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INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA

INTRODUCCIN

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los

componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.

a)Retencin. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por unafase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un

soporte slido.b)Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por

una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas.

El fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo largo

de la fase estacionaria, impulsados por la fase mvil, recibe el nombre de

elucin. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionara, mientras que

la mvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla adistinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas

con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la

muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase mvil y la fase

estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase

estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario

los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con

rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la

muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa

y/o cuantitativamente.

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TIPOS DE CROMATOGRAFA.

Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se

pueden distinguir distintos tipos de cromatografa

a) Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y lamvil un lquido.

b) Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquidoanclado a un soporte slido.

c) Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido novoltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas.

d) Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvilun gas.

Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la

mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre.

a) Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slidopolar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla

mediante interacciones de tipo polar.

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b) Cromatografa de particin. La separacin se basa en lasdiferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las

fases estacionaria y mvil, que son ambas lquidas.c) Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un

slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya

carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la

fase mvil.

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

La adsorcin es la propiedad que tienen ciertos slidos de aumentar la

concentracin en su superficie de otras sustancias. La separacin se debe a las

diferencias de adsorcin de los componentes de una mezcla sobre la fase

estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un slido polar de gran superficie

(adsorbente). La fase mvil puede ser un gas o un lquido dando lugar a la

cromatografa gas-slido (CGS) o lquido-slido (CLS).

El grado de adsorcin vara segn la naturaleza y superficie especfica de

los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre molculas

adsorbidas y el adsorbente han de ser dbiles para que su fijacin sea reversible,

las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipolo

o puentes de hidrgeno). Como regla general, las polaridades del adsorbente y

de los solutos han de ser opuestas.

Cromatografa lquido-slido (CLS).

La fase estacionaria est constituida por un slido polar poroso y que esta

finamente granulado. La superficie especfica contiene centros polares aptos

para la adsorcin de las molculas polares presentes en la fase mvil. Al

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disminuir el tamao de las partculas, el nmero de centros activos por unida es

mayor, y la capacidad de adsorcin se incrementa. El adsorbente ms utilizado

es gel de slice aunque tambin se emplea almina activada. En el caso del gelde slice la interaccin se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los

grupos funcionales polares de los compuestos orgnicos.

La fase mvil est constituida por un disolvente en el que los

componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La

velocidad de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de

la fase mvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con eltiempo la proporcin del disolvente ms polar.

Propiedades de los disolventes ms comunes.

Disolvente Frmula qumicaPunto de

ebullicin

Constante

dielctricaDensidad

Disolventes no polares

Hexano CH3-(CH2)4-CH3 69 C 2,0 0,655 g/ml

Benceno C6H6 80 C 2,3 0,879 g/ml

Tolueno C6H5-CH3 111 C 2,4 0,867 g/ml

ter dietlico CH3CH2-O-CH2-CH3 35 C 4,3 0,713 g/ml

Cloroformo CHCl3 61 C 4,8 1,498 g/ml

Acetato de etilo CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77 C 6,0 0,894 g/ml

Disolventes polares aprticos

1,4-Dioxano CH2-CH2-O-CH2-CH2-O 101 C 2,3 1,033 g/ml

http://es.wikipedia.org/wiki/Disolventehttp://es.wikipedia.org/wiki/F%C3%B3rmula_qu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_ebullici%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_ebullici%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Constante_diel%C3%A9ctricahttp://es.wikipedia.org/wiki/Constante_diel%C3%A9ctricahttp://es.wikipedia.org/wiki/Densidadhttp://es.wikipedia.org/wiki/Hexanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bencenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Toluenohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%89ter_diet%C3%ADlicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Cloroformohttp://es.wikipedia.org/wiki/Acetato_de_etilohttp://es.wikipedia.org/wiki/Dioxanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Dioxanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Acetato_de_etilohttp://es.wikipedia.org/wiki/Cloroformohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%89ter_diet%C3%ADlicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Toluenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bencenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Hexanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Densidadhttp://es.wikipedia.org/wiki/Constante_diel%C3%A9ctricahttp://es.wikipedia.org/wiki/Constante_diel%C3%A9ctricahttp://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_ebullici%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_ebullici%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/F%C3%B3rmula_qu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/Disolvente

