2011 Informe Monitoreo Atmos Polen

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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL

(CENICA)

Monitoreo atmosférico de polen para la detección de secuencias transgénicas a nivel regional. Calibración del modelo.

Informe de actividades.

Dirección General del Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental (CENICA)

Noviembre, 2011

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I. INTRODUCCIÓN

En México los agricultores han conservado y moldeado la diversidad de maíz en sus razas e híbridos, los cuales cambian continuamente mediante flujo génico, adaptación local y selección artificial realizada por los mismos agricultores o productores de semillas. Estos factores evolutivos han intervenido en los cambios llevados a cabo en la diversidad de criollos, razas e híbridos que actualmente se utilizan y consumen. Nuevas variedades de híbridos genéticamente modificados o transgénicos estarán sujetas a los mismos factores evolutivos. Durante la última década se ha incrementado considerablemente el uso de maíz genéticamente modificado (GM) a nivel internacional, durante 2009 se sembraron cerca de 42 millones de hectáreas, más de la cuarta parte (26%) del total del área de maíz sembrada en el mundo (158 mill de ha) fue maíz GM, sembrado principalmente en USA, Argentina, Canadá, Sudáfrica, Uruguay, Filipinas, Chile y Honduras, aunque también 6 países de la Unión Europea (España, República Checa, Portugal, Rumania, Polonia y Eslovaquia) sembraron maíz GM (James, 2010). Se prevé que esta tendencia vaya en aumento. En México más de 30 eventos de maíz GM están autorizados para el consumo humano o animal, pero requieren de un permiso para su liberación al ambiente o siembra (Sistema Nacional de Información sobre OGMs, 2010). Por ello, la gran afluencia de comercio y cargamentos a gran escala de maíz, puede ser una fuente de maíz GM que pudiera ser sembrado sin un permiso de liberación previo (Ellstrand 2001, Quist and Chapela 2001, CEC 2004, Bellon and Berthaud 2006). Esto ha llevado a varios investigadores a examinar la posible presencia de maíz GM en las razas locales (Revisión por Mercer y Wainwright 2008). Los estudios sobre la presencia de secuencias transgénicas en variedades locales de maíz, se han llevado a cabo tanto por instancias gubernamentales como por investigadores independientes, mediante el muestreo de hojas o semillas, con métodos estadísticos que se han mejorado en algunos casos, tras las publicaciones de Ortiz et al (2005a, 2005b y 2006), para contar con una estimación razonable del nivel de detección. Sin embargo, los resultados de estos estudios aplican únicamente a nivel local (Revisar página de bioseguridad del INE). Estos estudios son muy costosos y los resultados han sido en la

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mayoría de los casos negativos, en los casos en que se ha detectado presencia ésta ha sido en niveles muy bajos (<0.1%). Con el fin de mejorar el uso de los recursos para el monitoreo de la presencia de maíz GM en el ambiente se han llevado a cabo diferentes esfuerzos. Se han utilizado métodos indirectos para seleccionar las áreas a ser monitoreadas mediante la aplicación de encuestas a los campesinos sobre su disposición a usar nuevas tecnologías (Álvarez y Hofre, 2003), o bien, mediante el uso de variables exógenas como información sobre geografía del paisaje, agrobiodiversidad y factores sociales (migración, marginación y porcentaje de población indígena) para determinar junto con la aplicación de encuestas, las áreas prioritarias para el muestreo (Castañeda, 2010). Esta información indirecta puede ser útil, pero no necesariamente estar relacionada con la presencia de maíz GM en los sistemas agrícolas. En este estudio se propone una nueva estrategia de muestreo y cuantificación diseñada para minimizar el sesgo previo al análisis estadístico mediante una combinación de técnicas de amplificación (PCR) y secuenciación paralela masiva con el objetivo de identificar en partículas de polen al maíz y al componente genéticamente modificado, si éste último se encuentra presente en la totalidad del material muestreado, con una resolución cercana a una sola copia del gen específico (Detección de presencia de el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, CaMV y el terminador nopalina sintetasa, NOS de Agrobacterium tumefaciens usando por y la detección de evento específico con la secuenciación masiva en paralelo). Este método reduce la posibilidad de no detección de material GM debida a los límites de detección de las técnicas utilizadas actualmente. El proceso de monitoreo que se propone se llevará a cabo mediante la distribución. estratégica de trampas volumétricas de bioaerosoles alrededor de los sitios experimentales de liberación de maíz GM en Chihuahua, durante la época de floración para contar con tres períodos de 14 días cada uno de muestreo continuo (Previo, durante y posterior al período de floración). Las técnicas propuestas combinarán el análisis de datos a nivel local en el sitio específico de muestreo y un análisis regional utilizando datos meteorológicos. Estos análisis permitirán estimar la influencia climática y meteorológica sobre la dispersión de polen de maíz GM reflejada como la densidad de éste en las trampas de bioaerosoles a diferentes distancias de la fuente.

