2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la...

Identificación y cuantificación de bacterias

filamentosas del género Thiothrix con la técnica

FISH en EDAR de la Comunidad Valenciana y

estudio de sus relaciones con parámetros

físico-químicos y operacionales.

TRABAJO FINAL DE MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL

Realizado por:

Verónica Romera Lozano

Dirigido por:

Dr. José Luis Alonso Molina

Dr. Gonzalo Cuesta Amat

VALENCIA, Septiembre 2013

MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO

3

Agradecimientos

Lo primero dar las gracias a mis tutores Gonzalo Cuesta Amat y José Luis Alonso durante este

periodo a pesar de las dificultades que hayan tenido, muchas gracias por vuestra dedicación,

correcciones y apoyo. También destacar el ambiente de trabajo en el Instituto Universitario

del Agua y Medio Ambiente (IIAMA) donde he podido trabajar con Yolanda, Irene, Paula,

Mariela, Andrés e Inma, además de numerosas personas que han pasado y han coincidido

conmigo; como Marta, Alba, Paula y Laura entre otros, aportándome su experiencia,

consejos y sus amenas charlas en ratos difíciles.

A Andrés Zornoza por su ayuda y su disposición siempre que lo he necesitado, por su

paciencia en los ratos de trabajo y su aportación.

A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana

(EPSAR) por facilitar los datos para la realización de este estudio.

A mi familia por sus esfuerzos, sus ánimos y su incondicional ayuda sin la cual este trabajo no

estaría terminado.

También agradecer a Iván los momentos de apoyo mutuos, las largas charlas sobre este

tema y todo lo relacionado con él, además de sus horas acompañándome.


4


5

Índice

1. Introducción ........................................................................................................................ 17

1.1 Las aguas residuales y su composición ................................................................................. 17

1.2 Tratamiento de aguas residuales .......................................................................................... 21

1.2.1 Fases del tratamiento .................................................................................................... 21

1.2.1.1 Tratamiento biológico ............................................................................................... 22

1.2.2 Fangos activos: .............................................................................................................. 23

1.2.3 Microbiología de los Fangos activos.............................................................................. 24

1.2.4 Problemas en sistemas de Fangos activos .................................................................... 26

1.3 Importancia de las bacterias filamentosas ............................................................................ 27

1.3.1 Género Thiothrix ........................................................................................................... 27

1.3.1.1 Descripción taxonómica de Thiothrix eikelboomii. ................................................... 31

1.3.1.2 Descripción taxonómica de Thiothrix disciformis ...................................................... 32

1.3.1.3 Descripción taxonómica de Thiothrix defluvii ........................................................... 32

1.3.1.4 Descripción taxonómica de Thiothrix fructosivorans ................................................ 32

1.3.1.5 Descripción taxonómica de Thiothrix nivea. ............................................................. 33

1.4 Identificación de morfotipos filamentosos ........................................................................... 33

1.4.1 Microscopía convencional ............................................................................................. 33

1.4.2 Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas ...................................... 34

2. Objetivos ............................................................................................................................. 40

3. Material y Métodos ............................................................................................................. 42

3.1 Toma de muestras ................................................................................................................. 42

3.1.1 EDAR CARRAIXET ........................................................................................................... 42

3.1.2 EDAR CASTELLÓN DE LA PLANA .................................................................................... 43

3.1.3 EDAR DENIA-ONDARA ................................................................................................... 43

3.1.4 EDAR QUART-BENÁGER................................................................................................. 44

3.2 Muestreo ............................................................................................................................... 44

3.3 Parámetros físico-químicos y variables operacionales ......................................................... 45

3.4 Método clásico de identificación de bacterias filamentosas ................................................ 45

3.5 Técnica FISH........................................................................................................................... 45

3.5.1 Fijación y permeabilización de las muestras ................................................................. 45

3.5.2 Hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas con fluoróforos (FISH) ........... 48

3.5.2.1 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón ............................................ 48

3.5.2.2 Aplicación de las muestras a los portaobjetos .......................................................... 48


6

3.5.2.3 Sondas utilizadas ....................................................................................................... 48

3.5.2.4 Hibridación “in situ” .................................................................................................. 49

3.5.2.5 Observación al microscopio ....................................................................................... 50

3.6 Análisis estadístico ................................................................................................................. 52

3.6.1 Coeficiente de correlación de Spearman. ..................................................................... 53

3.6.2 Análisis de Componentes Principales (ACP) .................................................................. 54

3.6.3 Tratamiento por ordenador .......................................................................................... 57

4. Resultados ........................................................................................................................... 59

4.1 Características morfológicas y estructurales de las bacterias filamentosas del género

Thiothrix ............................................................................................................................................. 59

4.2 Cuantificación e identificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix ................... 62

4.2.1 Microscopia convencional ............................................................................................. 62

4.2.2 Técnica molecular FISH .................................................................................................. 63

4.3 Comparación microscopía convencional-FISH ...................................................................... 65

4.4 Análisis estadísticos entre las bacterias filamentosas del género Thiothrix y los parámetros

operacionales y físico-químicos ......................................................................................................... 72

4.4.1 Análisis Bivariante. Coeficiente de Spearman. .............................................................. 72

4.4.2 Análisis de Componentes Principales (ACP) .................................................................. 76

5. Discusión .............................................................................................................................. 82

5.1 Técnica convencional versus FISH ......................................................................................... 82

5.2 Correlaciones de Spearman ................................................................................................... 82

5.3 Análisis componentes principales ......................................................................................... 85

5.3.1 Parámetros físico-químicos del afluente ....................................................................... 85

5.3.2 Parámetros físico-químicos del Licor Mezcla ................................................................ 85

5.3.3 Parámetros físico-químicos del efluente ....................................................................... 86

5.3.4 Parámetros operacionales ............................................................................................. 86

6. Conclusiones ........................................................................................................................ 88

7. Bibliografía ........................................................................................................................... 90

8. Anexos ................................................................................................................................. 96


7

Índice de Figuras

Figura 1: Esquema de las etapas de tratamiento de una EDAR con el sistema de fangos activos ....... 22

Figura 2: Fases del tratamiento. Línea de fangos (EPSAR) .................................................................... 22

Figura 3: El ciclo del azufre. (Sawyer y McCarty, 1967) ........................................................................ 27

Figura 4: Árbol filogenético del género Thiothrix. (Aruga et al., 2002) ................................................. 29

Figura 5. Árbol filogenético del género Thiothrix (Chernousova, 2009) ............................................... 31

Figura 6: Preparación del portaobjetos para visualización en microscopio de FISH ............................ 36

Figura 7: Técnica FISH con sondas 16SrDNA marcadas con fluoróforos ............................................... 37

Figura 8: Depuradora de Carraixet ........................................................................................................ 42

Figura 9: Depuradora de Castellón ........................................................................................................ 43

Figura 10: Depuradora de Denia ........................................................................................................... 43

Figura 11: Depuradora de Quart ........................................................................................................... 44

Figura 12: Protocolo de Fijación ............................................................................................................ 47

Figura 13: Recuento de Índice Filamentoso .......................................................................................... 51

Figura 14: Ejemplo de matriz ................................................................................................................ 52

Figura 15: Matrices análisis de Componentes Principales .................................................................... 56

Figura 16 A, B: A) Vista convencional, B) Vista con FISH sonda G123T, 1000X ..................................... 59

Figura 17 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda G2M, 1000X .............................................. 60

Figura 18 A, B y C: A) Vista convencional, B) Vista FISH y C) Superposición capas vistas a y b sonda

TFR, 1000X ............................................................................................................................................. 60

Figura 19 A, B: A) Vista Convencional, B) Vista FISH sonda TFR, 1000X ................................................ 61

Figura 20 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda TNI, 1000X ................................................ 61

Figura 21 A y B: A) Vista Convencional G2M, y B) FISH sonda G2M (Quart), 1000X............................. 62

Figura 22 A y B: A) Vista Convencional, B) FISH sonda TFR (Denia), 1000X .......................................... 62

Figura 23 A y B: A) Vista Convencional Thiothrix Eikelboomii, B) FISH sonda G2M (Quart) ................. 63

Figura 24 A y B: A) Vista Convencional y B) FISH sonda TNI (Castellón), 1000X ................................... 63

Figura 25 A, B y C: A) Vista Convencional, B) FISH y C) superposición de imagen FISH y Convencional

Sonda TFR. (Denia) ................................................................................................................................ 64

Figura 26: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart. ......................................................................................... 66

Figura 27: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia .......................................................................................... 67

Figura 28: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1 ........................................................................ 67

Figura 29: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón; Línea 2. ...................................................................... 68

Figura 30: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1. ...................................................................... 68

Figura 31: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2 ....................................................................... 69

Figura 32: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart. ......................................................................................... 69

Figura 33: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia .......................................................................................... 70



Figura 36: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1 ....................................................................... 71

Figura 37: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2 ....................................................................... 71

Figura 38: ACP de las variables físico-químicas del afluente con las sondas G2M, TNI y TFR .............. 77

Figura 39: ACP de las variables físico-químicas del licor mezcla con las sondas G2M, TNI y TFR ......... 78

Figura 40: ACP de las variables físico-químicas del efluente con las sondas G2M, TNI y TFR .............. 79

Figura 41: ACP de las variables operacionales con las sondas G2M, TNI y TFR .................................... 80


8

Figura 42: Vista aérea EDAR Carraixet ................................................................................................... 96

Figura 43: Vista aérea EDAR DENIA ....................................................................................................... 96

Figura 44: Vista aérea EDAR QUART ...................................................................................................... 97

Figura 45: Vista aérea EDAR CASTELLÓN ............................................................................................... 97


9

Índice de Tablas

Tabla 1: Ejemplo composición de aguas residuales domésticas (% DQO) ............................................ 18

Tabla 2: Composición típica de agua residual doméstica ..................................................................... 18

Tabla 3: Límites de vertido zonas normales (MAGRAMA 2012) ........................................................... 20

Tabla 4: Límites adicionales de vertido en zonas sensibles (MAGRAMA 2012) .................................... 20

Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: Causas y Efectos .......................... 26

Tabla 6: Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas .................................... 49

Tabla 7: Solución de hibridación según porcentaje de formamida ...................................................... 49

Tabla 8: Solución de lavado según porcentaje de formamida .............................................................. 50

Tabla 9: Escala de valoración de organismos filamentosos .................................................................. 51

Tabla 10: Interpretación de Coeficiente de Spearman ......................................................................... 54

Tabla 11: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet

L1 ........................................................................................................................................................... 64

Tabla 12: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet

L2 ........................................................................................................................................................... 64

Tabla 13: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón

L1 ........................................................................................................................................................... 65

Tabla 14: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón

L2 ........................................................................................................................................................... 65

Tabla 15: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Denia . 65

Tabla 16: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Quart. 65

Tabla 17: Variables mínimos, máximos, media y desviación estándar de todas las sondas ................. 65

Tabla 18: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente .... 73

Tabla 19: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente

continuación .......................................................................................................................................... 73

Tabla 20: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Licor mezcla .... 74

Tabla 21: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Efluente .......... 75

Tabla 22: Correlaciones Spearman de las sondas con las Variables operacionales ............................. 75

Tabla 23: Matriz de componentes rotados con porcentajes de las varianzas ...................................... 76

Tabla 24: Matriz de componentes rotados con el porcentaje de la varianza, licor mezcla. ................. 78

Tabla 25: Matriz de componentes rotados del efluente con el porcentaje de la varianza .................. 79

Tabla 26: Matriz de componentes rotados de las variables operacionales, con el porcentaje de la

varianza ................................................................................................................................................. 80

Tabla 27: Relación de muestras estudiadas. L.1: Línea 1; L.2: Línea 2; L(A+B): Línea A+B; L(C+D): Línea

(C+D) ...................................................................................................................................................... 98

Tabla 28: Listado completo de los parámetros físico-químicos y las variables operacionales,

nomenclatura y ubicación en el tratamiento ........................................................................................ 99

Tabla 29: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del afluente por

depuradora .......................................................................................................................................... 101

Tabla 30: Media, desviación estándar e intervalos del afluente continuación ................................... 102

Tabla 31: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del licor mezcla por

depuradora .......................................................................................................................................... 103

Tabla 32: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del efluente por

depuradora .......................................................................................................................................... 104


10

Tabla 33: Media, desviación estándar e intervalos de las variables operacionales por depuradora . 104


11

ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS

%SSVLM: Porcentaje de Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla

AGV: Ácidos Grasos Volátiles

CAGV: Carga Másica de Ácidos Grasos Volátiles

CARBO: Carbohidratos

CCARBO: Carga Másica de Carbohidratos

CM: Carga Másica

CMDBO: Carga Másica de la Demanda Biológica de Oxígeno

CMDQOs: Carga Másica de la Demanda Química de Oxígeno soluble

CNT: Carga Másica del Nitrógeno Total

CNTs: Carga Másica del Nitrógeno Total soluble

CN-NH4: Carga Másica del Nitrógeno Amoniacal

Cond: Conductividad del licor mezcla

CPT: Carga Másica del Fósforo Total

CPTs: Carga Másica del Fósforo Total Soluble

CP_PO4: Carga Másica del Fósforo como ortofosfato

CPROT: Carga Másica de Proteínas

CS: Carga Másica del sulfuro

CSO4: Carga Másica de Sulfatos

CTA: Carga Másica de Tensoactivos

DBO5: Demanda Bioquímica de Oxígeno total a los 5 días

DBOT: Demanda Bioquímica de Oxigeno total del efluente

DBOs: Demanda Bioquímica de Oxígeno soluble del efluente

DBO5/NKT: Relación Demanda Biológica de Oxígeno relacionado con el Nitrógeno Kjeldahl

DBO5/PT: Relación Demanda Biológica de Oxígeno relacionado con el Fósforo Total

DQOt: Demanda química de Oxígeno total efluente

DQOtLM: Demanda química de Oxígeno total Licor mezcla

DQOs: Demanda química de oxígeno soluble efluente

DQOs/NKTs: Relación Demanda Química de Oxígeno soluble/ Nitrógeno Kjeldahl soluble


12

DQOs/PTs: Relación Demanda Química de Oxígeno soluble/ Fósforo Total soluble

DQOLM: Demandad química de oxígeno del Licor Mezcla

EDAR: Estación Depuradora de Aguas Residuales

EF: Edad del fango

EPS: Sustancias poliméricas extracelulares

EPSAR: Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana

FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes

H2S: Ácido sulfhídrico

he: Habitantes equivalentes

IF: Índice de filamentos

IVF: Índice volumétrico de Fango

LM: Licor Mezcla

NKTs: Nitrógeno amoniacal Kjeldahl soluble

N_orgs: Nitrógeno Orgánico Soluble

N_orgp: Nitrógeno Orgánico Particulado

N_org: Nitrógeno Orgánico Total

NT: Nitrógeno Total

NTs: Nitrógeno Total Soluble

NTLM: Nitrógeno total del licor mezcla

NT SSVLM: Nitrógeno total de los Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla

ODb: Oxígeno disuelto en el reactor biológico bajo <0,8 ppm

ODm: Oxígeno disuelto en el reactor biológico medio 0,8-2 ppm

ODa: Oxígeno disuelto en el reactor biológico alto >2 ppm

PDQOs: Porcentaje de la Demanda Química de Oxígeno soluble en el afluente

PROT: Porteínas

P_org: Fósforo Orgánico

P_orgs: Fósforo Orgánico Soluble

P_orgp: Fósforo Orgánico Particulado

P_PO4: Fósforo relativo al ortofosfato


13

PT: Fósforo total

PTs: Fósforo Total Soluble

PTLM: Fósforo total del Licor Mezcla

PT SSVLM: Fósforo total de los Sólidos suspendidos Volátiles del Licor Mezcla

rDBOf: Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno filtrada del efluente

rDBOT: Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno Total del efluente

rDQOt: Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno Total del efluente

rDQOs: Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno soluble del efluente

rSST: Rendimiento de eliminación de los Sólidos suspendidos totales

SO2: Dióxido de azufre

SO32-

: Sulfito

SO42-

: Sulfato

SSLM: Sólidos en Suspensión del Licor Mezcla

SSTefl: Sólidos Suspendidos Totales del efluente

SSVLM: Sólidos en suspensión volátiles del Licor Mezcla

Sulfu: Sulfuros

Tªr: Temperatura reactor biológico

Tensan: Tensoactivos

TRHr: Tiempo de retención hidráulico en el reactor biológico


14


15

Resumen

Las bacterias que pertenecen al género Thiothrix se caracterizan por rasgos morfológicos

distintivos, como el crecimiento filamentoso y la acumulación de gránulos de azufre cuando

se incubaron en presencia de sulfuro o tiosulfato. Los morfotipos Thiothrix se producen en

plantas depuradoras municipales e industriales con y sin eliminación de nutrientes.

Tradicionalmente, los problemas de “Bulking” filamentoso han sido controlados por

microscopía clásica, como la observación morfológica y tinción policromática. Pocos trabajos

se han llevado a cabo para la detección de Thiothrix en muestras de EDAR con

procedimientos moleculares, tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH). En este

estudio, se investigó varias EDAR de la Comunidad Valenciana con la técnica de FISH para

analizar la composición de las especies y sus relaciones del género Thiothrix con parámetros

físico-químicos y operativos. Las muestras de lodos activos se obtuvieron de cuatro EDAR de

la Comunidad Valenciana y se analizaron por microscopía óptica cuantitativa y FISH. En el

análisis de FISH se utilizó un conjunto de 10 sondas FISH ácidos nucleicos rRNA específicos

que cubren el género y la especie Thiothrix. La abundancia de bacterias filamentosas en las

139 muestras de lodos activados se midió de acuerdo con el método de puntuación

subjetiva de Eikelboom (2000), donde las observaciones se calificaron en una escala de 0

(ninguna) a 5 (crecimiento extensivo). Los filamentos de Thiothrix estaban presentes en los

cuatro EDAR analizadas. En 92 (66,2%) de las muestras, los filamentos de Thiothrix se

observaron con la sonda G123T. Era evidente que las poblaciones mixtas de Thiothrix sp.

estaban presentes en las muestras de lodos activos investigados, las diferencias observadas

estaban en la abundancia relativa de los diversos grupos. Estos resultados fueron apoyados

por los resultados obtenidos mediante microscopía convencional. T. eikelboomii, T. nivea y T.

fructosivorans eran comunes (IF> 3) en dos de los cuatro EDAR analizadas. No se detectó

señal de fluorescencia con las sondas G1B (T. disciformis), G3M (T. defluvii) y Meg1028 +

Meg 983 (Meganema perideroedes). El análisis de correlación de Spearman y el análisis de

componentes principales (ACP) sugirió un comportamiento diferente entre las especies

dentro del género Thiothrix. Thiothrix eikelboomii mostró una relación positiva con la

temperatura del reactor (Tªr). Por el contrario, T. fructosivorans se relacionó negativamente

con la temperatura del reactor, (Tªr). Las bacterias filamentosas T. nivea y T. fructosivorans

se asociaron con altos valores de edad del fango (EF) y valores bajos de tasa de carga másica

(CM). T. nivea mostró una relación positiva con el tiempo de retención hidráulico (TRHr) y

negativa con los carbohidratos y las proteínas del afluente. Thiothrix eikelboomii y T. nivea se

asociaron con déficit de nitrógeno y fósforo (DBO5/NT/PT).


16


I N T R O D U C C I Ó N

17

1. Introducción

1.1 Las aguas residuales y su composición

Las aguas residuales contienen materias sólidas o líquidas evacuadas como desechos

tras un proceso industrial, es lo que comúnmente conocemos como residuos. Estos

residuos son la consecuencia de los diversos usos del agua.

o Residuo de uso doméstico: se producen estos en la utilización de baños, cocina

y lavado, los cuales contienen detergentes, restos de alimentos y restos

sintéticos.

o Residuos por el uso humano y animal: consisten en desechos fecales y orina,

los cuales pueden transportar organismos patógenos que afectan a la salud

humana.

o Residuos Industriales Líquidos (Riles): elementos que las industrias vierten en

las redes de alcantarillado tales como; metales, productos químicos y

elementos sólidos, todos con serios efectos nocivos.

o Agua de lluvia: al derivar hacia los alcantarillados las aguas de lluvias, estás

arrastran gran cantidad de arena, hojas y ramas de árboles, pasto y otros

elementos que se combinan con los otros residuos líquidos.

Según la composición de estas aguas residuales pueden estar formadas por:

o Agua Potable: las aguas residuales se componen mayoritariamente de agua

potable. Esto es, agua convenientemente tratada para el consumo humano.

o Sólidos: en las aguas residuales se encuentran todo tipo de sólidos

distinguiéndose entre ellos los orgánicos y los inorgánicos:

o Los sólidos orgánicos son sustancias que contienen carbón, hidrógeno y

oxígeno, pudiendo alguno de estos elementos combinarse con

nitrógeno, azufre o fósforo.

o Los sólidos inorgánicos son sustancias inertes y no susceptibles de ser

degradados, designándoseles comúnmente como minerales. Dentro de

estos se incluyen arenas, aceites y sales minerales disueltas en el agua

potable y sin propiedades combustibles.

o Gases disueltos: las aguas residuales contienen pequeñas y variadas

concentraciones de gases disueltos como el oxígeno, el cual está presente en el

agua en su estado original, así como también disuelto en el aire que está en

contacto con la superficie del líquido, el anhídrido carbónico, resultante de la

descomposición de materia orgánica, el nitrógeno disuelto de la atmósfera, y el

sulfuro de hidrógeno de compuestos de azufre tanto orgánicos como

inorgánicos.



18

Tabla 1: Ejemplo composición de aguas residuales domésticas (% DQO)

Componentes Henze, 1982 Tamaka et

al.; 1991 ** Narkis et al.;

1980* ***

DQO Total (g/m3) 530 259 394 (350-443) 813 (600-1180)

DQO soluble 40

Carbohidratos 12 6 57 (50-70) 36 (33-38)

Proteínas 8 12 9 (2-20) 6 (2-9)

Lípidos 10 19 27 (18-36) 14 (7-22)

Surfactantes 5 6 8

Ácidos Grasos 19 3 10 (7-10) 4 (3-5)

Ácidos húmicos 2

(6-12) 14 (8-18)

Otros orgánicos 46 49

*Cantidades y rangos de 3 ejemplo por cada tipo de agua

** Agua residual nueva (10-60 minutos), *** Agua residual antigua (6-12 horas)

Tabla 2: Composición típica de agua residual doméstica

Concentración (mg/l)

Fuerte Media Débil

Sólidos totales 1200 700 350

Sólidos disueltos totales 850 500 250

Fijos 525 300 145

Volátiles 325 200 105

Suspendidos totales 350 200 100

Fijos 75 50 30

Volátiles 275 150 70

Sólidos Sedimentables (ml/l) 20 10 5

Demanda Bioquímica de Oxígeno, 5 días 20ºC (DBO5, 20º)

400 220 110

Carbono Orgánico Total (CCT) 290 160 80

D.Q.O. (Demanda Química de Oxígeno) 1000 500 250

Nitrógeno total como N2 85 40 20

Nitrógeno Orgánico 35 15 8

Amoniaco Libre 50 25 12

Nitritos 0 0 0

Nitratos 0 0 0

Fósforo (total como P) 15 8 4

Orgánico 5 3 1

Inorgánico 10 5 3

Cianuros (*) 100 50 30

Alcalinidad (como CaCO3) (*) 200 100 50

Aceites y grasas 150 100 50

Detergentes 15 10 5



19

o Microorganismos: destacan como componentes biológicos,

o Bacterias: pueden tener dos comportamientos totalmente distintos.

Beneficiosas para el sistema porque participan en la depuración, o

dañinas porque alteran los procesos de depuración y pueden ser

patógenas.

o Organismos microscópicos y macroscópicos: metazoos, protozoos; que

juegan un papel en el control de la población de bacterias libres y unidas

al flóculo.

o Virus: patógenos para los humanos.