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Tetrahidrofurano(THF) CH2-CH2-O-CH2-CH2 66 C 7,5 0,886 g/ml

Diclorometano(DCM) CH2Cl2 40 C 9,1 1,326 g/ml

Acetona CH3-C(=O)-CH3 56 C 21 0,786 g/ml

Acetonitrilo(MeCN) CH3-CN 82 C 37 0,786 g/ml

Dimetilformamida

(DMF)H-C(=O)N(CH3)2 153 C 38 0,944 g/ml

Dimetil sulfxido

(DMSO)CH3-S(=O)-CH3 189 C 47 1,092 g/ml

Disolventes polares prticos

cido actico CH3-C(=O)OH 118 C 6,2 1,049 g/ml

n-Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 C 18 0,810 g/ml

Isopropanol(IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 C 18 0,785 g/ml

n-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 C 20 0,803 g/ml

Etanol CH3-CH2-OH 79 C 24 0,789 g/ml

Metanol CH3-OH 65 C 33 0,791 g/ml

cido frmico H-C(=O)OH 100 C 58 1,21 g/ml

Agua H-O-H 100 C 82 1,000 g

La retencin se realiza en base a la competencia que se establece entre el

soluto a separar (S) y las molculas de la fase mvil (M) por adsorberse a los

centros activos polares (X) de la fase estacionaria. As las molculas de soluto se

adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados

por las molculas polares presentes en la fase mvil.

http://es.wikipedia.org/wiki/Tetrahidrofuranohttp://es.wikipedia.org/wiki/Tetrahidrofuranohttp://es.wikipedia.org/wiki/Diclorometanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Diclorometanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Acetonahttp://es.wikipedia.org/wiki/Acetonitrilohttp://es.wikipedia.org/wiki/Acetonitrilohttp://es.wikipedia.org/wiki/Dimetilformamidahttp://es.wikipedia.org/wiki/Dimetilformamidahttp://es.wikipedia.org/wiki/Dimetil_sulf%C3%B3xidohttp://es.wikipedia.org/wiki/Dimetil_sulf%C3%B3xidohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ac%C3%A9ticohttp://es.wikipedia.org/wiki/Butanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Butanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Isopropanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Isopropanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Propanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Propanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Etanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Metanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_f%C3%B3rmicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Aguahttp://es.wikipedia.org/wiki/Aguahttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_f%C3%B3rmicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Metanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Etanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Propanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Isopropanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Butanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ac%C3%A9ticohttp://es.wikipedia.org/wiki/Dimetil_sulf%C3%B3xidohttp://es.wikipedia.org/wiki/Dimetilformamidahttp://es.wikipedia.org/wiki/Acetonitrilohttp://es.wikipedia.org/wiki/Acetonahttp://es.wikipedia.org/wiki/Diclorometanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Tetrahidrofurano

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Los tiempos de retencin y la selectividad en la separacin dependern de

la polaridad de los compuestos a separar (S), la naturaleza del adsorbente (X) y

la naturaleza de los disolventes que componen la fase mvil (M).

Cromatografa en capa fina.

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa,

uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de

vidrio, aluminio u otro soporte. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria

consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el

eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que

los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.

La mezcla a analizar se deposita a una pequea distancia del borde

inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase mvil, que

asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes

de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separacin. Cuando el

frente del disolvente se encuentra prximo al extremo superior de la placa esta

se saca y se visualiza.

La relacin entre la distancia recorrida por un compuesto y por el

disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor).

Rf= Distancia recorrida por el compuesto

Distancia recorrida por el disolvente

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La bsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de

diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se

desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el

hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y

acetato de etilo.

La mayora de las placas de cromatografa llevan un indicador

fluorescente que permite la visualizacin de los componentes activos a la luz

ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz

ultravioleta, la visualizacin requiere utilizar un agente revelador. El revelador

reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.