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II. JUSTIFICACIÓN

En este proyecto conjunto se propone una nueva estrategia de muestreo y cuantificación diseñada para minimizar el sesgo previo al análisis estadístico mediante una combinación de técnicas de amplificación (PCR) y secuenciación paralela masiva con el objetivo de identificar polen de maíz y el componente genéticamente modificado, si éste se encuentra presente en la totalidad del material muestreado, con una resolución cercana a una sola copia del gen específico (Detección de presencia de el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, CaMV y el terminador nopalina sintetasa, NOS de Agrobacterium tumefaciens usando por y la detección de evento específico con la secuenciación masiva en paralelo), de esta forma se reduce la posibilidad de no detección de material GM debida a los límites de detección de las técnicas utilizadas actualmente. El proceso de monitoreo que se propone se llevará a cabo mediante la distribución estratégica de trampas volumétricas de bioaerosoles alrededor de los sitios experimentales de liberación de maíz GM en Sonora, Chihuahua y/o Tamaulipas, (en función de las fechas, áreas y permisos otorgados) durante la época de floración para contar con tres períodos de 14 días cada uno de muestreo continuo (Previo, durante y posterior al período de floración). Las técnicas propuestas combinarán el análisis de datos a nivel local en el sitio específico de muestreo y un análisis regional utilizando datos meteorológicos. Estos análisis permitirán estimar la influencia climática y meteorológica sobre la dispersión de polen de maíz GM reflejada como la densidad de éste en las trampas de bioaerosoles a diferentes distancias de la fuente. Esta es la primera vez que se propone un proyecto conjunto, de este tipo, por lo que en esta primera etapa se calibrara el modelo para posteriormente probar su utilidad para establecer un mecanismo más eficiente para el monitoreo de maíz GM a nivel nacional que apoye a las autoridades competentes en direccionar el monitoreo local. Este método tiene el potencial adicional de ser utilizado posteriormente para monitorear la diversidad genética de maíz utilizada en tiempo real a nivel nacional. Por otro lado, el seguimiento de éstos factores (tanto la diversidad genética, como la presencia de maíz GM) permitirá llevar a cabo simulaciones sobre los efectos del cambio climático en cultivos de gran importancia para México como lo es el maíz (Devoto et al 2007). Las repercusiones de las labores de monitoreo para detectar los niveles de la posible presencia de maíz transgénico así como la generación de información que nos permita detectar a tiempo sitios en dónde un tipo particular de modificación genética pueda ser adecuado como medida de adaptación al cambio climático pueden estimarse con mayor certidumbre desde una perspectiva de un análisis por omisión. Esto es, si se atiende a las

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posibles repercusiones ambientales, sociales y económicas que la generación de marcos políticos e institucionales sobre los umbrales permitidos como presencia adventicia en nuestra legislación sobre bioseguridad se lleve a cabo sin información técnica sobre los niveles reales en el campo puedan representar. Con la ejecución de los análisis moleculares se buscará generar la información de la más alta calidad, para poder establecer cuáles son los niveles de OGM en el cultivo tradicional y poder perfilar una política sobre los umbrales permitidos, así como mantener a la sociedad en su conjunto informada sobre la posible presencia de maíz genéticamente modificado y así aumentar la confianza de la sociedad en sus autoridades ambientales.

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III. OBJETIVOS

Obtener información sobre la presencia de maíz genéticamente modificado en variedades convencionales de maíz a través del muestreo de polen, involucrando para parte de análisis molecular de muestras al laboratorio de Biología Molecular del CENICA.

III. 1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS i) Diseñar el protocolo específico de muestreo de polen de maíz, considerando las fuentes de maíz GM y la aplicación del mismo. ii) Diseñar, probar y aplicar un protocolo de extracción de ADN a partir de las muestras de polen en cintas con vaselina de las trampas de biopartículas. iii) A partir de las muestras colectadas detectar la presencia de material transgénico mediante la técnica de PCR (polimerase chain reaction) y la secuenciación masiva en paralelo. iv) Analizar el potencial de dispersión de maíz GM considerando la distancia a la fuente del mismo y datos climáticos y meteorológicos. v) Generar un documento del alcance del método propuesto para su aplicación en el monitoreo de maíz GM y en el monitoreo de diversidad genética de maíz.

