alcanzado.

CINÉTICA • La cinética se refiere al estudio de la velocidad de

cambio de reactivos a productos durante una reacción química

• La velocidad se refiere al cambio en la concentración de reactivos o productos por unidad de tiempo

• La tasa de cambio (rate) se refiere al cambio total en las concentraciones por unidad de tiempo

• Velocidad inicial es el cambio en la concentración de reactivos o productos inmediatamente después de que la reacción se inicia, es decir cuando la reacción es lineal.

La derivación de la primera ecuación de velocidad para una reacción catalizada por enzimas fue derivada en 1903 por Henri y se basó en los siguientes supuestos: E + S ES E + P 1. La enzima es un catalizador (propuesto por Berzelius en 1835-1837). 2. La enzima y el sustrato reaccionan rápidamente para formar un complejo enzima- sustrato (propuesto en 1902 por Brown) 3. Sólo 1 sustrato y un complejo enzima-sustrato están involucrados, y el complejo ES se rompe directamente para formar E libre y producto. 4. La enzima, el sustrato y el complejo enzima-sustrato están en equilibrio, esto es la velocidad a la cual ES se disocia a E + S es mucho más rápida que la velocidad a la cual ES se rompe para formar E + P. 5. La [S] es mucho mayor que la [E], de modo que la formación del complejo ES no altera la [S]. Los paréntesis cuadrados [] indican concentraciones. 6. La velocidad de la reacción está limitada por el rompimiento del complejo ES para formar E libre y P (etapa limitante). 7. La velocidad es medida durante tiempos muy cortos, de modo que la velocidad de la reacción reversa es insignificante

Otras condiciones para la cinética de tipo Michaelis-Menten

Para que la cinética enzimática responda a lo propuesto por Michaelis-Menten, algunas condiciones secundarias, pero importantes, deben ser mantenidas durante la reacción: La Temperatura, la fuerza iónica, el pH, y otras constantes físicas que puedan afectar la velocidad de la reacción deben permanecer constantes Cada molécula de enzima debe actuar en una molécula de sustrato en cada ocasión La enzima debe permanecer sin ninguna modificación, ni en su estructura, ni en su concentración, durante todo el tiempo que dure la determinación de la reacción.

ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

La ecuación de Michaelis-Menten describe como varía la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas de acuerdo a la concentración de sustrato:

Para utilizar la ecuación de Michaelis-Menten deben asumirse diferentes cosas: Las concentraciones relativas de E y S: La concentración de sustrato

([S]) es mucho mayor que la concentración de enzima ([E]), de manera que la proporción de sustrato fijo a la enzima es siempre relativamente pequeña.

La reacción esta en equilibrio: [ES] no cambia durante el tiempo (la reacción se asume en equilibrio de flujos), es decir, la velocidad de formación de ES es igual a la velocidad de su transformación en E + S y en E + P).

Velocidad Inicial: Deben usarse velocidades iniciales (vo). Esto significa que la velocidad de la reacción debe determinarse tan pronto como el sustrato y la enzima son mezclados. En dicho tiempo, la concentración de productos es despreciable y, por lo tanto, la reacción inversa de productos a sustratos puede ser ignorada.

Las enzimas aumentan las velocidades de las reacciones químicas sin ser alteradas en el proceso de conversión de reactivos a productos

Esta conducta define, precisamente, a un catalizador Las enzimas aumentan las velocidades de reacción

disminuyendo la cantidad de energía requerida para formar un complejo reactivo, activado, competente para formar productos

Esto ocurre por medio de la formación de un complejo entre la enzima y el sustrato (ES)

La velocidad a la cual ocurre la reacción (1) es consecuencia de lo siguiente:

El número posible de choques entre S y E, que es directamente proporcional al producto de sus concentraciones [S][E] El número de choques por un tiempo determinado capaces de producir reacción, el cual será proporcional al número de choques posibles Así pues, la velocidad de la reacción será proporcional a [S][E]:

Velocidad1 (v1) = k1 [S][E] En donde k1 es la constante de velocidad

La velocidad a la cual ocurre la inversa de la reacción (1) puede deducirse del siguiente modo:

Una determinada cantidad de E liberará cierta cantidad de S durante el tiempo en que la reacción progresa

La velocidad de la reacción inversa será entonces directamente proporcional a ES Velocidad2 (v2) = k2 [ES] En donde k2 es la constante de velocidad

La velocidad a la cual ocurre la reacción (2) puede deducirse del siguiente modo:

Una determinada cantidad de E1 producirá cierta cantidad de P durante un tiempo definido de la reacción

La velocidad de producción de P será entonces directamente proporcional a [E1] Velocidad3 (v3) = k3 [ES] En donde k2 es la constante de velocidad

Cinética de Michaelis-Menten (1) • Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la

concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando la enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:

v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES]

Los paréntesis cuadrados [] indican concentraciones

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario,

según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción. Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3):

v1 = v2 + v3 Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los

productos es constante: v = v3 = k3 [ES] = constante.