Una EDAR es una Estación Depuradora de Aguas Residuales, que recoge el agua

residual de una población o de una industria y, después de una serie de tratamientos y

procesos la, devuelve a un cauce receptor (río, embalse, mar…).

Se distinguen dos tipos de EDAR principales: las urbanas y las industriales. Las EDAR

urbanas reciben aguas residuales mayoritariamente de una aglomeración humana.

Mientras que las industriales reciben las aguas residuales de una o varias industrias.

El agua residual urbana en la mayor parte de España está formada por la reunión de las

aguas residuales procedentes del alcantarillado municipal, de las industrias asentadas

en el casco urbano y en la mayor parte de los casos de las aguas de lluvia que son

recogidas por el alcantarillado.

La mezcla de las aguas fecales con las aguas de lluvia suelen producir problemas en

una EDAR, sobre todo en caso de tormentas, por lo que en las actuaciones urbanas

recientes se están separando las redes de aguas fecales de las redes de aguas de lluvia.

Habitualmente las autoridades que tiene encomendadas competencias

medioambientales definen primero los usos que van a tener los cauces para así

establecer las necesidades o situaciones críticas de los vertidos. Debemos distinguir,

por lo general, dos grandes líneas maestras para empezar (en España):

o La Directiva 217/ 91/CEE de la Unión Europea que establece los plazo para

construir depuradoras y los tamaños de la población de que deben contar con

una. Así mismo establece mecanismos y frecuencias de muestreo y análisis de

las aguas residuales. El control se basa en los siguientes parámetros: sólidos en

suspensión, DBO5, DQO, fósforo y nitrógeno. La transposición de la Directiva

91/271/CEE al derecho español, está contenida en el Real Decreto-Ley 11/1995,

de 28 de Diciembre (BOE núm. 312, de 30 de Diciembre), por el que se

establecen las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales

urbanas. Por su parte, el Real Decreto 509/1996, de 15 de Marzo (BOE núm. 77,

de 29 de Marzo) desarrolló el contenido anteriormente citado, mediante la

incorporación de los Anexos contenidos en la Directiva 91/271/CEE, que no

había sido incorporado inicialmente.



20

o Los programas de aplicación de la Directiva 91/271/CEE, en España, se han

introducido mediante la aprobación del Plan Nacional de Saneamiento y

Depuración de Aguas Residuales (1995-2005) (resolución de 28 de Abril de

1995 de la Secretaría de Estado de Medio Ambiente y Vivienda, por la que se

publica el Acuerdo de Consejo de Ministros de 17 de Febrero de 1995). Existe la

trasposición a la legislación española de esta Directiva y un Plan Nacional de

Saneamiento y Depuración de Aguas Residuales.

La comisaría de Aguas correspondiente a la cuenca donde se vierte las aguas tras su

depuración, emite una autorización de vertido en la que se puede reflejar valores

límite de vertido.

La depuración consiste en la eliminación de la contaminación e impurezas contenidas

en el agua a tratar. Los procesos utilizables para depuración depende del tipo de

afluente pudiéndose estructurar en tres grandes bloques atendiendo a la naturaleza:

físicos, químicos y biológicos. Los tres se basan en la separación del agua residual en

dos fases: una contiene el agua limpia ya tratada y otra los sólidos sedimentables.

En la Comunidad Valenciana, se depuró en el año 2011 un volumen de 474 hm3/año,

que la sitúa entre las primeras regiones españolas en el cumplimiento de la Directiva

Comunitaria 271/91 sobre depuración. Al igual que en otras regiones como Cataluña se

ha implantado un Canon de Depuración (Ley 2/1992), que se factura junto al recibo del

agua potable, y se ha permitido financiar parte de las actuaciones previstas en el Plan

Director de Saneamiento (1992). El número de estaciones depuradoras de aguas

residuales (EDAR) existen en la región ascendía en el año 2011 a 460 unidades, que

ofrecían cobertura a más de 5.962.911 Habitantes Equivalente (he). Se ha

incrementado la capacidad de reducción de la carga media contaminante tratada por

las EDAR en 2011 lo que supone una reducción del 1,71% respecto a la tratada en

2010, superando la carga máxima semanal los 11.652.951 he, la cual aumenta en un

5,7 % respecto a los registrados en el año 2010. Se ha favorecido que en 2011 las

depuradoras eliminasen del agua 120.000 Tm de sólidos en suspensión y 122.000 Tm

Tabla 3: Límites de vertido zonas normales (MAGRAMA 2012)

Concentración Porcentajes de Reducción

DBO5 25 mg/l de O2 70-90 %

DQO 125 mg/l de O2 75 %

Sólidos en suspensión 35 mg/l de O2 90 %

Tabla 4: Límites adicionales de vertido en zonas sensibles (MAGRAMA 2012)

Concentración Porcentajes de Reducción

h-e<100.000 P total 2 mg/l 80 %

N Total 15 mg/l 70-80 %

h-e>100.000 P Total 1 mg/l 80 %

N Total 10 mg/l 70-80 %



21

de DBO5 (materia orgánica biodegradable). Actualmente, la Comunidad Valenciana, es

una de las más avanzadas en materia de infraestructuras de reutilización, disponiendo

de 41 EDAR con tratamiento terciario o avanzado con una capacidad total de 330,9

hm3/año. Desglosando por provincias Valencia sería la de mayor aprovechamiento de

aguas depuradas con el 65% seguida de Alicante con 28% y Castellón con 7%.

1.2 Tratamiento de aguas residuales

Una EDAR comprende varias etapas de tratamiento colocadas en serie. Paralelamente

a este tratamiento, un laboratorio de análisis, se encarga de controlar la calidad del

afluente y efluente de la EDAR, así como de los parámetros de funcionamiento del

procedimiento. El grado de tratamiento requerido para un agua residual dependerá

fundamentalmente de los límites de vertido para el efluente en un determinado lecho

receptor.

1.2.1 Fases del tratamiento

En general en la bibliografía los distintos tratamientos de aguas residuales se dividen

en pretratamientos, primarios, secundarios y avanzados o terciarios (figura 1 y 2). En el

pretratamiento se eliminan los sólidos de mayor tamaño que pueden atascar o dañar

la instalación posterior así como las gravas y arenas. En el primario se elimina parte de

los sólidos suspendidos y la materia orgánica asociada a ellos, normalmente mediante

operaciones físicas como la sedimentación. El efluente del tratamiento primario

frecuentemente contiene una DBO relativamente elevada. El tratamiento de este

efluente para eliminar la materia orgánica residual y la materia suspendida se conoce

como tratamiento secundario. Este tratamiento se realiza normalmente mediante

procesos biológicos con utilización de microorganismos. El efluente del tratamiento

secundario tiene, generalmente baja DBO5 y sólidos suspendidos y puede contener

varios mg/l de O2 disuelto. Para la reutilización del agua o para el control de la

eutrofización de las aguas receptoras es necesario el tratamiento terciario, con el fin

de eliminar los sólidos suspendidos, materia orgánica y nutrientes que quedan después

del tratamiento secundario. Actualmente la distinción entre tratamiento primario,

secundario y terciario resulta bastante arbitraria dado que muchos métodos modernos

de tratamiento incluyen procesos físicos, químicos y biológicos en la misma operación.

Así mismo, cuando la eliminación de nutrientes se realiza por vía biológica, estos

procesos se suelen incluir en el tratamiento secundario, realizándose simultáneamente

la eliminación de materia orgánica y nutrientes. (Ferrer y Seco; 2010)

En el apartado 1.2.1.1 hablaremos más detenidamente del tratamiento biológico.



22

Figura 1: Esquema de las etapas de tratamiento de una EDAR con el sistema de fangos activos

Figura 2: Fases del tratamiento. Línea de fangos (EPSAR)

1.2.1.1 Tratamiento biológico

En la etapa biológica de la depuración se ponen en contacto las aguas residuales con

unos microorganismos (bacterias, protozoos y metazoos). Estos crecen utilizando los

contaminantes del agua como fuente de carbono y/o como fuente de energía,

convirtiéndolos en nueva biomasa, dióxido de carbono y otros compuestos inertes

(Ferrer y Seco, 2007) que eliminan de ellas la mayor parte de la materia orgánica que

puedan contener. De la acción sobre los compuestos biodegradables los

microorganismos obtienen la energía para sus procesos vitales, como ya se ha

mencionado anteriormente y dejan como productos finales unos fangos fácilmente

sedimentables en depósitos diseñados a tal efecto y un agua depurada limpia que

puede verterse sin prejuicio para el medio ambiente.



23

Además en las EDAR se han desarrollado esquemas de procesos orientados a la

nitrificación, desnitrificación y eliminación de fósforo, incluyendo el citado

anteriormente; de eliminación de materia orgánica.

1.2.2 Fangos activos:

Existen varios métodos para el tratamiento de aguas residuales sin embargo el proceso

de fangos activos se utiliza desde hace más de medio siglo y es el más extendido en la

actualidad; a partir de la observación de que cualquier agua residual, doméstica o

industrial, aireada durante cierto tiempo, reducía su contenido en materia orgánica, al

mismo tiempo que se formaba un fluido con flóculos de bacterias. La observación en el

microscopio del fluido muestra que se encuentra formado por una población

heterogénea de microorganismos, que cambia continuamente con el tiempo como

respuesta a la variación de la composición del agua residual y a las condiciones

ambientales (Soddell y Seviour, 1990)

Es imprescindible, para el buen rendimiento del proceso, que en los tanques de

aireación se produzca una buena agitación persiguiéndose dos fines. En primer lugar

que se obtenga una buena homogenización entre el agua residual y el fango activado

de tal forma que todos los microorganismos del fango obtengan alimento. En segundo

lugar mantener unas concentraciones de oxígeno disuelto lo suficientemente altas,

que permitan el metabolismo de los microorganismos que conforman el fango

activado. Para conseguir ambos fines, las cubas de aireación están dotadas de sistemas

de aireación y/o homogenización. Con este proceso conseguimos un tratamiento

aerobio que oxida la materia orgánica hasta dióxido de carbono (CO2), amoniaco (NH3),

agua (H2O) y nueva biomasa celular.

La etapa biológica de un proceso por fangos activos podemos dividirla en tres fases: los

tanques de aireación, los decantadores secundarios y la línea de recirculación. En los

tanques de aireación se realiza la mezcla entre el agua a tratar y el cultivo de

microrganismos o fango activo, por medio de difusores o aireación mecánica. Esta

mezcla, que se obtiene tras un período de agitación y oxigenación, se envía a los

decantadores secundarios en los que se produce una separación en dos fases: por un

lado la biomasa celular obtenida forma flóculos o también llamados fangos activos,

que sedimentan en el fondo de los decantadores, por el otro el agua limpia. Es un

proceso utilizado a escala mundial como tratamiento biológico secundario para aguas

residuales domésticas (Bitton et al., 1999).

Una parte de los fangos activos que quedan en la parte baja de los decantadores son

enviados de nuevo a los tanques de aireación mediante la línea de recirculación para

mantener una concentración adecuada de microorganismos, el resto de fangos se

extrae del sistema evitando una acumulación excesiva de biomasa y controlando el

tiempo de retención celular. (Knobelsdorf et al, 2005).



24

1.2.3 Microbiología de los Fangos activos

El proceso de separación de los fangos activos del agua tratada es uno de los pasos

más importantes en la depuración biológica del agua residual, es por ello que tiene

especial importancia en la formación del flóculo. Éste debe tener un tamaño que le

permita soportar las turbulencias del agua y poder sedimentar posteriormente, para

obtener un sobrenadante fluido y claro.

Los microorganismos del flóculo se mantienen unidos gracias a una matriz extracelular

de naturaleza variable, que contiene material polisacárido, altos niveles de proteínas,

DNA y sustancias húmicas y fúlmicas (Kerley y Foster, 1995; Frölund et al; 1995), es lo

que se suele llamar biofloculación. Estos polímeros extracelulares (EPS); son

segregados por las denominadas bacterias formadoras de flóculos.

Centrándonos en la estructura del flóculo, está formado por microorganismos

(bacterias, hongos, protozoos y algún metazoo), materia inorgánica y orgánica (≈ 60-

90% de la misma es volátil) y su tamaño oscila entre 1 y 1000 µm. Los flóculos se unen

para formar el fango y se depositan en el fondo del tanque por sedimentación (Soddell

y Seviour, 1990). A continuación describiremos cada uno de los microorganismos que

forman la estructura del flóculo.

o En los fangos activos los microorganismos más abundantes son las bacterias

que forman el 95% de la biomasa. Principalmente intervienen en la eliminación

de materia orgánica por distintas vías y en la eliminación de nutrientes.

Además, sin las bacterias formadoras de flóculo y las bacterias filamentosas

sería imposible la sedimentación y la obtención de un efluente clarificado y de

calidad.

o El segundo grupo más numeroso son los protozoos, que componen el 5% de la

biomasa. Eliminan microorganismos patógenos de las aguas tratadas, ayudando

a clarificar el efluente y favoreciendo la biofloculación.

o Además podemos encontrar en raras ocasiones, hongos que pueden proliferar

pero que no suelen competir con las bacterias por la utilización de materia

orgánica disuelta, por tanto no los consideraremos relevantes para el proceso

de depuración.

o En los sistemas de depuración se suele atribuir a las algas el papel principal de

proporcionar oxígeno a las bacterias, para que éstas puedan participar

activamente en la eliminación de materia orgánica del agua residual (Ferrer, y

Seco 2007). Por el contrario su excesivo crecimiento puede provocar graves

problemas de atascos en las conducciones, aunque no son frecuentes en los

procesos de fangos activos.

o El último grupo son los rotíferos, que junto con los nematodos constituyen la

cima de la cadena trófica, en el sistema de fangos activos. Principalmente son

depredadores de organismos inferiores. Además los rotíferos eliminan

bacterias dispersas y contribuyen a la formación del flóculo por la secreción de



25

mucus. Son indicadores del buen funcionamiento de la depuración de las aguas

tratadas. Cuando existen elevadas cantidades de rotíferos y nematodos en

nuestro sistema, será un indicador de altas edades de fango y por lo tanto de

cambios en la capacidad de depuración del fango activo.

Basándose en la observación visual y en algunas medidas físicas, se ha sugerido que

existen dos niveles de estructura en los flóculos del fango activo (Sezgin et al., 1978):

o Microestructura: la confieren procesos de agregación microbiana y

biofloculación.

o Macroestructura: la proporcionan microorganismos filamentosos. Estos

organismos forman una red o una espina dorsal dentro del flóculo en la que las

bacterias floculadoras se adhieren.

Cuando las bacterias formadoras del flóculo y las filamentosas crecen en equilibrio se

forma el flóculo ideal, que es compacto, denso, grande y que sedimenta bien,

permitiendo obtener un sobrenadante claro. Si este equilibrio no se da, aparecen

problemas de separación de los sólidos del fango activo, relacionados con la naturaleza

del flóculo; lo que se conoce comúnmente como hinchazón de fangos o “Bulking”. Un

crecimiento masivo de filamentosas que impide el acercamiento de los flóculos y

dificulta la compactación y sedimentación de los flóculos. Al contrario de lo que

pasaría sí la proporción de filamentosas fuera baja, a lo que conllevaría la aparición de

pequeños y débiles flóculos que pueden aparecer en el clarificado de las aguas “flóculo

punta de alfiler”.



26

1.2.4 Problemas en sistemas de Fangos activos

El proceso de fangos activos lleva asociado una serie de fallos en la formación de la

microestructura o de la macroestructura del flóculo (Ferrer y Seco, 2007). Estos

problemas ejercen un efecto negativo sobre la calidad del efluente, que impide

alcanzar los objetivos de calidad en muchas circunstancias. A continuación en la tabla 5

podemos ver algunos de los problemas que se suelen dar con más frecuencia en las

EDAR:

Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: Causas y Efectos

PROBLEMA CAUSA EFECTO

Crecimiento

disperso.

Los microorganismos no forman flóculos,

sino que están dispersos, formando sólo

pequeños grupos o en células aisladas.

Efluente turbio. No hay zona de sedimentación

del fango.

Limo (Gelatina)

“Bulking” viscoso

(también se ha

denominado

“bulking” no

filamentoso).

Los microorganismos aparecen entre

grandes cantidades de limo exocelular. En

casos severos este limo confiere al fango

activo una consistencia gelatinosa.

Reducción de los porcentajes de sedimentación y

compactación. En casos severos no hay

separación de sólidos y se pierde fango con el

efluente del clarificador secundario. En casos más

leves suele aparecer una espuma viscosa.

Flóculo-alfiler “Pin-

floc” o “Pinpoint

floc”.

Se forman flóculos pequeños, compactos,

tenues, toscamente esféricos. Los

mayores decantan rápidamente. Los

menores decantan lentamente.

Índice volumétrico del Fango (I.V.F.) bajo, y

efluente turbio.

Esponjamiento

“Bulking”.

Organismos filamentosos se extienden

fuera de los flóculos por la solución,

interfiriendo en la compactación y

decantación del fango activo.

I.V.F. alto, sobrenadante muy claro.

Concentración del Fango Activo Recirculado

(F.A.R.) y del Fango Activo en Exceso (F.A.E) baja.

En casos severos hay pérdidas de fango con el

efluente. El proceso de manejo de los sólidos

resulta sobrecargado hidráulicamente.

Manto

ascendente.

La desnitrificación en el clarificador

secundario libera N2 gaseoso poco soluble

que se adhiere a los flóculos de fango

activo subiéndolos a la superficie del

clarificador.

Se forma una espuma de fango activo en la

superficie del clarificador secundario.

Formación de

espumas y/o

natas.

Causado por:

Sobrenadantes no degradables

Presencia de GALO y en ocasiones de

Microthrix parvicella.

Grandes cantidades de sólidos del fango activo

flotan formando espuma en la superficie de los

elementos del tratamiento. Las espumas de

Gordonia y Microthrix son persistentes y difíciles

de eliminar mecánicamente. Se acumulan y

pueden pudrirse. Los sólidos pueden pasar al

clarificador y al efluente o derramarse de las

cubas de aireación.



27

1.3 Importancia de las bacterias filamentosas

Las bacterias filamentosas aparecen en todos los tipos de EDAR con procesos de

fangos activos, siendo responsables de la mayoría de los problemas de “bulking” y

“foaming” (Jenkins et al., 2004). Más de 30 morfotipos filamentosos han sido

identificados en plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas (Eikelboom, 2000)

y muchos más han sido detectados en plantas que reciben agua de origen industrial

(Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom, 2006).

Las bacterias filamentosas deben ser consideradas como un miembro más de la

comunidad biológica de los fangos activos que están involucradas en la degradación de

la materia orgánica.

1.3.1 Género Thiothrix

Este género pertenece a la familia Thiothrichaceae, clase Gammaproteobacteria,

acomoda un grupo importante de bacterias filamentosas relacionadas con el ciclo del

azufre (figura 3), (Eikelboom y van Buijsen, 1981; Jenkins et al., 1993; Seviour et al.,

1999). Se encuentran a menudo como grupos de bacterias filamentosas dominantes en

el fango activo, y su proliferación puede llevar a una sedimentabilidad pobre de los

flóculos (bulking).

Alimento animal

Alimento vegetal

Mat

eria

co

loid

al

Mu

erte

Bacteria anaerobia

Sulfatos

SO42-

S elemental

Proteínas vegetales.

S orgánico

Urea

So42-

Sulfitos

S02, So32-

Sulfuro

H2S

Materia orgánica

residual.

S orgánico.

Proteína animal

S orgánico

Descomposición bacteriana Anaerobia Bacteria aerobia

Oxi

dac

ión

qu

ímic

a p

arci

al

Bac

teri

a d

el a

zufr

e

Bac

teri

a A

nae

rob

ia

Oxí

gen

o

Figura 3: El ciclo del azufre. (Sawyer y McCarty, 1967)



28

Los miembros del género Thiothrix, suelen ser filamentos de 0,7 – 2,6 µm de diámetro

y 0,7– 5,0 µm de longitud, son filamentos multicelulares. Producen gonidios

deslizantes al final de los filamentos. Son Gram negativo o Gram variable. No

presentan flagelos pero si pueden contener un mechón o penacho fímbrico al final de

los gonidios, pueden formar rosetas y tienen la capacidad intracelular de almacenar

gránulos de azufre (Larkin y Strohl, 1983, Williams et al., 1987). Son bacterias aeróbicas

o microaerofílicas. El rango óptimo de temperatura es de 15 - 30º; llegando a un

máximo de 32 o 37ºC; y un mínimo entre 4 - 10ºC, además presenta un rango de pH

óptimo para crecimiento entre 6,0 - 8,5. Se han aislado especies autótrofas

facultativas, mixotróficas y heterotróficas. Utilizan compuestos orgánicos simples

como sustrato para el crecimiento tanto en especies autotróficas facultativas como

mixotróficas. Algunas cepas pueden contener biopolímeros de azufre dentro de

invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células están creciendo en

presencia de compuestos de azufre inorgánico reducido (Williams et al., 1987)

creciendo autotróficamente y pudiéndose comparar con las proporciones cinéticas en

aquellos organismos con crecimiento heterotrófico. En condiciones aerobias oxidan el

S2- a S0.

⁄

Esta información, combinado con el hecho de que hay otros organismos que compiten

por este sustrato, verifica que el “bulking” causado por Thiothrix, es muy común

cuando el agua residual es de origen séptico. Algunas, pero no todas las especies

necesitan este almacenamiento para después reducirlo a azufre. (Winogradsky 1888).

Las distintas especies de Thiothrix han sido encontradas en innumerables hábitat,

desde las aguas naturales que contienen sulfuros (Jones et al., 1982; McGlannan y

Makemson, 1990; Brigmon et al., 1994), sistemas de irrigación (Ford y Tucker, 1975)

hasta sistemas de fangos activos de plantas de tratamiento de aguas residuales, donde

su presencia en gran número contribuye directamente al problema de “bulking”

(Eikelboom, 1975; Williams y Unz, 1985; Williams y Unz, 1989; Brigmon et al 1994;

Tandoi et al., 1994; Wagner et al., 1994;). La implicación del género Thiothrix podría

ser la causa del “bulking” en el fango activo en las plantas de tratamiento de aguas

residuales, esta característica ha dado lugar a distintos estudios de su fisiología

(Richard et al., 1985; Williams y Unz, 1985 a, b; Tandoi et al., 1994), ultra estructura

(Williams et al., 1987; Brigmon et al., 1994b), características de crecimiento (Unz y

Williams, 1989; Williams y Unz, 1989) e interacciones con metales pesados

(Shuttleworth y Unz, 1991, 1993). (Howarth et al.; 1999)

Desde la primera descripción de Thiothrix por Winogradsky (1888), se han validado

cinco especies (Skerman et al., 1980; Howarth et al., 1999); los miembros de cada

taxón forman un grupo filogenético distinto (Howarth et al., 1999; Kanagawa et al.,

2000).



29

Una de las cualidades para definir los rasgos del género Thiothrix es la capacidad de

formar rosetas. Sin embargo, algunas bacterias filamentosas como Leucothrix murcor

también pueden forman rosetas y gonidios (Williams y Unz, 1985a; Brock, 1992).

Los géneros Thiothrix y Leucothrix se han agrupado alternativamente juntos en la

familia Leucotrichaceae en base a su fisiología (Reichenbach y Dworkin, 1981; Howarth

et al., 1999). Posteriormente, Aruga et al.; 2002, (figura 4); publicaron una nueva

clasificación y corrección del árbol filogenético de Thiothrix propuesto anteriormente

por Winogradsky y Howarth.

