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MPMI Vol.12, n 8, 1999, pp. 720-727. Publicacin no. M-1999-0524-01R.

La resistencia sistmica en Arabidopsisinducida por Ethylene-Dependent

Rhizobacteria requiere la sealizacin en ellugar de la aplicacin

Marga orn !noester"# M$ %$ &ieterse"# %uan '$ (ol") y Leendert $ *an Loon#

1Instituto d !iolo"#a, $ccin %itopatolo"#a d la &ni'(sidad d &t(c)t, P.*. !o+ 80084, 508 !, &t(c)t.

os Pa#ss !a/os 2Instituto d incias Molcula( V"tal, labo(ato(ios o(laus, idn &ni'(sit3,

P.*. !o+ 9502, 200 R idn, Pa#ss !a/osacpta(on l 2 d ab(il d 1999.

La colonizacin radicular deArabidopsis thaliananopatgenas, por la rizosfera-colonizar, biocontrol

bacteriaPseudomonas fluorescensWCS417R se hamostrado para obtener la resistencia sistmicainducida !"SR# contraPseudomonassyringaep$% Tomate!&S'#% La respuesta de "SRdifiere del patgeno-inducible de la resistenciasistmica ad(uirida !S)R# en respuesta (ue el "SR esindependiente del *cido salic+lico no asociados conprote+nas relacionadas con la patognesis% arios deetileno-respuesta mutantes fueron probados demostraron esencialmente normales los s+ntomas deinfeccin de &S'% "SR (ued abolida en el etileno-mutante insensible etr1-1, mientras (ue el S)R no fueafectado% Se obtu$ieron resultados similares con eletileno-insensible mutantes ein2por ein7,indicando(ue la e.presin de "SR re(uiere la $+a detransduccin de se/al completa de etileno conocidahasta el momento% La induccin de "SR por WCS417rno fue acompa/ada por un aumento de la produccinde etileno en ra+ces u ho0as, ni por los aumentos en lae.presin de los genes (ue codifican para las enzimasde bios+ntesis de etileno 1-aminocclopropane-1carbo.+lico sintasa !C)C# la )CC-o.idasa%LaEIR1 mutante, mostrando insensibilidad deetileno en las ra+ces slo, no e.presan el "SR, pre$iasolicitud de la CC417r a las ra+ces, pero no e.hiben"SR cuando las bacterias (ue pro$ocan se infiltraronen las ho0as% 2stos resultados demuestran (ue, para lainduccin de "SR, el etileno se re(uiere fle.ibilidad enel lugar de la aplicacin de inducir rhizobacteria%

Palabras clave adicionales:la mancha bacterianaenfermedad, respuesta de etileno mutantes.

Resistencia inducida es el fenmeno por el cual unaplanta, tras la estimulacin adecuada, adquiere un mayor

nivel de resistencia frente a un amplio espectro deagentes patgenos. La forma clsica de obtenerresistencia inducida se logra por la infeccin con un

patgeno necrotizante, sobre la cual la planta se vuelvems resistente al ataque de patgenos posteriores, tantoen el plano local y sistmica. Este tipo de resistencia

inducida se denomina resistencia sistmica adquirida!"R# y primero fue caracterizado en tabacoinfectados con el virus del mosaico del tabaco $% Ross '()' a, '()'b#. *nducida por el patgeno !"Rest acompa+ado por un pronto aumento de cidosaliclico !"# %alamy et al. '((- %trau/ et al.'((-#. "cumulacin de sa es esencial para el desarrollode la R"E, desde plantas transgnicas que son capacesde acumular !" han perdido su capacidad de e/presar el!"R 0affney et al. '((1#. *nfeccin de una planta porun patgeno necrotizante tambin est acompa+ada poruna rfaga de produccin de etileno Ross y 2illiamson,'(3' de Laat y &an Loon '(45 %auch et al. '(46!panu y espectrgrafo 7oller, '(4(#. El papel del etilenoen la R"E parece ser dependientes de las especiesvegetales. En la "rabidopsis, La8ton et al. '((3#mostraron que el etileno9insensible etr1-1 mutantes es

plenamente capaz de montar una respuesta de !"R. Encontraste, en plantas de tabaco transgnicas que e/presanel gen mutante de "rabidopsis etr'9', una reduccinsustancial de la !"R se observ respuesta :noester'((4#. !"R est asociada con la e/presin de losllamados genes !"R 2ard et al. '(('#, incluidos losgenes que codifican para las protenas relacionadas conla patognesis ;Rs# &an Loon Linthorst '(43 '(('#,que a menudo se utilizan como marcadores para el estadoinducido. "plicacin e/gena de los qumicos !", 5,)9cido dichloroisonicotinic *