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IV. AVANCES

Preparación de suspensiones de granos de polen para la extracción del ADN Espigas con granos de polen de maíz proporcionadas por la alumna Ixel Miranda López fueron colocadas en bolsas de papel a temperatura ambiente y almacenadas hasta su uso. Posteriormente se tomaron algunas espigas y fueron sumergidas en aprox. 40 ml de Nonidet P40 (Roche) estéril al 0.1%. Se agitó vigorosamente con vortex por 2 minutos para que se liberaran los granos de polen. Se dejo reposar de 5-10 minutos y con ayuda de una pipeta Pasteur se tomaron los granos de polen depositados en el fondo y se colocaron en un tubo eppendorf de 1.5 ml. La suspensión fue ajustada mediante la cuantificación de granos de polen en la cámara de Neubauer y se hicieron diluciones seriadas para usarlas en experimentos posteriores. Rompimiento de los granos de polen El método usado para el rompimiento de la pared de las granos de polen y la posterior extracción del ADN fue adaptado primero por Williams et al. (2001) y posteriormente por Calderón et al. (2002). Se tomaron 250 µl de las suspensiones de granos de polen y se agregaron a microtubos de 2 ml que contenían previamente 0.2 g de perlas de vidrio (400 a 455 µm de diámetro y lavadas con ácido clorhídrico). Los tubos fueron agitados en el equipo FastPrep (Thermo Savant Instruments, Holbrook, Nueva York, EUA), realizándose pruebas para buscar la velocidad y el tiempo óptimo de agitación, con el fin de determinar las condiciones más eficientes que permitan obtener la mayor cantidad de granos de polen rotos. El ensayo inició con las condiciones reportadas por Calderón et al. (2002), es decir, 2 periodos de 45 s, a 6 m/s, con 2 min de enfriamiento en hielo entre cada periodo. Se analizaron las suspensiones de granos de polen resultantes bajo el microscopio, para determinar el tiempo y velocidad óptima en la que se obtuvo el mayor porcentaje de granos de polen rotos y su contenido liberado dentro de la suspensión. Resultados Los resultados de los periodos de molienda se muestran en la tabla 1, donde se observa un porcentaje de granos de polen rotos cercano al 100% con 3 ciclos de molienda, razón por la que todos los experimentos con rompimiento de granos de polen en FastPrep incluirán 3 periodos de molienda a 6m/s durante 45 segundos.

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Tabla 1. Porcentaje de granos de polen rotos en equipo FastPrep de acuerdo a periodos de molienda (6 m/s durante 45 segundos).

Periodos de molienda

% granos de polen rotos

1 70 %

2 92 %

3 99 %

Figs. 1 y 2. Microfotografías de granos de polen de Maíz sometidos a uno (izquierda) y dos (derecha) ciclos de molienda en equipo FastPrep. El grano oscuro del centro

corresponde a un grano de polen entero y los demás cuerpos son granos de polen rotos.

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Detección de ADN especifico de maíz en muestras colectadas con trampa de esporas Hirst

Preparación de cintas de celofán melinex con granos de polen de maíz Antes de colectar granos de polen de maíz con ayuda de la trampa de esporas Hirst (ver descripción más abajo) en zonas de cultivo y posterior identificación mediante qPCR es necesario probar si la extracción y detección de ADN de maíz no se ve afectada por el soporte que se emplea como agente adherente. Existen dos opciones a utilizar, vaselina con hexano y silicona con tetracloruro de carbono. Ambos agentes son ampliamente utilizados para la captura de granos de polen y se ha demostrado que la vaselina con hexano no interfiere en la pruebas de PCR, sin embargo, en ambientes de temperaturas altas (como las de la zona que se planea estudiar) la vaselina tiende a aumentar su fluidez y si la temperatura aumenta mucho puede desprenderse de la cinta de celofán. Por otro lado, la silicona con tetracloruro de carbono es más estable a temperaturas altas pero no se ha determinado si puede interferir con las reacciones de PCR, por ello se realizó un experimento en el que se simularon cintas de celofán con concentraciones conocidas de granos de polen con ambos adherentes con el fin de determinar si no interfieren negativamente con las pruebas de QPCR. Para ello se cortaron 14 trozos de celofán melinex de 48 mm de longitud (lo cual correspondería a un periodo de 24 horas de muestreo). 7 de ellos fueron cubiertos con una capa de vaselina con hexano (1:5) y los otros 7 con una capa de silicona disuelta en tetracloruro de carbono y se dejaron secar hasta que se evaporó el disolvente y solo quedó la capa adherente inerte. Posteriormente se preparó una nueva suspensión de granos de polen de maíz y se cuantificó en cámara de Neubauer y se hicieron diluciones seriadas. Se tomó la cantidad exacta necesaria para obtener las siguientes concentraciones de granos de polen: 10 000, 5000, 1000, 500, 100, 50 y 0 y se depositaron sobre los trozos de cinta. Se dejaron secar al aire y posteriormente se agregaron a microtubos de 2 ml que contenían previamente 0.2 g de perlas de vidrio. Se les adicionó a cada tubo 250 µl de Nonidet p40 al 0.1% y fueron sometidos a 3 ciclos de rompimiento en equipo FastPrep a 6m/s durante 45 segundos por ciclo con periodos de enfriamiento en hielo de 2 minutos entre cada ciclo. Finalmente, se tomaron 50 µl de la suspensión resultante para la extracción de ADN. Extracción del ADN Se purificó el ADN siguiendo el método de Lee y Taylor (1990) y modificado por Williams et al. (2001). A partir de 50 µl de la suspensión resultante del rompimiento se le adicionaron 50 µl de fenol/cloroformo 1:1, se agitó en vortex 10 s y se centrifugó a 14 000 rpm durante 15 min. 40 µl de la fase acuosa fue transferida a otro tubo que contenía 60 µl de isopropanol frío, 4 µl de acetato de amonio 6 M y 20 µg de glicógeno (Roche, Suiza). Se