Figura 4: Árbol filogenético del género Thiothrix. (Aruga et al., 2002)

En este estudio se encontraron diferencias filogenéticas entre el grupo T. nivea y el

tipo 021N de Eikelboom. Todas las cepas tipo 021N utilizaron varios tipos de azucares,

incluyendo glucosa, manosa, maltosa y trehalosa, mientras que los miembros del

grupo de T. nivea utilizaron pocos o ningunos de estos azucares. Los filamentos de

Eikelboom tipo 021N son muy largos (varios milímetros en longitud), mientras que los

filamentos del grupo T. nivea son de menor longitud. (Eikelboom, 1975; Williams y

Unz, 1985a; Kanagawa et al., 2000). Estas diferencias han dado lugar a la separación

del tipo 021N y T. nivea.

Además el grupo Eikelboom tipo 021N pude dividirse en tres distintos subgrupos (I al

III) en base a los datos filogenéticos. Se observó que la secuencia de 16S era similar

entre cepas del grupo III y otros dos grupos entre el 89,7 y el 91%.

Las cepas del grupo III están claramente diferenciadas del grupo I y II por su gran

longitud y la capacidad de oxidar compuestos de azufre (Kohno, 1988; Kanagawa et al.,



30

2000).Esta diferencia entre los grupos también se aprecia en la habilidad para utilizar

glicerol y butirato que tienen las cepas del grupo III.

A parte de todo lo anterior, el grupo III se ha separado de los grupos I y II; y se ha

designado como una nueva especie del genero Thiothrix. Las cepas del grupo III son

filogenéticamente más cercanas a T. defluvii Ben 57T, designándolas con el nombre de

T. flexilis.

Las diferencias en las secuencias del gen 16S entre el grupo I y II, sugiere que las cepas

del I y las cepas del II no son miembros de la misma especie. Diferentes autores

(Stackebrandt y Goebel, 1994; Hiraishi y Ueda, 1994; Kanagawa et al., 2000),

encuentran diferencias en la utilización del lactato y el carácter del poli-β-

hidroxibutarato y la actividad catalasa. Para esta diferenciación se propone el nombre

de una nueva especie para el grupo I llamado T. disciformis.

Cinco de las cepas del grupo II, incluida T. eikelboomii AP3T, poseen la capacidad de

reducir nitrato y utilizar algunas fuentes de carbono diferentes. Las secuencias del gen

16 S rDNA mostraron similitudes del 98,5 – 98,7% entre T. eikelboomii AP3T y las otras

cuatro cepas. Estos resultados sugieren que las cinco cepas no pertenecen a una sola

especie. Sin embargo, estas diferencias filogenéticas y fenotípicas podrían no ser

definitivas en la división de las cepas en una nueva especie. Por tanto se propone la

inclusión de todas ella en el grupo II (Aruga, 2002).

En el último estudio publicado de relaciones filogenéticas (Chernousova, 2009), se

estudian la secuencias de dos cepas comparadas con las secuencias depositadas en el

banco de datos del NCBI. El análisis de estas secuencias ha revelado la elevada

similitud entre el gen hsp 60 y el de T. fructosivorans QT (91,2 y 91,5% respectivamente

para las cepas BLT y G1T). Las características genotípicas y fenotípicas descritas en ese

estudio sugieren la diferencia a nivel de especie previamente y al nivel de genero de

Thiothrix para cada una de las cepas BLT y G1T. Se propone el nombre de Thiothrix

caldifontis para la cepa G1T, G2, K2 y P y Thiothrix lacustris para la cepa BLT.

Con lo cual el árbol filogenético del género Thiothrix quedaría de la siguiente manera

(figura 5):



31

Figura 5. Árbol filogenético del género Thiothrix (Chernousova, 2009)

Actualmente las sondas FISH disponibles para los diferentes grupos y especies del

género Thiothrix son: 021N y TNI (Wagner et al., 1994), y G1B, G2M, G3M y G123T

(Kanagawa et al., 2000). Sin embargo, la sonda 021N, diseñada para detectar

miembros del tipo 021N, ha hibridado con un número limitado de filamentos tipo

021N (Nielsen et al., 1998; Pernelle et al., 1998, van der Waarde et al., 1998;

Kanagawa et al., 2000).

1.3.1.1 Descripción taxonómica de Thiothrix eikelboomii.

Thiothrix eikelboomii: (ei.kel.boom’i.i. M.L. gen. n. eikelboomii de Eikelboom;

Denominada así en honor de D.H. Eikelboom, pionero en las claves de identificación

morfológicas para bacterias filamentosas del agua residual). Las células forman

filamentos multicelulares. La morfología celular en los filamentos no es constante, es

pleomórfica. Las células discoidales en la base de los filamentos puede medir 1.0 - 3.0

µm de diámetro y 0.4 - 0.7 µm de longitud. Pueden observarse nudos en los

filamentos. Gram–negativo o Gram-variable. Sin presencia de vaina. Forman rosetas en

algunas pero no en todas las cadenas de filamentos. (Howarth et al., 1999)

Se pueden observar inclusiones intracelulares de gránulos sudanofílicos y poli-β-

hidroxibutirato. El crecimiento se produce en un rango de temperatura entre 10-33ºC,

pero no suele presentar crecimiento a 37ºC. El rango de pH está comprendido entre

los 6.5 - 8.5. Reacción oxidasa positiva. No hay ningún requisito de azufre inorgánico

reducido para su crecimiento y es heterótrofa. Los gránulos de azufre se depositan en

invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células crecen en presencia

de algún compuesto de azufre inorgánico reducido. Hidrolizan la gelatina. No

hidrolizan el almidón, caseína y urea. Utilizan la glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa,

manitol, piruvato, succinato, malato, acetato, lactato y propinato como fuente de

carbón. Reducen el nitrato a nitrito.



32

1.3.1.2 Descripción taxonómica de Thiothrix disciformis

Las células son filamentos celulares suavemente curvados. Los filamentos son de más

de 0,5 mm de longitud. Las colonias son como huellas dactilares. La morfología celular

en los filamentos es variable, particularmente por la longitud y en las células presentan

formas de disco u ovales. El tamaño de las células mayores va de 1,2 - 3,0 µm de

diámetro y 0,5 - 3,0 µm de longitud.

La elongación y el hinchamiento celular están siempre presentes. Los septos son

claramente visibles entre células individuales. Gram negativa. Con ausencia de vaina.

No se observan inclusiones de volutina. Los gránulos sudanófilos (PHB) son observados

en el interior celular. El crecimiento ocurre en los rangos de temperatura de 14 – 32ºC

y un rango de pH 7,0 - 7,9. La temperatura optima esta entre 25 - 30ºC. Con reacción

positiva a la oxidasa. También catalasa positivos con presencia de burbujas violetas

generadas cuando las células son expuestas a peróxido de hidrogeno. Cuando las

células están creciendo en presencia de un compuesto inorgánico de azufre reducido,

los glóbulos de azufre son depositados en invaginaciones de la membrana

citoplasmática. El azufre inorgánico reducido no es requerido para el crecimiento. La

glucosa, fructosa, manosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, manitol, succinato, piruvato,

acetato, malato, butirato, hidroxibutirato, glutamato, glicerol y aspartato son

utilizados como fuentes de carbono. La mayoría de las cepas utilizan citrato y alanina.

No crecen con lactato, benzoato, xylosa, erititol, galactosa, lactosa, melobiosa,

rafinosa, arabinosa, ramnosa, etanol, l-propanol, sorbitol, formato, gelatina o almidón.

El crecimiento es inhibido por el 0,5 % (w/V) de cloruro sódico. No reducen el nitrato.

El contenido de DNA en G+C es de 44-45 mol%. (Aruga; 2002)

1.3.1.3 Descripción taxonómica de Thiothrix defluvii

Las células son filamentos multicelulares muy finos, similares a varillas. Las células

presentan distintos diámetros desde la base del filamento, donde miden 2,0 – 4,0 pm

de diámetro y 0,5 - 2,0 µm de longitud, mientras que las demás células del filamento

miden 1,0 - 2,0 µm de diámetro y 5,0-10 µm longitud. Las células presentan formas

irregulares, pueden ser cilíndricas u ovales (forma de barril). Generalmente son Gram-

negativas. No presentan vaina. Pueden forman rosetas y gonidios aunque estas

características no están presentes en todas las cepas. Las células pueden depositar

intracelularmente azufre elemental en presencia de compuestos reducidos de azufre

inorgánico. No presenta gránulos de volutina, pero sí gránulos de poli-β-

hidroxibutirato. El crecimiento óptimo lo presenta en el rango de temperaturas 10 - 30

ºC. Esta bacteria es de crecimiento muy lento y no ha sido posible determinar las

propiedades bioquímicas de este organismo. La cepa tipo es Thiothrix defluvii Ben57 '.

1.3.1.4 Descripción taxonómica de Thiothrix fructosivorans

Las células son varas de 1.2 – 2.5 µm y 1.2 - 2.5 µm de longitud, y forman filamentos

multicelulares. Gram negativa. No presenta flagelo pero presentan un mechón

fímbrico al final del gonidio. Presencia de vaina. Suelen forman rosetas. Las inclusiones



33

volátiles, gránulos sudanofílicos y los gránulos de poli-β–hidroxibutirato se observan

en el interior de las células. El crecimiento ocurre en el rango de temperatura de 4 –

28º C y un pH de 6.5 – 8.5, pero no hay crecimiento a 33ºC. Son positivos a la oxidasa y

a la catalasa, pero a esta última débilmente. No hay ningún requisito de azufre

inorgánico reducido para su crecimiento y es heterótrofa. Se depositan los glóbulos de

azufre dentro de las invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células

crecen en presencia de algún compuesto de azufre inorgánico reducido. Hidroliza la

gelatina pero no el almidón, la caseína, ni la urea. La fructosa, sacarosa, piruvato,

succinato, malato, acetato, lactato, son utilizados, como fuente de carbono. El nitrato

es reducido a nitrito. (Howarth et al., 1999)

1.3.1.5 Descripción taxonómica de Thiothrix nivea.

El análisis filogenético (Kanagawa et al., 2002) mostró claramente las diferencias entre

el grupo T. nivea y Eikelboom tipo 021N, con menos del 92.0 % de similitud en las

secuencias del gen 16S rDNA entre ellos. Todos los Eikelboom Tipo 021N utilizan varios

tipos de azúcares, incluyendo glucosa, manosa y maltosa como fuente de carbono,

mientras que los miembros del grupo T. nivea no utilizaron estos azúcares. Los

filamentos de Eikelboom Tipo 021N son muy largos y pueden alcanzar varios

milímetros de longitud, mientras los miembros de T. nivea son más cortos, alrededor

de 1 mm de longitud (Eikelboom, 1975; Williams y Unz 1985 a; Kanagawa et al., 2000;).

El grupo Eikelboom Tipo 021N forma colonias que son como huellas digitales en su

identificación, característica distinta respecto de los miembros del grupo T. nivea

(Williams y Unz, 1985 a; Kanagawa et al., 2000). El grupo Eikelboom Tipo 021N

presenta metabolismo heterótrofo, sin el requerimiento de azufre reducido, mientras

que T. nivea y T. unzii requiere azufre reducido para su crecimiento.

1.4 Identificación de morfotipos filamentosos

1.4.1 Microscopía convencional

Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras para

determinar las características morfológicas. Eikelboom (1975), estableció una

nomenclatura basada en la observación microscópica de las características

morfológicas, que actualizaron posteriormente otros autores (Jenkins et al., 2004)

Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación de Eikelboom (1975), y

de Jenkins et al., (2004) son: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma

del filamento (curvo, irregular, enrollado, etc.), ubicación respecto al flóculo, existencia

de crecimiento epifítico, vaina, septos, constricciones celulares, dimensiones celulares,

dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada, rectangular, ovalada, etc.),

presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de tinción

(Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios.

Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de

microorganismos en plantas de tratamiento de aguas residuales, sin embargo no dan



34

información fiable sobe la identidad exacta de los filamentos observados, por este

motivo, los filamentos son designados con los términos “tipo” o “morfotipo” en vez de

especie. Hoy en día se sabe que un morfotipo específico puede incluir varias especies y

también puede ocurrir lo contrario, que varios morfotipos puedan representar una

sola especie.

La identificación y cuantificación mediante las técnicas convencionales puede resultar

difícil:

o Los filamentos que se encuentran en el interior de los flóculos son difíciles de

identificar y cuantificar.

o El método convencional es subjetivo y depende del nivel de entrenamiento y

de la experiencia del que realiza la cuantificación e identificación.

o Estructura abierta de los flóculos.

o Elevada población de filamentos.

o Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer

iguales.

Los métodos clásicos complementan a las técnicas moleculares ya que proporcionan

información de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos

y otros microorganismos asociados. La microscopía convencional es considerada una

herramienta indispensable para el control del proceso de depuración pero a nivel

microbiológico realmente solo unas pocas bacterias filamentosas han podido ser

identificadas según sus características morfológicas, por ello actualmente se sabe que

la identificación de las bacterias del fango activo no puede llevarse a cabo utilizando

sólo el método convencional (Nielsen et al., 2009).

1.4.2 Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas

Los métodos moleculares han sido utilizados para la identificación y cuantificación de

microorganismos filamentosos (Blackall, 1994; Wagner et al., 1994; Bradford et al.,

1996; Erhart et al., 1997; Kanagawa et al., 2000;), en particular la técnica de

hibridación in situ con sondas 16S DNA marcadas con fluoróforos (FISH) es considerada

como la más apropiada para una correcta identificación de las bacterias filamentosas

en las muestras de fangos activos (Nielsen et al., 2009).

La mayoría de los morfotipos filamentosos de Eikelboom no han sido nombrados

siguiendo las reglas del Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas y

muchos reciben una identificación alfanumérica. Ello se debe principalmente a que

muchos de estos microorganismos muestran una morfología celular diferente a la que

presentan en los fangos activos. Esta situación está cambiando gracias al empleo de

técnicas moleculares de caracterización y secuenciación del gen 16S rDNA, que

empiezan a clarificar la posición taxonómica de los morfotipos de bacterias

filamentosas.



35

La técnica FISH ha sido una técnica común para la detección e identificación de

microorganismos en diferentes ambientes microbianos, en los que se incluyen

comunidades de bacterias como las presentes en los sistemas biológicos de

depuración con fangos activos (Amann et al., 1995).

Las técnicas de identificación moleculares se basan en nuevas herramientas

moleculares, que hacen posible tanto la determinación de la composición de

comunidades microbianas, como la detección y cuantificación de especies dentro de

las comunidades microbianas. Las técnicas moleculares más utilizadas en estos

estudios de diversidad microbiana a nivel genético, son aquellas basadas en la

amplificación y secuenciación del gen 16S, que codifica para la subunidad ribosómica

bacteriana (y su equivalente en eucariotas, 18S rRNA).

El ARN ribosómico 16S (o el gen que lo codifica) es la macromolécula más ampliamente

utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como

cronómetro molecular fue propuesta por Carl Woese (Universidad de Illinois) a

principios de la década de 1970.

Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al rRNA 16S, hasta el momento

ninguno ha conseguido sustituirle. De hecho, esta macromolécula presenta una serie

de características, en base a las cuales fue considerado como cronómetro molecular

definitivo (Woese, 1987):

1- Se trata de una molécula presente en todas las bacterias actuales. Constituye,

por tanto una diana universal para su identificación.

2- Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy

prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan

probablemente cambios aleatorios.

3- Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar

información acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los

rRNA 16S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los rRNA de la subunidad

pequeña contiene, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no sólo

los organismo más alejados, sino también los más próximos.

4- El tamaño relativamente largo de los rRNA 16S (1.500 nucleótidos) minimiza las

fluctuaciones estadísticas (tamaño adecuado como para proporcionar

información suficiente, con un coste asumible).

5- La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las

comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso.

6- Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los rDNA 16S existen bases de

datos amplias, en continuo crecimiento.

Esta técnica se basa en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra, llamadas

sondas, que son complementarias de las secuencias de RNA que se quieren identificar.

Estas sondas pueden unirse con una secuencia de RNA complementaria (16S rRNA o 23



36

rRNA y se produce un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con moléculas

fluorescente (por ejemplo fluoresceína o rodamina) de forma que los híbridos

formados sean fácilmente detectables con un microscopio de epifluorescencia. La

especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles, taxonómicos como

son dominio, phylum, clase, familia, género y especie, para la identificación de las

bacterias en sus diferentes comunidades naturales (Amann et al.; 1995) la hibridación

directa de la bacteria diana con una sonda complementaria de una región del gen 16S

o 23S rRNA. El elevado número de moléculas de rRNA (103 – 105) es una ventaja en la

aplicación de la técnica de hibridación al aumentar su sensibilidad (Amann, 1994). Una

secuencia de DNA (sonda) puede unirse con una secuencia de RNA complementaria

(16SrRNA o 23SrRNA) y se produce un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con

una molécula fluorescente de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar

fácilmente con un microscopio de epifluorescencia.

Las sondas deben ser lo suficientemente específicas para unirse únicamente a la

bacteria que se quiere identificar. Para asegurar la especificidad, los dos parámetros

determinantes son la temperatura y la concentración de formamida en el tampón de

hibridación (Alonso et al., 2009). La formamida hace que disminuya la temperatura de

unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir,

disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72 º C por cada 1%

de formamida utilizada y permite realizar la hibridación a 46 º C (Alonso et al., 2009).

La sonda que se utiliza en la técnica FISH está formada por una pequeña secuencia de

nucleótidos de cadena sencilla, en cuyo extremo, normalmente 5’, se marca con un

fluoróforo, como puede ser rodamina o fluoresceína.

En las figuras 6 y 7 se muestran esquemas simplificados del proceso de hibridación in

situ con sondas 16SrDNA con fluoróforos.

Figura 6: Preparación del portaobjetos para visualización en microscopio de FISH



37

Figura 7: Técnica FISH con sondas 16SrDNA marcadas con fluoróforos

La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluoróforos in situ (FISH), presenta

una serie de ventajas frente a otras técnicas de detección e identificación. Las cuales se

comentan a continuación:

o No parecen existir sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de

hibridación.

o Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos

detectados.

o No necesita cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos

(Nielsen et al., 2009).

o Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).

o Se mantiene la morfología de la célula (Nielsen et al., 2009).

o La hibridación inespecífica con otros microorganismos presentes en la muestra

no es habitual, por lo que no se dan resultados falsos positivos.

o La especificidad de las sondas permite detectar varias especies o genes en una

misma muestra, utilizando una sonda para cada especie, género o grupo,

marcada con fluoróforos distintos, para la identificación de las bacterias en sus

diferentes comunidades naturales.

o Puede utilizarse junto con la tinción DAPI para determinar si las células

estudiadas están vivas o no, muy útil para la monitorización del estado de la

microbiota durante la adicción de tóxicos para el control del “bulking” y del

“foaming”.

Además de todas las ventajas de la técnica molecular FISH anteriormente citadas, se

aprecian ciertas limitaciones:

o La identificación a través de FISH es solo posible si la sonda requerida está

disponible.

o Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes,

pero aún no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo.

o Podría afectar las características morfológicas de las especies filamentosas.

o Su mayor limitación reside en la sensibilidad de la penetración de la propia

sonda y de la matriz donde estemos hibridando, que depende del contenido de

ribosomas existente en las bacterias filamentosas, si este contenido es bajo no



38

darán una señal fluorescente clara con la sonda; en muchos casos es necesario

un tratamiento previo.

o Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal

fluorescente con otras especies, si sus secuencias de rRNA son muy parecidas.

Tales resultados positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la aplicación

de sondas competidoras.

o La accesibilidad de la sonda rRNA es distinta según la molécula de rRNA de que

se trate y la zona del mismo de la que sea complementaria, lo que hay que

tener en cuenta para el diseño de la sonda.



39


O B J E T I V O S

40

2. Objetivos

El control efectivo de muchos de los problemas en el proceso de depuración se basa en

la identificación de los microrganismos que lo causan y en la eliminación de las

condiciones que favorecen su crecimiento. El crecimiento excesivo de las bacterias

filamentosas puede interferir en el correcto funcionamiento del sistema de fangos

activos produciendo problemas como la deficiente sedimentación del fango o la

formación de espumas.

El principal objetivo de este trabajo es la identificación y cuantificación de

determinados morfotipos filamentosos del género Thiothrix, presentes en los fangos

activos de varias EDAR de la Comunidad Valenciana y, estudiar las posibles relaciones

con parámetros físico-químicos y operacionales.

Para todo ello, en el presente trabajo se plantean los siguientes objetivos específicos:

o Aplicar la técnica FISH a muestras procedentes de 4 plantas depuradoras de

aguas residuales urbanas con sistemas de fangos activos de la Comunidad

Valenciana (Carraixet, Castellón, Denia y Quart Benàger) para detectar la

presencia de los morfotipos filamentosos Thiothrix disciformis, T. eikelboomii,

T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus “Meganema perideroedes”

morfotipo 021N

o Determinar la abundancia de siguientes especies del género Thiothrix: T.

disciformis, T. eikelboomii, T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus

“Meganema perideroedes” morfotipo 021N mediante el criterio subjetivo de

Eikelboom 2000, 2006.

o Comparar la abundancia de los morfotipos Thiothrix disciformis, T. eikelboomii,

T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus “Meganema perideroedes”

morfotipo 021N obtenida con dos técnicas de detección diferentes:

microscopía convencional y la técnica molecular FISH.

o Estudiar las características morfológicas y estructurales de las bacterias

filamentosas detectadas.

o Estudiar las relaciones existentes entre los parámetros operacionales y físico-

químicos de las EDAR y la abundancia de las diferentes especies de Thiothrix

causadores de “bulking”.


O B J E T I V O S

41


M A T E R I A L E S Y M É T O D O S

42

3. Material y Métodos

3.1 Toma de muestras

Se tomaron las muestras del licor mezcla de cuatro EDAR de la Comunidad Valenciana

con una frecuencia quincenal durante un año. En el Anexo I podemos encontrar

imágenes aéreas de las 4 EDAR de estudio. A continuación se muestran los esquemas

de funcionamiento y algunos datos de interés de las depuradoras elegidas para el

presente estudio.

3.1.1 EDAR CARRAIXET

La planta de depuración Cuenca del Carraixet se ubica en la comarca de La Ribera Alta,

en el municipio de Alzira, en la Comunidad Valenciana, es capaz de tratar agua

procedente de 4 municipios consiguiendo unos rendimientos del 98 % para sólidos en

suspensión (SS), 95 % de DBO5 y del 91 % para DQO, según la información publicada

por la EPSAR en el año 2012.

Cuenta con dos líneas aerobias de tratamiento biológico, línea A+B y línea C+D, ambas

con una zona anaerobia (figura 8.). El caudal tratado es de 33.584 m3/d abasteciendo a

una población de 96.230 habitantes equivalentes (he).

Figura 8: Depuradora de Carraixet



43

3.1.2 EDAR CASTELLÓN DE LA PLANA

La EDAR de Castellón de la Plana se encuentra localizada en la comarca de la Plana Alta

en la provincia de Castellón. Para el año 2012 el caudal tratado era de 43.220 m3/d,

prestando servicio a 193.773 habitantes equivalentes (he). Los rendimientos de

eliminación son los siguientes: 95 % para SS, 95% para DBO5 y 91 % para DQO (Figura

9)

3.1.3 EDAR DENIA-ONDARA

La EDAR Denia-Ondara-Pedreguer se ubica en la comarca de La Marina Alta, en la

provincia de Alicante. Da servicio a los municipios de Denia, Ondara y Pedreguer. Trata

un caudal de 17.089 m3/d y abastece a una población de 45.152 según datos del año

2012 publicados por la EPSAR. El tratamiento consta; (figura 10) de una sola línea con

proceso de oxidación total y tiene un rendimiento de eliminación del 97% para sólidos

en suspensión, 95% de DBO5 y 93% de DQO.

Figura 10: Depuradora de Denia

Figura 9: Depuradora de Castellón



44

3.1.4 EDAR QUART-BENÁGER

La depuradora de Quart-Benàger se ubica en la comarca valenciana de L’Horta Oest.