Cinética de Michaelis-Menten (3) Como v1=v2+v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES], queda que:

En donde:

Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la KM un parámetro cinético importante. Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

Cinética de Michaelis-Menten (4) Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son

constantes. Vamos a considerar dos casos extremos: A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3

[ET]/KM) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.

A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando toda la enzima disponible se encuentra unida al sustrato.

Cinética de Michaelis-Menten (5)

Si introducimos el parámetro Vmax = k3 [ET] en la ecuación general de la velocidad,

obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

A valores bajos de [S], la velocidad inicial, Vi, aumenta casi linealmente al aumentar [S].

Pero según [S] aumenta, el incremento en Vi disminuye (formando una hipérbola rectangular).

La asímptota de esta curva representa la velocidad máxima de la reacción, designada Vmax

La concentración de sustrato que produce una Vi que sea igual a la mitad de Vmax se designa como constante de Michaelis-Menten, Km (llamada así por los investigadores que desarrollaron este estudio de la cinética enzimática).

La mayoría de las enzimas muestran cinética del tipo de Michaelis-Menten, en la cual la gráfica de la velocidad inicial (vo) contra la concentración de sustrato ([S]), es de tipo hiperbólico.

Orden de Reacción Orden de Reacción: Se refiere al número de moléculas de reactivo que deben estar presentes para producir un producto. Un S unimolecular S → P es una reacción de primer orden. Un 2S bimolecular 2S → P es una reacción de segundo orden. Un bimolecular S1 + S2 → P es de segundo orden: de primer orden en S1 y de primer orden en S2.

• El orden de la reacción esta dado por los exponentes de las

concentraciones de reactivos en la ley de velocidad. – v = k[A]n

• n=0, orden cero (no depende de [A] • n=1, primer orden • n=2, segundo orden

– v = k[A]2[B] • Segundo orden en A, primer orden en B, reacción de

tercer orden

Significado de Km

• Km es una constante • Km es una constante derivada a partir de

constantes de velocidad: (k-1 + k2)/k1 • Km es, siendo verdaderas las condiciones

supuestas ciertas por Michaelis-Menten, una estimación de la constante de disociacion del complejo ES para dar E + S, a partir de (k-1/k1)

• Km pequeña significa ES en unión fuerte; • Km alta significa ES en unión débil

CINÉTICA DE TIPO MICHAELIS-MENTEN

Características de Km: la constante de Michaelis es característica de cada enzima y su sustrato particular, y refleja la afinidad de la enzima por dicho sustrato.

La Km es numéricamente igual a la concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad máxima de la enzima, ½Vmax.

La Km no depende de la concentración de la enzima. Una Km numéricamente pequeña, refleja una gran afinidad por el

sustrato, ya que bajas concentraciones de sustrato son suficientes para saturar al 50% de la enzima – es decir, para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, ½Vmax.

Una Km numéricamente grande, refleja una baja afinidad de la enzima por su sustrato, ya que son necesarias grandes concentraciones de sustrato para saturar el 50% de la enzima.

• Vmax es una constante • Vmax es la velocidad máxima teórica de la reacción

– pero, en realidad, nunca se alcanza • Para alcanzar la velocidad máxima se requiere que

[S] >> [E] y que TODAS las moléculas de enzima estén unidas al sustrato.

• Vmax se alcanza asintóticamente a medida que la concentración de sustrato aumenta

Gráfica de Dobles Recíprocos o de Lineweaver-Burk

En la práctica la determinación de la constante de Michaelis-Menten (Km) y de la velocidad máxima a partir de una gráfica hiperbólica no nos proporciona un valor suficientemente preciso.

Por esta razón, Lineweaver y Burk decidieron cambiar la ecuación de Michaelis-Menten tomando los valores recíprocos de la V y la [S] generando una gráfica de dobles recíprocos.

