2. Tecnicas moleculares
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• Electroforésis de ácidos nucleicos,
• Hibridación de ácidos nucleicos (southern blot)
• Amplificación enzimática del ADN (PCR o reacción en cadena de la polimerasa)
• Enzimas de restricción y RFLP
• Secuenciación de ácidos nucleicos
• Microarreglos de ADN
Herramientas y métodos para el Análisis del ADN
Electroforésis de ADN
Southern blotLos fragmentos de ADN se separan en un gel de agarosa y se transfieren a una membrana. El ADN problema esta en forma de cadena sencilla antes de que se agregue una sonda marcada (radioactiva). Si la sonda se une con su blanco o problema se puede detectar a través de su exposición a una película fotográfica. Se formará una banda (mancha) en una posición que corresponde a la hibridación sonda-blanco. El ADN que no hibridó es lavado
Northern Blot
Hibridación ARN - ARN
Western Blot
Hibridación Proteína-Proteína
1983 [24 años]
Kary Mullis desarrolla la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR polymerase Chain reaction)
Ciclos de una PCR
Desnaturalización
Alineación
Extensión
Reactivos
ADN blanco o problema
Oligonucleótidos (primers, cebadores)
ADN polimerasa termoestable
Nucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, etc)
Termociclador
Amplificación por PCR de un gen a partir de ADN genómico
Se diseñan dos primers que hibridan los extremos del gen en cuestión y se lleva a cabo la reacción de PCR (25-35 ciclos).El ADN del gen amplificado se visualiza a través de un gel de agarosa Junto al producto de PCR están marcadores de peso molecular
Producción teórica de ADN amplificado partiendo de una sola molécula blanco después de un experimento de PCR bien diseñado
RT-PCR.
La enzima Transcriptasa inversa usa un oligonucleótido complementario para iniciar la síntesis de ADN (ADNc) a partir de ARNm
Se produce una molécula de ADN de una sola hebra que se usa como templado para la síntesis de una segunda cadena complementaria.
Esta molécula sirve finalmente como blanco para la amplificación por PCR
PCR Anidada
PCR Multiplex
PCR en tiempo real
RT-PCR en tiempo real
EcoRI y EcoRV (obtenidas de Escherichia coli) y PstI (obtenida de Providencia stuartii) . Estas enzimas tienen especificidad para la secuencia reconocida (diana) y cortan a la misma liberando fragmentos con extremos cohesivos o romos.
ENZIMAS DE RESTRICCION
Detección de la mutación que causa anemia falciformemediante digestión con el enzima Mst I I .
mutación
homocigoto Arg-Arg
141 bp
homocigoto Pro-Pro
177 bp
heterocigoto Arg-Pro
Polimorfismo Arg/Pro del gen p53RFLP Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción
Detección fluorescente de los fragmentos oligonucleoídicos producidos por el método Dideoxy
Cada una de las cuatro mezclas de terminación de la cadena esta cebada con una marca que fluoresce a diferentes longitudes de onda (por ejemplo, azul para A). La secuencia se determina midiendo la fulorescencia a cuantro longitudes de onda (cuadro inferior)
L. M. Smith, J. Z. Sanders, R. J. Kaiser, P. Hughes, C. Dodd, C. R. Connell, C. Heiner, S. B. H. Kent, and L. E. Hood. Nature 321. (1986):674.]
Secuenciación de ácidos nucleicos
Se puede usar el análisis del ADN para establecer la culpabilidad en delitos.
Aquí, el DNA se aisló de las manchas de sangre en pantalones y camisa de un sospechoso y se amplifico por PCR. Se comparó el DNA del sospechoso con el de la victima y del propio sospechoso usando electroforésis en gel y autoradiografía. El DNA de las manchas de sangre de la ropa del sospechoso tiene un patrón similar al ADN de la víctima pero no al del sospechoso. La frecuencia de patron similar entre los DNAs de la ropa del sospechoso y el de la victima es de aproximadamente 1 en 33 millones.
Carril I, 1kb, y TS = muestras de DNA control; Carril D = DNA del sospechoso; jeans = DNA aislado de las manchas de sangre de los pantalones del sospechoso; shirt = DNA aislado de las manchas de sangre de la camisa del sospechoso (se analizan dos cantidades diferentes); V = Muestra del DNA de la victima
(Cortesía de Cellmark diagnostics, Germantown MD.)
MICROARREGLOS DE ADN
Microarreglos de ADN (Biochips)
Son dispositivos que consisten de miles de pequeños oligonucleótidos (8-15 mer) de secuencia específica unidos a una pequeña superficie de vidrio o silicio y que permiten el análisis de la secuencia nucleotídica de un gen de interés
Los microarreglos de ADN (Biochips o GeneChips) son sistemas microtecnológicos en los que se disponen miles de fragmentos de material biológico (DNA, RNA, proteínas) de una forma ordenada y conocida sobre un soporte sólido.