Da servicio a los municipios de Alaquás, Aldaia, Manises, Mislata, Quart de Poblet,

Valencia y Xirivella. El tratamiento biológico tiene lugar en cuatro reactores paralelos

anóxico-aerobio de geometría rectangular (figura 11). Según datos de 2012, trata un

caudal de 35.903 m3/d, abastece a una población de 166.942 y tiene unos

rendimientos de eliminación del 98% para SS, 98% para DBO5 y 95% para DQO.

Figura 11: Depuradora de Quart

3.2 Muestreo

El muestreo se realizó siempre en el mismo punto, generalmente a la salida del reactor

biológico. Se tomaron 1,5 l de licor mezcla con un recipiente de plástico, de estas

muestras se tomaron unas alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24

horas.

Los muestreos se realizaron cada quince días durante el año 2009. El muestreo

comenzó en Diciembre de 2008 y finalizó en Diciembre de 2009. Las muestras fueron

simples realizadas de forma puntual.

Para el transporte y conservación de las muestras fue necesario mantener las

condiciones aerobias de la muestra, lo cual se logró con la cámara de aire que queda

sobre el licor mezcla en el recipiente de recogida.

Las EDAR estudiadas tratan aguas de origen doméstico, aunque la planta de

tratamiento de Quart-Benàger recibe además aguas industriales.

El número de líneas de tratamiento independientes se distribuye de la siguiente

manera Quart-Benàger y Denia con una línea cada una, total de muestras a analizar 24.

Las depuradoras de Carraixet y Castellón contaban con dos líneas independientes cada

una; por lo tanto se tomaron 46 muestras en cada una de las EDAR con dos líneas. El



45

cómputo total de muestras fue de 140 muestras. En el Anexo II encontramos la

relación de fechas de muestreo por depuradora estudiada.

3.3 Parámetros físico-químicos y variables operacionales

En las tablas expuestas en el anexo III se encuentran los parámetros físico-químicos

analizados, su nomenclatura y unidades en los que se han utilizado y en el anexo IV las

tablas con todos los parámetros donde aparecen los rangos, media y desviación

estándar en cada depuradora. Estos parámetros se determinaron siguiendo los

procedimientos normalizados (APHA, 2005) en las muestras de las distintas EDAR. El

Índice Volumétrico de Fango (IVF) se calculó según el procedimiento descrito por

Jenkins et al., 2004.

En el presente trabajo los valores de oxígeno disuelto (OD) en el reactor fueron

distribuidos en tres intervalos: < 0,8 oxígeno disuelto bajo (ODb), 0,8 – 2 oxígeno

disuelto medio (ODm) y > 2 ppm oxígeno disuelto alto (ODa). Anexo IV, tabla 33.

3.4 Método clásico de identificación de bacterias filamentosas

El método clásico de identificación de microorganismos filamentosos se basa en el

examen microscópico, principalmente a 1000X y con óptica de contraste de fases, de

una serie de características morfológicas y estructurales de los filamentos. Los

caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación son los anteriormente

citados y descritos por Eikelboom (1975), y Jenkins et al., (2004).

La cuantificación con el método clásico sólo se puede hacer de modo indicativo, ya que

los microorganismos filamentos que se encuentran en el interior del flóculo pueden

pasar inadvertidos, y además el método tradicional es subjetivo y depende del nivel de

entrenamiento y experiencia del personal que realiza la identificación y/o

cuantificación.

3.5 Técnica FISH

3.5.1 Fijación y permeabilización de las muestras

Para llevar a cabo la técnica FISH fue necesario fijar las bacterias. Este primer paso es

necesario para que la estructura celular se mantenga rígida y estática y se conserve su

morfología favoreciendo la penetración de las sondas.

Para la fijación de las muestras se utilizó un reactivo diferente según la pared celular

de la bacteria (Gram + o Gram -). En el caso de las bacterias de este estudio, Gram - la

permeabilización se realizó con paraformaldehido. Una vez fijadas las muestras, se

conservaron a -20ºC.

Los pasos y reactivos para la fijación y permeabilización se describen en detalle a

continuación para bacterias Gram -.

o Lavar 1 ml de flóculo con 500 µl de PBS 1X (7000 r.p.m durante 3 minutos)



46

o Añadir 3 vol de PFA (750 µl) a 1 vol (250 µl) de muestra y mantener a 4ºC

durante 3 h.

o Concentrar las células por centrifugación (7000 r.p.m durante 3 minutos) y

eliminar fijador

o Lavar las células con PBS 1X (500 µl)

o Resuspender las células con PBS 1X (500 µl) y etanol absoluto (500 µl) y

mantener a -20ºC

En la figura 12 se describen los pasos a realizar.



47

Guardar a –20ºC

Resuspender 500µl

PBS 1X + 500µl EtOH

abs

Gram +

1 ml muestra

Lavar 1000 µl PBS 1X

Centrifugar 3 min 7000

rpm


rpm

Gram -


rpm

1 ml muestra



rpm

Resuspender 250µl PBS

1X + 750µl PFA durante

3h a 4ºC


rpm

Resuspender 500µl PBS 1X

Resuspender 500µl

PBS 1X + 500µl

EtOH abs


rpm

Resuspender

500µl PBS 1X +

500µl EtOH abs


rpm

Mycolata


rpm

Resuspender 500µl PBS 1X

1 ml muestra



rpm


rpm

Resuspender 250µl PBS

1X + 750µl PFA durante

1 min

Fijación

Figura 12: Protocolo de Fijación



48

3.5.2 Hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas con fluoróforos (FISH)

Para la hibridación de las muestras describiremos detalladamente todos los pasos a

seguir. En el Anexo V, se describe la preparación de los reactivos para la técnica de

hibridación.

3.5.2.1 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón

Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y desengrasar.

Previamente a su empleo se les debe dar un baño en una solución de gelatina y de

sulfato potásico y cromo para favorecer la adhesión de la muestra. A continuación se

detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos.

o Lavar con solución de limpieza

o Enjuagar con agua destilada

o Secar al aire (dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental

cubriendo los portas con papel aluminio)

o Cubrir con gelatina por inmersión en la solución 0,1% con cromato sulfato

potásico 0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC)

o Secar al aire

3.5.2.2 Aplicación de las muestras a los portaobjetos

Los pasos para la aplicación de las muestras se describen a continuación:

o Poner un volumen entre 3 y 5 µl de muestra fijada en el portaobjetos FISH. En

este caso se ha colocado un volumen de 5 µl en cada pocillo del portaobjetos

o Secar al aire

o Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión



o Secar al aire

3.5.2.3 Sondas utilizadas

Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones, así como su secuencia de

nucleótidos del extremo 5’ al 3’ y el porcentaje de formamida óptimo a utilizar se

muestran en la tabla 6.

Las sondas marcadas con el fluoróforo TAMRA (rodamina, cuya longitud de onda de

absorción es de 565 nm y de emisión de 580 nm, rojo) fueron las siguientes: G123T y

G2M, Meg983 y Meg1028.

Las sondas marcadas con el fluoróforo FAM (Fluoresceína) cuya longitud de onda de

absorción es de 494 nm y de emisión de 518 nm (verde):G1B, G3M, TNI y TFR.



49

Tabla 6: Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas

Especificidad Sonda Secuencia (5’ – 3’) %FA Referencia

Thiothrix G123T CCTTCCGATCTCTATGCA 40 Kanagawa et al., (2000)

Comp. Thiothrix G123TC CCTTCCGATCTTCTACGCA 40 Kanagawa et al., (2000)

T. Disciformis G1B TGTGTTCGAGTTCCTTGC 30 Kanagawa et al., (2000)

T. eikelboomii G2M GCACCACCGACCCCTTAG 35 Kanagawa et al., (2000)

T. defluvii G3M CTCAGGGATTCCTGCCAT 30 Kanagawa et al., (2000)

T. nívea TNI CTCCTCTCCCACATTCTA 45 Wagner et al., (1994)

T. fructosivorans TFR CTCCTCTCCCACACTCTA 35 Kim et al., (1994)

Comp. TNI y TFR TEI TCCCTCTCCCACATTCTA 45/35 Kim et al., (2002)

“Meganema perideroedes”

Meg 983 CGGGATGTCAAAAGGTGG 35 Kragelund et al., (2005)

“M. perideroedes” Meg 1028

CTGTCACCGAGTCCCTTGC 35 Kragelund et al., (2005)

3.5.2.4 Hibridación “in situ”

Los pasos y reactivos del proceso de hibridación se describen en detalle a

continuación:

o En primer lugar se prepara la solución de hibridación con formamida en un

microtubo de 2 ml. La cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo

de formamida que a su vez dependerá de la sonda utilizada (tabla 7)

Tabla 7: Solución de hibridación según porcentaje de formamida

Reactivo % de Formamida

10 20 25 30 35 40 45

NaCl 5M 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl

HCL-Tris 1M 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl

Formamida 200 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl

H2O MiliQ 1398 µl 1198 µl 1098 µl 988 µl 898 µl 798 µl 698 µl

SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl

Volumen Final 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl

o Poner 9 µl de la solución de hibridación + 1 µl de sonda en cada pocillo y

repartir homogéneamente por todo el campo. En el caso de que junto con la

sonda se tenga que añadir sondas competidoras se deberá hacer una

combinación de todos ellos con la sonda hasta alcanzar la cantidad total de 1 µl

de sonda. A partir de la puesta en contacto con la sonda hay que evitar el

contacto con la luz para evitar la pérdida de fluorescencia del fluoróforo

o Poner un trozo de papel celulosa dentro de un tubo Falcón de 50 ml y verter

sobre el papel la solución de hibridación restante sin sonda, este paso es

necesario para crear una atmósfera húmeda en el tubo Falcón y favorecer la

hibridación.

o Introducir el portaobjetos en posición horizontal dentro del tubo Falcón de 50

ml

o Incubar a 46ºC durante al menos 1 hora y 30 minutos

o Para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado y la formamida de los

portaobjetos se prepara 50 ml de solución de lavado mezclando los reactivos



50

presentes en la siguiente tabla dependiendo del porcentaje de formamida que

ha sido utilizado en la solución de hibridación (Tabla 8)

Tabla 8: Solución de lavado según porcentaje de formamida

Reactivo % de Formamida

10 20 25 30 35 40 45

NaCl 5M 4500 µl 2150 µl 1490 µl 1020 µl 700 µl 460 µl 300 µl

EDTA 0,5 M - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl

HCL-TRIS 1M 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl

H2O MiliQ 44,45 ml 46,3 ml 47,94 ml 47,43 ml 47,75 ml 47,06 ml 48,15 ml

SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl

Volumen Final 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml l

o Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro

del tubo con la solución de lavado, los tubos se forran con papel de aluminio

para protegerlos de la luz. Incubar en un baño a 48ºC durante 15 – 20 minutos.

o Lavar con agua Mili-Q

o Secar al aire en la oscuridad

o Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC

3.5.2.5 Observación al microscopio

Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas se procede a la

observación con el microscopio y a la toma de imágenes.

A la hora de observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia se precisa

utilizar un líquido de montaje (Vectashield) para evitar la pérdida de fluorescencia. Se

añaden unas gotas de este líquido en la zona central del portaobjetos y se coloca

encima un cubreobjetos, con ayuda de una punta se ejerce una pequeña presión sobre

éste para que el líquido de montaje se extienda de forma uniforme por toda la

muestra, a continuación se observa el pocillo a 600X.

El microscopio utilizado para la observación de las muestra ha sido un Olimpus BX 50.

Las fotografías en color se realizaron con una cámara digital Olimpus DP 10 acoplada al

microscopio con los filtros: U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-MWIG (Rodamina,

TAMRA)

Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los

pocillos del portaobjetos con el microscopio de epifluorescencia una vez realizado el

proceso de hibridación in situ.

Se realizó la valoración de la abundancia de las bacterias filamentosas utilizando la

escala subjetiva de Eikelboom (2000, 2006).



51

La escala de valoración de los organismos filamentos se muestra en la tabla 9.

Tabla 9: Escala de valoración de organismos filamentosos

Índice filamento

Abundancia Descripción

0 “Ninguno” Ningún filamento presente

1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo

2 “Algunos” Filamentos en aproximadamente la mitad de los flóculos

3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculos)

4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media(5-20/flóculos)

5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/flóculos)

En la figura 13 se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de las bacterias

filamentosas.

Figura 13: Recuento de Índice Filamentoso



52

3.6 Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de todas estas variables medidas se utilizó el paquete

informático IBM Statistics SPSS versión 19.

En el análisis primeramente se realizó un resumen estadístico donde se tabularon los

valores mínimos, máximos, la media y la desviación estándar de cada una de las

variables operacionales, variables físico-químicas del afluente, del efluente y del licor

mezcla presentes en los fangos (Anexo IV).

Se integraron todo los datos de las cuatro depuradoras para obtener una matriz

general con un elevado número de muestras (140) y realizar primero un análisis

preliminar bivariante. Este análisis bivariante sirve para establecer la asociación

existente entre la abundancia de los distintos morfotipos filamentosos con las

variables del proceso de depuración, además de servir como análisis exploratorio junto

con el análisis de componentes principales.

Este primer análisis consistió en el cálculo del coeficiente de Spearman siendo un

análisis de medida no paramétrica sin hacer ninguna suposición de la ordenación de las

variables.

En el análisis estadístico se emplearon 140 variables medidas; habiendo sido

transformadas previamente para conseguir una distribución normal, (Esteban et al.,

1991) con la consiguiente transformación logarítmica, “LN (variable+1)”, dando lugar a

una matriz semejante a la que se muestra en la figura 14 de forma esquemática el

tratamiento estadístico de los datos.

Figura 14: Ejemplo de matriz

Físico-químicas Operacionales

Mu

estr

as 1

40

Afluente Efluente



53

Seguidamente se empleó un análisis multivariante mediante la realización de un

Análisis de Componentes Principales (ACP) para permitir la síntesis de la información

contenida en una base de datos de gran dimensión en un nuevo subespacio de menor

dimensión (Aguado, 2004). Esta técnica debe usarse como una técnica exploratoria y

debe ayudar al investigador a que adquiera cierta percepción respecto a un conjunto

de datos. En la mayoría de los libros sobre métodos multivariados sugieren que los

objetivos principales de un ACP son:

- Reducir la dimensionalidad del conjunto de datos

- Identificar nuevas variables significativas subyacentes. (estas nuevas variables

son útiles por el cribado de datos, la verificación de la hipótesis y la verificación

de agrupaciones.)

A continuación se detallan cada uno de los métodos estadísticos realizados.

3.6.1 Coeficiente de correlación de Spearman.

El coeficiente de correlación de Spearman o por rangos, también llamado rs, es una

medida no paramétrica de asociación que requiere que ambas variables sean

aleatorias continuas, de forma que los objetos o individuos puedan colocarse en series

ordenadas (Siegel, 1983).

El Coeficiente de Spearman utiliza los números de orden (rangos) de cada grupo de

variables y compara dichos rangos (Conover, 1998). Si la asociación lineal entre ambas

variables fuera perfecta, esperaríamos que el rango de la variable X fuera exactamente

igual al rango de la variable Y, por lo tanto el coeficiente se calcula en base a las

diferencias registradas en los rangos entre ambas variables, esperando que estas

diferencias fueran cero. Conforme mayores son las diferencias observadas en las

ordenaciones de ambas variables, más se alejaría de la relación de ser perfecta. Para

evitar que las diferencias positivas anularan las diferencias negativas y comportaran la

toma de decisiones equivocadas, el estadístico se calcula en función de la suma de las

diferencias elevadas al cuadrado.

Este coeficiente es recomendable utilizarlo cuando los datos presentan valores

externos que afectan al coeficiente de Pearson o ante distribuciones no normales.

La fórmula para calcular el Coeficiente de Spearman es la siguiente:

∑

Dónde:

di: es la diferencia entre los rangos de X e Y,

N: es el número de valores de la muestra.



54

Los valores de los rangos se colocan según el orden numérico de los datos de la

variable estudiada.

Su interpretación es semejante al coeficiente de correlación de Pearson. Para índices

cercanos a +1 la asociación es positiva, para valores cercanos a -1 la asociación es

negativa y 0 significa que no hay correlación entre las variables. (Siegel, 1983).

El coeficiente evalúa si existe una relación lineal, creciente o decreciente, entre ambas

variables. El coeficiente de correlación de Spearman únicamente puede adoptar

valores comprendidos entre -1 y 1, identificando el valor de -1 una relación

decreciente perfecta; lo que indica una asociación negativa, mientras que por el

contrario, el valor 1 identificaría una relación lineal creciente perfecta; o asociación

positiva. Si este valor es 0 significará que no hay correlación entre las variables. (Siegel,

1983).

Intuitivamente, el coeficiente de correlación debe examinar la relación lineal de dos

variables por lo que imaginemos que si la relación es muy evidente, los puntos se

separarán muy poco de la línea de puntos se ensanchará tanto que será imposible

extraer conclusiones sobre algún tipo de relación.

Aunque no existen valores estandarizados, a título indicativo se presenta la

interpretación de sus valores por intervalos en la tabla 11.

Tabla 10: Interpretación de Coeficiente de Spearman

Coeficiente Interpretación

0 Relación Nula

0 - 0,2 Relación muy baja

0,2 – 0,4 Relación Baja

0,4 – 0,6 Relación Moderada

0,6 – 0,7 Relación alta

0,8 – 1 Relación muy alta

1 Relación Perfecta

3.6.2 Análisis de Componentes Principales (ACP)

El análisis de componentes principales (ACP) se basa en un procedimiento matemático

que transforma un conjunto de variables correlacionadas de respuesta lineal en un

conjunto menor de variables no correlacionadas; a las cuales llamamos componentes

principales. Al observar cuidadosamente este nuevo conjunto de variables no

correlacionadas, se pueden obtener algunas conclusiones relevantes. Es probable que

estas primeras conclusiones determinen el uso de otros análisis de ordenación

ambiental (p.e. análisis de redundancia).

El ACP es quizá el más útil para cribar datos multivariados. Para casi todas las

situaciones de análisis de datos, se puede recomendar el APC como un primer paso. Se

debe realizar sobre un conjunto de datos, antes de realizar cualquier clase de análisis

multivariados. Los análisis de seguimiento sobre las componentes principales son útiles



55

para comprobar las hipótesis que el investigador podría establecer acerca de un

conjunto de datos multivariados. Si se presentan algunas otras anormalidades en un

conjunto de datos multivariados, el ACP puede ayudar a revelarlos.

Para la selección de este análisis hemos tenido en cuenta el tamaño muestral; que

generalmente para un análisis de este tipo la muestra no debe ser inferior a 50

observaciones, y preferiblemente el tamaño muestral debería ser 100 o más grande.

Como regla general, el mínimo es tener por lo menos un número de observaciones

cinco veces mayor que el número de variables a ser analizadas

Además existen algunos supuestos que se deben tener en cuenta en la aplicación del

análisis factorial. Estos supuestos son:

- Multicolinealidad, dado que el objetivo es identificar series de variables

interrelacionadas.

- El investigador debe asegurar de que existen suficientes correlaciones para

justificar las aplicaciones del análisis factorial. El tratamiento por SPSS 19

proporciona la matriz de correlación anti-imagen, que es simplemente el valor

negativo de la correlación parcial. A anti-imágenes mayores, son indicativas de

una matriz de datos que no es quizá adecuada para el análisis factorial.

- Examinando la matriz de correlación entera. El contrates de esfericidad de

Bartlett, que es una prueba estadística para la presencia de correlaciones

entres las variables, es una de estas medidas. Proporciona la probabilidad

estadística de que la matriz de correlaciones de las variables sea una matriz de

identidad. El investigador debe tener en cuenta, sin embargo, que el

incremento del tamaño muestral da lugar a que la prueba de contrataste de

Bartlett sea más sensibles a la detección de correlaciones entres las variables.

Otra medida para cuantificar el grado de intercorrelaciones entra las variables y

la conveniencia del análisis factorial es la medida de suficiencia de muestreo

(MSA). Este índice se extiende de 0 a 1, llegando a 1 cuando cada variable es

perfectamente predicha sin error por otras. A menores valores más mediocre

será este análisis.

El ACP es una técnica de reducción de la información disponible sobre un grupo de

muestras, de los cuales se han tomado diversas variables sobre diversas

características. Por ejemplo si se tienen datos de N muestras referentes a p

características diferentes de éstos, es decir, X= (X1,….., Xp), el objetivo del ACP consiste

en reducir las dimensiones de la variable x creando una nueva variable U= (U1,….Ur),

donde r<p, cuyas componentes Ui sean combinación lineal de las Xi y que también

expliquen una proporción suficientemente grande de la dispersión total presente en

los datos originales (Pérez, 1996).

El proceso de cálculo del ACP es el siguiente:



56

El primer componente se construye buscando un vector b= (b1,…bp) que, entre todos

los que tengan modulo unitario, atribuya a U1 la mayor varianza posible, de forma tal

que este nuevo componente constituya la mejor explicación unidimensional de la

varianza total en los datos (Pérez, 1996).

Procediendo con las variables sucesivas se construyen las componentes principales.

Este método logra sintetizar al máximo la información con el criterio de pérdida

mínima de capacidad explicativa con respecto a la covarianza de las series (Pérez,

1996).

Cuando se realiza un ACP sobre una matriz de datos X, se está realizando la siguiente

modelación (Aguado, 2004):

∑

Donde, pa son los vectores de pesos que definen las direcciones principales de máxima

varianza en el espacio X. Estas direcciones determinan un subespacio de menor

dimensión (A) que el espacio original.

La dimensión (A) se escoge de manera que no exista información importante de X en E

que es la matriz de residuos, y que, por tanto, representa el ruido es la estimación de

X a partir de modelo con A componentes.

En la figura 15 se muestran de forma gráfica las matrices del modelo APC.

Para una componente dada, los pesos son definidos como la dirección sobre la que se

están proyectando las observaciones y están poniendo de manifiesto la contribución

de las variables originales en la formación de dicha componente (Aguado, 2004).

X T E

𝑷𝑻

Figura 15: Matrices análisis de Componentes Principales



57

3.6.3 Tratamiento por ordenador

Se introdujo una matriz con todos los parámetros a estudiar y se realizó un análisis

estadístico donde se incluían las correlaciones de Spearman. Este programa

estadístico, genera como salida de este estudio una hoja de cálculo con los valores de

las correlaciones y los p-valores (p <0,05; p <0,01).

Para realizar el ACP, se introdujo en el programa estadístico la matriz de datos y se

especificaron las variables con las que se deseaba hacer el análisis.

El programa genera como salida tablas de saturaciones de componentes, puntuaciones

de objetos y varianza total explicada, así como también matrices de coeficientes para

el cálculo de las puntuaciones en las componentes y de componentes.

Con estas tablas el programa genera los siguientes gráficos:

- Gráfico de Sedimentación: Se utiliza para determinar cuántos factores deben

retenerse, tomándose en cuenta la cantidad de varianza (en porcentaje)

explicada por dichos factores. Típicamente el gráfico muestra una fuerte

ruptura entre la pronunciada pendiente de los factores más significativos y el

descenso gradual de los restantes, denominados sedimentos.

- Gráfico de Componentes: En este se utiliza la rotación varimax para mostrar las

cargas factoriales de las distintas variables que forman cada componente.

- Gráfico de Saturaciones en componentes: representa las relaciones entre

variables, es decir, que variables son responsables de los patrones que

presentan las muestras. En este gráfico cuando dos variables se encuentran

muy cercanas entre si presentan correlaciones positivas entre sí, por el

contrario si se encuentran linealmente opuestas presentan correlaciones

negativas. En este gráfico se eliminaran aquellas cargas factoriales que no sean

significativas en función del número de observaciones.

- Gráfico de puntos de objetos etiquetados mediante número de caso: se

refiere a la distribución de las muestras en las zonas del diagrama de la

Dimensión 1- Dimensión 2 (o Componente 1- Componente 2) mostrándose que

los puntos que se encuentran próximos presentan valores parecidos de las

variables que determinan dichos componentes.