Esto proporciona una gráfica lineal del recíproco de la velocidad contra el recíproco de la concentración de sustrato, que nos proporciona los valores exactos de la Km en el intercepto de la línea en el eje de las abscisas y el valor exacto de la velocidad máxima (Vmax) en el intercepto del eje de las ordenadas

Puede ser simplemente transformada tomando los inversos de ambos miembros, lo cual nos proporcionará:

Separando los componentes del numerador en el segundo miembro de esta ecuación, nos da:

Que se simplifica fácilmente para dar finalmente:

La Ecuación de Michaelis-Menten

Ecuación de Dobles Recíprocos o de Lineweaver-Burk

Otras transformaciones gráficas de la ecuación de Michaelis-Menten

[S]v

mK

maxVv −=

Vmax Km

v -Km Inclinação =

v [S]

Vmax

Gráfico de Eadie-Hofstee

pendiente =

Los valores obtenidos son mas precisos, porque no incluye el error intrínseco en el uso de valores recíprocos

[S]

[S] v

-Km

Km

Vmax

1 Vmax

Inclinação =

Gráfico de Hanes-Woolf

[S]maxV1

maxVmK

v[S]

+=

pendiente =

v0(3) v0(2)

v0(1)

-[S]1 -[S]2 -[S]3

Vm

KM

Gráfico de Eisenthal/Cornish-Bowden

Km

Vmax

No requiere de cálculos

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten.

Se dice que su cinética no es Michaeliana.

Esto ocurre con las llamadas enzimas alostéricas, cuya gráfica v contra [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (en forma de s)

En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

Efecto del pH Las enzimas, al ser proteínas, poseen propiedades que son

muy sensibles al pH. De hecho, la mayoría de las proteínas sólo son activas en un

estrecho intervalo de pH, típicamente entre 5 y 9. Esto es el resultado de los efectos del pH sobre una

combinación de factores: (1) la fijación del sustrato a la enzima, frecuentemente utilizando

enlaces electrostáticos que dependen de la ionización de los participantes.

(2) la actividad catalítica de la enzima, dependiente del estado de ionización de los aminoácidos importantes localizados en el sitio activo de la enzima, así como de su estructura terciaría y cuaternaria

(3) la ionización del sustrato y (4) la variación de la estructura proteica misma (normalmente,

sólo significativa a pH extremos).

La actividad enzimática varía con el pH El pH óptimo es aquel al cual la

enzima manifiesta su mayor actividad y frecuentemente refleja el pH al cual la enzima funciona dentro del organismo. El pH de mayor actividad varía para diferentes enzimas. Por ejemplo, la pepsina, una enzima digestiva del estómago, muestra su pH óptimo a pH <2, mientras que otras enzimas, diseñadas para funcionar a pH neutro, serían desnaturalizadas si se someten a condiciones tan drásticamente ácidas

Es necesario recalcar, sin embargo, que el término "pH óptimo" no tiene una significación físico-química bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reacción dada. Este rango depende no sólo de la naturaleza de la enzima particular, sino también del substrato y de la concentración de éste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensión del periodo de reacción.

Los segmentos de la izquierda y de la derecha de la curva de campana obtenida, en donde la actividad enzimática es menor que en el pH óptimo, representan las curvas de titulación de los cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que forman parte del sitio activo de la enzima.

El punto de inflexión a pH 4.2 refleja el pKa del residuo 25, cisteína, y el de pH 8.2 el pKa de la His-159.

La enzima sólo es activa cuando estos grupos se encuentran como un par iónico tiolato - imidazolium.

Efecto del pH Como ocurre con las proteínas, las enzimas poseen un punto

isoeléctrico al cual su carga libre neta es cero. El pH del punto isoeléctrico, como regla, no es igual al pH al cual se observa actividad máxima.

El pH óptimo de las enzimas varia ampliamente; la pepsina, que existe en el medio ácido del estómago, tiene un pH óptimo de alrededor de 1,5, mientras que la arginasa tiene un pH óptimo de 9,7.

Sin embargo, la gran mayoría de las enzimas tienen un óptimo entre pH 4 y 8, muchas de ellas alrededor del pH fisiológico del organismo, ~7.3 - 7.4. Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios del pH, pero otras trabajan bien sólo en un rango estrecho.