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st a(t#culo st n l do6inio pblico 3 no cop3(i")tabl. Pud s(lib(6nt (p(oducido con ac(ditacin )abitual d la %unt. a$ocidad 6(icana d :itopatolo"#a, 1999.

I pepino 2ei et al. '(('#. ;ara distinguir esta mayorcapacidad defensiva de !"R, inducida por el patgeno dela proteccin inducida se denomin rhizobacteriainducida mediada por la resistencia sistmica *!R#

;ieterse et al. '(() &an Loon, '((H &an Loon et al.'((4#. *nvestigaciones previas sobre ;0;R hademostrado su capacidad para el control de patgenos delsuelo por la competencia por nutrientes siderophorecompetencia mediada por el hierro, o antibiosis 7a??eret al. '((' '((5 $homasho8 !chippers y 2eller,'(()#. *!R fue encontrado para constituir un nuevomecanismo por el cual estos rhizobacteria puede suprimirlas enfermedades de las plantas. %ayor resistencia a lasenfermedades es inducido independientemente de si elrhizobacteria se aplican a las races o las ho=as Jofflandet al. '((3 ;ieterse et al. '(()#.

%ediada Rhizobacteria *!R difiere del !"R inducidapor el patgeno en varias maneras. "l contrario de lo queocurre con el !"R, el *!R no es acompa+ada por la

acumulacin de ;Rs Joffland et al. '((3 ;ieterse et al.'(() &an 2ees et al. '((H#. "dems, se demostr por;ieterse et al. '(()# que en la "rabidopsis *!R esindependiente de sa acumulacin. Duando la respuesta deetileno mutante de etr1-1fue utilizado, se constat queesta mutante haba perdido la capacidad de ser inducida

por rhizobacteria ;ieterse et al. '((4#, mientras quetodava era capaz de e/presar !"R La8ton et al. '((6;ieterse et al. '((4#. ;or lo tanto, la capacidad derespuesta a etileno parece ser necesario para la induccinde *!R. ;or el contrario, el tratamiento de la "rabidopsiscon el precursor de etileno '9aminocyclopropane9'9carbo/lico "DD# resistencia inducidacontraPseudomonas syringaepv. Tomate ;!$#,

indicativa de un papel de etileno en la va de transduccinde se+al de *!R.!e+alizacin de etileno se ha estudiado e/tensivamente

en "rabidopsis con mutantes que se encuentran alteradosen la triple respuesta fenotipo de oscuro plntulascultivadas en la presencia de etileno. Daractersticas de latriple respuesta inducida por etileno incluyen lainhibicin de la raz y el hipoctilo alargamiento, radialhinchazn del hipocotilo y raz, y la e/ageracin de lacurvatura del gancho apical. &arios mutantes estabanaisladas que no responden al etileno e/geno, oconstitutivamente mostrar la respuesta en ausencia de lahormona 0uzmn y Ec?er, '((-#. Esto result en laidentificacin de varios genes que constituyen una va detransduccin de la se+al que se aseme=a a la osmolaridad

respuesta va en levaduras Bta y &arshavs?y '((1%aeda et al. '((6#. Los primeros pasos en el camino sondefinidos por el tipo de receptor de etileno E$R', E*@D ml9' devirulentos de ;!$. En nuestros e/perimentos,ein2-1desarrollado sntomas claros, despus de que las plantasse sumergen en una suspensin de 5,3 K '-H >@D ml9

+)# Plant-Mic(ob Int(accions 6olcula(s


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' de virulentos de ;!$. "unque la aparicin de lossntomas es diferente de las de Dol9- que de=a carecan dela caracterstica coloracin amarillenta, claramentevisible empapado de agua eran lesiones aparentes.El ein3-1plantas tambin mostraron lesiones empapadode agua, aunque menos evidentes que aquellas en ein2-1plantas, con ms de amarillamiento. La otra respuestade etileno mutantes probado, e/cepto ein6# a"r1-

12#y ctr1-1# mostr sntomas similares a la enfermedade/tensa Dol9- yetr11plantas. %utantes ein6 y a"r1-12 apenas desarrollado sntomas incluso despus de lainoculacin con ',53 K '-4 >@D ml9' de virulentos de;!$.