- Diagrama de dispersión biespacial: el cual contiene la información de los dos

diagramas anteriores y viene siendo una superposición del gráfico de

saturaciones en componentes y de los puntos de objetos, mostrando de forma

clara los grupos de muestras que se encuentran relacionadas con ciertas

variables debido a su cercanía en las zonas del gráfico.

En el ACP realizado se utilizó la misma nomenclatura específica para cada una de las

variables físico-químicas y operacionales, mostradas en los anexos III y IV.


R E S U L T A D O S

58


R E S U L T A D O S

59

4. Resultados

Los resultados obtenidos durante la realización del proyecto corresponden, tal como

se explicó en apartados anteriores, a la realización de las hibridaciones mediante la

técnica FISH de 24 muestras tomadas quincenalmente en el fango activo de las

depuradoras de Quart Benàger, Denia, Carraixet y Castellón; durante un periodo de un

año. Las hibridaciones se realizaron con el fin de determinar y cuantificar la cantidad

de bacterias filamentosas del género Thiothrix presentes en el licor mezcla del reactor

biológico.

Seguidamente se realizó un análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias

hibridadas que dieron resultado positivo en las hibridaciones. Por último se realizó un

análisis estadístico bivariante (Spearman) y un análisis de componentes principales

(ACP), con los parámetros físico–químicos y operacionales de las especies identificadas

de Thiothrix presentes en el fango activo.

Previo al análisis de los resultados; se muestra un análisis de las muestras hibridadas

para detallar las características del género Thiothrix y los distintos morfotipos

estudiados.

4.1 Características morfológicas y estructurales de las bacterias

filamentosas del género Thiothrix

En las primeras imágenes se observó el género Thiothrix, marcado con la sonda G123T

en ellas se apreciaron rasgos diferenciales entre las distintas especies dentro del

género, como diversos grosores en los filamentos hibridados, comprobando que se

trataban de especies diferentes (figuras 16 A y B)

B A

Figura 16 A, B: A) Vista convencional, B) Vista con FISH sonda G123T, 1000X


R E S U L T A D O S

60

Para la sonda G2M que hibrida con la especie Thiothrix eikelboomii pudimos observar

que se encontró filamentos tanto intraflocularmente como interfloculares,

generalmente eran más fáciles de ver, y de mayor grosor que las otras especies

estudiadas, en ocasiones, se pudo observar los septos siendo estos muy visibles y de

tamaños regulares con formas rectangulares, como señalan las flechas de la figuras 17

A y B.

Se encontró una muestra en la que se aprecian filamentos totalmente paralelos unos

de otros como se observa en la figura 17. En esta imagen también se aprecia en

contraste de fases (A), como aparecen más filamentos que luego no hibridarán con la

sonda G2M, en la imagen de fluorescencia (B)

En las muestras correspondientes a la sonda TFR pudimos observar filamentos

generalmente intrafloculares, difíciles de observar (figura 18 A), con grosores muy

finos, encontramos algunas hibridaciones de pequeñas células aisladas de la bacteria T.

fructosivorans sin formar filamentos (flecha 18 B). Normalmente los filamentos eran

difíciles de observar.

BA

BA

C

Figura 17 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda G2M, 1000X

Figura 18 A, B y C: A) Vista convencional, B) Vista FISH y C) Superposición capas vistas a y b sonda TFR, 1000X


R E S U L T A D O S

61

Al igual que en la sonda TFR, en la sonda TNI hubo dificultades para el recuento de

filamentos en contraste de fase; como se aprecia en la siguiente imagen (figura 19 A y

B), aparecieron filamentos intrafloculares difíciles de observar (imagen A), y con poca

fluorescencia lo que hizo imposible discernir entre el filamento hibridado y la

fluorescencia de fondo (imagen B).

Figura 19 A, B: A) Vista Convencional, B) Vista FISH sonda TFR, 1000X

Como aparece en la figura 20 B, en la de hibridación se observó los septos que dividen

las células filamentosas, mucho más apreciables que en la técnica convencional, (figura

20 A).

Figura 20 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda TNI, 1000X

B A

B A


R E S U L T A D O S

62

4.2 Cuantificación e identificación de bacterias filamentosas del

género Thiothrix

4.2.1 Microscopia convencional

Los resultados de abundancias según el método convencional fueron extraídos del

proyecto “Estudio Integrado del Proceso de Fangos Activos” financiado por la EPSAR.

Las bacterias filamentosas se identificaron mediante una serie de características

morfológicas como puede apreciarse en las figuras 21 A y 22 A. Se ha conseguido

diferenciar especies intrafloculares mediante la técnica FISH que no son reconocibles

mediante la técnica convencional; como se muestran en figura 21 B y 22 B.

A B

B A

Figura 21 A y B: A) Vista Convencional G2M, y B) FISH sonda G2M (Quart), 1000X

Figura 22 A y B: A) Vista Convencional, B) FISH sonda TFR (Denia), 1000X


R E S U L T A D O S

63

4.2.2 Técnica molecular FISH

La sonda G2M se utilizó para la detección e identificación de filamentos pertenecientes

a la especie Thiothrix eikelboomii .En la figura 23 muestra un ejemplo de filamento

hibridado con la sonda específica en la depuradora de Quart. En primer lugar se realizó

la observación bajo el microscopio de epifluorescencia y se tomó la imagen,

seguidamente se fotografió el mismo campo en contraste de fases.

Para la detección del morfotipo Thiothrix nivea se utilizó la sonda TNI. En la figura 24 se

muestra un ejemplo de filamento hibridado con dicha sonda bajo contraste de fases y

epifluorescencia.

B A

A B

Figura 23 A y B: A) Vista Convencional Thiothrix Eikelboomii, B) FISH sonda G2M (Quart)

Figura 24 A y B: A) Vista Convencional y B) FISH sonda TNI (Castellón), 1000X


R E S U L T A D O S

64

En la imagen que muestra la sonda TFR (figura 25), que se utilizó para la detección del

morfotipo Thiothrix fructosivorans, se muestra un ejemplo de lo difícil que es

encontrar estas bacterias; pues normalmente aparecen intraflocularmente. Además en

algunas se apreció, que existen bacterias de este morfotipo pero no formando

filamentos sino como bacterias aisladas. Se muestran fotos en contraste de fases y

bajo epifluorescencia (figura 25).

Figura 25 A, B y C: A) Vista Convencional, B) FISH y C) superposición de imagen FISH y Convencional Sonda TFR. (Denia)

No se obtuvo ninguna señal positiva con las sondas G1B y G3M en ninguna de las EDAR

estudiadas.

Como conclusión en este apartado podemos decir que la presencia de las bacterias

filamentosas no es abundante en ninguna de las depuradoras estudiadas, aunque sí

que se encuentran en mayor proporción en las depuradoras de Quart Benàger y Denia

que en la de Castellón o en la de Carraixet, además se presenta los rangos, media y

desviación estándar de los índices de filamentos de cada uno de los morfotipos

filamentosos, (tablas 11,12,13, 14, 15, 16 y 17)

Tabla 11: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet L1

Parámetro Sondas Rangos Media ± desviación

Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00-1.00 0.44 ± 0.51

Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00-2.50 0.24 ± 0.6

Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-1.00 0.13 ± 0.34

Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-1.00 0.17 ± 0.39

Tabla 12: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet L2

Parámetro Sondas Rangos Media ± - desviación

Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00 -1.50 0.63 ± 0.53




A B C


R E S U L T A D O S

65

Tabla 13: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón L1



Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00 0



Tabla 14: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón L2



Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00 0



Tabla 15: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Denia


Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00-3.00 2 ± 0.84

Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00-1.00 0 ± 0.39

Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-2.00 2 ± 0.80

Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-4.00 2 ± 0.83

Tabla 16: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Quart

Parámetro Sonda Rangos Media ± desviación





4.3 Comparación microscopía convencional-FISH

Como se ha descrito en el apartado de objetivos del presente trabajo, se comparó el

método clásico y la técnica molecular FISH en la estimación de la abundancia de los

morfotipos en las cuatro depuradoras estudiadas.

Se pudo observar que no aparecieron datos de la sonda G1B, ni la de la G3M, como

ocurrirá en el resto de los resultados.

Tabla 17: Variables mínimos, máximos, media y desviación estándar de todas las sondas

Parámetro Nomenclatura Media ± Desviación Rangos

Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.15 ± 0.35 0.00-1.50

Sonda T. nivea TNI TNI 0.29 ± 0.45 0.00-1.50

Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.36 ± 0.45 0.00-1.50

Sonda Thiothrix G123T G123T 0.60 ± 0.50 0.00-1.79


R E S U L T A D O S

66

Se apreciaron diferencias significativas al comparar los resultados en la cuantificación e

identificación de estas bacterias filamentosas mediante las dos técnicas, convencional

y FISH. Generalmente la técnica convencional subestimó la presencia de Thiothrix

nivea (sonda TNI) en todas las depuradoras estudiadas. Estos datos se pueden

observar en las figuras de distribución de datos por depuradoras comparando la

técnica convencional con la de hibridación. Las gráficas de la 26 a la 31 muestran las

diferencias encontradas con el género Thiothrix. Desde la gráfica 32 hasta la 37 se

muestran las diferencias encontradas en las distintas especies del género Thiothrix.

Comenzaremos analizando la figura de la EDAR Quart (figura 26), pudímos ver como

generalmente los muestreos del género Thiothrix en contraste de fases suelen tener

índices muy dispares a los reales. Por ejemplo, si nos centramos en la muestra número

8 podemos ver que la columna de color azul que es el recuento realizado en contraste

de fases del género Thiothrix da una estimación del índice filamentoso en torno a 5, si

además sumamos la columna de color rojo que son filamentosas de la especie

Thiothrix eikelboomii tipo 021N, deberían ser el resultado que aparecen en la columna

de color verde (sonda G123T genérica para todos los tipos de Thiothrix), sin embargo el

recuento de filamentosas hibridadas; indica un índice de alrededor de 3, mucho más

bajo que lo que el determinado con microscopía de contraste de fases.

Figura 26: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart.

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

IF

Muestreo

Quart Thiothrixconvencional

Sonda G123TFISH

Tipo 021NConvencional


R E S U L T A D O S

67

En la figura correspondiente a la EDAR Denia (figura 27), obtuvimos resultados muy

parecidos a los de Quart, los índices filamentosos fueron mucho más bajos que en la

anterior depuradora, pero se llegó a la misma conclusión. Como pudimos apreciar en

cualquiera de las muestras, generalmente el sumatorio de las columnas azul y roja

debieron ser de igual valor que las columnas de color verde, sin embargo esto no llegó

a pasar en ninguna muestra.

Figura 27: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia

En la Línea de Castellón 1 (figura 28), los IF no sobrepasaron el valor de 2. Esto indico

que la abundancia de filamentosas en esta planta es mucho menor que en las EDAR de

Quart y Denia. Además volvimos a observar el mismo patrón, el recuento de bacterias

filamentosas del género Thiothrix, de la columna azul más la roja no alcanzo el valor de

la columna verde. Incluso en esta figura pudimos observar como encontramos

muestreos en los que solo aparece una columna, ya sea verde o roja. Esto pudo ser

debido al índice tan bajo de bacterias filamentosas que se encuentra en la muestra.

.

Figura 28: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Denia Thiothrix spConvencional

Sonda G123TFISH

Thiohtrix 021Nconvencional

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Castellón L1 Thiothrix sp.Convencional

Sonda G123TFISH

Thiothrix 021NConvencional


R E S U L T A D O S

68

La línea de Castellón 2 (figura 29) es muy parecida a la anterior. Obtuvimos índices de

filamentos muy bajos, la única muestra con un valor de IF superior es la número 21. En

ella pudimos ver como el número de filamentosas obtenidas con el recuento

convencional en contraste de fases sigue siendo menor que el obtenido con la técnica

de hibridación in situ. También observamos que en la muestra 1, se obtiene un

resultado algo anormal. Puede ocurrir que al realizar el recuento en técnica

convencional se confundieran ciertas especies y contabilizáramos filamentosas que no

se corresponderían con las de tipo 021N, llegando a obtener mayores resultados en

este recuento que con la técnica FISH.

Figura 29: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón; Línea 2.

Por último los resultados del IF de la EDAR de Carraixet, (figuras 30 y 31) se obtuvieron

mayores aproximaciones de los recuentos con la técnica molecular que con la técnica

convencional de microscopia. Se observó claramente, tanto en la línea 1 como en la

línea 2, que los recuentos realizados con técnicas moleculares son más precisos,

llegando a igualar los resultados de las técnicas convencionales e incluso a superarlas

con total precisión. Se contabilizaron IF en muestreos donde con las técnicas

convencionales no se observó ni cuantifico nada, por ejemplo en las muestras 2, 3,

9,11, 18, 19 y 20 del gráfico de Carraixet línea 1, o en las muestras 2, 11, 15, 19 y 22 del

gráfico de Carraixet Línea 2.

Figura 30: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1.

0123456

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Castellón L2 Thiothrix sp.Convencional

Sonda G123TFISH

Tipo 021NConvencional

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Carraixet L1 Tipo 021NConvencional

Sonda ThiothrixG123T


R E S U L T A D O S

69

Figura 31: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2

Seguiremos con los gráficos de los recuentos realizados con la técnica FISH

comparando las bacterias filamentosas por especie dentro del género Thiothrix en

cada depuradora.

En la figura 32 de la EDAR de Quart, es en la que se observó los valores de IF más altos

para las sondas por especies. Realizando el análisis de hibridación con distintas sondas,

observamos que las especies que más abundan son T. eikelboomii y T. nivea, siendo T.

fructosivorans la que poseía valores de IF más bajos (<2).

Figura 32: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart.

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Carraixet L2 Tipo 021NConvencional

Sonda G123TFISH

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

IF

Muestreo

Quart Sonda 021NFISH

Sonda TNIFISh

Sonda TFRFISH


R E S U L T A D O S

70

En la EDAR Denia, (figura 32) la especie T. fructosivorans fue la más abundante y la

única que apareció en casi todos los muestreos, además se observó que los valores de

IF de T. nivea son más bajos que en la EDAR de Quart, al igual que ocurre con la

especie T. eikelboomii.

Figura 33: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia

En la EDAR Castellón, tanto la línea 1 (figura 34), como la línea 2 (figura 35), se

contabilizaron bacterias de la especie T. fructosivorans y se detectó una muestra

aislada de T. nivea



0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Denia Sonda G2MFISH

Sonda TNIFISH

Sonda TFRFISH

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Castellón L1 Sonda G2MFISH

Sonda TNIFISH

Sonda TFRFISH

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Castellón L2 Sonda G2MFISH

Sonda TNIFISH

Sonda TFRFISH


R E S U L T A D O S

71

Por último, en los resultados de la EDAR Carraixet Línea 1 (figura 36) y línea 2 (figura

37) se observó que de los 24 muestreos realizados para cada línea, el índice

filamentoso para las sondas estudiadas fue muy bajo. A pesar de estos valores (IF=1) se

encontraron bacterias hibridadas con las tres sondas comparadas.

Figura 36: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1

Figura 37: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2

En resumen podemos decir que los valores obtenidos de IF más altos para Thiothrix se

obtuvieron en las EDAR de Quart y Denia. Siendo en las EDAR de Castellón y Carraixet

donde los IF son más bajos.

Dentro de los distintos tipos filamentosos estudiados con la sonda G1B (Thiothrix

disciformis) y G3M (Thiothrix defluvii) no se obtuvieron señales en ninguna de las

depuradoras, se consideró mejor obviar los datos en el apartado de resultados de

correlaciones y análisis de componentes principales.

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Carraixet L1 Sonda G2M

Sonda TNI

Sonda TFR

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IF

Muestreo

Carraixet L2 Sonda G2MFISH

Sonda TNIFISH

Sonda TFRFISH


R E S U L T A D O S

72

4.4 Análisis estadísticos entre las bacterias filamentosas del género

Thiothrix y los parámetros operacionales y físico-químicos

El análisis estadístico realizado para relacionar la población de bacterias filamentosas

con los parámetros físico-químicos, operacionales se dividió en dos partes: primero un

análisis bivariante donde se determinó el coeficiente de Spearman y segundo un

análisis multivariante, correspondiente a un ACP.

Antes de hacer dichos análisis, se realizó un resumen estadístico de todos los

parámetros determinados durante el período de estudio. En estos resúmenes se

presentó el mínimo, máximo, media y desviación estándar de cada una de las

variables. Estas tablas se pueden observar en el anexo IV.

Posteriormente a la unión del conjunto de los datos se realizó el análisis bivariante de

Spearman.

4.4.1 Análisis Bivariante. Coeficiente de Spearman.

En las tablas 18 y 19 correspondientes a los parámetros físico-químicos del afluente;

encontramos que la sonda G2M que pertenece a T. eikelboomii, se vio afectada por las

cargas altas en afluente de nitrógeno, de nitrógeno soluble, de fósforo total, fósforo

soluble, de fosfatos, al igual que las cargas de sulfuros, sulfatos y tensoactivos; esto

quiere decir que a concentraciones altas de los compuestos citados el crecimiento de

Thiothrix eikelboomii se ve interrumpido y limita su proliferación en fangos activos. Por

el contrario las relaciones DBO5/NKT, DQO/NKT y las relaciones de DBO5/PT y DQO/PT

en el afluente de las depuradoras, favorecieron positivamente el crecimiento de la

especie.

Para la sonda TNI (Thiothrix nivea) se obtuvieron comportamientos parecidos a los de

G2M pero con números aún mayores que en los encontrados en G2M. Está se ve

afectada por cargas altas de nitrógeno, de nitrógeno soluble, de fosforo total, de

fosforo soluble, fosfatos, tensoactivos, pero no por la presencia de sulfuros o sulfatos

en el medio. A elevados valores de DBO5/NKT, DQO/NKT, DBO5/PT y DQO/PT, el

crecimiento de estas bacterias aumenta.

Para la sonda TFR (Thiothrix fructosivorans), los resultados fueron parecidos a los

comentados en la otras sondas, aunque en esta última los valores de los coeficientes

de Spearman no eran tan elevados. Se ve también como las concentraciones de

fósforo total y fosfatos no eran significativos para el crecimiento de la bacteria, no

pasa lo mismo con el fósforo orgánico particulado que sí pareció tener una relación

indirecta con el crecimiento de T. fructosivorans. La concentración de sulfuros en el

afluente favoreció la aparición de este tipo de bacterias. En G2M y TFR la

concentración de sulfatos afecto de forma negativa en su crecimiento.


R E S U L T A D O S

73

Tabla 18: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente

G2M TNI TFR G123T

Coef. Correlación

Sig. Coef. Correlación



Sig.

NT -,233** 0.006 0.021 0.806 0.042 0.623 -0.098 0.252

CNT -,234** 0.006 -,490** 0 -,383** 0 -,483** 0

Nts -0.169 0.104 -0.057 0.59 -0.057 0.587 -0.18 0.085

CNTs -,284** 0.006 -,478** 0 -,297** 0.004 -,474** 0

N NH4 -0.156 0.067 -0.015 0.862 0.064 0.456 -0.014 0.871

%N-NH4 -0.026 0.761 0.131 0.126 ,189* 0.026 0.134 0.116

CN-NH4 -,249** 0.003 -,486** 0 -,334** 0 -,436** 0

N orgs -0.003 0.981 0.079 0.455 -0.183 0.082 -0.04 0.71

N orgp -,286** 0.001 -,575** 0 -,327** 0 -,469** 0

N org -0.137 0.108 0.073 0.394 -0.019 0.822 -0.088 0.305

PT -,298** 0 -,291

** 0.001 -0.072 0.398 -,325

** 0

CPT -,279** 0.001 -,559

** 0 -,336

** 0 -,520

** 0

PTs -,498** 0 -,464

** 0 -0.069 0.524 -,572

** 0

CPTs -,456** 0 -,533

** 0 -0.171 0.112 -,599

** 0

P PO4 -,364** 0 -,424

** 0 -0.012 0.888 -,409

** 0

%P PO4 -,295** 0.001 -,349

** 0 0.003 0.972 -,373

** 0

CP PO4 -,264** 0.002 -,535

** 0 -,213

* 0.013 -,483

** 0

P_orgs -0.207 0.056 -0.021 0.85 0.09 0.412 -0.175 0.107

P_orgp 0.187 0.082 0.082 0.451 -,354**

0.001 0.116 0.285

P org 0.059 0.504 0.132 0.132 0.052 0.552 0.126 0.151 p< 0,05(*), p<0,01 (**)

Tabla 19: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente continuación

G2M TNI TFR G123T

Coef. Correlación




Sig.

DBO5/NKT ,304** 0 ,208

* 0.015 -0.05 0.566 ,261

** 0.002

DQOs/NKTs ,332** 0.001 ,230

* 0.027 -0.172 0.099 ,257

* 0.013

DBO/PT ,343** 0 ,542

** 0 0.098 0.257 ,501

** 0

DQOs/PTs ,526** 0 ,485

** 0 0.05 0.642 ,582

** 0

Sulf -,283** 0.002 -0.153 0.091 ,236

** 0.008 -,180

* 0.046

CS -,322** 0 -0.169 0.061 ,215

* 0.017 -,218

* 0.015

Sulfa -,266** 0.002 -,347

** 0 -,188

* 0.027 -,304

** 0

CSO4 -,191* 0.025 -,565

** 0 -,433

** 0 -,487

** 0

Tensan -0.206 0.088 -0.174 0.15 0.037 0.759 -,243* 0.042

CTA -,327** 0.006 -,398

** 0.001 0.03 0.802 -,448

** 0

CARBO 0.159 0.063 0 0.999 -0.129 0.131 0.094 0.272

CCARBO 0.006 0.942 -,377** 0 -,385

** 0 -,293

** 0

Prot -0.003 0.97 0.034 0.696 -0.125 0.145 0.041 0.632

Cprot -0.159 0.063 -,416** 0 -,411

** 0 -,360

** 0

AGV -0.061 0.479 -0.035 0.681 0.019 0.823 0.071 0.41

CAGV -0.07 0.413 -0.091 0.29 -0.002 0.978 0.033 0.704

p< 0,05(*), p<0,01 (**)

En los datos obtenidos en el licor mezcla (tabla 20) destaco, que las bacterias de la

especie T. eikelboomii (G2M) estaban correlacionadas con la conductividad, la

concentración de sólidos suspendidos y el fósforo total en los sólidos suspendidos del

licor mezcla, indicando que a concentraciones altas de estos parámetros no esperamos

encontrar crecimiento de esta especie.


R E S U L T A D O S

74

Para la sonda TNI (T. nivea) se relacionó más positivamente con la sedimentabilidad y

con el índice volumétrico del fango (IVF), además de con la DQO.

La sonda TFR mostro correlaciones positivas con la conductividad, los sólidos

suspendidos, sólidos volátiles, fósforo de los sólidos volátiles y la DQO. Sin embargo se

vio afectada por valores de nitrógeno alto en los sólidos suspendidos volátiles y con la

temperatura, factores que no parecieron afectar a ninguna de las otras dos sondas de

estudio.