Cualquier enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza. Esta sensibilidad de las enzimas a la alteración del pH es una de las razones por la que la regulación del pH del organismo es controlada celosamente y explica por qué las desviaciones de la normalidad pueden implicar graves consecuencias.

pH Óptimo

Es necesario recalcar, sin embargo, que el término "pH óptimo" no tiene una significación físico-química bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reacción dada. Este rango depende no sólo de la naturaleza de la enzima particular, sino también del substrato y de la concentración de éste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensión del periodo de reacción.

Efecto de la temperatura sobre las enzimas Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad

enzimática, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una pérdida de actividad.

Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimáticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia.

Al aumentar la temperatura, la velocidad de reacción aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10°C duplica e incluso triplica la velocidad de reacción.

Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera también la inactivación de la enzima por desnaturalización térmica. Para muchas enzimas la región de inactivación térmica está muy próxima de la temperatura óptima.

La velocidad de inactivación térmica depende también del pH, fuerza iónica y del estado físico de la enzima

Todas las reacciones químicas son afectadas por la temperatura. A mayor temperatura, mayor velocidad de reacción. La velocidad de reacción aumenta porque hay más moléculas con suficiente energía para llegar al estado de transición. Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas también aumentan con la temperatura . Pero, las enzimas son proteínas y se desnaturalizan a temperaturas altas Cada enzima posee una temperatura óptima a la cual opera con mayor eficiencia Puesto que las enzimas son proteínas, su temperatura óptima depende también del pH y de la fuerza iónica.

Si la temperatura de operación se eleva más allá de la temperatura óptima, la actividad de muchas enzimas desciende bruscamente. Las temperaturas óptimas de muchas enzimas se encuentran cercanas a la temperatura normal del organismo de donde proceden. Por ejemplo, la temperatura óptima de la mayoría de las enzimas en el hombre es cercana a 37°C.

Estabilidad Térmica

El aumento de temperatura acelera también la inactivación de la enzima por desnaturalización térmica.

Para muchas enzimas la región de inactivación térmica está muy próxima de la temperatura óptima.

La velocidad de inactivación térmica depende de la enzima, pero también del pH, fuerza iónica y del estado físico de la enzima

Efecto de la Ionización

Las velocidades iniciales de muchas reacciones enzimáticas en función del pH muestran curvas en forma de campana. Estas curvas reflejan la ionización de ciertos restos de aminoácidos que han de encontrarse en un estado de ionización determinado a fin de que haya actividad enzimática.

Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de interacciones con el centro activo u otros centros específicos (alostéricos). Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores: I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Inhibidores Enzimáticos

Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad.

La unión de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima catalice su reacción correspondiente.

La unión del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con

la enzima de forma covalente y modifican su estructura química a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos necesarios para la actividad enzimática.

En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de la manera como el inhibidor se une a la enzima o al complejo enzima-sustrato.

Inhibidores Enzimáticos

Los inhibidores enzimáticos usados dentro de la célula están implicados en la regulación del metabolismo.

Por ejemplo, las enzimas en una ruta metabólica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas rutas. Este tipo de retroalimentación negativa retarda el flujo a través de la ruta cuando los productos comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en una célula.

Otros inhibidores enzimáticos celulares son proteínas que se unen específicamente e inhiben una enzima importante.

Este mecanismo puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser dañinas para la célula, como las proteasas o nucleasas.

Un buen ejemplo es el inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones proteína–proteína más fuertes conocidas.

Inhibición Enzimática

Competitiva El Inhibidor se fija en el sitio activo de la enzima. La inhibición es

reversible puesto que altas concentraciones de sustrato compiten con el inhibidor. Depende de las afinidades relativas de la enzima por su sustrato y por el inhibidor. La Km aumenta, la Vmax permanece sin cambios

No-competitiva El Inhibidor se fija en un sitio diferente al sitio activo de la enzima.