Cromatografa preparativa en placa.

La cromatografa preparativa se lleva a cabo en placas de gel de slice de

1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la separacin y

aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidas

entre 100-200 mg.

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En la superficie del adsorbente (gel de slice), mediante una pipeta

Pasteur, se traza una lnea continua con la muestra disuelta y se introduce la

placa en posicin vertical en una cubeta. Durante la elucin debe permanecertapada para evitar la evaporacin del disolvente. Una vez se han separado los

productos que componen la muestra, se marca con una cuchilla el contorno del

compuesto a aislar y con ayuda de una esptula se desprende del soporte de

vidrio el gel de slice con el compuesto adsorbido. Una vez transferido a un

erlenmeyer se aade un disolvente en el cual sea soluble el producto, se filtra el

gel de slice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro.

Chromatotron.

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Cromatografa en columna.

Es el mtodo ms utilizado para la separacin de compuestos orgnico a

escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna

de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un

estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la

fase estacionaria mientras que la fase mvil atraviesa el sistema. Los

compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones,

los ms polares quedan ms retenidos y para que salgan generalmente hace falta

aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir uncompuesto de la columna se llama tiempo de retencin.

El adsorbente ms utilizado para cromatografa de columna es gel de

slice, aunque tambin se puede emplear almina y florisil. La elucin de la

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cromatografa puede realizarse por gravedad o mediante presin (Flash

chromatography), la diferencia en ambos casos est en el tamao de las

partculas de gel de slice (0,063-0,200 nm, slice de columna, 0,040-0,063 nm,slice flash). Debido a que la disminucin del tamao de las partculas de

adsorbente conduce a una separacin ms eficaz, la cromatografa a media

presin (flash) proporciona mejores resultados, adems de ser ms rpida.

Las variables que ms influyen en la eficacia de la separacin en

cromatografa de columna y utilizando gel de slice como adsorbente son las

siguientes;

a) Dimetro de la columna y cantidad de gel de slice. La altura deladsorbente est relacionada con la diferencia de Rf de los componentes

de la mezcla. El dimetro de la columna con la cantidad de producto a

separar.

b) Eleccin del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buenaseparacin de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizndose

en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elucin en

gradiente. Una de las mezclas ms utilizadas es hexano/acetato de

etilo.

Cromatografa en papel.

Es la ms sencilla de las tcnicas, pero slo nos dar resultados

cualitativos. Est casi en desuso. El mtodo se basa en un mecanismo de reparto,

y consiste en depositar una pequea cantidad de muestra en el extremo de una

tira de papel de filtro, que se deja evaporar. Luego se introduce la tira en una

cubeta que contenga el disolvente, de manera que ste fluya por la tira por

capilaridad.

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Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo, se retira el

papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color

propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando loscomponentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado.

Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la

eleccin del disolvente y la del papel de filtro.

CROMATOGRAFA DE PARTICIN.

La cromatografa lquido-lquido, tambin llamada de particin se

caracteriza por emplear una fase estacionaria lquida, anclada a un soporte

slido, y una fase mvil tambin lquida. El soporte slido por lo general es gel

de slice, sobre cuya superficie se ha anclado una fase lquida con la

incorporacin de una cadena hidrocarbonada larga, mediante la transformacin

de los grupos silanol (Si-OH) de la gel de slice en grupos siloxano (Si-O-Si-R),

lo que proporciona una fase lquida estacionaria trmicamente estable y difcil

de hidrolizar en condiciones normales.

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Tabla. Cadenas hidrocarbonadas ancladas a la gel de slice en cromatografalquido-lquido.