Ctr mutante1-1constitutivamente muestra respuestasde etileno. En esta mutante, ;st infeccin no tuvo comoresultado la formacin del sntoma. ;ara analizar si lafalta de formacin de los sntomas fue causado por unaincapacidad de ;!$ para entrar y se multiplican enel CTR1-1 de=a el nmero de bacterias se determininmediatamente despus del desafo de la inoculacinmediante inmersin y 6 das ms tarde. En 8ild9type9-Dol, ;st aument de ',H3 K '-3 >@D 09' peso fresco tM-# a ',5 K '-H >@D 09' tM 6 das#. En ctr1-1# estos

valores fueron de 6,( / '-3 y 6,H / '-H >@D 09',respectivamente, lo que representa un aumento del mismoorden de magnitud que en Dol9- plantas, indicando que lafalta de sntomas en plantas ctr'9' no fue causado por lareduccin de la entrada o crecimiento de ;!$ en lasho=as. "dems de la falta de sntomas, el fenotipoe/tremadamente peque+a dectr1-1#debido a su triplerespuesta constitutiva, dict esta mutante inadecuados

para ensayos adicionales.

)n*lisis de "SR S)R en el etileno mutantes%

;ara investigar qu partes de la ruta signaltransductionde etileno son necesarios para la resistencia inducida, lae/presin de *!R y !"R fue probado en etr1-1#la

ethyleneinsensitiveeinmutantes, y el etileno etoover$roducer1-1.

;ara 8ild9type9- Dol, induccin de *!R por 2D!6'HRse tradu=o en entre el 5- y el 1-N menos de las ho=asenfermas. La induccin de la R"E fue ms efectivo queel de *!R, resultando en una reduccin de la proporcinde las ho=as enfermas en un 3-N.


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3ig% 1% Lacuantificacin de la resistencia sistmica inducidacontraPseudomonas syringaepv.tomatoinfeccin en Dol9- yetileno mutantes cultivadas en suelo modificada con '- m%%g!B6 Dtrl# oP' (luorescens 2D!6'HR 6'Hr#, o la presininfiltrado en las ho=as con el avirulent P'

syringaepv. Tomateavr;!$#. Duatro das despus de lainoculacin con desafo virulentos deP'

syringaepv.tomato# severidad de la enfermedad fue anotado pordeterminar por ciento las ho=as enfermas por planta. La enfermedades la media de ndice nM 5-# del porcenta=e de ho=as enfermas por

planta con relacin al control del tratamiento. &alores absolutos delos porcenta=es de las ho=as enfermas en controlesC Dol9-35,1#,ETR1-1)6,(#, ein2-1)5,3#, ein3-1 33,4#, ein4-134,3#, ein5-1H',1#, ein61'.'#,einH),6# y eto1131.-#. Gentro de cadafotograma, letras diferentes indican diferencias estadsticamentesignificativas entre los tratamientos con la mnima diferenciasignificativa de @isher $est M -,-3#.

1#y eto1-1@ig. 1#. Domo era de esperarse, noninducedDol9B y eir1-1las plantas mostraron un mayor nivel

basal de &ella e/presin gnica de etileno9insensible ein2-1. E/presin aument significativamentea solicitud del D"D a col9- y eir1-1#pero


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LaE%R1-1 igualmente mutantes mostraron una reduccinde hasta el 53 N, mientras que el *!R no significativa fuevisto en el etr et&yleneinsensitive1-1 deplantas. %ientrasque laE%R1-1mutante no desarrollar *!R en aplicacinde 2D!6'Hr a sus races, e/pres *!R al menos as como8ild9type Dol9- cuando la bacteria se infiltr en eletileno9responsive ho=as. El *!R respuesta no fueinducida en el etileno9insensitive de=a deetr1-1. Estos

resultados demuestran claramente que, para *!R adesarrollar, etileno9dependientes se requiere lase+alizacin en el lugar de la aplicacin de las bacteriasque provocan *!R.