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dejaron reposar 24 h a -20ºC y luego se centrifugaron 15 min a 14 000 rpm. Se descartó el sobrenadante y el botón se lavó con 100 µl de etanol al 70% a -20ºC. De nuevo se centrifugó 5 min a 14 000 rpm, se eliminó el sobrenadante, se dejo secar al aire y el botón de ADN fue resuspendido en 40 µl de agua estéril Milli-Q (Millipore MA, USA). Para la prueba de QPCR se utilizaron 5 µl de dicha suspensión. Las concentraciones (en número de granos de polen) luego de cada paso de la extracción de ADN se muestran en la siguiente tabla (tabla 2).

Muestra

# de granos de polen

depositados en cinta

# de granos de polen en 50 µl de

suspensión (tomados luego del rompimiento)

# de granos de polen en 40 µl de suspensión (luego de la extracción de

ADN)

# de granos de polen en 5 µl de suspensión (utilizados para la

QPCR)

1s* 10 000 2000 1600 200

2s 5000 1000 800 100

3s 1000 200 160 20

4s 500 100 80 10

5s 100 20 16 2

6s 50 10 8 1

7s 0 0 0 0

1v** 10 000 2000 1600 200

2v 5000 1000 800 100

3v 1000 200 160 20

4v 500 100 80 10

5v 100 20 16 2

6v 50 10 8 1

7v 0 0 0 0

* la letra s indica muestra en soporte de silicona ** la letra v indica muestra en soporte de vaselina

Tabla 2 Concentración de granos de polen utilizados en cada muestra

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PCR en tiempo real Para la amplificación de PCR en tiempo real se empleó el gen endógeno de maíz HMG (high-mobility group) (Van den Eede, 2010), se usaron los iniciadores MaiJ-F2 (TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA), mhmg-Rev (GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT) y la sonda Mhmg-probe (6FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA) que producen un amplicon de 79bp. Las muestras se corrieron en un equipo ABI PRISM 7500 sequence detection system (Applied Biosystems) con los reactivos y cantidades de la tabla 3. Las condiciones de amplificación se encuentran en la tabla 4. Se preparó una curva estándar con ADN de maíz extraído del material de referencia certificado del evento TC1507 al 10% (Fluka/BioChemika). Se prepararon diluciones seriadas a partir de 20ng, de manera que se agregaran por reacción 100ng, 50ng, 10ng y 1ng de ADN. Ademas se utilizaron las muestras descritas en el apartado anterior.

Reactivo Concentración inicial

Concentración final

Volumen para una reacción

de 25 µL

Agua ultrapura ---- ---- 6.5 µL

TaqMan Universal PCR Master Mix

2X 1X 12.5 µL

Iniciador mhmg-Rev 10 µM 150 nM 0.375 µL

Iniciador maiJ-F2 10 µM 150 nM 0.375 µL

Sonda mhmg-P 5 µM 50 nM 0.25 µL

ADN molde 50 ng/µL 200 ng 5 µL

Volumen total ---- ---- 25 µL

Gen Etapa Paso Temperatura Tiempo Número de ciclos

mhmg 1 1 50 ºC 0:02:00 1

2 1 95 ºC 0:10:00 1

3

1 2

95 ºC 60 ºC

0:00:15 0:01:00

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Tabla 3. Reactivos y cantidades utilizadas en qPCR

Tabla 4. Condiciones de amplificación utilizadas en qPCR

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Resultados Los resultados de la qPCR se muestran a continuación en la figura 3.

Figura 3. Curva de amplificación de qpCR. Se incluye la curva estándar y las muestras problemas

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El límite de detección mínimo para las muestras con soporte de silicona pertenece a la muestra 6s (correspondientes a 50 granos de polen en cinta y 1 grano en la mezcla de qPCR) (figura 4).

Para las muestras con soporte de vaselina el límite mínimo corresponde a la muestra 5s (correspondientes a 100 granos de polen en cinta y 2 granos en la mezcla de qPCR) (figura 5).