Tabla 20: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Licor mezcla

G2M TNI TFR G123T

Coef. correlación

Sig. Coef. correlación



Sig.

pH 0.014 0.873 0.097 0.255 -0.106 0.216 0.137 0.109

Cond -,184* 0.03 0.082 0.337 ,424

** 0 0.12 0.159

SSLM -,191* 0.024 0.009 0.914 ,372

** 0 0.041 0.63

SSVLM -0.16 0.059 -0.007 0.937 ,322** 0 0.045 0.597

%SSVLM 0.137 0.107 -0.135 0.114 -,412** 0 -0.131 0.124

IVF 0.016 0.856 ,308** 0 ,242

** 0.004 ,195

* 0.021

NT SSVLM

0.153 0.072 -0.066 0.443 -,225** 0.008 -0.069 0.421

PT SSVLM

-,245** 0.004 -0.118 0.166 ,265

** 0.002 -0.064 0.453

DQO -0.026 0.763 ,377** 0 ,525

** 0 ,404

** 0

Tªr -0.027 0.751 -0.101 0.234 -,245** 0.004 -,202

* 0.017

p< 0,05(*), p<0,01 (**)

En el efluente (tabla 21), las correlaciones obtenidas para G2M dieron positivas para la

DQO soluble y para la DBO total y negativas con el rendimiento de DQO total y la DBO

filtrada; estos valores son totalmente contrarios a los obtenidos en las correlaciones de

TFR menos en la DBO filtrada que no se correlacionaba ni positiva ni negativamente

con esta sonda. Además para TFR obtuvimos correlaciones negativas en los sólidos

suspendidos totales, DQO total, rendimiento de DBO filtrada. Por último decir que TNI

apareció en el efluente con altos rendimientos de DBO total y suele no aparecer en

presencia de DBO filtrada.


R E S U L T A D O S

75

Tabla 21: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Efluente

G2M TNI TFR G123T

Coef. Correlación




Sig.

SST 0.033 0.697 -0.144 0.091 -,266** 0.002 -0.056 0.512

rSST -0.069 0.419 0.109 0.202 ,262** 0.002 0.024 0.775

DQOt 0.162 0.057 -0.054 0.531 -,360** 0 0.012 0.891

rDQOt -,223** 0.008 -0.044 0.604 ,278

** 0.001 -0.067 0.432

DQOs ,197* 0.02 0.055 0.522 -,220

** 0.009 0.117 0.172

rDQOs -0.038 0.658 0.123 0.153 ,271** 0.001 0.107 0.213

DBOf -,224* 0.034 -,318

** 0.002 -0.161 0.129 -,329

** 0.002

rDBOf -0.055 0.615 -0.062 0.573 -,315** 0.003 -0.082 0.458

DBOt ,212* 0.013 0.12 0.165 -,246

** 0.004 0.155 0.073

rDBOt -0.004 0.966 ,289** 0.001 ,267

** 0.003 0.148 0.105

p< 0,05(*), p<0,01 (**)

Según las variables operacionales de estudio, en la tabla 22; pudimos observar como la

especie T. nivea tuvo un comportamiento muy parecido a T. fructosivorans, aunque T.

fructosivorans estaba menos afectada por el tiempo de retención hidráulico o por el

oxígeno medio, y negativamente por la temperatura. La sonda G2M solo tuvo

correlación positiva con el tiempo de retención hidráulico y con el oxígeno bajo, y una

correlación negativa con el oxígeno alto.

Tabla 22: Correlaciones Spearman de las sondas con las Variables operacionales

G2M TNI TFR G123T

Coef. Correlación




Sig.

CMdbo -0.074 0.384 -,343** 0 -,371

** 0 -,340

** 0

CMdqos -0.084 0.326 -,308** 0 -,245

** 0.004 -,289

** 0.001

TRHr ,340** 0 ,616

** 0 ,171

* 0.044 ,496

** 0

EF 0.114 0.182 ,438** 0 ,434

** 0 ,415

** 0

O_bajo ,182* 0.032 ,490

** 0 ,548

** 0 ,485

** 0

O_medio

0.109 0.203 ,353** 0 ,216

* 0.011 ,283

** 0.001

O_alto -,239** 0.005 -,566

** 0 -,432

** 0 -,515

** 0

p< 0,05(*), p<0,01 (**)


R E S U L T A D O S

76

4.4.2 Análisis de Componentes Principales (ACP)

Los gráficos de saturaciones mostrados en este apartado corresponden a los diagramas

de dispersión biespacial. Las dos dimensiones que explican la máxima varianza para las

variables físico-químicas y operacionales.

El ACP relativo a las variables del afluente (figura 38) presentó una medida de

adecuación de la muestra (KMO) de 0,826 y un nivel de significación < 0,05, lo que

indico que es un buen análisis factorial. El total de la varianza explicada con los dos

componentes fue del 62,44%, si hubiésemos utilizado un tercer componente la

varianza explicada hubiera sido del 71% (tabla 23) En la matriz de componentes

rotados se obtuvo una relación inversa entre la carga másica de proteínas, el amonio,

el fósforo total, el nitrógeno total, el fosfato, los carbohidratos, los aceites y grasas, los

ácidos grasos volátiles y la sonda TNI (T. nivea). Por otro lado existió una relación

directa entre la sonda TFR (T. fructosivorans) y la carga de ácidos grasos volátiles.

Además con la sonda G2M (T, eikelboomii) había una relación directa de la DBO5/NKT,

DBO/PT. El gráfico que deberíamos haber obtenido en tres dimensiones donde los

parámetros de G2M, DBO5/PT y DBO5/NKT estarían en ese tercer eje.

Tabla 23: Matriz de componentes rotados con porcentajes de las varianzas

Componente

1 (45,6%) 2 (16,9%) 3 (9,33)

Cprote ,925

CN-NH4 ,918

CPT ,897

CNT ,866

CP_PO4 ,865

CCARBO ,823

CAG ,806

DBO5/NKT ,815

DBO/PT ,769

G2M ,625

TNI -,412 ,422

TFR ,704

CAGV ,400 ,633


R E S U L T A D O S

77

Figura 38: ACP de las variables físico-químicas del afluente con las sondas G2M, TNI y TFR

En el análisis del ACP del licor mezcla (figura 39), se obtuvo una media de KMO de

0,762 y un nivel de significación < 0,05. La varianza explicada en el análisis con las dos

primeras dimensiones es del 54% (tabla 24), es un porcentaje válido para el análisis. En

la matriz de componentes rotados vimos unas correlaciones negativas entre T.

fructosivorans (sonda TFR) y T. nivea (sonda TNI) con la temperatura, lo que indico que

a mayor temperatura del licor mezcla menores IF de las sondas TNI y TFR. La sonda

G2M (T. eikelboomii) no se relacionó con ninguna variable operacional pero una vez

analizado el gráfico para un tercer componente más pudimos ver que G2M, se

relacionó con la sonda TNI.


R E S U L T A D O S

78

Tabla 24: Matriz de componentes rotados con el porcentaje de la varianza, licor mezcla.

Componente

1 (36,3 %) 2 (16,2 %) 3 (12,1%)

PT SSVLM ,868

SSLM ,748

%SSVLM -,831

NT SSVLM -,845

CondLMµS/cm ,580

pH -,515

G2M ,641

TNI ,821

TFR ,690

Tª -,798

Figura 39: ACP de las variables físico-químicas del licor mezcla con las sondas G2M, TNI y TFR


R E S U L T A D O S

79

Dentro de los parámetros físico-químicos del efluente, figura 40; los resultados con los

que se obtuvo un buen análisis de componentes principales fueron los relacionados

con la DQO soluble y las sondas. Es un análisis donde la media de KMO = 0,5 y un nivel

de significación < 0,05, a pesar de que el valor de KMO es algo bajo, el análisis es

todavía aceptable. La varianza acumulada para dos componentes en este análisis

explica un 70% del acumulado (tabla 26). Por último, se observó una relación directa

entre T. fructosivorans y el rendimiento de DQO soluble, al contrario que con las

especies T. nivea y T. eikelboomii que se obtuvieron valores relacionados directamente

con la DQO soluble. Con un nivel de depuración bajo del agua tratada estas dos

especies eran más representativas.

Tabla 25: Matriz de componentes rotados del

efluente con el porcentaje de la varianza

Componente

1 (38,2 %) 2 (32,7%)

TFR ,753

rDQOs ,634

DQOs -,600 ,576

TNI ,799

G2M ,667

Figura 40: ACP de las variables físico-químicas del efluente con las sondas G2M, TNI y TFR


R E S U L T A D O S

80

Por último en el ACP realizado de las variables operacionales; (figura 41) la media de

KMO = 0,722 y un nivel de significación < 0,05. La varianza explicada de este análisis

con los dos primeros componentes fue del 63,2 (tabla 26). En este último análisis de

componentes principales obtuvimos una; relación directa de T. nivea con el oxígeno

medio y oxígeno bajo, y relación inversa con la concentración de oxígeno alto. Por otro

lado, T. fructosivorans estaba más relacionada positivamente con la edad de fango e

inversamente con la carga másica de la DQO soluble. La especie T. eikelboomii (sonda

G2M) se encuentro representada en una tercera dimensión, sin relación con ninguna

otra variable.

Tabla 26: Matriz de componentes rotados de las variables

operacionales, con el porcentaje de la varianza

Componente

1(43,64 %) 2(9,50%) 3(4,14%)

O_medio ,934

O_bajo ,909

O_alto -,790

TNI ,542

G2M ,901

CMdqos -,883

EF ,850

TFR ,538

Figura 41: ACP de las variables operacionales con las sondas G2M, TNI y TFR


R E S U L T A D O S

81


D I S C U S I Ó N

82

5. Discusión

5.1 Técnica convencional versus FISH

Los métodos convencionales de detección e identificación de bacterias filamentosas, a

pesar de ser una gran ayuda para la observación en fangos activos de las EDAR, no son

una herramienta fiable debido a su baja especificidad a nivel de identificación como se

ha observado principalmente en las bacterias del presente estudio. Con la técnica

convencional se identificaron 2 morfotipos; Tipo 021N y Thiothrix, (Eikelboom, 2006;

Jenkins et al., 2004), sin embargo con la técnica FISH fueron identificadas 3 bacterias

pertenecientes a estas especies; Thiothrix nivea, Thiothrix eikelboomii y Thiothrix

fructosivorans (Kanagawa et al., 2000; Aruga et al., 2002; Howarth et al., 1999).

La técnica convencional depende principalmente de la experiencia del operador de

planta, de los conocimientos sobre los morfotipos filamentosos, de otros factores

externos; como puede ser el tipo de microscopio y el tiempo utilizado, así como el

nicho donde la bacteria filamentosa se encuentre (intraflocular o interflocular). De

estos parámetros depende su identificación y posterior cuantificación.

En nuestro caso de estudio, se apreciaron diferencias significativas al comparar los

resultados en la cuantificación e identificación de los morfotipos filamentosos

estudiados mediante las dos técnicas utilizadas (convencional y FISH). Los resultados

revelaron que la técnica convencional siempre subestimó la presencia del género

Thiothrix, principalmente por la gran dificultad que conlleva identificar bacterias de

localización intraflocular con respuesta negativa a las tinciones de Gram y Neisser.

Además, con la técnica convencional no se consiguieron diferenciar las distintas

especies dentro de este género. Este hecho dificulta avanzar en el estudio de la

fisiología de este género en los fangos activos de las EDAR, puesto que especies

pertenecientes a un mismo género pueden asociarse a condiciones ambientales

distintas, como es el presente estudio. Por tanto, el uso exclusivo de la técnica

convencional en las EDAR como medida de control y seguimiento de las poblaciones de

bacterias filamentosas del género Thiothrix se encuentra sometida a sesgos,

ocasionando que las medidas correctoras operacionales no sean las adecuadas para el

control de los episodios de bulking filamentoso. El uso complementario de la técnica

FISH permitirá evitar tomar medidas erróneas.

5.2 Correlaciones de Spearman

Según Bergeron y Pelletier, (2004); Thiothrix sp. y T. eikelboomii son organismos

versátiles, los cuales se comportan como quimioheterótrofos (Kämpfer et al., 1995),

quimiautótrofos (Tomei et al., 1999), actuando como fijadores de CO2 y oxidadores de

sulfuro (Strohl y Schimd, 1984; Williams y Unz, 1989), obligados mixotrófos (Williams y

Unz, 1989) así como aerobios estrictos (Richard et al., 1985; Hudson et al., 1994) o

anaerobios facultativos (Hudson et al., 1994).


D I S C U S I Ó N

83

Para Jenkins et al., (1993), el crecimiento de Thiothrix y T. eikelboomii está promovido

por mezcla completa, sistemas con aportación continua de nutrientes, relaciones de

carga másica elevadas (> 0,1), déficit de nutrientes y septicidad. Además de las

condiciones descritas por Jenkins, Eikelboom (2000) también incluye un déficit de

oxígeno disuelto; conclusión a la cual también hacen referencia Bergeron y Pelletier,

(2004). Además, estos autores observaron que en sistemas convencionales de fangos

activos con mezcla completa se favorecía el crecimiento de Thiothrix y T. eikelboomii.

Observados los valores en el presente estudio de las correlaciones de Spearman para

la sonda G2M, se pudo afirmar que existen correlaciones importantes con los

nutrientes (variables físico-químicas del afluente), como; el nitrógeno total, nitrógeno

total soluble, amonio, nitrógeno orgánico particulado, fósforo total, fósforo total

soluble y fosfatos.

Williams y Unz, (1989) también encontraron que Thiohtrix sp. y T. eikelboomii podían

consumir urea, amonio, nitrito o nitrato. La especie T. eikelboomii predomino en

condiciones intermitentes de aporte de amonio. Otra aportación sobre la relación de

nutrientes, la encontraron en sistemas convencionales de fangos activos Bergeron y

Pelletier (2004), en el cual fluctuaciones en la relación DBO5/N se relacionaban con

“bulking” por T. eikelboomii. Thiothrix sp. utiliza preferentemente polifosfato y/o

amonio antes que urea/ácido fosfórico como fuentes de nitrógeno o fósforo,

respectivamente (Bergeron y Pelletier, 2004).

Las fluctuaciones de nutrientes así como deficiencias en la dosis de nutrientes

descritas anteriormente, parecían favorecer la proliferación tanto T. eikelboomii como

Thiothrix, (Bergeron y Pelletier, 2004). Como se comprobó en nuestro estudio entorno

a la deficiencia de nutrientes, señalamos la relación positiva encontrada de T.

eikelboomii con las relación DBO5/NKT, DQOs/NKTs, DBO5/PT, y DQOs/PTs. Donde

relaciones elevadas de estos cuatro parámetros, hicieron aumentar su crecimiento,

valores que comparte con la sonda de género (G123T) y con T. nivea. Estos resultados

están de acuerdo con los obtenidos por otros autores, (Jenkins et al., 1994, Bergeron y

Pelletier, 2004, Eikelboom, 2006).

Las bacterias pertenecientes al género Thiothrix son muy versátiles y muestran

incorporaciones de acetato y/o bicarbonato bajo condiciones heterótrofas, mixotrófas

y quimiolitotrófas (Nielsen et al., 2000). Estos microorganismos pueden crecer en

condiciones anerobias (sin oxígeno, con y sin nitrato) en estas condiciones forman

intracelularmente gránulos de azufre a partir de la utilización de acetato o tiosulfato,

(Nielsen et al., 2000). Como ya hemos visto al tratarse de bacterias relacionadas con el

ciclo del azufre, (Eikelboom y Buijsen, 1981; Jenkins et al., 1993; Seviour et al., 1999),

diferentes autores (Jenkins et al., 1994; Howarth et al., 1999 y Eikelboom, 2006),

concluyen que T. eikelboomii es capaz de almacenar compuestos de azufre inorgánico

reducido. En este estudio no se pudo obtener conclusiones que relacionaran T.


D I S C U S I Ó N

84

eikelboomii con las concentraciones de sulfuros y sulfatos debido a la baja carga de

estos en el afluente. Así mismo no fue observado en las muestras en vivo metabolismo

del azufre (azufre in situ).

Añadir que el TRH del reactor parece influir de forma positiva en el crecimiento tanto

de T. eikelboomii como de T. fructosivorans y T. nivea, aunque habría que esperar a

decir algo más concluyente con análisis más avanzados.

En los valores presentados de oxígeno disuelto se pudo ver que con niveles de oxígeno

bajo incrementó la presencia de T. eikelboomii, valores contrarios a los que Bergeron y

Pelletier (2004) obtuvieron, donde T. eikelboomii creció con relaciones altas de carga

másica (0,2), y con oxígeno disuelto alto, por encima de 2 ppm; mientras que Thiohtrix

sp, generalmente proliferaba con relaciones de carga másica baja y oxígeno disuelto

bajo. Según Bergeron y Pelletier (2004), el oxígeno disuelto a bajas concentraciones

era determinante para el crecimiento del género Thiothrix, y solo los valores altos

favorecían a la especie T. eikelboomii, confirmando el metabolismo estrictamente

aerobio para esta especie descrito por (Richard et al., 1985; Hudson et al., 1994)

mientras otros autores aseguraron la versatilidad de la especie donde Thiothrix puede

crecer en sistemas anoxicos o anaerobios, en vez de aerobios (anaerobios facultativos

(Hudson et al., 1994, Nielsen et al., 2000), datos más correlacionados con los

obtenidos en nuestro estudio pues se observó cómo T. eikelboomii prolifero con

condiciones de oxígeno bajo.

Para la especie T. nivea, las relaciones con los nutrientes y con los parámetros

DBO5/NKT, DQOs/NKTs, DBO5/PT y DQOs/PT son más parecidas a T. eikelboomii que a T.

fructosivorans.

Analizando los parámetros del licor mezcla, vemos diferencias muy grandes dentro de

las distintas especies. Por ejemplo se encontró correlaciones positivas del IVF y la DQO

con T. nivea y T. fructosivorans, lo cual no se había descrito con anterioridad.

T. nivea tiene correlaciones importantes positivas con la mayoría de las variables

operacionales de estudio (TRHr, EF, ODb, ODm, ODa), sin embargo en presencia de

cargas másicas altas de DQO y DQOs esta especie no presenta crecimiento. Este

comportamiento se acercó más al que aparece en los valores de T. fructosivorans

En relación con los valores de T. fructosivorans no se correlaciona significativamente

con los parámetros DBO5/NKT, BQOs/NKTs, DBO5/PT y DQOs/PTs. Centrados en las

variables operacionales observamos una correlación negativa entre T. fructosivorans y

la CMDBO, CMDQOs y ODa (pero en todas las demás variables operacionales se

observaron correlaciones positivas (TRH, EF, ODb, ODm), exactamente igual que

ocurrió con T. nivea, estos valores son contrarios a los citados por Bergeron y Pelletier,

(2004) donde el género Thiohtrix sp, generalmente proliferaba con relaciones de carga

másica baja y oxígeno disuelto bajo.


D I S C U S I Ó N

85

Conocidos los valores del análisis bivariante (Spearman), podemos resumir que los

comportamientos de T. nivea y T. fructosivorans, son más parecidos entre ellos que

con T. eikelboomii. Sin embargo, T. nivea tiene un comportamiento similar a T.

eikelboomii con respecto a la asociación con los nutrientes.

5.3 Análisis componentes principales

Dentro de los cuatro ACP realizados el comportamiento de T. eikelboomii es muy

distinto de T. nivea y T. fructosivorans. En la mayoría de los ACP realizados, T.

eikelboomii no se asocia a ninguna de los dos primeros componentes representados.

Una vez revisado todos los estudios publicados hasta el momento sobre estas

bacterias filamentosas no podemos contrastar resultados de otros autores con los

obtenidos en el ACP del presente trabajo. Todas esas investigaciones abarcaron

estudios sobre la morfología y/o fisiología del género Thiothrix, sin estudiar su relación

con las condiciones ambientales en las EDAR a escala real. Únicamente se encontró un

estudio en planta real, el cual trata aquellas variables operacionales que influyen en el

crecimiento solamente de Thiothrix sp y T. eikelboomii (Bergeron y Pelletier, 2004).

5.3.1 Parámetros físico-químicos del afluente

Los resultados corroboran en gran parte los obtenidos en el análisis bivariado.

Respecto a la deficiencia de nutrientes T. eikelboomii (G2M) está más relacionada que

T. nivea, (TNI) sin embargo esta última, se relacionó mucho más que T. eikelboomii,

con la baja concentración de nutrientes, carbohidratos y proteínas. (Bergeron y

Pelletier, 2004). Las fluctuaciones de nutrientes así como deficiencias en la dosis de

nutrientes descritas anteriormente, parecían favorecer la proliferación tanto T.

eikelboomii como Thiothrix, (Bergeron y Pelletier, 2004).

Por otro lado T. fructosivorans presenta una relación directa con los ácidos grasos

volátiles. Esto puede deberse a lo descrito por anteriores autores donde las especies

pertenecientes al género Thiothrix con capacidades muy versátiles, muestran

incorporaciones de acetato y/o bicarbonato bajo condiciones heterótrofas, mixotrófas

y quimiolitotrófas (Nielsen et al., 2000). Además, estos microorganismos pueden

crecer en condiciones anerobias (sin oxígeno, con y sin nitrato) en estas condiciones

forman intracelularmente gránulos de azufre a partir de la utilización de acetato o

tiosulfato, (Nielsen et al., 2000).

5.3.2 Parámetros físico-químicos del Licor Mezcla

En el ACP del licor mezcla solamente se obtuvo relación de las especies T. nivea y T.

fructosivorans con la temperatura del reactor. Influyendo positivamente en el

crecimiento de estas dos bacterias filamentosas cuando las temperaturas en el reactor

fueron bajas.


D I S C U S I Ó N

86

5.3.3 Parámetros físico-químicos del efluente

En los valores para T. nivea y T. eikelboomii, se confirmó un comportamiento similar en

ambas especies, apareciendo principalmente con un menor rendimiento de la

eliminación de la materia orgánica. Contrariamente a los valores obtenidos para la

especie T. fructosivorans, la cual solo apareció con buenos rendimientos de

eliminación.

5.3.4 Parámetros operacionales

Respecto a los parámetros operacionales, T. nivea presenta su máxima abundancia en

valores por debajo de 2 ppm de oxígeno disuelto sin embargo Bergeron y Pelletier,

(2004) concluyeron que el oxígeno disuelto era determinante a bajos niveles para la

proliferación del género Thiothrix, (Bergeron y Pelletier 2004); y que valores altos de

oxígeno disuelto favorecían a la especie T. eikelboomii. Esto no tiene relación con

nuestros datos, aunque podemos decir que como ya hemos comentado al ser una

familia tan versátil en cuanto a comportamientos de oxígeno no sea un factor claro o

determinante para proporcionar conclusiones sobre la relación de su metabolismo con

las concentraciones de oxígeno disuelto en el medio.

T. fructosivorans se relacionó con una baja carga másica y alta edad de fango, no

obteniéndose valores que relacionen estos parámetros con las otras dos especies (T.

nivea y T. eikelboomii), a pesar de que según Jenkins et al., 2004 publico rangos de 0,1-

0,7 de carga másica (kgDBO5/kgLMSS, día) y de 2–20 de edad del fango (días) para el

morfotipo T. eikelboomii.


D I S C U S I Ó N

87


C O N C L U S I O N E S

88

6. Conclusiones

Las conclusiones obtenidas en el presenta trabajo han sido las siguientes:

- Se apreciaron diferencias significativas al comparar los resultados en la

cuantificación e identificación del género Thiothrix, mediante microscopía

convencional y técnica molecular FISH. La técnica convencional presenta una

serie de inconvenientes que le impide ser una herramienta ideal. El futuro de la

identificación y valoración se encuentra en las técnicas moleculares debido a la

alta especificidad de estas pruebas.

- Los mayores valores de IF encontrados fueron los de T. eikelboomii seguidos de

T. nivea.

- Las especies T. nivea y T. fructosivorans se comportaron de igual forma para

baja carga másica y alta edad de fango. Estos parámetros influyen

positivamente en la aparición de estas especies.

- Thiothrix nivea y T. eikelboomii se relacionaron con la deficiencia de nutrientes

(DBO5/NKT, BQOS/NKTS, DBO5/PT, DQOS/PT) observándose una mayor relación

de esta última bacteria filamentosa, con los parámetros antes citados.

- La abundancia de Thiothrix fructosivorans se asoció con altos valores de ácidos

grasos volátiles.

- Bajas temperaturas en el reactor biológico favorecieron la aparición de T.

fructosivorans y T.nivea.