Funcionalidad Estructura Polaridad Tipo

Diamino -(CH2)3-NH(CH2)2-NH2 Muy alta NormalAminopropilo -(CH2)3-NH2 Alta Normal

Nitrilo -(CH2)n-CN Media Normal

Nitro -(CH2)n-NO2 Media Normal

Diol (CH2)3-OCH2-CH(OH)-CH2OH Dbil Normal

Dimetilamino -(CH2)3-N(CH3)2 Dbil Normal

Propilo -(CH2)2-CH3 Baja Inversa

Fenilo -(CH2)n-Ph Baja Inversa

Octilo -(CH2)7-CH3 Baja Inversa

Octadecilo -(CH2)17-CH3 Muy baja Inversa

La polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en funcin de la

naturaleza de las cadenas hidrocarbonadas introducidas en la gel de slice, lo que

permite disponer de fases estacionarias con selectividad diferente. La separacin

en la cromatografa lquido-lquido se basa en la diferencia de solubilidad de los

componentes de la mezcla entre las dos fases lquida o en las diferentes

interacciones de los componentes de la mezcla con los grupos funcionales

presentes en la cadena enlazada al gel de slice. En funcin de la polaridad de la

fase lquida estacionaria, se distingue entre:

a) Cromatografa en fase normal. La fase estacionaria est constituida por unlquido de carcter polar. Como fase mvil se emplean mezclas de

disolventes apolares (hexano, pentano), con disolventes polares (cloroformo,diclorometano, T.H.F., etanol, metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la

separacin de compuestos muy polares que quedaran demasiado retenidos

en una cromatografa slido-lquido. En este tipo de cromatografa el orden

de elucin est gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos ms

polares quedan ms retenidos, igual que en la cromatografa de adsorcin.

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b) Cromatografa en fase reversa. La fase estacionaria est constituida por unlquido de carcter apolar. Como fase mvil se emplean mezclas de agua con

disolventes polares miscibles, como metanol o acetonitrilo siendo la fasemvil ms polar que la fase estacionaria. Se emplea para la separacin de

mezclas de compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en una

cromatografa slido-lquido, y para la separacin de compuestos de una

misma serie homloga. La retencin se explica en base a una adsorcin

preferencial del disolvente menos polar de la fase mvil a la superficie de las

cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que se

establece un mecanismo complejo que supone una combinacin de

equilibrios de solubilidad (particin) de la mezcla que se cromatografa entre

la fase lquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase mvil.

La separacin ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficie

apolar de los componentes de la muestra, los compuestos menos polares

sern ms solubles en la fase estacionaria que los ms polares. Por tanto, al

contrario que en la fase normal, los compuestos ms polares estarn menos

retenidos que los menos polares. Los tiempos de retencin disminuyen

cuando menor sea la proporcin de agua, cuando menos polar sea el

disolvente empleado.

Cromatografa de intercambio inico.

La cromatografa de intercambio inico (cromatografa inica) es un

proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basado en las

propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de

molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y

aminocidos. La solucin que se inyecta es usualmente llamada muestra y los

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componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a

menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.

La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la superficie

grupos funcionales inicos que interactan con iones de carga opuesta. Este tipo

de cromatografa se subdivide a su vez en la cromatografa de intercambio

catinico y cromatografa de intercambio aninico:

La cromatografa de intercambio catinico retiene cationes cargados

positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcionalcargado negativamente (SO3

-, CO2

-). Las resinas cuyo grupo funcional activo es

un sulfonato (SO3-) se consideran resinas intercambiadoras cidas fuertes,

mientras que aqullas cuyo grupo funcional activo es un in carboxilato (CO2-)

se consideran resinas cidas dbiles.

R-A-H

++ M

++ B

- R-A

-M

++ H

++ B

-

La cromatografa de intercambio de aniones retiene aniones usando

grupos funcionales cargados positivamente, como un catin de amonio

cuaternario (R4N+).