El complejo ESI (Enzima-Sustrato-Inhibidor) no puede formar productos. Concentraciones altas de sustrato no son competidoras. La Km no se modifica, la Vmax disminuye

Un-competitiva o Anti-competitiva El inhibidor es capaz de fijarse únicamente una vez que el

complejo ES está ya formado y el cambio en la conformación de la enzima le proporciona un sitio para su fijación. Tanto la Km como la Vmax disminuyen

E ES

EI

I

S

E + P

Características: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. - El inhibidor es tan específico como el substrato

Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor: Ki =

[E] [I] [EI]

Inhibición Competitiva

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo. 4. Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas; 5. el complejo EI no es productivo

E ES

EI

I

S

E + P I

ESI

S Inhibición

No Competitiva

El inhibidor no se fija en el sitio activo, y lo hace indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

E ES

S

E + P I

ESI

Inhibición Anticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo

Inhibición por Sustrato

La inhibición por sustrato y por producto es donde el sustrato o el producto de una reacción enzimática inhiben la actividad enzimática.

Este tipo de inhibición puede seguir cualquier tipo de patrón de inhibición y es frecuentemente de gran importancia en la regulación del metabolismo celular.

En la inhibición por sustrato hay una disminución progresiva de la actividad a altas concentraciones de sustrato. Esto puede indicar la existencia de dos sitios de unión entre sustrato y enzima. Cuando hay poco sustrato, se ocupa el sitio de alta afinidad y sigue la cinética normal. Sin embargo, a altas concentraciones, el segundo sitio de inhibición se ocupa, inhibiendo a la enzima.

La inhibición por parte del producto es a menudo una característica reguladora en el metabolismo y puede ser una forma de retroalimentación negativa.

Aplicaciones de los inhibidores Los inhibidores enzimáticos pueden ser encontrados en la

naturaleza, pero también son diseñados y producidos como parte de la industria, la farmacología y la bioquímica.

En el ser humano, los inhibidores enzimáticos son utilizados principalmente como fármacos en el tratamiento de diversas enfermedades.

Los venenos naturales son a menudo inhibidores enzimáticos que han evolucionado para defender a una planta o animal contra sus depredadores. Estas toxinas naturales incluyen algunos de los compuestos más venenosos conocidos hasta hoy.

Los inhibidores artificiales son a menudo utilizados como insecticidas (como el Malathion), herbicidas (como el Glifosato) o desinfectantes, (como el Triclosán).

Regulación Enzimática La regulación enzimática depende profundamente de cada

proceso, cada célula, cada momento del metabolismo, pero en general pueden precisarse algunos mecanismos generales de regulación

Por control de la expresión genética para obtener más o menos enzima activa

La enzima existe en una forma inactiva (zimógeno) que debe ser modificada, primariamente por hidrólisis

La enzima debe ser covalentemente modificada para aumentar o disminuir su actividad, la forma más común es por fosforilación o desfosforilación

Secuestración, la enzima no se encuentra en el sitio adecuado para desempeñar su función

Por regulación alostérica, tanto positiva como negativa.

Enzimas Reguladas

En todos los organismos y, prácticamente, en todas las vías metabólicas, el control rápido – en la escala de segundos o menos – puede ser alcanzado mediante la modulación reversible de la actividad de determinadas enzimas, llamadas enzimas reguladas.

En este concepto, se pueden definir las enzimas reguladas, como aquellas cuya actividad puede ser modificada rápidamente por varios tipos de efectores, permitiendo que la célula se adapte a las exigencias cambiantes del metabolismo celular

En la mayoría de los casos estas enzimas reguladas ocupan pasos claves, o limitantes, en los senderos metabólicos.

El mecanismo más sencillo es que las enzimas reguladas cambien rápidamente en relación con la concentración de sus sustratos, o de los productos que su actividad origina, activación por sustrato, inhibición por producto.

Alosterismo

El fenómeno conocido como alostería o alosterismo es el responsable del control reversible de la actividad de una gran variedad de las enzimas reguladas

Muchas enzimas reguladas experimentan transiciones alostéricas entre el estado (R) activo y el estado (T) inactivo.

Estas enzimas poseen un segundo sitio de fijación, alejado del sitio activo. Este segundo sitio es llamado sitio regulador, o sitio alostérico

Un activador o inhibidor alostérico, también llamado en general, efector alostérico, puede fijarse a este segundo sitio y producir un cambio conformacional en la enzima reguladora.

Este cambio conformacional es transmitido al sitio activo de la enzima y modifica su actividad.

Sitio alostérico Negativo

Efector Alostérico

Positivo

Efector Alostérico Negativo

Área de fijación del

cofactor

Cofactor

enzimas alostéricas

Las enzimas alostéricas son aquellas que, además del centro activo mediante el cual interactúan con el sustrato, poseen otro centro de unión llamado centro alostérico mediante el cual interactúan con otra molécula denominada efector o modulador (la palabra "alostérico" hace referencia a la existencia de ese "otro lugar").

