Tinción de Papanicolaou

La tinción de Papanicolaou es un examen basado en la coloración de smears* en general (vaginal, cervical, prostático) o para fluídos corporales (peritoneal, pleural, gástrico, urinario, espinal,etc)

Colorantes empleados: Existen varias soluciones de Papanicolaous, pero todas son variantes de los siguientes colorantes

Hematoxilina de Harris (EA50, EA65,EA36)Naranja GEosinaResultado de las tinciones celulares:

núcleos---------------------------------------en azulcélulas acidófilas--------------------------rojo a naranjacélulas basófilas---------------------------verde o azul verdosocélulas o fragmentos de tejido impregnados de sangre----naranja o naranja verdosoComo prueba para la detección del cáncer cervico-uterino, se toma una muestra de células del epitelio del cuello uterino y se extienden en una lámina de vidrio que es la que se colorea con Papanicolaou.

Tinción negativa--------------------------resultados normalesTinción positiva---------------------------resultados alterados

Una tinción positiva puede ser índice de:• Inflamación ( por diferentes causas)• Signos tempranos de cáncer (displasia)• Signos de cáncer más avanzado que se extiende más allá del cuello• Cáncer avanzado

La tinción de Papanicolaou es una prueba fiable. Requiere de experiencia en la interpretación de los resultados, pero en los smears cervicales, el porcentaje de aciertos es muy elevado. Esta prueba ha ayudado a disminuir drásticamente el número de mujeres que mueren por causa de cáncer cervical. En nuestro país el Programa de detección de cáncer cervico-uterino con las pruebas citológicas periódicas ha ayudado extraordinariamente a reducir esta enfermedad.

Otros métodos computarizados, utilizados en conjunción con el Papanicolaou, ayudan a la fiabilidad de la prueba, pero aumentan el costo de su utilización.

Células normales Células cancerosas

En la actualidad la Organización Panamericana de la Salud (OPS) está proponiedo la utilización de otra prueba, para América Latina, que afirman que es más segura que el Papanicolaou y menos costosa, se denomina "Tamizaje y tratamiento" y utiliza la inspección visual con ácido acético, para detectar células anormales en el cuello del útero y luego suministra tratamiento inmediato con crioterapia, para los pacientes que tienen células precancerosas. Los estudios fueron realizados por la Alianza para la Prevención del Cáncer Cervicouterino, del cúal es miembro la OPS, con apoyo de otras organizaciones.

Qué son los Coilocitos?Con la tinción de Papanicolaou en los smears y también en los cortes

histologicos con HE aparecen células con determinadas caracteristicas, (célula grande, con núcleo rechazado a la periferia, de bordes irregulares, citoplasma claro, con una vacuola central, que generalmente es de glucógeno) que se les denominó, desde hace tiempo, Coilocitos, cuyo significado se desconocia y que hoy se sabe están infectadas por papilomavirus en diferentes tipos. Algunos tipos de ese virus, se saben están relacionados con las lesiones precancerosas de las mucosas cubiertas por epitelios estratificados planos, como es el caso del cervix.

Kit de tinción PASpara la detección de aldehído y mucosustanciaPrincipio

La tinción PAS (periodic acid-Schiff) es uno de los métodos químicos mâs empleados en histología.

En la tinción PAS se trata el material con ácido peryódico, que oxida los1,2-glicoles formándose grupos aldehído. Con el reactivo de Schiff, los aldehídos reaccionan dando un color rojo luminoso.

Con polisacáridos no substituidos, mucopolisacáridos neutros, mucoproteínas y glucoproteínas, glucolípidos y fosfolípidos, la tinción PAS da una reacción de color específica.

Combinando la tinción PAS con azul alcián pueden identificarse además mucosustancias ácidas (glucosaminoglicanos).

