2007 Desarrollo Profesional. Transformación de pGLO ™ y Purificación de la Proteína GFP (Green...
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2007 Desarrollo Profesional
Transformación de pGLO™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein)
Instructores
Essy Levy, M.S.Coordinadora de Programas de Hughes Scholars
UCSD, San Diego CA
Julie MathernBioEducation Product ManagerBio-Rad Laboratories, Hercules CA
¿Para que enseñar la transformación genética?
• Una herramienta poderosa para el aprendizaje
• Parte de los estándares nacionales curriculares
• Varias extensiones de practicas de laboratorio
• Conexiones con el mundo real
• Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria
Dogma Central de la Biología Molecular
ADN ARN Proteína Característica
Conexiones con el mundo real
• GFP es un marcador visual
• Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas)
• Localización y regulación de la expresión de un gen
• Movimiento celular
• El destino celular durante el desarrollo
• Formación de los diferentes órganos
• Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos
Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™
Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad
• Basado en los estándares curriculares
• Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento
• Compatible con un periodo de clase de 50 minutos
• Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo)
• Costo económico
• Resultados exitosos en las manos de los estudiantes
• Seguro para uso en el aula
• ¡Resultados tangibles!
Procedimiento Transformación
Day 1
Day 2
Horario para el Taller de GFP
• Introducción
• Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO
• Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína
Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™
¿Que es una transformación?
Absorción deADN exógeno;frecuentemente un plásmido circular
GFP
Lactamasa beta
Resistencia a la
Ampicilina
¿Que es un plásmido? Un pedazo circular deADN que se replica autónomamente
Evolucionado originalmente enbacterias
Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede
ser modificado paraexpresar una proteína de interés
Las diferentes caras de un plásmido
Micrografía de transmisión de electrones
Gel de agarosaRepresentación Grafica
Plásmido pGLO
• Lactamasa Beta -Resistencia a la
ampicilina
• La proteína GFP (Green Fluorescent Protein)– Aequorea victoria
gen de medusa
• araC: Regulador Regula la trascripción de GFP
Transformación con pGLO
Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)
Plásmidos de pGLO
Cromosoma Bacteriano (ADN)
Pared celular
GFP
ADN Bacteriano
Plásmido de ADN
Célula de Bacteria
ADN Geonómico
Regulación de Trascripción
•Operón de lactosa
•Operón de Arabinosa
•Plásmidos de pGLO
Regulación de Trascripción
B A DaraC
B A DaraC
ARN Polimerasa
Efector (Arabinosa)
araC B A D
Operón ara
ARN Polimerasa
Z Y A
Z Y ALacI
Efector (Lactosa)
Z Y ALacI
Operón lac
Regulación de la expresión del gen
ARN Polimerasa
araC
Operón GFP
Gen de GFP
araC Gen de GFP
araC Gen de GFP
Efector (Arabinosa)
B A DaraC
B A DaraC
ARN Polimerasa
Efector (Arabinosa)
araC B A D
Operón ara
Métodos de Transformación
• Electroporación– Un choque eléctrico resulta en que
la célula sea permeable al plásmido ADN
• Cloruro de Calcio y Choque Térmico– Las células químicamente
competentes absorben el ADN después del choque térmico
Proceso de Transformacion
• Suspender las colonias en la Solución de Transformación
• Añadir el plásmido pGLO ADN
• Incubar los tubos en hielo ice
• Choque térmico a 42°C y colocar en hielo
• Incubar con caldo nutriente LB
• Extienda la suspensión por la superficie de las placas
¿Porque es importante cada paso de la transformación?
1. La solución de transformación = CaCI2
La carga positiva del los iones de Ca+2 neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN
Ca++
Ca++
OCH2
O
P O
O
OBase
CH2
O
P
O
O
O
Base
OH
Azúcar
Azúcar
OCa++
¿Porque es importante cada paso de la transformación?
2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular
3. Choque térmico -incrementa la
permeabilidad de la membrana celular
4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta
Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)
Pared Celular
GFP
¿Que es el caldo nutriente de LB?
• Caldo Luria-Bertani (LB)
• Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés
– carbohidratos– aminoácidos– nucleótidos– Sales– Vitaminas
¿Crecer? ¿Brillar?
Siga el protocolo
¿En que placas crecerán colonias?
¿Que colonias brillarán?
Medida de Volumen