P fluorescensWCS417r no inducir la bios+ntesis deetileno en Col-%

;ara *!R e/presin, etileno, tiene que actuar en el sitiode aplicacin de *!R de inducir a las bacterias. "dems,nuestros resultados con el etileno9insensitive mutantesdemuestran que el *!R respuesta requiere todos loscomponentes conocidos de la ethylenesignaling sendero.!e ha demostrado recientemente que el D"D induce unaresistencia contra la infeccin ;st similares a 2D!6'HR9mediada *!R ;ieterse et al. '((4#. Las similitudes en elD"D9resistencia inducida y 2D!6'HR9mediada *!R

plante la cuestin de si la aplicacin de 2D!6'Hr a lasraces se traduce en elevados niveles de etilenolocalmente. $al aumento de los niveles de etileno puedeser instrumental en la generacin de la se+alizacinsistmica compuesto que hace que la planta sea msresistente a la impugnacin de los patgenos. Btras

preguntas son si la e/presin de *!R tambin requiereetileno y si, previa solicitud de la D%D6'Hr a las races,las ho=as son tambin elevados niveles de etileno.

!e realizaron mediciones de etileno en races deplantas en maceta de Dol9- en el suelo con o sin

2D!6'Hr. Resultados de unE/perimento tpico se muestran en la $abla 5. Gurante el

perodo de 1 semanas entre el trasplante de las plntulasen el suelo bacterized y desafo de inoculacin, cuandolas bacterias estn presentes en las races en nivelesdesencadenando *!R, una diferencia estadsticamentesignificativa en los niveles de etileno de races de controly 2D!6'Hrtreated plantas nunca fue encontrado. Lasho=as fueron analizados de manera similar pero,igualmente, no e/isten diferencias estadsticamente

significativas en la produccin de etileno se observ entrecontrol y 2D!6'HR9plantas tratadas.

E/aminar la posibilidad de que bacterization de racesest acompa+ado por una pronta, aumento transitorio enla produccin de etileno, la e/presin de los genes de

biosntesis de etileno "DDsynthase !EC# y "DD9o/idasa !C*# fue analizado en la primera semanadespus de races de plntulas fueron e/puestos a la

rhizobacteria. La familia de genes de "rabidopsis "D!consta de cinco miembros, de los cuales el !C+3es unpseudogene deacs1Liang et al. '((5#.!C+1#!C+4y acs5fueron probados pero no mostrarone/presin en races en el nivel de deteccin. Encontraste,!C+2 fue e/presado claramente @ig. 6#. !inembargo,!C+2 revel patrones de e/presin similares

para el control y la 2D!6'Hr tratados con races. ;araambos tratamientos, e/presin de acs2 aumentaron entre' y 1 das despus de la aplicacin de la bacteria y semantuvo elevada u ocasionalmente disminuy en Hdas.acola e/presin gnica mostraron una pauta

bastante parecida con diferencias aparentes entre elcontrol y el 2D!6'Hr tratados con races. ;or lo tanto, nohubo alteraciones en la e/presin de genes de biosntesis

de etileno producido asociado con la induccin de *!R.

Discusin

*!R es el mecanismo por el cual elP'(luorescens2D!6'Hr ha demostrado reducir laenfermedad causada por el ;st en "rabidopsis ;ieterse etal. '((), '((4 &an 2ees et al. '((H#. El camino por elcual se induce *!R es pobremente entendido. !eobservaron claras diferencias cuando se compar con el*!R bien establecida, en la cual la respuesta !"R !"

acumulacinPR y la inducci,n de lae/presin gnicaque se asocian con la respuesta de la resistencia. $ampocoocurre durante el desarrollo de la *!R y marcadores para*!R de respuesta son an no identificado. !in embargo, lacapacidad de respuesta tanto a cido =asmonic O"# y eletileno es necesaria para la e/presin de *!R, y laaplicacin de cualquiera de bromuro =asmonate %eO"# o"DD induce una resistencia en "rabidopsis similares a*!R ;ieterse et al. '((4#. "plicacin de %eO" a etr1-1plantas no resultar en la proteccin. !in embargo, el

Vol. 12, ;o. 9, 1999 +).