MaterialComo material de partida se emplean cortes de tejido fijado en formalina e

incluido en parafina o bien extensiones celulares.Cortes parafínicos de 3-5 μm de espesor

ReactivosComponentes en el kit de tinción PAS, Merck art. nro. 1.01646.Solución 1: Ácido peryódico 0,5 %, acuoso 500 mlSolución 2: Reactivo de Schiff 500 ml

Preparación1. Solución de azul alcián al 1%Se disuelven, revolviendo, 5 g de azul alcián 8 GX Certistain® en 500 ml de

ácido acético al 3%. El valor del pH es aprox. 2,5.2. Solución de ácido acético al 3%Mezclar cuidadosamente 485 ml de agua destilada con 15 ml de ácido

acético del 100%.TécnicaTinción PASEtapa Tiempo

Desparafinar en forma típica los cortes y rehidratar.Enjuagar en agua destilada.Ácido peryódico 5 min.Agua corriente del grifo, fluente 3 min.Enjuagar en agua destilada.Reactivo de Schiff 15 min.Agua corriente del grifo, fluente 3 min.Enjuagar en agua destilada.Solución de hematoxilina modificada según Gill III 2 min.Agua corriente del grifo, fluente 3 min.Serie creciente de alcoholes, 2 x Neo-Clear® o xilenoMontar con Neo-Mount® o Entellan® NuevoCubrir con Entellan® Nuevo los preparados humedecidos con xileno, o con

Neo-Mount® y cubreobjetos los preparados humedecidos con Neo-Clear®.

ResultadoNúcleos azul

Polisacáridos, glucógeno, mucopolisacáridos neutros, mucoproteínas y glucoproteínas, glucolípidos, fosfolípidos, membrana basal, colágeno púrpura

Tinción azul alcián PASEtapa Tiempo

Desparafinar en forma típica los cortes y rehidratar.Solución de azul alcián 5 min.Agua corriente del grifo, fluente 3 min.Enjuagar en agua destilada.Ácido peryódico 10 min.Agua corriente del grifo, fluente 3 min.Enjuagar en agua destilada.Reactivo de Schiff 15 min.Agua corriente del grifo, fluente 3 min.Enjuagar en agua destilada.Solución de hematoxilina modificada según Gill III 20 segundosAgua corriente del grifo, fluente 3 min.Serie creciente de alcoholes, 2 x Neo-Clear® o xilenoMontar con Neo-Mount® o Entellan® NuevoCubrir con Entellan® Nuevo los preparados humedecidos con xileno, o con

Neo-Mount® y cubreobjetos los preparados humedecidos con Neo-Clear®.

ResultadoNúcleos azulMucosustancias ácidas azul claroPolisacáridos, mucopolisacáridos neutros púrpura

Nota técnicaEl microscopio usado debería corresponder a los requisitos de un

laboratorio de diagnóstico médico.Seguir las indicaciones de empleo del fijador.Deben seguirse las indicaciones de empleo del histoprocesamiento y las

instrucciones de empleo del fabricante del aparato y del software.Si se utiliza un aparato automático de tinción, deben tenerse en cuenta las

instrucciones de empleo del fabricante del aparato y del software.

Preparación de las muestrasTodas las muestras deben tratarse de acuerdo con el estado de la

tecnología.Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.Deben usarse instrumentos adecuados para la toma de muestras y en la

preparación, y deben seguirse las instrucciones del fabricante para la aplicación/el empleo.

DiagnósticoLos diagnósticos deberán ser establecidos solamente por personas

autorizadas y cualificadas.Deberán emplearse terminologías vigentes.

Deberán elegirse y realizarse ensayos ulteriores según métodos reconocidos.

AlmacenamientoEl kit de tinción debe almacenarse entre +15°C y +25°CLas soluciones pueden usarse hasta la fecha de caducidad indicada.

EstabilidadDespués de abrir el frasco por primera vez, el contenido almacenado entre

+15°C y +25°C es utilizable hasta la fecha de caducidad indicada.Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.

Notas sobre el empleoPara evitar errores, la tinción debería ser realizada por personal

especializado.Solamente para uso profesional.Deben cumplirse las directivas nacionales sobre seguridad en el trabajo y

aseguramiento de la calidad.Deben emplearse microscopios equipados de acuerdo con el estándar.

Protección contra infeccionesDebe observarse a toda costa una protección eficaz contra infecciones de

acuerdo con las directivas de laboratorio.