Figura 4. Curva de amplificación de qpCR para las muestras con soporte de silicona

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Figura 5. Curva de amplificación de qpCR para las muestras con soporte de vaselina

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Aislamiento de granos de polen del aire

Experimentos en el minitúnel de viento

El objetivo de los experimentos en el minitúnel de viento es simular la presencia de granos de polen en el aire para su posterior colecta, cuantificación y extracción de ADN. Para ello se colocaron espigas con granos de polen dentro de un minitúnel de viento (construido en el taller mecánico del Centro de Ciencias de la Atmósfera de la UNAM). El túnel mide 90 cm de largo, por 15 cm de ancho y 15 cm de altura y está unido a una cámara de 35 cm de alto, por 24 cm de largo y 24 cm de ancho donde se acopla un humidificador para control de humedad, y situado afuera se encuentra el ventilador eléctrico. Posee compartimentos para la introducción y colocación de muestras (fig 3). A las espigas se les aplicó una corriente constante de aire de 4 m/s y la colecta de granos de polen del aire se llevo a cabo con una trampa de granos de polen Hirst (Burkard). Este equipo succiona 10 L de aire por minuto y puede funcionar 24 horas durante los 365 días del año (fig. 7). El muestreador tiene integrado un tambor (fig. 8) que gira en dirección con las manecillas del reloj, sobre el cual se adhiere una cinta de celofán (Melinex) cubierta con una delgada capa de adherente (vaselina con hexano o silicona con tetracloruro de carbono) donde se impactan las partículas colectadas del aire. Esta cinta se remueve cada semana y se corta en trozos de 48 mm los cuales corresponden a 24 h de muestreo (fig. 9).

Figura 6. Minitúnel de viento con espigas de maíz en su interior

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Además, junto a la trampa de esporas Hirst se colocó un muestreador pasivo. Este dispositivo consiste en una veleta giratoria en cuyo interior se coloca un portaobjetos al que esta adherido un trozo de celofán con silicona (idéntico al de la trampa de esporas) y carece de una fuente que aspire aire. La laminilla está dirigida hacia el frente del sistema tubular, quedando por detrás la veleta, por lo que siempre estará expuesta a las corrientes de aire que acarrean a las partículas, impactándose éstas sobre el portaobjetos. La trampa se deja funcionando, es decir, girando con la fuerza del viento durante 7 días. Posteriormente, la laminilla es desmontada y colocada en una caja diseñada para transportarlas al laboratorio para su análisis (fig.10).

Figura 10. Minitúnel de viento que emite una corriente de aire que arrastra los granos de polen y son capturados en la trampa de esporas Hirst y en el

muestreador pasivo.

Fig. 7. Trampa de granos de polen Hirst

Fig. 8. Tambor interno de la Trampa de granos de polen Hirst

Fig. 9. Trozo de cinta de celofán Melinex

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PCR en tiempo real Para la amplificación de PCR en tiempo real se emplearon 7 muestras (por triplicado) correspondientes cada una a 24 h de funcionamiento de la trampa de esporas Hirst y una muestra (por triplicado) de la trampa pasiva de esporas (en todos los casos con silicona como soporte) y ademas se preparó una curva estándar con ADN de maíz extraído del material de referencia certificado del evento TC1507 al 10% (Fluka/BioChemika). Se prepararon diluciones seriadas a partir de 20ng, de manera que se agregaran por reacción 100ng, 50ng, 10ng y 1ng de ADN. Resultados Los resultados de la qPCR se muestran a continuación en la figura 11.

Figura 11. Curva de amplificación de qpCR para los granos de polen emitidos por el minitúnel de viento y capturados en la trampa de esporas Hirst y el muestreador pasivo

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Desafortunadamente solo hubo amplificación de la curva estándar (fig.12) lo cual quiere decir que ni la trampa de esporas Hirst ni la trampa pasiva capturaron granos de polen o lo hicieron en cantidad insuficiente (hay que recordar que el límite mínimo corresponde a 50 granos de polen en cinta que es equivalente a 1 grano de polen en la mezcla de qPCR). Una posible explicación de esto puede ser que la velocidad del minitúnel de viento (4 m/s = 14.4 km/h) conjuntada con la cercanía a ambas trampas impidió la deposición de los granos de polen de maíz.

Figura 12. Curva de amplificación de qpCR para los granos de polen emitidos por el minitúnel de viento y capturados en la trampa de esporas Hirst y el muestreador pasivo.

No existió amplificación en ningún caso

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Análisis de Adherentes (Silicona vs Vaselina)

El objetivo de este experimento fue determinar si existe diferencia entre la cantidad de granos de polen capturados con silicona o vaselina. Para ello se tomaron 48 trozos de cinta melinex y se les aplicó silicona o vaselina (24 c/u). Posteriormente se colocaron 8 trozos (4 de cada uno) a la salida del túnel del viento en cuyo interior se encontraban espigas de maíz con granos de polen. Se hizo pasar una corriente de aire a 4 m/s durante 2 minutos. Posteriormente se retiraron y se cambiaron por otros. Finalmente los trozos con granos de polen impactados fueron analizados al microscopio y se contabilizó el número de granos de polen de maíz capturados en 4 transectos, lo que da un total de 96 resultados para cada adherente. A continuación se muestra el análisis estadístico de los resultados (Minitab v.15.0).