- Las relaciones estudiadas entre el género Thiothrix y los parámetros descritos

permitirá relacionar episodios de “bulking” en diferentes EDAR pudiendo

identificar el tipo de bacteria y actuando sobre las variables que afecta a su

crecimiento.


C O N C L U S I O N E S

89


B i b l i o g r a f í a

90

7. Bibliografía

AENOR. Vocabulario tratamiento aguas residuales. UNE-EN 1085. Madrid: AENOR

(2007).

ALONSO, J., CUESTA, G., RAMÍREZ, G., MORENILLA, J., BERNÁCER, I., LLORET, R. (2009).

Manual de Técnicas Avanzadas para la identificación y control de bacterias

filamentosas. EPSAR Generalitat Valenciana. Valencia, España.

AMANN, R.(1994). Identification and in situ detection of gram-negative filamentous

bacteria in activated sludge. Syst Appl Microbiolo 17, 405-417.

AMANN, R., LUDWING, W., y SCHLEIFER, K.H., (1994) Phylogenetic identification and in

situ detection of individual microbial cells without cultivation.

AMANN R. (1995). In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization

with rRNA-targeted nucleic acid probes. En: Molecular Microbial Manual. Akkermans

A.D.L., van Elsas, J.D., y de Brujin, F.J. (eds.) p. 1-15. Kluwer Academic Publications.

ANDÚJAR, A.B., ZORNOZA, A., ALONSO, J.L., (2012). La ecofisiología de los morfotipos

filamentosos 0803, 0914 y 0092 enmascarada por las técnicas convencionales de

identificación en fangos activos. Póster presentado en VIII Jornadas de Transferencia

de Tecnología sobre Microbiología del Fango Activo. Sevilla, España.

APHA AWWA-WEF. (2005) Standar Methods for the Examination of Water and

Wastewater, 21th ed. American public Health Association/American Water Works

Association/Water Environment Federation, Washintong, DC, USA.

BERGERON, J. y PELLETIER, C.(2004) Occurrence and significance of filamentous

bacteria in pulp and paper activated sludge systems. Water Science and Technnology

Vol 50, No · pp 39-48.

BITTON, G., (1999). Wastewater Microbiology, 2nd ed. John Wiley & Sons, New York.

BLACKALL, LL. (1994). Molecular identification of activated sludge foaming bacteria.

Water Sci. Technol. 29, 35-42.

BRADFORD, D., HUGENHOLTZ, P., SEVIOUR, E. M., CUNNINGHAM, M. A., STRATTON,

H., SEVIOUR, R. J., and BLACKALL, L. L. (1996). 16 rRNA analysis of isolates obtained

from gram-negative, filamentous bacteria micromanipulated from activated sludge.

Syst. Appl. Microbiol. 19, 334-343.

BRIGMON, RL., BITTON G., ZAM SG., MARTIN HW., O’BRIEN, B., (1994a). Identification,

enrichment, and isolation of Thiothrix spp. Form environmental samples. Curr

Microbiol 28: 243-246.



91

BRIGMON, RL., MARTIN HW, MORRIS TL, BITTON, G., ZAM, SG., (1994b.)

Biogeochemical ecology of Thiothrix spp. In underwater limestone caves.

Geomicrobiolo. J 12:141-159.

Brock T.D. In THE Prokaryotes (A. BALOWS, H.G. TRÜPER, M. DWORKIN, W.HARDER,

K.-H. SCHLEIFER, eds.), 2nd Ed. The genus Leucothrix, pp. 3247 – 3255. New York,

Springer Verlag (1992)

CATALÁN, J. (1997). Depuradoras “Bases Científicas”. BELLISCO, Librería Editorial.

Madrid, España.

CHERNOUSOVA, E., GRIDNEVA, E., GRABOVICH, M., DUBININA, G., AKIMOV, V.,

ROSSETTI, S., y KUEVER, J. (2009). Thiothrix caldifontis sp.nov. and Thiothrix lacustris

sp. nov., gammaproteobacteria isolated from sulfide springs. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology, 59, 3128-3125.

EIKERLBOOM, D. H. (1975). Filamentous organisms observed in activated sludge.

Water Res. 9, 365-388.

EIKELBOOM, D.H. y Van BUIJSEN, H.J.J., (1981) Microscopic Sludge Investigation

Manual (2nd Ed.). TNO Research Institute for Environmental Hygiene, The Netherlands.

EIKELBOOM, D.H. (2000). Process control of activated sludge plants by microscopic

investigation. IWA Publishing, London.

EIKELBOOM, D.H. y GEURKINK, B. (2002). Filamentous microorganisms observed in

industrial activated sludge plants. Water Sci Technol 46, 535-542

EIKELBOOM, D. (2006). CD-ROM Identification and Control of Filamentous

Microorganisms in Industrial Activated Sludge Plants. IWA Publishing, London.

ERHART, R., BRADFORD, D., SEVIOUR, R. J., AMANN, R., BLACKALL, L.L. (1997).

Development and use of fluorescente in situ hybridization probes for the detection

and identification of ‘Microthrix parvicella’ in activated sludge. Systematic and Applied

Microbiology 20 (2), 310-318.

ESTEBAN, G., TELLEZ, C. y Bautista, L.M. (1991). Dynamics of ciliated protozoa

communities in activated sludge process. Water Res. 25: 1645-52.

FERRER, J y SECO, A. (2007). Tratamientos Biológicos de Aguas Residuales. Editorial

UPV. Valencia, España.

FERRER, J y SECO, A. (2009). Tratamientos Físicos y Químicos de Aguas Residuales.

Editorial UPV. Valencia, España.



92

FORD, H.W., y D.P.H. TUCKER. (1975). Blockage of drip irrigation filters and emitters by

iron-sulfur-bacterial products. Hortic. Sci. 10: 62-64.

Vervaeren, H., De Wilde, K., Matthys, J., Boon, N., Raskin, L., Vertracte, W. (2005).

Quantification of an Eikelboom type 021N bulking event with fluorescence in situ

hybridization and real-time PCR. Appl. Microbiol. Biotechnol(2005) 68: 695-704.

HAIR, J.F., ANDERSON, R.E., TATHAM, R.L., BLACK, W.C. (1999) Análisis multivariante.

5º ed. Prenticf . Hall Iberia. Madrid, 1999

HOWART, R., UNZ, R. F., SEVIOUR, E.M., SEVIOUR, R.J., BLACKALL, L.L., PICKUP, R.W.,

JONES, J.G., YAGUCHI, J., HEAD, I.M. (1999). Phylogenetic relationships of filamentous

sulfur bacteria (Thiothrix spp. and Eikelboom type 021N bacteria) isolated from

wastewater treatment plants and description of Thiothrix eikelboomii sp. nov. Thiothrix

unzii sp. nov., Thiothrix fructosivorans sp. nov. and Thiothrix defluvii sp. nov.

International Journal of Systematic Bacteriology, 49, 1817-1827.

JENKINS D, RICHARD, M.G., DAIGGER, G.T., (1993) Manual on the causes and Control of

Activated Sludge Bulking and Foaming. Lewis Publishers, Boca Ratón.

JENKINS, D., RICHARD, M., DAIGGER, G. (2004). Manual on the Causes and Control of

Activated Sludge Bulking and Foaming. 3th Ed.. Lewis publishers. Nueva York, EEUU.

JONES, G.B., BURDON-JONES, C., THOMAS, F.G., (1982). Influence of Trichodesmiun

red tides on trace metal cycling at a coastal in the Great Barrier Reef Lagoon. Oceanol.

Acta Special Publication, 319 - 326.

KANAGAWA, T., KAMAGATA, Y., ARUGA, S., KOHNO, T., HORN, M. y WAGNER, M.

(2000). Phylogenetic analysis of an oligonucleotide probe development for eikelboom

type 021N filamentous bacteria isolated from bulking activated sludge. Appl Environ

Microbiol 66, 5043-5052

KANAGAWA, T., ARUGA, S., KAMAGATA, Y., KOHNO, T., HANADA, S. y NAKAMURA, K.,

(2002). Characterization of filamentous Eikelboom type 021N bacteria and description

of Thiothrix disciformis sp. nov. and Thiothrix flexilis sp.nov. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology (2002), 52, 1309-1316.

KELEY, S. y FOSTER, C. F., (1995). Extracellular polymers in activated sludge and stable

foams. J. Chem. Tech. Biotech. 62: 401-404.

Knobelsdorf, M. Juliana. Eliminación biológica de nutrientes en un ARU de baja carga

orgánica mediante el proceso VIP. Tesis doctoral. Universidad Politécnica de Cataluña,

España, 2005.



93

KRAGELUND, C., NIELSEN, J.L., THOMSEN, T.R., NIELSEN, P.H., (2005). Ecophysiology of

the filamentous Alphaproteobacterium Meganema perideroedes in activated sludge.

FEMS Microbiolo. Ecol. 2005 Sep. 1; 54 (1): 111-22.

KRAGELUND, C. NILSSON, B., ESKILSSON, K., BOGH, A.M. NIELSEN, P.H., (2010) Full-

scale control of Mycolata foam by FEX-120 addition. Water Sci. Technol. 2010; 61 (10):

2443-50.

LARKIN, J.M. Y STROHL, W.R., (1983) Beggiatoa, Thiothrix and Thioploca. Annu. Rev.

Microbiolo. 1983; 37: 341-67.

McGLANNAN, M.F. Y MAKERMSON, J. C., (1990). HCO(3) Fixation by Naturrally

Occurring Tufts and Pure Cultures of Thiothrix nivea. Appl. Environ. Microbiolo. 1990

Mar; 56(3); 730-8.

NIELSEN, P.H., ANDREASEN K., WAGNER M., BLACALL, LL., LEMMER, H., SEVIOUR, R.J.,

(1998) Variability of Type 021N in activated sludge as determined by In situ substrate

pattern and in situ hybridization with fluorescent rRNA-targeted probes. Wat. Sci.

Technol. 37: 423:430.

NIELSEN, P.H., AQUINO DE MURO, M. Y NIELSEN, J.L., (2000). Studies on the in situ

physiology of Thiothrix spp. Present in activated sludge. Blackwell Sciencie Ltd,

Environmental Microbiology, 2, 383-388.

NIELSEN, P.H., KRAGELUND, C., SEVIOUR, R.J., (2009). Identify and ecophysiology of

filamentous bacteria in activated sludge. FEMS Microbiology Reviews 33 (6), 969-998.

NIELSEN, P. H., MIELCZREK, A. T., KRAGELUND, C., NIELSEN, J. L., SAUNDERS, A. M.,

KONG, Y., HANSEN, A. A. y VOLLERSTEN, J. (2010 c). A conceptual ecosystem model of

microbial communities in enhanced biological phosphorus removal plants. Water Res.

44, 5070-5088.

Reichenbach, H. y Dworkin, M. (1981). Introduction to the gliding bacteria. The

Prokaryotes, 1st Edition, Vol. 1 (eds): Starr MP, Stolp H, Trüper HG, Balows A & Schlegel

HP, Springer, Berlin.

Richard, M. G., Shimizu, G. P. y Jenkins, D. (1985). The growth physiology of the

filamentous organism type 021N and its significance to activated sludge bulking.

JWPCF 57, 1152-1161.

Pernelle , J.J., Cotteux, E. y Duchene, P. (1998). Effectiveness of oligonucleotide probes

targeted against Thiothrix nivea and type 021N 16S rRNA for in situ identification and

population monitoring in activated sludges. Water SCi Technol 37, 431-440.



94

SEVIOUR, R.J. y BLACKALL, L.L. (1999) Current taxonomic status of filamentous bacteria

found in activated sludge plants, In the Microbiology of Activated Sludge. R.J. Seviour

& L. L. Blackall. Dordrecht (eds): Kluwer Academic Publisher, pp, 122-146

SEVIOUR, E.M., SEVIOUR, R.J., LINDREA, K. C. (1999) Description of filamentousbacteria

causing bulking and foaming in activated sludge plants., In the Microbiology of

Activated Sludge. R.J. Seviour & LL. Blackall. (eds), pp, 301-381. Dordrecht: Kluwer

Academic Publisher

SEVIOUR, R. J. y NIELSEN, P. H. (2010). Microbial Ecology of Activated Sludge. IWA

Publishing, UK.

SEZGIN, M., JENKINS, D. y PARKER, D.S. (1978) A unified theory of filamentous

activated sludge bulking. JWPCF 50, 362-381.

SHUTTLEWORTH, K. L. y UNZ, R. F. (1991) Influence of metals and metal speciation on

the growth of filamentous bacteria. Water Res. 25, 1177-1186.

SHUTTLEWORTH, K. L. y UNZ, R. F. (1993). Sorption of heavy metals to the filamentous

bacterium Thiothrix strains A1. Appl. Environ. Microbiol. 59, 1274 -1282.

SODDELL, J. Y SEVIOUR, R. J., (1990). A review: microbiology of foaming in activated

sludge plants. J. Appl. Bacteriol. 69: 145- 176.

TANDOI, V., CARAVAGLIO, N., DI DIO BALSAMO, D., MAJONE, M. Y TOMEI, M. C.

(1994). Isolation and physiological characterization of Thiothrix sp. Water Science and

Technology 29 (7), 261 -269.

Van der WAARDE, J.J., GEURKINK, B., HENSSEN, M. y HEIJNEN, G. (1998). Detection of

filamentous and nitrifying bacteria in activated sludge with 16S rRNA probes. Water

Sci. and Techn. Vol37, No 4-5pp 475-479. IWA Publishing 1998.

VAN DER WAARDE, J., KROONEMAN, J., GEURKINK, B., VAN DER WERF, A., EIKELBOOM,

D., BEIMFOHR, C., SNAIDR, J., LEVANTESI, C., TANDOI, V. (2002). Molecular monitoring

of bulking sludge in industrial wastewater treatment plants. Water Sci Technol 46, 551-

558

WAGNER, M., ASSMUS, B., HARTMANN, A., HUTZLER, P. y AMANN, R., (1994). In situ

analysis of microbial consortia in activated sludge using fluorescently labelled, rRNA-

targeted oligonucelotide probes and confocal scanning laser microscopy. J Microscopy

176, 181-187

WILLIAMS, T. M. y UNZ, R.F. (1985b) Isolation and characterization of filamentous

bacteria present in bulking activated sludge. Applied Microbiology and Biotechnology

22, 273 -282.



95

WILLIAMS, T.M. y UNZ, R.F. (1985a) Filamentous sulfur bacteria of activated sludge:

Charactization of Thiothrix, Beggiatoa, and Eikelboom Type 021N Strains. Applied and

Environmental Microbiology, Apr. 1985, p. 887-898.

WILLIAMS, T.M. y UNZ, R.F. (1989). The nutrition of Thiothrix type 021N, Beggiatoa

and Leucothrix strains. Water Res 23; 15-22.

WILLIAMS, T.M. y UNZ, R.F. y DOMAN, J.T. (1987). Ultrastructure of Thiothrix spp. and

type 021N bacteria. Appl. Environ microbiolo 53, 1560 -1570.

ZORNOZA, A. (2010 a). Curso Teórico-Práctico de Técnicas de Bioindicación y Control

de Procesos en EDAR. Ed. Grupo de Bioindicación de Sevilla. Valencia, España.

ZORNOZA, A., ALONSO, J., SERRANO, S., FAJARDO, V., ZORILLA, F., BERNÁCER, I.,

MORENILLA, J. (2010b).Estudio integrado del proceso de fangos activos I. Análisis

descriptivo de factores físico -químicos y biológicos implicados en su dinámica.

Documentación presentada en VII Jornadas de Transferencia de Tecnología sobre

Microbiología del Fango Activo. Sevilla, España.

ZORNOZA, A., (2011). Análisis de las correlaciones entre los parámetros operacionales,

físico-químicos y biológicos asociados al proceso de fangos activos. Universidad

Politécnica de Valencia. Valencia, España.


A n e x o s

96

8. Anexos

I. Vistas aéreas de las EDAR estudiadas

Figura 42: Vista aérea EDAR Carraixet

Figura 43: Vista aérea EDAR DENIA


A n e x o s

97

Figura 44: Vista aérea EDAR QUART

Figura 45: Vista aérea EDAR CASTELLÓN


A n e x o s

98

II. Relación fechas muestreo por depuradora

Tabla 27: Relación de muestras estudiadas. L.1: Línea 1; L.2: Línea 2; L(A+B): Línea A+B; L(C+D): Línea (C+D)

Castellón Carraixet Denia Quart

03/12/2008 L.1 03/06/2009 L.2 10/12/2008 L (A+B)

10/06/2009 L (C+D)

10/12/2008 04/12/2008

03/12/2008 L.2 17/06/2009 L.1 10/12/2008 L (C+D)

24/06/2009 L (A+B)

22/12/2008 17/12/2008

17/12/2008 L.1 17/06/2009 L.2 23/12/2008 L (A+B)

24/06/2009 L (C+D)

08/01/2009 14/01/2009

17/12/2008 L.2 01/07/2009 L.1 23/12/2008 L (C+D)

08/07/2009 L (A+B)

21/01/2009 28/01/2009

15/01/2009 L.1 01/07/2009 L.2 07/01/2009 L (A+B)

08/07/2009 L (C+D)

04/02/2009 11/02/2009

15/01/2009 L.2 15/07/2009 L.1 07/01/2009 L (C+D)

22/07/2009 L (A+B)

18/02/2009 25/02/2009

28/01/2009 L.1 15/07/2009 L.2 21/01/2009 L (A+B)

22/07/2009 L (C+D)

04/03/2009 11/03/2009

28/01/2009 L.2 09/09/2009 L.1 21/01/2009 L (C+D)

16/08/2009 L (A+B)

16/03/2009 28/03/2009

11/02/2009 L.1 09/09/2009 L.2 04/02/2009 L (A+B)

16/09/2009 L (C+D)

01/04/2009 07/04/2009

11/02/2009 L.2 23/09/2009 L.1 04/02/2009 L (C+D)

30/09/2009 L (A+B)

29/04/2009 22/04/2009

25/02/2009 L.1 23/09/2009 L.2 18/02/2009 L (A+B)

30/09/2009 L (C+D)

13/05/2009 06/05/2009

25/02/2009 L.2 07/10/2009 L.1 18/02/2009 L (C+D)

14/10/2009 L (A+B)

27/05/2009 20/05/2009

11/03/2009 L.1 07/10/2009 L.2 04/03/2009 L (A+B)

14/10/2009 L (C+D)

10/06/2009 03/06/2009

11/03/2009 L.2 21/10/2009 L.1 04/03/2009 L (C+D)

27/10/2009 L (A+B)

24/06/2009 17/06/2009

25/03/2009 L.1 21/10/2009 L.2 01/04/2009 L (A+B)

27/10/2009 L (C+D)

08/07/2009 01/07/2009

25/03/2009 L.2 04/11/2009 L.1 01/04/2009 L (C+D)

11/11/2009 L (A+B)

22/07/2009 15/07/2009

22/04/2009 L.1 04/11/2009 L.2 29/04/2009 L (A+B)

11/11/2009 L (C+D)

16/09/2009 09/09/2009

22/04/2009 L.2 18/11/2009 L.1 29/04/2009 L (C+D)

25/11/2009 L (A+B)

30/09/2009 23/09/2009

06/05/2009 L.1 18/11/2009 L.2 13/05/2009 L (A+B)

25/11/2009 L (C+D)

14/10/2009 07/10/2009

06/05/2009 L.2 16/12/2009 L.1 13/05/2009 L (C+D)

09/12/2009 L (A+B)

11/11/2009 21/10/2009

20/05/2009 L.1 16/12/2009 L.2 27/05/2009 L (A+B)

09/12/2009 L (C+D)

25/11/2009 04/11/2009

20/05/2009 L.2 29/12/2009 L.1 27/05/2009 L (C+D)

21/12/2009 L (A+B)

15/12/2009 18/11/2009

03/06/2009 L.1 29/12/2009 L.2 10/06/2009 L (A+B)

21/12/2009 L (C+D)

21/12/2009 16/12/2009


A n e x o s

99

III. Parámetros físico-químicos y variables de estudio

Tabla 28: Listado completo de los parámetros físico-químicos y las variables operacionales, nomenclatura y ubicación en el tratamiento

Parámetros Nomenclatura Aflu Eflu LM V.O. Unidades

Porcentaje de sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla

%SSVLM

x

%

Ácidos grasos volátiles AGV x

mg AGV/l

Carga Másica de Ácidos Grasos Volátiles CAGV x

KgAGV/kgSSVLM*d

Carbohidratos CARBO x

mg/l

Carga Másica de Carbohidratos CCARBO x

Kg Carbo/kgSSVLM*d

Carga Másica CM

x KgDBo5/kgSSVLM*d

Caga Másica de DBO CMDBO

x Kg DBO/kgSSVLM*d

Carga Másica DQOs CMDQOs

x Kg DQOs/kgSSVLM*d

Carga Másica del Nitrógeno Total CNT x

Kg Nt/kgSSVLM*d

Carga Másica del Nitrógeno Total soluble CNTs x

Kg NTs/kgSSVLM*d

Carga Másica del Nitrógeno Amoniacal CN_NH4 x

Kg NH4/kgSSVLM*d

Carga Másica del Fósforo Total CPT x

Kg Pt/kgSSVLM*d

Conductividad Cond

x

µS/cm

Carga Másica del Fósforo Total CPT x

Kg Pt/KgSSVLM*D

Carga Másica del Fósforo Total Soluble CPTs x

kg Pts/kgSSVLM*d

Carga Másica del Fósforo como ortofosfato

CP_PO4 x

kg P-PO4/kgSSVLM*D

Carga Másica de Proteínas CPROT x

Kg Prot/KgSSVLM*d

Carga Másica del sulfuro CS x

kg S/KgSSVLM*d

Carga Másica de sulfatos CSO4 x

KgSO4/KgSSVLM*d

Carga másica de Tensoactivos CTA x

KgTenso/KgSSVLM*D

Demanda Biológica de Oxígeno Total a los 5 días

DBO5

mg O2/l

Demanda Biológica de Oxígeno filtrada DBOF

x

mg O2/l

Demanda Biológica de Oxígeno Total DBOT x

mg O2/l

Demanda Biológica de Oxígeno soluble DBOS mg O2/l

Relación Demanda Biológica de Oxígeno/ Nitrógeno Kjeldahl

DBO5/NKT x

-

Relación Demanda Biológica de oxígeno/ Fósforo Total

DBO5/PT x

-

Relación Demanda Biológica de oxígeno/ Fósforo total soluble

DBO5/PTS -

Demanda Química de Oxígeno total efluente

DQOT x

mg O2/l

Demanda Química de Oxígeno total licor mezcla

DQOTLM

x

mg O2/l

Demanda Química de Oxígeno Soluble efluente

DQOS

x

mg O2/l

Relación Demanda Química de Oxígeno/ Nitrógeno Kjeldahl Soluble

DQOs/NKTs x

-

Relación Demanda Química de oxígeno/ Fósforo total soluble

DQOs/PTs x

-

Relación Demanda Química de Oxígeno x Demanda Biológica de Oxigeno

DQOxDBO x

-

Demanda Química de Oxígeno del Licor Mezcla

DQOLM

x

mg O2/l


A n e x o s

100

Edad del Fango EF

X Días

Índice Volumétrico de Fango IVF

X

ml/g

Nitrógeno Orgánico soluble N_orgs x

mg N/l

Nitrógeno Orgánico particulado N_orgp x

mg N/l

Nitrógeno Orgánico N_org x

mg N/l

Nitrógeno Total NT x

mg N/l

Nitrógeno Total de Licor Mezcla NTLM

x

mg /gSSTLM

Nitrógeno Total Soluble NTs x

mg N/l

Nitrógeno Total de los Sólidos suspendidos volátiles del Licor mezcla

NT-SSVLM

x

mg NSSVLM/l

Oxígeno Disuelto bajo ODb

X %

Oxígeno Disuelto Medio Odm

X %

Oxígeno Disuelto Alto ODa

X %

pH pH

x

-

Proteínas PROT x

mg/l

Fósforo Orgánico P_org x

mg P/l

Fósforo Orgánico particulado P_orgp x

mg P/l

Fósforo relativo al Ortofosfato P_PO4 x

mg P/l

Fósforo Total PT x

mg P/l

Fósforo Total Soluble PTs x

mg P/l

Fósforo Total del Licor Mezcla PTLM

x

Mg PSSVLM/l mg/g SSLM

Fósforo Total Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla

PT-SSVLM

x

mg P/l

Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno filtrada

rDBOf

x

-

Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno Total

rDBOT

x

-l

Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno Total

rDQOt

x

-

Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno Soluble

rDQOs

x

-

Rendimiento de eliminación de los sólidos suspendidos totales

rSST

x

-

Sólidos en suspensión del Licor Mezcla SSLM

x

mg/l

Sólidos Suspendidos totales del efluente SSTefl

x

mg/l

Sólidos en suspensión volátiles del Licor Mezcla

SSVLM

x

mg/l

Sulfatos Sulfa x

mg/l

Sulfuros Sulfu x

mg/l

Temperatura del reactor biológico Tªr

x ºC

Tensoactivos Tensan x

mg/l

Tiempo de retención hidráulico en el reactor biológico

TRHr

x Horas


A n e x o s

101

IV. Rangos de los parámetros operacionales y físico-químicos

Tabla 29: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del afluente por depuradora