Indicaciones para la eliminación de residuosLas soluciones usadas y las soluciones caducadas deben eliminarse como

desechos especiales, debiéndose cumplir las directivas locales de eliminación de residuos.

Merck, además de aceptar la devolución de productos usados o caducados a través del servicio de retrologística, ofrece también ayuda técnica para soluciones locales de eliminación de residuos.

Tricromico de Masson Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. Se observan tres

colores distintos; tejido conjuntivo de verde, tejido muscular de verde pardo, eritrocitos de rojizo, núcleos azul negro y citoplasma y fibras musculares rosa.

1º-Desparafinado.Estufa durante 30 min. a 60º.Sumergimos en xilol durante 10 o 15

min.

7º- Ácido fosfomolíbdico 5 min.

2º- Hidratación.Alcohol absoluto-5min.Alcohol 96º-5min.Alcohol 70º-5min.

8º- Ácido fosfomolíbdico 5 min.

3º- Lavar en H2O destilada. 9º- Verde luz 5-7 min.4º- Hematoxilina de Weigert 5 10º-Deshidratar.

min.Alcohol de 70ºAlcohol de 96º.Xilol.

5º- Lavar con agua corriente 10 min.

11º- Montaje.

6º- Fucsina de Ponceau 5 min.

El tricrómico de Masson, al igual que otros colorantes tricrómicos, es una tinción especial que permite visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I que forman fibras gruesas o haces, diseñados para dar resistencia; también evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras reticulares. Se emplean tres colorantes para diferenciar el núcleo celular, el citoplasma y las fibras de colágeno.

Contenido[ocultar]1 Fundamento 2 Tejido control y

diana3 Reactivos 4 Procedimiento 4.1 Análisis de

resultados4.2 Variantes 5 Véase también 6 Bibliografía 7 Enlaces externos

[editar] FundamentoPrimeramente, se tiñen las secciones con un tinte ácido tal como escarlata de

Biebrich. Todos los elementos acidófilos del tejido tales como el citoplasma, el músculo y el colágeno se unirán a los tintes ácidos. Las secciones entonces se tratan con ácido fosfotúngstico y/o fosfomolíbdico. Ya que el citoplasma es mucho menos permeable que el colágeno, los ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colágeno pero no del citoplasma. Los ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos tienen numerosos grupos ácidos que probablemente actúen como medio de unión entre el colágeno y el azul de la anilina, que es el tinte del colágeno. Probablemente, el pH de la solución fosfotúngstico/fosfomolíbdico también aumente la coloración y ayude al colágeno en la difusión o el retiro de los colorantes.

[editar] Tejido control y dianaCualquier tejido con componente conjuntivo, en especial con contenido en fibras

colágenas, puede servir como control o ser un tejido diana. Cualquier fijador es válido, si bien es de elección la solución de Bouin. El grosor de corte óptimo de las muestras es de entre 4 y 6 micras.

[editar] ReactivosSolución de hematoxilina férrica de Weigert.Solución de escarlata de Biebrich – fucsina ácida: 90 cc de escarlata de Biebrich al 1% en agua destilada.9 cc de fucsina ácida al 1% en solución acuosa.1 cc de ácido acético glacial.Solución acuosa de ácido fosfomolíbdico (utilizar ácido fosfotúngstico en la

misma proporción, si se va a teñir con verde luz):

5 g de ácido fosfomolíbdico.200 cc de agua destilada.Solución de azul de anilina: 2,5 g de azul de anilina.2 cc de ácido acético glacial.98 cc de agua destilada.Solución de verde luz al 2% (alternativa al azul): 2 g de verde luz SF amarillento.99 cc de agua destilada.1 cc de ácido acético glacial.Solución diferenciadora: solución acuosa de ácido acético glacial al 1%.[editar] ProcedimientoDesparafinar e hidratar hasta el agua destilada de manera habitual.En material fijado en soluciones de formaldehído o alcohólicas se recomienda

hacer un mordentaje previo con líquido de Bouin durante 1 hora a 56-60 ºC o toda la noche a temperatura ambiente.