3ig% 8% "nlisis dela e/presin gnica de Jel en ho=as de col9-, eir1-1, ein2-1#y eto1-1 deplantas.else analiz la e/presin gnica 5 das despusdel tratamiento con -,-'N !il8et L9HH -#, o de -,3, ' y 5,3 m% "DD '9aminocyclopropane9'9cido carbo/lico# -,-'N !il8et L9HH. ;ara

comprobar la igualdad de las cargas, 7lot fue desnudado y se hibridaron con un proble para 9 tubulina hidromasa=e #.


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Raz de tiempo Leaf

(semanas) Ctrl Ctrl R417WCS WCS417r

tratamiento de la O"9.ar mutante no res$onden1con elD"D hizo inducir resistencia, indicando que =a y lacapacidad de respuesta de etileno sucesivamentecontratados en la transduccin de la se+al. "mbos !"R y

*!R son dependientes de


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Materiales y Mtodos

Los culti$os bacterianos%

" R*@"%;*D*@D ml9' 2D!6'Hr por ?g de suelo, o unacantidad equivalente de '- m% %g!B6 comotratamiento de control. ;ara la induccin de la *!R atravs de la infiltracin de ho=a, 3 semanas de edad seutilizaron plantas. >n da antes del tratamiento, las

plantas fueron puestas al '--N de humedad relativa. $resho=as por planta inferior se haban infiltrado con unasolucin que contenga '-H >@D ml9' de 2D!6'HR,usando una =eringa sin agu=a !8anson et al. '(44#. ;arala induccin de la !"R el procedimiento utilizado para la

induccin de la *!R fue seguida, con '-H >@D ml9' de;st avirulent avrR;$5#.

9esaf+o de la inoculacin e$aluacin de laenfermedad%

Las plantas fueron sometidas a impugnar la inoculacin1 semanas despus de trasplantar en suelos que contenganrhizobacteria mezcla o 1 das despus de la infiltracin

con ho=a avirulent ;!$. >n da antes del reto, la humedadrelativa se elev a '--N, y mantuvo al '--N durante lainoculacin. Gesafo de la inoculacin se realizasumergiendo las ho=as en una suspensin de 5,3 K '-H>@D ml9' de ;st virulenta en '- m% %g!B6,complementado con un -,-'N del surfactante !il8et L9HH. Duatro das ms tarde, la proporcin de las ho=asenfermas por planta fue determinada ;ieterse et al. '((),'((4#. El nmero de bacterias ;st en las ho=as inoculadasse determin en tres con=untos de 5- ho=as seleccionadasaleatoriamente por tratamiento. Las ho=as fueron pesados,

bien en=uagados en agua esterilizada y homogeneizada en'- m% %g!B6. ;osteriormente, diluciones apropiadas sechape hacia :7 agar suplementado con 3- mg L9' yrifampicina '-- mg L9' de ciclohe/imida. Gespus de 64h de incubacin a 54 QD, el nmero de rifampicina9resistant >@D 09' te=ido foliar infectado fue determinada.

Los datos fueron analizados estadsticamente con elanlisis de la varianza, seguido por el test de @isher paramenos diferencias significativas a M -,-3.

Rizosfera colonizacin%

Races -,3 a ',- g de peso fresco# de tres a cuatroplantas fueron cosechadas en duplicado, y agitarenrgicamente durante 1- s en '- m% %g!B6 '- ml porcada ' g de races#, conteniendo -.3 g de microesferas devidrio -,'H mm#. Giluciones seriadas fueron sembradasen agar :7 complementado con ciclohe/imida '-- mgL9'#, ampicilina 3- mg L9'#, cloranfenicol '1 mg L9'#y rifampicina '3- mg L9'#, el cual es selectivo pararifampicinresistant, fluorescentePseudomonas spp. I!chippers 0eels '(41#. Gespus de 5 das de incubacina 54 QD, el nmero de rifampicina9resistant >@D 09' sedetermin el peso fresco de raz.