EDAR QUART DENIA CASTELLÓN L1 CASTELLÓN L2 CARRAIXET L1 CARRAIXET L2

Características INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV

FÍSI

CO

– Q

UÍM

ICO

AFL

UEN

TE

NT 31.5-83.5 53.6±17 26.00-103.00 52.05±17.96 36.00-80.00 58.47±10.55 39.00-92.00 61.65±13.91 19.95-88.80 47.65±17.67 19.95-88.80 47.65±17.67

CNT 0.03-0.10 0.05±0.02 0.01-0.06 0.03±0.01 0.04-0.14 0.09±0.02 0.05-0.16 0.09±0.03 0.04-0.19 0.12±0.05 0.04-0.19 0.12±0.05

Nts 24.0-72.0 43.4±15.7 17.80-63.30 39.79±12.68 35.00-78.00 51.08±9.69 35.00-87.00 51.47±14.81 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

CNTs 0.02-0.08 0.04±0.02 0.02-0.04 0.03±0.01 0.04-0.14 0.08±0.02 0.03-0.15 0.07±0.02 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

N_NH4 24.0-62.2 40.3±12.1 5.30-56.00- 27.33±12.67 32.00-66.00 46.56±7.06 32.00-66.00 45.43±9.53 7.08-40.95 25.66±7.47 7.08-40.95 25.66±7.47

%N-NH4 66.1-88.3 75.8±6.24 29.77-94.16 65.43±19.39 72.86-91.30 80.07±5.14 52.17-86.04 74.41±8.10 35.49-86.63 55.97±13.56 35.49-86.63 55.97±13.56

CN-NH4 0.02-0.08 0.04±0.01 0.00-0.03 0.02±0.01 0.03-0.11 0.07±0.02 0.03-0.11 0.06±0.02 0.01-0.10 0.06±0.02 0.01-0.10 0.06±0.02

N_orgs 0.00-13.7 5.26±4.18 1.70-31.20 13.19±8.25 0.00-12.00 4.52±3.94 0.00-21.00 6.04±5.84 3.60-57.10 22.00±13.19 3.60-57.10 22.00±13.19

N_orgp 0.50-15.0 8.22±3.07 0.00-42.00 12.31±12.13 1.00-16.00 7.39±4.22 0.00-34.00 10.17±8.02 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

N_org 4.40-23.9 13.48±5.86 10.10-47.00 25.37±11.73 4.00-19.00 11.91±4.23 6.00-44.00 16.21±7.81 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

PT 3.10-9.70 5.24±1.96 0.76-8.24 4.79±1.83 5.00-20.00 10.47±3.59 4.70-31.00 11.91±5.47 1.85-13.40 6.26±2.92 1.85-13.40 6.26±2.92

CPT 1.81-8.99 4.79±2.04 0.69-5.95 3.46±1.12 5.94-36.77 16.39±6.22 7.40-34.94 17.76±8.03 3.77-30.12 15.20±6.98 3.77-30.12 15.20±6.98

PTs 1.00-5.50 2.84±1.31 0.63-7.50 3.97±1.89 4.30-19.00 8.82±3.43 3.30-17.00 8.50±3.44 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

CPTs 0.72-5.70 2.60±1.33 0.57-5.14 2.82±1.23 4.56-34.93 13.82±5.95 5.55-24.66 12.49±4.66 0.00-0.00 . 0.00-0.00 .

P_PO4 1.00-4.80 2.52±1.22 0.19-5.20 2.98±1.71 3.92-16.35 7.78±3.00 3.27-17.00 7.87±3.27 1.09-9.36 4.68±1.99 1.09-9.36 4.68±1.99

%P_PO4 32.25-80.55 47.00±10.95 5.37-93.19 60.36±24.62 50.53-96.88 74.47±10.73 29.53-98.10 68.96±17.58 58.65-92.29 75.70±8.77 58.65-92.29 75.70±8.77

CP_PO4 0.72-5.36 2.31±1.27 0.16-4.44 2.15±1.28 4.16-30.06 12.11±4.98 4.92-19.49 11.56±4.25 2.21-19.27 11.40±4.82 2.21-19.27 11.40±4.82

Porg 0.00-1.10 0.28±0.22 0.01-3.74 1.19±1.23 0.00-3.34 1.03±0.91 0.00-2.51 0.64±0.68 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

P_orgp 0.50-4.30 2.41±0.89 0.00-3.66 0.99±0.93 0.20-6.50 1.65±1.27 0.00-20.00 3.40±4.13 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -


A n e x o s

102

Tabla 30: Media, desviación estándar e intervalos del afluente continuación



FÍSI

CO

– Q

UÍM

ICO

AFL

UEN

TE

DBO5/NKT 2.65-7.93 4.54±1.14 1.15-6.61 3.12±1.21 1.64-4.67 3.07±0.76 1.48-6.67 3.20±1.17 2.16-5.37 3.11±0.70 2.16-5.37 3.11±0.70

DQOs/NKTs 2.88-10.12 4.86±1.52 1.34-4.24 2.59±0.83 1.62-4.88 3.29±0.83 1.56-4.48 2.88±0.79 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

DBO5/PT 27.27-97.87 48.76±13.97 17.74-46.51 33.95±6.67 5.00-20.00 10.47±3.59 7.85-40.42 18.27±8.37 16.67-41.13 24.43±5.95 16.67-41.13 24.43±5.95

DQOs/PTs 32.97-138.70 83.76±32.97 6.33-49.76 29.98±11.68 9.64-37.74 20.33±6.65 9.53-36.09 18.50±6.53 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

Sulfu 0.05-0.00 0.02±0.1 0.02-30.90 3.68±7.52 0.40-9.00 1.78±2.16 0.40-15.00 2.36±3.53 0.00-0.24 0.02±0.06 0.00-0.24 0.02±0.06

CS 0.00-0.00 - 0.02-16.35 2.29±4.43 0.04-14.98 3.02±3.76 0.36-14.43 3.08±3.71 0.00-0.46 0.03±0.12 0.00-0.46 0.03±0.12

Sulfa 159.0-293.0 221.04±34.63 131-383 248.52±65.42 182.0-375.0 266.08±50.49 154-376 265.17±51.74 183.00-429.3 339.94±58.18 183.00-429.3 339.94±58.18

CSO4 0.11-0.33 0.20±0.05 0.10-0.31 0.18±0.05 0.22-0.58 0.42±0.09 0.14-0.70 0.41±0.14 0.43-1.38 0.83±0.25 0.43-1.38 0.83±0.25

Tensan 1.23-7.50 3.27±1.82 0.00-0.00 - 1.50-7.00 4.53±1.13 1.10-12.00 4.53±2.29 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

CTA 0.87-10.20 3.09±2.17 0.00-0.00 - 1.50-9.98 7.11±1.81 1.38-12.54 6.58±2.70 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -

CARBO 5.00-15.00 8.67±3.00 2.00-10.00 4.56±1.80 5.00-12.00 7.04±1.79 4.00-10.00 6.52±1.67 2.00-34.00 7.00±6.35 2.00-34.00 7.00±6.35

CCARBO 3.74-19.34 8.37±4.16 1.92-10.44 3.41±1.75 6.67-22.06 11.27±3.59 5.23-19.39 9.97±3.69 4.06-59.57 16.71±11.63 4.06-59.57 16.71±11.63

PROT 30.00-111.0 62.33±21.30 4.00-57.00 30.43±16.52 40.00-80.00 56.04±11.20 38.00-95.00 55.30±13.52 9.00-75.00 39.00±14.63 9.00-75.00 39.00±14.63

CPROT 25.17-140.50 59.92±29.18 3.59-40.13 21.36±9.77 46.9-147.08 89.98±24.02 41.25-153.20 85.19±30.45 18.33-153.84 94.55±37.49 18.33-153.84 94.55±37.49

AGV 0.00-169.00 27.78±42.05 0.00-30.80 2.47±7.08 0.00-79.60 26.13±27.10 0.00-78.7 29.84±24.36 0.00-45.00 3.62±10.04 0.00-45.00 3.62±10.04

CAGV 0.00-279.19 31.32±62.44 0.00-16.29 1.43±3.92 0.00-127.23 40.55±41.35 0.00-107.08 44.53±34.57 0.00-108.65 8.61±23.64 0.00-108.65 8.61±23.64


A n e x o s

103

Tabla 31: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del licor mezcla por depuradora



FÍSI

CO

– Q

UÍM

ICO

LIC

OR

MEZ

CLA

pH 7.05-7.79 7.44±0.18 6.92-8.00 7.40±0.26 6.85-7.60 7.19±0.20 6.85-7.60 7.19±0.21 7.00-7.88 7.44±0.20 7.08-7.76 7.46±0.15

Cond 1330-2740 2043.4±433.6 986-5440 2783±1050 1895-4840 2906±690.5 1895-4840 2906±690.5 946.0-2540.0 1625±351.23 984-2150 1607±299.00

SSLM 1790-3120 2435.2±373.4 2500-3780 3225±289 2460-6800 4126±1156 2460-6800 4126±1156 1100-2980 1938±549.07 1080-2770 1831±450.00

SSVLM 1455-2490 1924.17±288.5 1790-2730 2238±229.9 1490-4920 2996±890.1 1490-4920 2996±890.1 905.0-2410.0 1605.4±435.5 900.00-2290 1513±364.00

%SSVLM 68.00-87.00 79.08±3.71 62.00-74.80 69.38±3.31 461.00-81.00 72.22±4.74 61.00-81.00 72.20±4.74 70.00-91.00 83.09±4.60 73.00-88.00 83.00±4.00

IVF 59.00-167.00 119.38±27.62 103.3-234.1 143.0±32.62 64.00-160.0 108.7±28.73 64.00-160.00 108.7±28.72 71.43-231.18 120.83±45.27 76.00-286.00 131.00±60.00

NT SSVLM 41.06-107.55 71.93±20.95 31.08-78.15 57.49±11.49 31.02-109.09 51.91±23.12 31.00-109.09 51.92±23.12 72.14-140.29 95.94±18.27 67.00-138.00 96.00±18.00

PT SSVLM 18.66-40.44 29.63±5.45 25.91-42.75 35.07±3.70 27.05-76.17 56.96±12.72 27.05-76.17 56.96±12.72 18.73-38.56 24.32±4.83 20.00-40.00 26.00±5.00

DQOtLM 1.25-1.63 1.42±0.09 2862-3885 3270±297.3 1.30-1.53 1.42±0.06 1.30-1.53 1.42±0.06 1.21-1.54 1.38±0.09 1.15-1.67 1.39±0.11

Tª LM 14.40-28.50 21.44±3.72 10.80-25.50 18.49±4.23 15.4-29.1 22.08±4.05 15.40-29.10 22.08±4.05 15.00-26.60 20.21±3.51 15.00-26.00 20.00±4.00


A n e x o s

104

Tabla 32: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del efluente por depuradora



FÍSI

CO

– Q

UÍM

ICO

EFLU

ENTE

SSTefl 4.00-211.00 48.33±59.23 1.00-10.00 3.95±2.42 5.70-92.00 24.06±25.58 5.00-177.00 24.40±38.07 5.00-25.00 10.00±5.00 4.67-25.00 10.02±5.24

rSST 0.00-95.38 66.66±33.70 94.92-99.49 97.74±1.33 0.00-95.84 77.99±27.93 0.00-97.96 82.20±26.95 88.00-99.00 93.00±3.00 87.75-98.75 92.93±2.87

DQOt 38.00-352.00 101.88±85.55 13.20-31.40 22.60±4.81 20.00-214.00 57.87±48.60 26.00-361.00 58.39±74.93 25.00-63.00 39.00±11.00 25.15-62.85 38.93±10.88

rDQOt 35.65-91.29 75.99±15.76 68.19-96.76 90.47±6.19 36.31-93.61 83.05±15.61 0.00-94.31 83.77±21.72 70.00-95.00 86.00±5.00 70.49-94.77 86.48±4.76

DQOs 34.00-96.00 48.38±13.19 12.90-30.50 20.11±4.73 20.00-97.00 34.35±16.34 23.00-40.00 29.96±3.94 13.00-37.00 25.00±5.00 12.80-36.60 25.49±5.50

rDQOs 52.94-88.68 74.66±9.59 62.18-96.00 83.21±8.32 0.00-89.59 76.40±19.17 37.50-90.04 75.34±13.48 44.00-90.00 70.00±9.00 43.86-90.23 69.50±9.38

DBOf 2.00-19.00 6.19±4.54 4.00-9.00 5.82±1.43 57.69-96.84 87.94±10.35 57.69-96.84 87.94±10.35 19.00-41.00 29.00±6.00 19.00-41.00 29.00±6.00

rDBOf 75.71-98.00 94.22±5.48 80.00-96.00 91.37±4.55 43.21-90.04 78.19±11.01 43.21-90.04 78.19±11.01 29.00-85.00 70.00±12.00 29.00-85.00 70.00±12.00

DBOt 4.00-49.00 17.45±13.12 4.00-9.00 6.47±1.41 4.00-110.00 18.87±24.16 4.00-110.00 16.39±23.26 4.00-14.00 8.00±3.00 4.00-14.00 8.34±2.66

rDBOt 72.78-97.71 92.56±5.74 86.66-97.94 95.19±2.41 15.35-98.26 88.13±17.79 0.00-98.18 89.51±20.18 83.00-97.00 94.00±3.00 83.00-97.39 93.51±2.96

Tabla 33: Media, desviación estándar e intervalos de las variables operacionales por depuradora



VA

RIA

BLE

S

OP

ERA

CIO

NA

LES

CM 0.09-0.85 0.25±0.16 0.03-0.19 0.11±0.04 0.10-0.56 0.30±0.11 0.10-0.56 0.30±0.11 0.10-0.51 0.33±0.12 0.10-0.51 0.33±0.12

CMDBO 0.08-0.47 0.20±0.09 0.03-0.19 0.13±0.04 0.15-0.53 0.27±0.10 0.15-0.53 0.27±0.10 0.12-0.43 0.29±0.09 0.12-0.43 0.29±0.09

CMDQOs 0.10-0.49 0.18±0.09 0.03-0.12 0.09±0.02 0.10-0.36 0.21±0.05 0.10-0.36 0.21±0.05 0.08-0.29 0.17±0.05 0.08-0.29 0.17±0.05

TRHr 13.48-21.90 16.83±1.74 12.35-18.86 14.89±1.92 4.87-6.23 5.40±0.38 4.87-6.23 5.40±0.38 5.27-6.85 6.42±0.37 5.27-6.85 6.42±0.37

EF 5.24-28.97 10.57±5.69 10.02-30.45 17.17±5.38 3.12-13.36 7.30±2.74 3.12-13.36 7.30±2.74 3.30-21.70 7.52±5.18 3.30-21.70 7.52±5.18

ODb 4.63-69.44 33.47±18.33 64.48-37.11 55.42±6.48 0.00-50.36 22.28±13.51 0.00-50.36 22.28±13.51 0.00-10.41 0.72±2.38 0.00-10.41 0.72±2.38

ODm 11.81-95.14 61.11±19.62 20.63-38.04 30.22±3.82 20.95-49.19 49.19±20.95 20.95-49.19 49.19±20.95 0.00-23.43 3.62±6.08 0.00-23.43 3.62±6.08

ODa 0.00-40.39 5.43±9.96 7.70-42.26 14.38±7.02 13.29-73.50 39.36±8.53 13.29-73.50 39.36±8.53 66.14-100 95.97±8.45 66.14-100 95.97±8.45

Tº r 28.5-14.4 21.44±3.72 10.80-25.50 18.50±4.23 15.40-29.10 22.09±4.05 15.40-29.10 22.09±4.05 15.00-26.60 20.21±3.51 15.00-26.60 20.21±3.51


A n e x o s

105

V. Preparación de los reactivos para la técnica FISH

A continuación se describe el protocolo de preparación de los reactivos necesarios en

los procesos de fijación, lavado e hibridación.

Paraformaldehido (para fijación)

o Calentar 65 ml de agua bidestilada hasta 60ºC

o Añadir 4 g de paraformaldehido (PFA)

o Añadir 1 gota de una solución de NaOH 2M y agitar rápidamente hasta

que la solución se haya clarificado.

o Quitar de la fuente de calor y añadir 33 ml de PBS 3X

o Ajustar el pH a 7,2 con HCl

o Eliminar cualquier resto de cristales por filtración a través de 0,2µm

o Enfriar rápidamente a 4ºC y conservar a esta temperatura

Tampón fosfato salino (para fijación)

o Concentración PBS 1X (para fijación, resuspensión)

NaCl 7,60 g

NaH2PO4 H20 1,38 g

Na2HPO4 H20 1,78 g

Agua destilada 1000 ml

pH 7,2

o Concentración PBS 3X (para fijación Inicialmente)

NaCl 22,8 g

NaH2PO4 H20 4,1 g

Na2HPO4 H20 5,3 g

Agua destilada 1000 ml

pH 7,2

Preparación: Primero disolver los fosfatos y luego el cloruro sódico.

Esterilizar por filtración 0,45µm o 0,2 µm y conservar a 4ºC

Solución de gelatina (para preparación de portaobjetos)

o Gelatina………………………………….0,1%

o Sulfato potásico cromato……….0,01% (sigma ref C-59236,12 H2O)

Calentar previamente el agua destilada hasta 60ºC

Fundir la gelatina (100 mg 0,1% + 10mg sal de cromato 0,01 %)

en 100 ml de agua destilada

Enfriar a 50ºC para sumergir los portar.

Solución de limpieza de portaobjetos (para preparación de portaobjetos)


A n e x o s

106

o Etanol con 10% KOH

Etanol (para deshidratación)

o 50%

o 80%

o 100%

Cloruro sódico 5M (para tampón de hibridación y tampón de lavado)

o Cloruro sódico ……………………………………292,2g

o Agua destilada……………………………………1000 ml

Disolver el NaCl en 800 ml de agua destilada y ajustar el volumen hasta

1 litro. Distribuir en alícuotas. Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15

minutos y por filtración.

EDTA 0,5M (cuando la concentración de formamida es mayor o igual a 20%)

o EDTA 2 H2O…………………………………………186,1g

o Agua destilada ……………………………………hasta 1000ml

Preparación: pesar el EDTA y añadir a 800 ml de agua destilada. Ajustar

el pH a 8,0 NaOh (el reactivo no se disuelve hasta ajustar el pH a 8,0).

Completar hasta 1000 ml con agua destilada. Esterilizar en autoclave

121ºC durante 15 minutos y por filtración.

Tris –HCl pH 8,0 (Tampón de hibridación y tampón de lavado)

o Tris Base……………………………………………121,1g

o H-Cl……………………………………………………..42 ml de HCl concentrado

o Agua destilada……………………………………Hasta 1000 ml

Preparación: pesar el Tris y añadir a 800 ml de agua destilada. Añadir 42

ml de HCl concentrado y completar hasta 1000ml con agua destilada.

Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y filtración.

SDS 10% (para tampón de hibridación y tampón de lavado)

o SDS ……………………………………………………..10g

o Agua destilada ……………………………………hasta 100 ml

Esterilizar por filtración

Agua Mili-Q

Reactivo de montaje

o Vectashield, evita la pérdida de fluorescencia en el montaje de las

muestra para observación en el microscopio.


A n e x o s

107

VI. Resumen del articulo presentado en V International Conference on

Environmental, Industrial and Applied Microbiology. Madrid,

Spain/ 2-4 October 2013

Identification and abundance of Thiothrix in wastewater treatment

plants treating domestic wastewater using fluorescence in situ

hybridization

V. Romera, A. Zornoza, and J.L. Alonso 1Instituto Universitario de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente, Universitat Politècnica de València,

46022 Valencia, Spain

Bacteria that belong to the genus Thiothrix are characterized by distinctive morphological

features, such as filamentous growth and accumulation of sulphur granule when incubated in

the presence of sulphide or thiosulphate. The Thiothrix morphotypes occur in municipal and

industrial WWTPs with and without nutrient removal [1]. Traditionally, the problems of

biological bulking have been monitored by classical microscopy such as morphological

observation and polychromatic staining [2]. Few works have been carried out for the

detection of Thiothrix in WWTP samples with molecular procedures such as the fluorescence

in situ hybridization (FISH) technique. In this study, we investigated several Spanish

WWTPs with the FISH technique to analyze the composition of Thiothix species and their

relathionships with physico-chemical and operational parameters. Samples of activated

sludge were collected from four Spanish WWTPs and analyzed by light microscopy and

quantitative FISH. In the FISH analysis a set of 10 rRNA-targeted nucleic acid FISH probes

covering Thiothrix genus and species were used. The abundance of filamentous bacteria in the

139 activated sludge samples was measured according to the subjective scoring method of

Eikelboom (2000) where observations are rated on scale from 0 (none) to 5 (extensive

growth). Thiothrix filaments were present in the four WWTP analyzed. In 92 (66,2 %) of the

samples, Thiothrix filaments were observed with the probe G123T. It was evident that

mixed populations of Thiothrix spp. were present in the activated sludge samples investigated,

the observed differences were in the relative abundance of the various groups. These findings

were supported by the results obtained using conventional microscopy. T. eikelbomii, T. nivea

and T. fructosivorans were common (FI>3) in two of the four WWTP analyzed. No

fluorescence signal was detected with the probes G1B (T. disciformis), G3M (T. defluvii) and

Meg1028+Meg 983 (Meganema perideroedes). Redundancy analysis (RDA) ordination

diagram (biplot) suggested different behaviour among species within genus Thiothrix. T.

eikelbomii showed a positive relationship with the reactor temperature (Tr). Conversely, T.

fructosivorans was negatively related with Tr. T. nivea and T. fructosivorans were associated

with high sludge retention time (SRT) values and low values of organic loading rate (OLR).

T. nivea showed a positive relationship with the hydraulic retention time (HRT) and negative

with the influent carbohydrates and proteins. T. eikelbomii and T. nivea were associated with

nitrogen and phosphorus deficit (BOD5/TN/TP).

Keywords Thiothrix, WWTP, FISH, activated sludge, bulking

References

[1] Eikelboom D (2000) Process control of activated sludge plants by microscopic investigation. IWA

Publishing, London, England.

[2] Jenkins D., Richard M., Daigger G. (2004) Manual on cases and control of activated sludge bulking

and foaming. Lewis Publishers, Chelsea, Michigan.

2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la...

Environment

Transcript of 2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la...