Descriptive Statistics:

Variable Adherente N N* Mean SE Mean StDev CoefVar Minimum Q1

gp silicona 96 0 33.72 2.72 26.68 79.13 1.00 13.00

vaselina 96 0 42.39 4.27 41.82 98.66 1.00 11.25

N for

Variable Adherente Median Q3 Maximum Mode Mode

gp silicona 27.00 50.75 111.00 5, 10, 13, 19 4

vaselina 27.00 66.50 196.00 12 7

vaselinasilicona

200

150

100

50

0

Adherente

gp

Boxplot of gp

Figura 13. Diagrama de cajas mostrando las diferencias entre la silicona y la vaselina

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Two-Sample T-Test and CI: gp, Adherente

Two-sample T for gp

Adherente N Mean StDev SE Mean

silicona 96 33.7 26.7 2.7

vaselina 96 42.4 41.8 4.3

Difference = mu (silicona) - mu (vaselina)

Estimate for difference: -8.67

95% CI for difference: (-18.66, 1.33)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1.71 P-Value = 0.089 DF = 161

One-way ANOVA: gp versus Adherente

Source DF SS MS F P

Adherente 1 3605 3605 2.93 0.089 Error 190 233756 1230

Total 191 237361

S = 35.08 R-Sq = 1.52% R-Sq(adj) = 1.00%

Individual 95% CIs For Mean Based on

Pooled StDev

Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+---

silicona 96 33.72 26.68 (-----------*-----------)

vaselina 96 42.39 41.82 (-----------*----------)

------+---------+---------+---------+---

30.0 36.0 42.0 48.0

Pooled StDev = 35.08

Mann-Whitney Test and CI:

N Median

Vaselina 96 27.00

Silicona 96 27.00

Point estimate for ETA1-ETA2 is -1.00

95.0 Percent CI for ETA1-ETA2 is (-9.00,5.00)

W = 9123.0

Test of ETA1 = ETA2 vs ETA1 not = ETA2 is significant at 0.7152 The test is significant at 0.7151 (adjusted for ties)

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En ninguna de las 3 pruebas estadísticas utilizadas (2 paramétricas y 1 no-paramétrica) se muestra un nivel de significancia menor a 0.05, por lo tanto se puede concluir que los resultados de este experimento no permiten afirmar que exista diferencia significativa entre el número de granos polen de maíz capturados cuando el adherente utilizado es silicona o vaselina.

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Prueba piloto en campos de maíz cercanos a la Ciudad de México

Previo a la realización del estudio en los campos con maíz GM, se decidió hacer un ensayo piloto en campos de maíz situados cerca de la Ciudad de México con el fin de afinar detalles. Para ello se eligieron 4 sitios: 2 cercanos al Ajusco, uno cercano al Poblado de Topilejo y el ultimo en el poblado de Parres, todos dentro del Distrito Federal (fig. 14) y se georeferenciaron todos los campos de maíz situados en un radio de 3 km de las trampas de esporas. Las trampas de esporas Hirst se dejaron funcionando del 16 de agosto al 21 de septiembre haciendo el cambio de la cinta cada 2 semanas (esto con el fin de aumentar la cantidad de granos de polen capturados por que la época de floración del maíz estaba en su parte final cuando se colocaron las trampas).

Figura 14. Ubicación de las trampas de esporas Hirst utilizadas en el ensayo piloto

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Posteriormente se recogieron las cintas y se cortaron en 7 trozos, cada uno correspondiente a 48 h de muestreo. La extracción de ADN y qPCR se realizaron con los métodos ya descritos y los resultados se muestran en la siguiente figura (fig. 15).

La figura 15 muestra amplificación de la curva estándar únicamente, aunque 2 muestras de ambos sitios cercanos al Ajusco parecen mostrar un crecimiento exponencial cerca del ciclo 40 (el último ciclo), por ello se decidió cambiar el método de extracción de ADN y las condiciones de la qPCR. Además, una observación al microscopio de algunas muestras reveló que la mayoría de los trozos de cinta contenían menos de 10 granos de polen cada uno.

Figura 15. Curva de amplificación de qPCR para los granos de polen capturados por las trampas de esporas Hirs situadas cerca de campos de maíz