Microarreglo de DNA ó Biochip
Spotter (Arrayer)
Impresora de sondas de ADN
Scanner
Lector de fluorescencia
Microarreglos o Biochips comerciales
Microarreglos de Oligonucleótidos
Microarreglos de cDNA
(de expresión)
Protein Chips
Tissue Chips
PROCEDIMIENTO
Reutilizable y barato
Práctico
Fácil de interpretar
Sensible
Características de un biochip de DNA ideal
Desventajas
Análisis de un solo gen en un ensayo
Varios pasos
Tiempos prolongados
Aplicaciones de los biochips
Monitoreo de la expresión genética (Expresión espacio-temporal del mRNA durante el desarrollo. bacterias, hongos, plantas, mamíferos)
Detección de mutaciones y polimorfismos (Conocer cómo es la variación polimórfica entre una especie o un subgrupo)
Secuenciación de ácidos nucleicos (Conocer la secuencia primaria entre las regiones codificantes y las regiones reguladoras. Identificación de blancos, descubrimiento/optimización de fármacos, estudios toxicológicos )
Toxicología de fármacos (Analizar la respuesta fisiológica normal y durante la enfermedad)
Diagnostico clínico y detección de microorganismos
Se pueden detectar mutaciones y diagnosticar enfermedades mediante la hibridación de los productos de PCR marcados fluorescentemente de paciente a sondas apropiadas unidas al vidrio.
La detección y la definición de mutaciones presentes en oncogenes, genes supresores de tumores y otros genes ayudarán en la terapia anticancerígena.
Un solo microarreglo puede detectar las mutaciones más comunes en genes como p53, ras, brcA1, rb, bcr.abl, etc., que se hallan en cánceres de pulmón, mama, páncreas, leucemias y otros.
Seguimiento de terapia
Medicina preventiva
Estudios genéticos a gran escala
Microarreglos de DNA comerciales
Incyte Genomics IncMotorola biochips systems Nanogen IncAgilent Technologies IncAffymetrix Hyseq Perkin Elmer Life SciencesEppendorfNEN life SciencesQiagenF Hoffmann La Roche LTDStratagene Takara Bio Inc
Aprox. 40 empresas
LinfoChip®
GeneChip Maize Genome array ®
MammaPrint®
ViriChip®
DR Milk kit18®
DR HBV chip®
Oncotype DX®
PapilloCheck®
LipoChip®
Aprox 105 marcas
Biochips de proteínasBiochips de carbohidratosBiochips de tejidos
Las técnicas moleculares aplicadas en la identificación
de genes, han tenido un enorme desarrollo en la
medicina forense, preventiva y farmacológica
(farmacogenómica)
•Actualmente se basa en la clínica
•Detección de la enfermedad antes de que surja como entidad clínica (Neurodegenerativas, Autoinmunes, metabólicas)
•Diagnóstico en Infectocontagiosas: Se basa actualmente en métodos descriptivos o indirectos (cultivos, serología, etc).
DIAGNOSTICO MEDICO
¿Por qué diagnóstico Molecular?
• Detección y Diagnóstico– De agentes no cultivables o difíciles de cultivar– Necesidad de un resultado rápido– Métodos bioquímicos inadecuados Detección de la enfermedad ante de que surja como entidad clínica (Neurodegenerativas, Autoinmunes, Metabólicas, etc
• Pronóstico y tratamiento– Necesidad de información cuantitativa (carga viral)- Monitoreo de la respuesta terapéutica
• Detección de genes de resistencia, patogenicidad,etc– pruebas de susceptibilidad sin cultivo (resistencia a drogas)
Nuevos métodos molecularescomplementan más que
sustituyen a losmétodos diagnósticos
convencionales:incrementan significativamente
loscostos para el presupuesto del
laboratorio
Diagnóstico Molecular
¿En dónde estamos?• Las técnicas más utilizadas en este momento son: PCR, RT-PCR, Secuenciación de ADN, Microrreglos de ADN
• Existe una tendencia al uso de métodos automatizados y sistemas comerciales
• Se están implementando sistemas de QC (CLSI MM3-A2, 2006. “Colección transporte, mantención y preparación de las muestras para BM)
•http://webstore.ansi.org/ansidocstore/product.asp?sku=MM3-A2
Plataformas comerciales “más amigables”
Mayor posibilidad de acceder a las técnicas de BM
El diagnóstico Molecular tiene muchos usos
• Puede monitorear la eficacia del tratamiento
(tratamiento temprano) y seguimiento de la
enfermedad
• Puede proporcionar información para el diseño de
nuevos tratamientos (p.e detección del cáncer)
• Puede predecir la respuesta del paciente al
tratamiento (farmacogenética: tratamientos
personalizados)