La interacción del modulador con el centro alostérico es tan específica como lo es la interacción del sustrato con el centro activo y también está basada en la complementariedad estructural.

Las enzimas alostéricas presentan pesos moleculares en general superiores a las de otras enzimas y en la mayor parte de los casos son proteínas oligoméricas, es decir están formados por varias subunidades (normalmente en número par).

Efecto Alostérico De gran importancia en el fenómeno de la actividad enzimática es el

hecho de que, en las enzimas, pueden existir dos (o cuando menos dos) sitios diferentes desde el punto de vista estéreo- específico y que, además, estén en lugares distintos, muy alejados uno de otro.

Uno de estos sitios es el centro activo, donde se fija el sustrato para dar origen a los productos de la reacción y por lo tanto donde reside el aspecto funcional de la proteína. El otro sitio se denomina sitio alostérico y en él puede acomodarse de manera complementaria - pero reversible - alguna sustancia llamada efector alostérico; al efectuarse esta unión se produce una alteración discreta de la estructura de la proteína, la transición alostérica, que modifica la actividad biológica de la proteína, porque altera las propiedades del sitio activo.

Es muy importante que el efector alostérico normal no tiene relación química o metabólica alguna con el sustrato de dicha enzima y que su acción tan específica se debe a que altera de tal modo la conformación de la proteína que modifica su centro activo.

Moduladores Alostéricos

Los moduladores alostéricos pueden ser de dos tipos: unos estimulan la actividad de la enzima al unirse al centro alostérico, reciben el nombre de moduladores positivos o activadores; otros la inhiben y se llaman moduladores negativos o inhibidores.

Los inhibidores alostéricos no responden a ninguno de los modelos de inhibición enzimática estudiados en el apartado anterior.

Las enzimas alostéricas presentan siempre dos formas, una activa y otra inactiva, interconvertibles por efecto del modulador.

Moduladores Alostéricos

Existen dos tipos de control alostérico: el control heterotrópico que se da cuando el modulador es una molécula diferente del sustrato, y el control homotrópico que se da cuando el modulador es el propio sustrato.

En ambos casos el modulador puede ser positivo o negativo. Las enzimas con control homotrópico poseen dos o más centros de unión para el sustrato; en ellos la interconversión entre las formas activa e inactiva depende de cuántos sean los centros de unión que estén ocupados por moléculas de sustrato.

Enzimas Alostéricas

Una enzima alostérica es una enzima cuya actividad está regulada mediante un centro alostérico, que es un sitio, distinto del centro activo de la enzima, al que se une un regulador (llamado regulador alostérico) de manera reversible y no covalente. La unión de este regulador modifica la estructura tridimensional de la enzima y llega a afectar la configuración del sitio activo, por lo que aumenta o disminuye su actividad, según el caso.

Alosterismo

El alosterismo es una de las principales formas de regulación en la célula debido a que puede producir cambios rápidos y fácilmente reversibles en la actividad de las enzimas (y, por lo tanto, en el metabolismo) sin depender de que el regulador tenga una estructura similar al sustrato de la enzima (lo que puede ayudar a coregular diferentes vías metabólicas).

Muchos fármacos actúan uniéndose al sitio alostérico de las enzimas, como los inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos.

Glucogeno fosforilasa ATP, Glucosa AMP Fosfofructoquinasa ATP, Citrato AMP, ADP, Fru2,6BiP Piruvato quinasa ATP ADP Isocitrato deshidrogenasa ATP ADP α-cetoglutarato deshidrogenasa ATP ADP Fructosa 1,6 Bifosfatasa AMP, Fru2,6BiP ATP Glucogeno sintasa AMP ATP, Glucosa 6-P AcetilCoA Carboxilasa AMP, PalmitoilCoA ATP, Citrato

INHIBIDORES ACTIVADORES

Reguladores alostéricos de algunas enzimas

La glucógeno fosforilasa posee, un sistema de regulación alostérica que

responde inmediatamente a las condiciones celulares en las que existe

una baja carga energética

La glucosa y el ATP inhiben la glucógeno fosforilasa, desplazando

su equilibrio alostérico hacia el estado tenso (T).

El AMP activa nuevamente la

enzima desplazando el equilibrio hacia el estado relajado (R)

ATP

AMP