Enfriar y lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.Teñir con hematoxilina férrica durante 10 minutos. Lavar en agua corriente durante

10 minutos.Lavar en agua destilada.Teñir con la solución de escarlata-fucsina ácida durante 2-5 minutos.Lavar en agua destilada.Tratar con la solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico durante 10-15

minutos si se va a colorear con la solución de azul de anilina, o en la solución acuosa de ácido fosfotúngstico al 5% durante 15 minutos si se desea teñir con verde luz.

Teñir con solución de azul de anilina 15 minutos o con solución de verde luz 5 minutos.

Lavar en agua destilada.Diferenciar en la solución de ácido acético al 1% durante 3-5 minutos.Deshidratar, aclarar y montar.[editar] Análisis de resultadosFibras de colágeno = Azul.Por tanto, el tejido conjuntivo se teñirá de dicho color.Estructuras oxidadas + Citoplasma = Rojo.Se teñirán de rojo la queratina, los glóbulos rojos y el tejido muscular.Núcleo celular = Lila, marrón.[editar] VariantesLa técnica presenta multitud de variantes, pero las principales modificaciones hacen

referencia al uso de un diferenciador después de la hematoxilina (por ejemplo, ácido pícrico), el tiempo de las soluciones, la temperatura, etc.

Definición de Tinción de mallory

Una técnica para el estudio del tejido conjuntico. Los cortes se tiñen con fucsina ácida,solución de azul-naranja G de anilina y ácido fosfotungstico. Las fibras de colágeno aparecen en azul, la fibroglia, neuroglia y fibras musculares aparecen en rojo y las fibrillas de elastina en naranja. También llamada tinción tricrómica de Mallorymicrofotografía

Ciclo de Krebs

Esquema didáctico del ciclo del ácido cítrico.El ciclo de Krebs (también llamado ciclo del ácido cítrico o ciclo de los

ácidos tricarboxílicos) es una ruta metabólica, es decir, una sucesión de reacciones químicas, que forma parte de la respiración celular en todas las células aeróbicas.En células eucariontas, se realiza en la mitocondria.En procariotas,el ciclo de Krebs se realiza en el citoplasma, específicamente en el citosol.

En organismos aeróbicos, el ciclo de Krebs es parte de la vía catabólica que realiza la oxidación de glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos hasta producir CO2, liberando energía en forma utilizable (poder reductor y GTP).

El metabolismo oxidativo de glúcidos, grasas y proteínas frecuentemente se divide en tres etapas, de las cuales, el ciclo de Krebs supone la tercera. En la primera etapa, los carbonos de estas macromoléculas dan lugar a moléculas de acetil-CoA de dos carbonos, e incluye las vías catabólicas de aminoácidos (p. ej. desaminación oxidativa), la beta oxidación de ácidos grasos y la glucólisis. La tercera etapa es la fosforilación oxidativa, en la cual el poder reductor (NADH y FADH2) generado se emplea para la síntesis de ATP según la teoría del acomplamiento quimiosmótico.

El ciclo de Krebs también proporciona precursores para muchas biomoléculas, como ciertos aminoácidos. Por ello se considera una vía anfibólica, es decir, catabólica y anabólica al mismo tiempo.

Contenido[editar] HistoriaEl ciclo Krebs recibe su nombre en honor a su descubridor Sir Hans Adolf

Krebs, quien propuso los elementos clave del consumo de O2, en cantidad desproporcionada respecto a las cantidades añadidas. En segundo lugar, empleando malonato (inhibidor de la succinato deshidrogenasa), lograba bloquear la oxidación del piruvato, lo que indicaba su participación en la vía. Además, observó que las células tratadas con malonato acumulaban citrato, succinato y α-cetoglutarato, lo cual sugería que citrato y α-cetoglutarato eran precursores del succinato. En tercer lugar, la administración al tejido de piruvato y oxaloacetato provocaba la acumulación de citrato en el músculo, lo que indicaba que son precursores del citrato. Con base en estas observaciones experimentales Hans Krebs propuso una ruta cíclica y su secuencia de reacciones. Este esquema inicial, con ciertas modificaciones, dio lugar al ciclo de Krebs tal y como hoy lo conocemos.