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Método modificado de extracción de ADN Se colocaron los trozos de cinta Melinex (con los granos de polen impactados) dentro de tubos de 2ml con tapa de rosca que previamente contenían 0.2 g de perlas de vidrio estériles. Se agregaron 200 µl de Nonidet P40 al 0.1%. y se molieron las cintas en el equipo Fast-Prep bajo las siguientes condiciones: velocidad 6m/s, tiempo 45 segundos. El total de ciclos a completar fue de 3 (teniendo cuidado de colocar los tubos en hielo 2 minutos entre cada ciclo para evitar sobrecalentamiento). Se centrifugaron a 10 000 rpm durante 1 min y se retiró la cinta de celofán con pinzas. Se agregaron 200 µl de la mezcla de fenol-cloroformo (1:1) y se agitaron en vortex durante 30 segundos. Se centrifugaron los tubos nuevamente durante 15 min. a 14 000 rpm. Se tomó el sobrenadante de 3.5 tubos (de forma cuidadosa para no perturbar la interface) y se transfirieron a un tupo eppendorf de 2ml que contiene previamente 900 ul de isopropanol, 56 ul de acetato de amonio 6m y 3.5 ul de glicógeno. Se invirtieron 3 veces los tubos y se incubaron a -20ºC durante toda la noche. De nuevo se centrifugaron los tubos durante 15 minutos a 14 000 rpm, se descartó el sobrenadante utilizando una micropipeta teniendo cuidado de no tocar el botón de ADN. Se adicionaron a cada tubo 750 µl de etanol al 70% frió (almacenarlo previamente a -20ºC). Se invirtieron los tubos 3 veces y se centrifugaron 10 min a 14 000 rpm a 4ºC. Posteriormente se removió el sobrenadante y se resuspendió el botón en 100 µl de agua mili Q estéril. Para la prueba de QPCR se utilizaron 5 µl de dicha suspensión. Estas modificaciones permiten reducir la cantidad de granos de polen capturados en la cinta para tener una amplificación positiva. Con el método anterior se requerían 50 granos y con el nuevo bastan 10 (aprox.). La prueba de qPCR se realizó con las mismas muestras del experimento anterior y bajo las mismas condiciones, con la salvedad de que el número de ciclos se incremento a 50. Resultados Los resultados de la qPCR se muestran a continuación en la figura 16.

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Como se puede apreciar, además de la curva estándar hubo amplificación de 4 muestras (de ambos sitios cercanos al Ajusco) señal de que las modificaciones funcionaron. De nueva cuenta hay que recordar que las trampas se colocaron al final de la temporada de floración por eso el recobro es muy bajo, pero se espera que cuando se coloquen en los campos experimentales de maíz GM en el pico máximo de emisión de polen el recobro será mucho mayor.

Figura 16. Curva de amplificación de qPCR para los granos de polen capturados por las trampas de esporas Hirs situadas cerca de campos de maíz con el método modificado

de extracción de ADN

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Elección de los sitios de muestreo Durante el año 2012 se planea hacer los experimentos en las parcelas donde se siembre maíz GM. A continuación se presenta una tabla con las coordenadas de los sitios candidatos dentro del Estado de Sinaloa:

ID POINT_X POINT_Y

0 -109.03471 26.4309943

1 -108.893016 26.3634014

2 -108.654546 26.1641396

3 -108.631903 25.9011525

4 -107.963013 25.5717392

5 -107.319542 24.8674641

6 -107.326337 24.5773938

7 -107.185649 24.369398

8 -107.255505 24.1710152

9 -107.479799 24.1608491

10 -107.740789 24.4951999

11 -107.944965 24.5583862

12 -108.200942 25.208321

13 -108.650979 25.4294643

14 -109.119061 25.4862331

15 -109.388558 25.8598353

16 -109.404306 26.0774186

17 -109.173981 26.3983692

Tabla 5. Sitios en Sinaloa con solicitud de permiso para siembra de maíz GM

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Debido a que se esperan condiciones de heladas y sequias severas para el estado, principalmente en la parte noroccidental (Fundación Produce Sinaloa, 2012) se decidió descartar esos puntos (fig.18) y además poner énfasis en sitios cercanos a fuentes de agua ya que las presas y embalses se encuentran en sus niveles mínimos históricos (fig. 19).

Figura 17. Sitios en Sinaloa con solicitud de permiso para siembra de maíz GM (imagen de Google Earth)

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Figura 18. Sitios en Sinaloa con solicitud de permiso para siembra de maíz GM situados en posible zona de afectación por heladas (imagen de Google Earth)

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Los sitios corresponden a los puntos 5, 6 y 8 de la tabla 5. Otro criterio para la selección de sitios es que deben encontrarse cerca de núcleos urbanos de tamaño medio o grande, esto con el fin de poder acceder a servicios de hospedaje, transporte, reparación, etc. que se necesitarán cuando inicie el muestreo y esta situación deja como sitios preferidos a los puntos 5 (cercano a Culiacán) y el punto 6 (cercano a la población de Costa Rica también en el municipio de Culiacán).