R4-N+L

-+ M

++ B

- R4-N

+B

-+ L

-+ M

+

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R-H++ M+ R-M++ H+ Kd= [M+]R[H+] / [M+] [H+]R

Este tipo de cromatografa se basa en el equilibrio de intercambio inico

entre una fase slida que contiene grupos sulfnicos o carboxlicos (para la

separacin de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios

(para la separacin de aniones) y los iones presentes en la fase mvil. Por

ejemplo, para la separacin de cationes se puede utilizar una resina de cido

dbil donde se producir el siguiente equilibrio:

R-CO2H + M+ R-CO2M + H

+

En este caso, el catin M+

puede ser eluido de la columna por un cido

fuerte en una concentracin capaz de desplazar el equilibrio representado en la

ecuacin anterior hacia la izquierda. El desarrollo de esta tcnica al estado de

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cromatografa de alta resolucin, llamada cromatografa inica, fue posible a

partir de la dcada del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienen

los materiales tpicos para el intercambio (grupos sulfnicos para cromatografacatinica y grupos aminos cuaternario para cromatografa aninica). Estos

recubrimientos se depositan sobre pequeas esferas de slice, vidrio o de algn

polmero que son capaces de soportar las altas presiones comnmente utilizadas

en cromatografa lquida de alta resolucin.

PRCTICA DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA

En todo procedimiento en qumica orgnica reconocemos las etapas que

se muestran en el siguiente esquema para el aislamiento y caracterizacin de los

productos orgnicos.

Esquema: Esquema general de las etapas de aislamiento y purificacin de

los productos preparados en un proceso sinttico en qumica orgnica

Reactivos Mezcla de reaccin

Otros

Productos de reaccin

A + B C + D

Purificacin Caracterizacin

Extraccin Separacincromatogrfica

Cristalizacin

Destilacin

Pf

Peb

RMN

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Una vez ha concluido la reaccin, la mezcla resultante se extrae para

separar los sustratos que nos interesan. A continuacin la mezcla obtenida, que

generalmente es el producto de reaccin, productos secundarios, reactivos y/oalgo del producto de partida, se separa por cromatografa de columna.

Finalmente los productos, para caracterizarlos correctamente, y por regla

general, requieren de una purificacin adicional que se lleva a cabo mediante

otra cromatografa ms cuidadosa y/o cristalizaciones-destilaciones, segn el

caso.

En ocasiones y por necesidades de tiempo en los laboratorios de prcticasno se lleva a cabo la separacin cromatogrfica, aunque sea una operacin

necesaria en el trabajo de sntesis, como hemos indicado en prrafos anteriores.

Por esta razn hemos considerado oportuno incluirla como ejemplo en un curso

introductoria, de esta manera damos una visin real del trabajo sinttico en

qumica orgnica.

En esta experiencia se propondr la separacin de los componentes de una

mezcla hipottica de reaccin por cromatografa de columna. Las mezclas

estarn constituidas realmente por dos sustancias. Por ello, y como en casos

anteriores, se sugiere tener conocimiento de las caractersticas de los sustratos

antes de comenzar.

Las mezclas estarn constituidas por 0.2 g de cada uno de los productos y

antes de proceder a su separacin habr que decidir eluyente ms adecuado para

poder desarrollar una separacin aceptable.

Procedimiento general

Para el proceso de separacin-purificacin por cromatografa de columna se

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siguen los siguientes pasos:

A) Se sujeta la columna a unsoporte y se rellena con la fase estacionaria

en forma de papilla o en seco segn se nos

indique.

B) Opcionalmente se puede aadirarena hasta obtener una franja de unos 2-5

mm de espesor, para proteger el frente de la

fase estacionaria.

C) Se deposita la muestra endisolucin o adherida a una pequea

cantidad de adsorbente sobre la arena,

procurando tener una franja horizontal.

D) Opcionalmente se puede ponerotra franja de arena como la primera o un

poco de lana de vidrio.

E) Aadir la fase mvil concuidado por la pared de la columna hasta

llenarla.

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F) Los componentes de la mezcladeben eluirse manteniendo un flujo continuo

de disolvente.

G) Las fracciones recogidasdebern analizarse mediante una tcnica

cromatogrfica analtica: cromatografa de

capa fina para comprobar su contenido y

pureza. Las fracciones que tengan semejante

contenido se juntan en el mismo matraz,

previamente pesado y el disolvente se

elimina en el rotavapor.