[editar] Reacciones del ciclo de Krebs

El ciclo de Krebs tiene lugar en la matriz mitocondrial en eucariota

El acetil-CoA (Acetil Coenzima A) es el principal precursor del ciclo. El ácido cítrico (6 carbonos) o citrato se regenera en cada ciclo por condensación de un acetil-CoA (2 carbonos) con una molécula de oxaloacetato (4 carbonos). El citrato produce en cada ciclo una molécula de oxaloacetato y dos CO2, por lo que el balance neto del ciclo es:Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O → CoA-SH + 3 (NADH + H+) + FADH2 + GTP + 2 CO2

Los dos carbonos del Acetil-CoA son oxidados a CO2, y la energía que estaba acumulada es liberada en forma de energía química: GTP y poder reductor (electrones de alto potencial): NADH y FADH2. NADH y FADH2 son coenzimas (moléculas que se unen a enzimas) capaces de acumular la energía en forma de poder reductor para su conversión en energía química en la fosforilación oxidativa.

El FADH2 de la succinato deshidrogenasa, al no poder desprenderse de la enzima, debe oxidarse nuevamente in situ. El FADH2 cede sus dos hidrógenos a la ubiquinona (coenzima Q), que se reduce a ubiquinol (QH2) y abandona la enzima.

Las reacciones son:

Molécula Enzima Tipo de reacciónReactivos/Coenzimas

Productos/Coenzima

I. 1. Aconitasa Deshidratación H2O

II. 2. Aconitasa Hidratación H2O

III. 3. Isocitrato deshidrogenasa

Oxidación NAD+ NADH + H +

IV. 4. Isocitrato deshidrogenasa

Descarboxilación

V. α-5. α-cetoglutaratodeshidrogenasa

Descarboxilación oxidativa

NAD+ +CoA-SH

NADH + H+

+ CO2

VI. 6. Succinil-CoA sintetasa

HidrólisisGDP+ Pi

GTP +CoA-SH

VII. 7. Succinato deshidrogenasa

Oxidación FAD FADH2

VIII. 8. Fumarato Hidratasa Adición (H2O) H2O

IX. 9. Malato deshidrogenasa

Oxidación NAD+ NADH + H+

Condensación

X. Oxaloacetato

10. Citrato sintasa

NOTA: El cis-aconitato es un intermedio de reacción muy inestable que rápidamente se transforma en citrato, antes de comenzar la tercera reacción.

[editar] Visión simplificada y rendimiento del procesoEl paso final es la oxidación del ciclo de Krebs, produciendo un

oxaloacetato y dos CO2.El acetil-CoA reacciona con una molécula de oxaloacetato (4 carbonos)

para formar citrato (6 carbonos), mediante una reacción de condensación.A través de una serie de reacciones, el citrato se convierte de nuevo en

oxaloacetato.Durante estas reacciones, se substraen 2 átomos de carbono del citrato

(6C) para dar oxalacetato (4C); dichos átomos de carbono se liberan en forma de CO2

El ciclo consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. También consume 3 NAD+ y 1 FAD, produciendo 3 NADH + 3 H+ y 1 FADH2.

El rendimiento de un ciclo es (por cada molécula de piruvato): 1 ATP, 3 NADH +3H+, 1 FADH2, 2CO2.

Cada NADH, cuando se oxide en la cadena respiratoria, originará 2,5 moléculas de ATP (3 x 2,5 = 7,5), mientras que el FADH2 dará lugar a 1,5 ATP. Por tanto, 7,5 + 1,5 + 1 GTP = 10 ATP por cada acetil-CoA que ingresa en el ciclo de Krebs.

Cada molécula de glucosa produce (vía glucólisis) dos moléculas de piruvato, que a su vez producen dos acetil-CoA, por lo que por cada molécula de glucosa en el ciclo de Krebs se produce: 4CO2, 2 GTP, 6 NADH + 6H + , 2 FADH2; total 32 ATP.