9eterminacin de etileno%

>no, 5, y 1 semanas despus de rellenado de lasplantas, races y ho=as se cosechan y encerrados enfrascos de 1- ml 0nM '-#. Gespus de un perodo deincubacin de 1 das ba=o condiciones de la cmara decrecimiento, la acumulacin de etileno se midi porcromatografa de gases como se describe anteriormentede Laat y &an Loon '(41#.

)n*lisis de )R:%

;ara el estudio de la e/presin del gen de etileno9inducible hel, 3 semanas de edad, las plantas estabanimpregnadas con una solucin que contenga variasconcentraciones del D"D, el -,-'N !il8et L9HH, o -,-'N!il8et L9HH como control. Gos das despus deltratamiento, el material foliar fue cosechada, congeladosen nitrgeno lquido y se almacena a 94- QD hasta que el"R< fue aislado.

Vol. 12, ;o. 9, 1999 +)0


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>na vez supuesto e/perimento para analizar *!R9relacionados y acs acola e/presin gnica en races de

plntulas se realiza colocando 5 semanas de edad, Dol9-plntulas horizontalmente en cubos de lana de rocaempapada en la mitad de la fuerza de la solucinJoagland ;ieterse et al. '(()#. >na suspensin de 3 K'-4 >@D ml9' 2D!6'HR de '- m% %g!B6 o '- m%%g!B6 solos, fue mezclado 'C' volS8t# con polvos de

talco y aplicado a las races, que luego fueron cubiertoscon cubos de lana de roca. " las ', 1 y H das despus deltratamiento, las races fueron cosechadas y talco mi/ fuequitado lavando las races en el agua. Gespus del secado,las races fueron congelados en nitrgeno lquido y sealmacena a 94-QD para el aislamiento de "R?nes :essmann, J. y Ryals, O. '((). 7enzothiadiazole induceresistencia sistmica adquirida en el tabaco. ;lanta O. '-C)'9H-.

0affney, $., @riedrich, L., &ernooi=, 7., ?nes, !., y Ryals, O. '((6. Laresistencia adquirida la transduccin de se+ales en "rabidopsis esdependiente de etileno. Dlula vegetal )C34'9344.

La8ton, :., 2eymann, :., @riedrich, L., &ernooi=, 7., !., y >?nessRyals, O. '((3. La resistencia sistmica adquiridaen!rabido$sisrequiere cido saliclico pero no de etileno. %ol.;lant9%icrobe interactuar. 4C4)14H-.

La8ton, :. "., @riedrich, L., Junt, %., 2eymann, :., !taub, $.:essmann, J. y Ryals, O. '((). 7enzothiadiazole induceresistencia a la enfermedad en "rabidopsis mediante la activacinde la resistencia sistmica adquirida va de transduccin dese+ales. ;lanta O. '-CH'945.

Liang, Y., "bel, !., :eller, O. "., gallina, nidos 4(C''-6)9''-3-.

+)+ Plant-Mic(ob Int(accions 6olcula(s


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Lincoln, D., 7ritton, O. J., y Estelle, %. '((-. Drecimiento ydesarrollo de la a"r1mutantes de "rabidopsis. Dlula vegetal5C'-H'9'-4-.

Linthorst, J. O. %. '(('. Las protenas relacionadas con lapatognesis de las plantas. Drit. Rev. ;lanta !ci. '-C'519'3-.

Linthorst, J. O. %., 7rederode, @. $. &an der hace, D. y 7ol, O. @.'((1. $abaco inhibidor de proteinasa9* genes son localmente,

pero no de manera sistmica inducida por estrs. ;lanta %ol.7iol. 5'C(439((5.

%aeda, $. 2urgler9%urphy, !. %., y !aito, J. '((6. >n sistema

t8ocomponent osmosensing que regula una cascada de quinasas%"; en la levadura. nanueva va de se+alizacin que controlan la resistencia sistmicainducida en la "rabidopsis. Dlula vegetal '-C'3H'9'34-.

;otter, !., >?nes, !., La8ton, :., *nvierno, ". %., Dhandler, G.,Gi%aio, O.,

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