Figura 19. Sitios en Sinaloa con solicitud de permiso para siembra de maíz GM, lejanos de zona de afectación de heladas y cerca de fuentes de agua (imagen de Google Earth)

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Ubicación de las trampas de esporas dentro de los campos de cultivo Para este estudio se cuentan con 9 trampas de esporas Hirst (Burkard) y con el fin de cumplir los objetivos planteados es necesario que las trampas se coloquen alrededor de los sitios experimentales de liberación de maíz GM en Sinaloa durante la época de floración para contar con tres períodos de 14 días cada uno de muestreo continuo (Previo, durante y posterior al período de floración). El viento es el principal agente dispersor del polen de maíz por ello se utilizó el modelo climático Hysplit para determinar las posibles trayectorias en las áreas seleccionadas. El modelo HYSPLIT (HYbrid Single-Particle Lagrangian Integrated Trajectory) (Drexler and Rolph, 2012) es un sistema completo para el computo de trayectorias de parcelas de aire e incluso permite simular dispersión deposición de partículas con base en las condiciones meteorológicas de la zona de interés (ARL, 2012). El modelo se puede utilizar de manera on-line y los parámetros básicos requeridos son la ubicación del punto de interés, altura y datos climáticos actuales o pasados (para el cálculo de trayectorias). Este modelo se utilizó para la determinación de trayectorias de viento durante el mes de febrero de 2012 y para el cálculo se utilizaron los datos del mismo mes del año 2011. Como el modelo permite mostrar las trayectorias dentro del programa Google Earth se mostrarán los resultados obtenidos con imágenes de ese programa en base a la localidad cercana a Costa Rica (Sinaloa, municipio de Culiacán).

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La figura 20 muestra que se presenta una alta variabilidad en la dirección de los vientos, lo cual también se puede observar en las rosas de viento de la misma zona, mostradas a continuación. Estas rosas de viento fueron obtenidas del sitio web de ARL (Air Resources Laboratory: http://ready.arl.noaa.gov/READYcmet.php). Estas graficas fueron obtenidas con datos de febrero de 2011 (figs. 21-29).

Figura 20. Trayectorias calculadas por el modelo Hysplit para un periodo de 15 días durante el mes de febrero. Las trayectorias fueron calculadas con diferencia de una hora entre cada una

de ellas (imagen de Google Earth)

http://ready.arl.noaa.gov/READYcmet.php

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De estos datos se deprende que la ubicación de las trampas de esporas Hirst debe ser de manera circular alrededor del centro del campo de cultivo, junto con una trampa situada en el centro mismo. En cuanto a la distancia, Hofmann y colaboradores recomiendan una distancia mínima de 1 km entre campos de cultivo para que no ocurra polinización cruzada, por lo tanto, la distancia máxima entre el campo de cultivo y las trampas debe ser de 1 km. Adicionalmente se pretende colocar entre 20 y 30 trampas pasivas en la misma zona para cubrir la máxima área posible.

Figuras 21-29. Rosas de viento para el mes de febrero en la zona de estudio

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Referencias bibliográficas ARL, 2012. HYSPLIT - Hybrid Single Particle Lagrangian Integrated Trajectory Model. Pagina

web: http://www.arl.noaa.gov/HYSPLIT_info.php Calderón, C., Ward, E., Freeman, J., Foster, J.S. y McCartney, H.A. 2002. Detection of

airborne inoculum of Leptosphaeria maculans and Pyrenopeziza brassicae in oilseed rape crops by polymerase chain reaction (PCR) assays. Plant Pathol. 51:303-310.

Draxler, R.R. and Rolph, G.D., 2012. HYSPLIT (HYbrid Single-Particle Lagrangian Integrated Trajectory) Model access via NOAA ARL READY Website (http://ready.arl.noaa.gov/HYSPLIT.php). NOAA Air Resources Laboratory, Silver Spring, MD.

Fundación Produce Sinaloa, 2011. Acciones para mitigar los efectos de una sequía en el cultivo de maíz en Sinaloa. Pagina web: http://www.fps.org.mx/divulgacion/index.php?option=com_remository&Itemid=269&func=download&id=558&chk=ede2778b43a7bc5a104baf64d38b55fd&no_html=1

Hofmann, F., R. Epp, L. Kruse, A. Kalchschmied, B. Maisch, E. Müller, U. Kuhn, W. Kratz, S. Ober, J. Radtke, U. Schlechtriemen, G. Schmidt, W. Schröder, D, R. Vögel, N. Wedl, W. Wosniok. 2010. Monitoring of Bt-Maize pollen exposure in the vicinity of the nature reserve Ruhlsdorfer Bruch in northeast Germany 2007 to 2008. Umweltwiss Schadst Forsch 22:229–251.

Lee, S., Taylor, J. 1990. Isolation of ADN from fungal mycelia and single spores, p. 282–287. In M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White (ed.), PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, Calif.

Van den Eede, Guy. 2010. Compendium of reference methods for GMO analysis . Publications Office of the European Union, JRC Publication N°: JRC60583. http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/111111111/15068

Williams, H., Ward, E., McCartney, H. 2001. Methods for integral air sampling and ADN analysis for detection of airborne fungal spores. Appl. Environ. Microbiol. 67:2453-2459.

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2011 Informe Monitoreo Atmos Polen

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