[editar] RegulaciónMuchas de las enzimas del ciclo de Krebs son reguladas por

retroalimentación negativa, por unión alostérica del ATP, que es un producto de la vía y un indicador del nivel energético de la célula. Entre estas enzimas, se incluye el complejo de la piruvato deshidrogenasa que sintetiza el acetil-CoA necesario para la primera reacción del ciclo a partir de piruvato, procedente de la glucólisis o del catabolismo de aminoácidos. También las enzimas citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa y α-cetoglutarato deshidrogenasa, que catalizan las tres primeras reacciones del ciclo de Krebs, son inhibidas por altas concentraciones de ATP. Esta regulación frena este ciclo degradativo cuando el nivel energético de la célula es bueno.

Algunas enzimas son también reguladas negativamente cuando el nivel de poder reductor de la célula es elevado. El mecanismo que se realiza es una inhibición competitiva por producto (por NADH) de las enzimas que emplean NAD+

como sustrato. Así se regulan, entre otros, los complejos piruvato deshidrogenasa y citrato sintasa.

[editar] Principales vías que convergen en el ciclo de KrebsLa mayoría de las vías catabólicas convergen en el ciclo de Krebs, como

muestra el diagrama. Las reacciones que forman intermediarios del ciclo se conocen como reacciones anapleróticas.

El ciclo de Krebs constituye la segunda etapa del catabolismo de carbohidratos. La glucólisis rompe la glucosa (6 carbonos) generando dos moléculas de piruvato (3 carbonos). En eucariotas, el piruvato se desplaza al interior de la mitocondria (gracias a un transportador específico de membrana

interna). En la matriz mitocondrial, produce acetil-CoA que entra en el ciclo de Krebs.

En el catabolismo de proteínas, los enlaces peptídicos de las proteínas son degradados por acción de enzimas proteasas en el tubo digestivo liberando sus constituyentes aminoacídicos. Estos aminoácidos penetran en las células, donde pueden ser empleados para la síntesis de proteínas o ser degradados para producir energía en el ciclo de Krebs. Para su entrada al ciclo deben eliminarse sus grupos amino (terminales y laterales) por acción de enzimas aminotransferasas y desaminasas, principalmente.

En el catabolismo de lípidos, los triglicéridos son hidrolizados liberando ácidos grasos y glicerol. En el hígado, el glicerol puede ser convertido en glucosa vía dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehído-3-fosfato, por la gluconeogénesis (ruta anabólica). En muy diversos tejidos, especialmente en músculo cardíaco, los ácidos grasos son degradados en la matriz mitocondrial mediante sucesivos ciclos de beta oxidación que liberan unidades de acetil-CoA, que pueden incorporarse al ciclo de Krebs. En ocasiones, el ciclo de Krebs puede rendir propionil-CoA (3 carbonos), que puede emplearse para la síntesis de glucosa en la gluconeogénesis hepática.

El ciclo de Krebs siempre es seguido por la fosforilación oxidativa. Este proceso extrae la energía en forma de electrones de alto potencial de las moléculas (Cofactores reducidos) que son el NADH y FADH2, regenerando NAD+ y FAD, gracias a lo cual el ciclo de Krebs puede continuar. Los electrones son transferidos a moléculas de O2, rindiendo H2O. Pero esta transferencia se realiza a través de una cadena transportadora de electrones capaz de aprovechar la energía potencial de los electrones para bombear protones al espacio intermembrana de la mitocondria. Esto genera un gradiente electroquímico de H+, que es utilizado para la síntesis de ATP mediante la enzima ATP sintetasa. De este modo, el ciclo de Krebs no utiliza directamente O2, pero lo requiere al estar acoplado a la fosforilación oxidativa.

Por cada molécula de glucosa, la energía obtenida mediante el metabolismo oxidativo, es decir, glucólisis seguida del ciclo de Krebs, equivale a 30/32 moléculas de ATP dependiendo del tipo de lanzadera para introducir el poder reductor dentro de la mitocondria, si es la lanzadera de malato-aspartato son 32 y si es la de glicerol 3 fosfato, son 30.

[ocultar]1 Historia 2 Reacciones del ciclo de Krebs 2.1 Visión simplificada y rendimiento del proceso 3 Regulación 4 Principales vías que convergen en el ciclo de Krebs 5 Véase también 6 Enlaces externos